專利名稱：：三酰甘油脂肪酶的功能性表達(dá)的制作方法三酰甘油脂肪酶的功能性表達(dá)本發(fā)明涉及編碼三酰甘油脂肪酶的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或載體的宿主細(xì)胞、在原核生物中表達(dá)三酰甘油脂肪酶的方法、用于檢測(cè)和用于產(chǎn)生三酰甘油脂肪酶的方法、由此獲得的三酰甘油脂肪酶，以及編碼三酰甘油脂肪酶的核酸、載體和重組宿主細(xì)胞用于前述方法的用途。
背景技術(shù)：
：三酰甘油脂肪酶(EC3丄1.3)是用于多種工業(yè)用途的有價(jià)值的有效催化劑，例如用于去污劑工業(yè)、油化學(xué)、食品工業(yè)以;Sj晴細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)生中(Schmidl998)。脂肪酶是羧酸酯酶，其催化三酰甘油以及其它通常的疏水性酯類的水解和合成。其三維晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明的所有三酰甘油脂肪酶屬于a/p-水解酶折疊蛋白質(zhì)家族，它們具有相似的整體構(gòu)造(Ollis1992)。南極假絲酵母(Om力V/"朋似r"/cfl)-脂肪酶B(CalB)是用于許多反應(yīng)的有效催化劑，并且被用于例如立體選擇性轉(zhuǎn)化和聚酯合成(Anderson1998)。CalB具有溶劑可及活性中心(Uppenberg1994)，并且不顯示出間期活性(Martinelle等人，1995)?；钚灾行氖钦穆┒?，并且由于此原因，CalB在羧酸酯類(例如辛酸乙酯)方面比三酰甘油方面具有更高的活性(Martinelle1995)。CalB在有機(jī)介質(zhì)中與在水中的活性相當(dāng)，特別是CalB對(duì)于仲醇的高對(duì)映選擇性，這一事實(shí)使得該酶目前在生物技術(shù)的使用中成為最重要的脂肪酶之一。過去，為了用于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用，CalB主要在米曲霉(4s/^^說"s中表達(dá)(Hoegh1995)。為了研究目的，該酶在酵母巴斯德畢赤酵母(尸/c/^fl/flstor/s)(Rotticci-Mulder等人2001)和釀酒酵母)(Zhang等人20(B)中成功表達(dá)。在容易操作5的原核生物表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌(co/i'(E)中沒有成功表達(dá)CalB(Rotticci-Mulder2003)。在大腸桿菌中的表達(dá)隨后第一次實(shí)現(xiàn)，但是僅產(chǎn)生低產(chǎn)量的功能性CalB(Rusnak2004)。這是不利的，因?yàn)榇竽c桿菌具有許多優(yōu)于其它表達(dá)系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)并且允許快速、便宜的高通量篩選大基因文庫。近期描述了通過隨機(jī)誘變修飾CalB(Chodorge等人，2005)。文獻(xiàn)中也已經(jīng)報(bào)道了通過合理的酶設(shè)計(jì)改良CalB用于特定應(yīng)用的許多嘗試。盡管這些中的一些產(chǎn)生了好結(jié)果(Patkar等人1998;Rotticci2000),通過對(duì)酶的催化性質(zhì)的不足的理解，合理酶設(shè)計(jì)的可能性仍然是有限的。但是，要解決的主要問題是CalB在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)不充分的功能性，這是通過定向進(jìn)化改善酶的前提。究其原因在于酶的復(fù)雜三級(jí)結(jié)構(gòu)，這需要三個(gè)二硫橋的形成，以確保功能性構(gòu)象。在大腸桿菌或其它原核生物中產(chǎn)生此類蛋白質(zhì)是很難的，因?yàn)樵松锏募?xì)胞環(huán)境、折疊機(jī)制和折疊質(zhì)量控制的限制點(diǎn)不同于真核生物的那些(Baneyx和Mujacic2004)。相應(yīng)地，在大腸桿菌的CalB的前期表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明A^L現(xiàn)有內(nèi)含體形成并且缺乏CalB活性(結(jié)果未顯示)。在翻譯水平上可以發(fā)生額外問題。在許多生物中tRNA種類的量可以差別很大。這一問題可以通過密碼子優(yōu)化來克服，事實(shí)上，一些真核蛋白質(zhì)(例如人1型神經(jīng)纖維瘤蛋白的結(jié)構(gòu)域)的表達(dá)水平顯著升高(Hale1998)。但是，功能性酶的量不直接與表達(dá)水平相關(guān)，因此也是僅有條件地與密碼子選捧相關(guān)。除了實(shí)際的基因序列，啟動(dòng)子在表達(dá)效率中起到了關(guān)鍵作用。在生物技術(shù)中，通常使用的載體系統(tǒng)，例如pET載體系統(tǒng)(諾華基因公司(Novagen))包含T7啟動(dòng)子，其使得所述載體適于在大腸桿菌中嚴(yán)格調(diào)節(jié)異源蛋白質(zhì)的顯著過量表達(dá)。但是，異源表達(dá)的酶的高表達(dá)水平非常通常地導(dǎo)致不正確折疊的蛋白質(zhì)。已經(jīng)顯示冷敏感啟動(dòng)子可以在降低的溫度下促進(jìn)某些蛋白質(zhì)的有效基因表達(dá)。特別地，過去使用主要的冷激基因的啟動(dòng)子(Goldstein等人19卯)。但是，^目當(dāng)?shù)难芯恐忻黠@可見，大腸桿菌中可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)仍是有問題的并且取決于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)所來源的生物(Qing等人2004)。細(xì)胞環(huán)境也可以對(duì)功能性(即酶促活性)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量造成影響。已經(jīng)報(bào)道了谷胱甘肽還原酶(gw)和硫氧還蛋白還原酶("x5)的基因中的突變可以導(dǎo)致在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)時(shí)蛋白質(zhì)中增加的二硫橋的形成(Prinz等人1997)。改良大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的一種方法包括涉及從頭的蛋白質(zhì)折疊的分子陪伴的共表達(dá)。因此，過去已經(jīng)報(bào)道了分子伴侶DnaK-DnaJ或引發(fā)因子(TF)的過量表達(dá)增加了在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)選定蛋白質(zhì)的溶解性(Nishihara等人2000)。對(duì)于〉60kD的靶蛋白質(zhì)報(bào)道了好結(jié)果?；贕roEL-GroES的另一機(jī)制可以用于小于約60kD的靶蛋白質(zhì)(Baneyx和Mujacic2004)。除了過去在異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的功能性表達(dá)方面產(chǎn)生的進(jìn)展外，成功的表達(dá)還不能被預(yù)測(cè)，但是相當(dāng)程度上取決于在每種情形中所用的蛋白質(zhì)。還沒有凈艮道在重組三酰甘油脂肪酶(特別是例如CalB)的功能性表達(dá)中的增力口。本發(fā)明的目標(biāo)因此是提供編碼三酰甘油脂肪酶的核酸以及在原核生物中其改良的功能性表達(dá)的方法。另一目標(biāo)是提供檢測(cè)三酰甘油脂肪酶的方法、篩選所述三酰甘油脂肪酶的方法，以及產(chǎn)生所述三酰甘油脂肪酶的方法。發(fā)明概述本發(fā)明的目標(biāo)是通過表達(dá)三酰甘油脂肪酶的方法來實(shí)現(xiàn)的，所述方法中蛋白質(zhì)的增加的功能性表達(dá)是通過在原核生物，特別是大腸桿菌宿主菌林中在下文詳細(xì)描述的特定條件下表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。目標(biāo)還是通過下述實(shí)現(xiàn)提供就原核生物(特別是大腸桿菌)中脂肪7酶B的表達(dá)而被優(yōu)化的編碼核苷酸序列。該目標(biāo)還是通過檢測(cè)三酰甘油脂肪酶(特別是CalB)的方法、用于篩選三酰甘油脂肪酶的檢測(cè)方法的用途以及其產(chǎn)生方法來實(shí)現(xiàn)的。附圖描述圖l:從南極假單胞菌(C朋tor"/cfl)擴(kuò)增的calB—wt與源自pPCR/calB載體的合成序列-優(yōu)化的基因calB—syn之間的序列比較。差異突出顯示。圖2:在CalB-表達(dá)實(shí)驗(yàn)中使用表達(dá)載體pET32-b(+)(在OrigamiTM2(DE3)細(xì)胞中)或pColdlll(在OrigamiTMB細(xì)胞中)在15X:獲得的可溶(S)和不可溶(i)級(jí)分的SDS-PAGE分離。用箭頭指出CalB條帶(33kDa)和Trx-CalB融合蛋白條帶(45kDa)。M:分子量標(biāo)準(zhǔn)。C:用空栽體的對(duì)照級(jí)分。圖3:可溶(S)和不可溶(I)級(jí)分的SDS-PAGE分離，所述級(jí)分是通過在OrigamiTMB細(xì)胞中用pColdlll構(gòu)建體與不同分子伴侶質(zhì)粒(a:pGro7,b:pG-Tf2，c:pTfl6，d:pKJE7，e:pG-KJE8)的CalB共表達(dá)實(shí)驗(yàn)獲得的。用箭頭標(biāo)出CalB(33kDa)和分子伴倡(GroEL:60kDa，Tf:56kDa，DnaK:70kDa，DnaJ:40kDa)。M:分子量標(biāo)準(zhǔn)(29、43和66kDa)。C:來自用空載體的對(duì)照的級(jí)分。圖4:來自大腸桿菌OrigamiTM2(DE3)細(xì)胞(在pET32b(+)表達(dá)的情形中)和OrigamiTMB細(xì)胞(所有其它構(gòu)建體)的澄清的細(xì)胞裂解物的丁酸甘油酯方面的水解活性，所述細(xì)胞具有所述構(gòu)建體。顯示了4-6個(gè)獨(dú)立表達(dá)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5:通過澄清的細(xì)胞裂解物的96孔孩t量滴定板中pNPP的水解，所述細(xì)胞裂解物來自包含pColdlll/calB—wt或—syn和GroES/GroEL(pGro7)的OrigamiB細(xì)胞。在表達(dá)CalB的細(xì)胞的情形中，研究了17(calB—wt)和18(calB_syn)個(gè)孔。使用具有包含空pColdlll載體和pGro7的OrigamiTMB細(xì)胞的6個(gè)孔作為對(duì)照。將值用背景消光值(無細(xì)胞裂解物的底物)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)涉及在原核生物中表達(dá)功能性三酰甘油脂肪酶的方法，這是通過在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下，在原核細(xì)胞(優(yōu)選在大腸桿菌中)表達(dá)編碼三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列。表達(dá)特別在重組原核細(xì)胞中發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，"三酰甘油脂肪酶"意思是根據(jù)IUBMB酶命名(httD:〃www.hibmb,unibe.ch;http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzvme八的類E.C.3丄1,3的酶。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法特別適合于用于脂肪酶的功能性表達(dá)，所述脂肪酶在其功能性形式中需要一個(gè)或多個(gè)S-S橋(二硫橋)，例如每條肽鏈l、2、3、4、5或6個(gè)S-S橋，其中S-S橋可以在相同肽鏈的含硫M酸之間形成(分子內(nèi))和/或不同肽鏈的含硫M酸之間形成(分子間)。具有S-S橋的脂肪酶的其它實(shí)例是來自米曲霉Us/^^7/附)的月旨肪酶(Tsuchiya等人，1996)、來自尸e"/"7/"附cawew&W/Z的月旨肪酶(Yamaguchi等人，1991)、來自及A/w附"cw的脂肪酶(Boel等人，1988)和來自鈹褶假絲酵母(CVi"rf,Vtomg仍")的脂肪酶(Longhi等人，1992)。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)在低溫下進(jìn)行。對(duì)于本發(fā)明的目的，將低溫理解為室溫或低于室溫的溫度，即大約25'C或更少，例如25匸、24°C、23。C、22。C、21。C、20X:、19X:、18°C、17'C、16。C、15*C、14。C、13X:、12。C、11。C、10。C、9。C、8"C、7。C、6"C、5。C、4。c、3x:、2'c、ix:、o'c的溫度，或者這些值之間的溫度。根據(jù)其它實(shí)施方案，用于表達(dá)的溫度選自lx:至20。c的范圍，特別是10X:至20r的范圍，例如10。C、ll"C、12匸、13匸、14X:、15°C、16°C、17°C、18。C、19。C或20。C，并且特別是13。C至16X:的范圍，例如13C、14*C、15。C或16X:。在特定的實(shí)施方案中，用于表達(dá)的溫度是大約15匸。本發(fā)明的一個(gè)目的涉及在缺乏硫氧還蛋白還原酶和/或缺乏谷胱甘肽還原酶的大腸桿菌菌林中的表達(dá)。所述菌林的實(shí)例為Origami2((DE3)和OrigamiTMB(諾華基因公司(Novagen)，Darmstadt,德國)。不希望受到理論的限制，假設(shè)這些酶阻止了蛋白質(zhì)中的s-s橋的形成或有助于已經(jīng)形成的s-s橋的還原。一種或多種這些酶的不存在或者其酶活性的阻抑因此穩(wěn)定了包含所述s-s橋的蛋白質(zhì)的構(gòu)象。根據(jù)本發(fā)明方法的特定實(shí)施方案，功能性表達(dá)的三酰甘油脂肪酶是月旨肪酶B，即來自南極假絲酵母的CalB的基因產(chǎn)物。描述了calB基因(Uppenberg等人，1994)，并且其核苷酸或蛋白質(zhì)序列在GeneBank中在登錄號(hào)Z30645和CAA83122.1下存儲(chǔ)。除非更加精確地指明，在此CalB意思是具有該登錄號(hào)的核苷酸序列。三酰甘油脂肪酶的另一實(shí)例是來自尸5^M^/，附fl加A:w6tfms/5"的月旨肪酶B(Suen等人2004)。根據(jù)本發(fā)明方法的另一特定實(shí)施方案，編碼三酰甘油脂肪酶的序列是calB_wt(SEQIDNO:2)。calB—wt源自發(fā)明人的前一個(gè)項(xiàng)目，其中，CalB在巴斯德畢赤酵母中功能性表達(dá)，并且包含在pPICZaA/calB構(gòu)建體中(Rusnak2004)。在該項(xiàng)目中，擴(kuò)增自南極假絲酵母的基因組DNA的calB基因相對(duì)于公開的CalB序列(CAA83122.1)在M酸水平上表現(xiàn)出兩處改變(T57A，A89T;SEQIDNO:13)。這兩處偏差出現(xiàn)在兩個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增測(cè)定中，在所述測(cè)定中基因擴(kuò)增自兩個(gè)不同的基因組DNA提取物。由于該原因，它們極有可能是脂肪酶基因的天然變異。在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，所述脂肪酶顯示出與野生型CalB的公布的值相當(dāng)?shù)幕钚?，從而在前一個(gè)項(xiàng)目中，發(fā)明人用所述擴(kuò)增的基因繼續(xù)了這一工作(Rotticci-Mulder等人，2001;Rusnak2004)。根據(jù)本發(fā)明方法的另一特定實(shí)施方案，編碼三酰甘油脂肪酶的序列是calB—syn(SEQIDNO:l)。從序列優(yōu)化中獲得calB_syn。序列優(yōu)化方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以包含多種測(cè)量之一或其組合。例如，就氨基酸選擇密碼子，從而使它們對(duì)應(yīng)于在所選定的宿主中相對(duì)最頻繁發(fā)生的轉(zhuǎn)移RNA。此外，避免具有非常高(>80%)或低(<30%)的GC含量的區(qū)域或?qū)τ诒磉_(dá)(以及因此DNA的轉(zhuǎn)錄和/或mRNA的翻譯)有影響的特定的序列基序是有優(yōu)勢(shì)的。為了產(chǎn)生calB—syn，使用GeneOptimizer技術(shù)(基因阿特7>司(GeneArt)，Regensburg，德國)優(yōu)化密碼子選擇，并且10此外，如果可能避免具有非常高(>80%)或低(<30%)的GC含量的區(qū)域。此外順式作用的序列基序，例如內(nèi)部TATA框、chi位點(diǎn)、核糖體連接位點(diǎn)、ARE、INS和CRS序列元件以及重復(fù)序列和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)被避免。該基因在253個(gè)核苷酸(26.5%)上不同于calB—wt序列(圖1)。在氨基酸水平上，合成基因編碼公開的蛋白質(zhì)(CAA83122.1;SEQIDNO:12)。才艮據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)特定實(shí)施方案，編碼三酰甘油脂肪酶的序列是calB—wt或calB—syn的同源物。在本文描述的各個(gè)背景中，來自南極假絲酵母的calB，特別是calB—wt和/或calB—syn以及其同源物，尤其是編碼功能性等價(jià)物的同源物是優(yōu)選的編碼三酰甘油脂肪酶的核苦酸序列的代表。根據(jù)本發(fā)明，同源核苷*列或同源核酸或同源物意思是，當(dāng)與參照核苷酸序列或參照核酸相比，不超過40°/。的核苷酸，特別是不超過35%的核苷酸，例如不超過30%的核苷酸或不超過26%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1。/。的核苷H不同的。例如，與SEQIDNO:l同源的序列與SEQIDNO:1的不同不超過40%的核苷酸，特別是不超過35%的核苷酸，例如不超過30%的核苷酸，或不超過26%、25%、20%、15%或10%的核苷酸。同源核苷酸序列特別表示這樣的序列，例如與前述參照核苷酸序列在"嚴(yán)格條件"下雜交的那些。將這一性質(zhì)理解為多聚核普酸或寡核苷酸在嚴(yán)格條件下結(jié)合幾乎互補(bǔ)的序列的能力，其中在所述這些條件下，較少互補(bǔ)的對(duì)之間的非特異性鍵不存在。為此，所述序列應(yīng)當(dāng)有70%-100%的互補(bǔ)，優(yōu)選75%、80%、85%或卯％至100%的互補(bǔ)。能夠特異性彼此結(jié)合的互補(bǔ)序列的性質(zhì)在例如Northern印跡或Southern印跡技術(shù)中或在PCR或RT-PCR的引物結(jié)合中被使用。通常為此使用從30個(gè)>!^^的長度開始的寡核苷酸。"嚴(yán)格條件"意思是，例如在Northern印跡技術(shù)中，使用在50-70°C(優(yōu)選60-65°C)的熱洗滌溶液，例如具有0.1%SDS的0.1xSSC緩沖液(20xSSC:3MNaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)，用于洗脫非特異性雜交的cDNA探針或寡核苷酸。如上所述，之后僅高度互補(bǔ)的核酸保留彼此結(jié)合。嚴(yán)格條件的建立是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且描述在例如Ausubel等人(1989)(節(jié)6.3.1-6.3,6)中。例如通過檢查基因組或cDNA庫來鑒定同源核酸，并且任選地可以在PCR中用適當(dāng)?shù)囊飶乃鼈冎袛U(kuò)增所述同源核酸，然后例如使用適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行分離。根據(jù)本發(fā)明的三酰甘油脂肪酶(特別是才艮據(jù)本發(fā)明的來自南極假絲酵母的脂肪酶B)的同源物可以通過篩選突變體(例如縮短突變體)的組合文庫來鑒定。例如，通過核酸水平的組合誘變來產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的文庫，這是例如通過合成的寡核苷酸混合物的酶促連接來實(shí)現(xiàn)的。有許多方法可以用于從簡并的寡核苷^列產(chǎn)生潛在的同源物文庫。簡并的基因序列的化學(xué)合成可以在自動(dòng)DNA合成儀中進(jìn)行，然后可以將合成的基因連接進(jìn)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。簡并基因組的使用使得在混合物中提供所有序列成為可能，所述混合物編碼所需的潛在蛋白質(zhì)序列組。合成簡并的寡核普酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如Narang1983;Itakura等人.1984;Ike等人，1983)。根據(jù)其它實(shí)施方案，編碼三酰甘油脂肪酶并且特別是編碼根據(jù)本發(fā)明的CalB的核苷酸序列受到T7啟動(dòng)子的控制，所述啟動(dòng)子例如才艮據(jù)SEQIDNO:3的啟動(dòng)子或與其同源的序列。允許在T7啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的適當(dāng)?shù)妮d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如pET載體系統(tǒng)(諾華基因公司(Novagen))如載體pET-32a-c(+)。根據(jù)本發(fā)明，在pET誦32b(+)中制備calB—syn或calB_wt(SEQIDNO:7或SEQIDNO:8)。從這些載體中的表達(dá)特別在上述溫度下發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，不使用特定冷i秀導(dǎo)型啟動(dòng)子從pET-載體表達(dá)calB—wt或calB—syn時(shí)，通過在低溫下孵育形成了增加比例的功能性蛋白質(zhì)。根據(jù)其它實(shí)施方案，編碼三酰甘油脂肪酶并且特別是編碼根據(jù)本發(fā)明的CalB的核苷酸序列受到由冷激可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制。就本發(fā)明的目的而言，冷激意思是將啟動(dòng)子暴露制氐溫。由冷激誘導(dǎo)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子是大腸桿菌的初級(jí)冷^L^因cspA的啟動(dòng)子(SEQIDNO:4)(Goldstein等人，19卯)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知包含該啟動(dòng)子的表達(dá)載體(使得可能通過常規(guī)方法克隆所需靼基因)，例如來自塔卡拉生物有限公司(TakaraBioInc.，日本(Takara2003))的以其多種形式的栽體pCOLD。根據(jù)本發(fā)明，在pCOLDIII中制備calB—syn或calB—wt(SEQIDNO:9或SEQIDNO:10)。已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在OrigamiTM2(DE3)細(xì)胞和OrigamiTMB細(xì)胞中從這些載體表達(dá)時(shí)，形成了增加量的功能性蛋白質(zhì)。冷激啟動(dòng)子的誘導(dǎo)通過在低溫下孵育并且任選地添加表達(dá)所需的其它因子(例如在lac-操縱基因控制下的基因的情形中的IPTG)而發(fā)生。任選地通過在水上在前孵育(例如30分鐘孵育)促進(jìn)低溫的受控的建立。其它冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且描述在例如Qoronfleh等人，1992，Nakashima等人1996或Giladi等人1995中。不受到理論的限制，假設(shè)用于三酰甘油脂肪酶(特別是CalB和其功能性等價(jià)物)的增加的功能性表達(dá)的方案包括允許僅在低溫下蛋白質(zhì)的基本表達(dá)。如果表達(dá)在高于以上的溫度下發(fā)生(即使表達(dá)隨后在正常導(dǎo)致功能性蛋白質(zhì)的條件(例如低溫)下發(fā)生)，形成不正確折疊的蛋白質(zhì)，其作用為結(jié)晶核，擾亂功能性蛋白質(zhì)的形成。根據(jù)本發(fā)明執(zhí)行該方案包括在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)(所述啟動(dòng)子僅允許在低溫下顯著表達(dá)(例如在pcOLD載體中包含的啟動(dòng)子))，以;M^達(dá)任選地還受到轉(zhuǎn)錄阻抑物(例如lacl的基因產(chǎn)物，其在IPTG不存在時(shí)阻止轉(zhuǎn)錄并且在IPTG存在時(shí)允許所述轉(zhuǎn)錄)的控制。另一執(zhí)行包括使用啟動(dòng)子，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性可以受到嚴(yán)格控制并且其允許這些啟動(dòng)子僅在低溫下轉(zhuǎn)錄。包含T7-啟動(dòng)子的pET-載體與其它啟動(dòng)子或者啟動(dòng)子的組合，以及調(diào)節(jié)元件(例如阻抑物)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如C1-調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(Schofield等人，2002),PltetO-1啟動(dòng)子(Lutz和Bujard，1997)或/^"T啟動(dòng)子(Giacalone等人2006)。就所用的每種載體系統(tǒng)選擇孵育時(shí)間，使得形成最大量的功能性蛋白質(zhì)，所述孵育時(shí)間可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員就在每種情形中從給定核酸中待表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行常規(guī)測(cè)試來容易地確定。時(shí)間的通常長度是1至48小時(shí)，例如8、12、16和24小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案，與編碼三酰甘油脂肪酶并且特別是編碼CalB的核苷酸序列同時(shí)，表達(dá)一種或多種分子伴侶。分子伴倡例如選自大腸桿菌的GroES、GroEL、DnaK，DnaJ、GrpE和引發(fā)因子(TF)。表達(dá)可能以任何組合，但是特別是共表達(dá)的下述組合GroEL和GroES;或DnaK、DnaJ和GrpE;或DnaK、DnaJ、GrpE、GroES和GroEL;或者引發(fā)因子任選地與GroES和GroEL—起共表達(dá)。分子伴侶可以與來自栽體的編碼三酰甘油-脂肪酶的核苷酸序列一M達(dá)?？蛇x地，表達(dá)來自分開的載體的編碼三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列和編碼一個(gè)或多個(gè)伴侶分子的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。適當(dāng)?shù)妮d體包含在可商購的"伴倡分子質(zhì)粒組(ChaperonePlasmidSet)"中，其包括質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTfl6(塔卡拉生物醫(yī)藥公司(TakaraBiomedicals)，日本，Takara2003b)。本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及用于檢測(cè)三酰甘油脂肪酶的方法，其中i)假設(shè)有三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明前述方法之一凈A^達(dá)，ii)將表達(dá)產(chǎn)物與可被三酰甘油脂肪酶水解的底物相接觸，以及iii)確定水解活性。該方法適合用于鑒定(即篩選)新的三酰甘油脂肪酶，特別是那些具有與來自南極假絲酵母的脂肪酶B的除&活性相當(dāng)?shù)腟^活性的酶。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見的是，該方法可以類似地應(yīng)用于下述脂肪酶，所述脂肪酶在其功能性形式中需要一個(gè)或多個(gè)S-S橋，例如每條肽鏈1、2、3、4、5或6個(gè)S-S橋，并且S-S橋可以在相同肽鏈的含硫氨基酸之間形成(分子內(nèi))和/或不同肽鏈的含硫M酸之間形成(分子間)。適當(dāng)?shù)目伤獾孜锸潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且水解活性的證明也可以以常規(guī)方式進(jìn)行。例如，當(dāng)以適當(dāng)?shù)臐舛?例如1%)添加到瓊脂板上時(shí)，丁酸甘油酯導(dǎo)致其混濁，這在酶促水解過程中消失。其它適當(dāng)?shù)牡孜锸瞧渌馇懈顚?dǎo)致顏色改變的化合物，其可以是例如可光度檢測(cè)的(例如椋櫚酸對(duì)硝基苯酯)。水解活性還可以通過在pH-stat測(cè)定中酶促切割羧酸酯來確定。用NaOH滴定恒定保持由釋放的羧酸所引起的pH值的降低。與釋放的羧酸的量成比例的NaOH的消耗因此提供了酶水解活性的信息。前述檢測(cè)方法參考Rusnak，2004(章節(jié)8.4.2),其以其全文引用作為參考。由三酰甘油脂肪酶可水解的其它底物可以通過以下確定嘗試用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的三酰甘油脂肪酶(例如具有序列CAA83122.1的CalB)水解給定底物。如果水解發(fā)生，那么該底物可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法用于檢測(cè)三酰甘油脂肪酶。盡管上述檢測(cè)方法可以在常規(guī)培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)容器中進(jìn)行，在特定實(shí)施方案中設(shè)想使用微量滴定板。例如，具有假定的三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)已經(jīng)在微量滴定板中發(fā)生，例如通過在微量滴定板中培養(yǎng)原核生物并且誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，水解活性的檢測(cè)還可以在微量滴定板中發(fā)生，并且根據(jù)給定培養(yǎng)物的參數(shù)，檢測(cè)可以在不事先移除微生物下發(fā)生。例如，在微量滴定板的分別的孔中細(xì)胞密度低時(shí)，無需分別的測(cè)量被高細(xì)胞密度所虛構(gòu)的值，可以直接從培養(yǎng)基的濁度性質(zhì)的改變或者光度底物的轉(zhuǎn)化來確定水解活性。可選地，在表達(dá)了釋放到培養(yǎng)基中的具有假定三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)后，將原核細(xì)胞從培養(yǎng)基分離(例如通過離心細(xì)胞沉降以及移除上清液或者在生長在孔表面的貼壁細(xì)胞或與支持物結(jié)合的細(xì)胞的情形中，立即移除培養(yǎng)基)并且包含具有假定三酰甘油脂肪酶的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基被轉(zhuǎn)移到新的微量滴定板上用于確定水解活性。根據(jù)特定的實(shí)施方案，具有假定三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的表達(dá)在可水解底物存在時(shí)發(fā)生，所述底物例如溶解在培養(yǎng)基中的底物。根據(jù)另一實(shí)施方案，可以在例如包含可水解底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)表達(dá)具有假定三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)的原核生物。就此而論，由于其丁酸甘油酯含量而混濁的瓊脂培養(yǎng)基特別適合。水解活性的三酰甘油脂肪酶表達(dá)時(shí)，例如在通過化學(xué)物質(zhì)或溫度改變(取決于所使用的表達(dá)載體)誘導(dǎo)編碼三酰甘油脂肪酶的基因后，有丁酸甘油酯的切割并且因此混濁的瓊脂澄清。在具有充足的三酰甘油脂肪酶活性的瓊脂區(qū)域上，因此有暈輪形成，其可以是視覺檢測(cè)的或者用適當(dāng)?shù)膱D像處理系統(tǒng)(例如Quantimet500Qwin;雷卡公司(Leica，Cambridge)，英國)自動(dòng)檢測(cè)并且可以作用于鑒定產(chǎn)生了三酰甘油脂肪酶活性的細(xì)菌菌落。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，方法的其它改變是顯而易見的，例如將微量滴定板的充有丁酸甘油酯瓊脂的孔用細(xì)菌懸液接種(所述細(xì)菌懸液被稀釋為允許在每個(gè)孔中發(fā)育單個(gè)細(xì)菌菌落)，然后進(jìn)行-見覺或自動(dòng)成像分析。根據(jù)另一實(shí)施方案，將具有假定三酰甘油脂肪酶活性的表達(dá)的蛋白質(zhì)從表達(dá)原核細(xì)胞(特別是大腸桿菌)中分離出來，然后在無細(xì)胞狀態(tài)中與可水解底物相接觸。適當(dāng)?shù)姆蛛x方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如通過離心沉降細(xì)胞或者通過過濾分離。這一實(shí)施方案具有以下優(yōu)勢(shì)，即水解活性的隨后檢測(cè)不受到原核細(xì)胞存在的影響。才艮據(jù)特定的實(shí)施方案，所述檢測(cè)通過確定可水解底物的減少或水解產(chǎn)物的增加來光度測(cè)定進(jìn)行。適當(dāng)?shù)牡孜锸潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如對(duì)硝基苯基酯例如棕櫚酸對(duì)硝基苯酯或乙酸對(duì)硝基苯酯。光度測(cè)量的參數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所使用的底物和溶液來容易地改變(例如，當(dāng)使用棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)時(shí)，建議測(cè)量410nm處的消光的增加)。在特定的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法用于就三酰甘油脂肪酶活性篩選誘變的蛋白質(zhì)或者由誘變的核酸編碼的蛋白質(zhì)。這些可以是通過誘變要凈皮賦予三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)(例如通過向蛋白質(zhì)(如果有也是很少的三酰甘油脂肪酶活性)中摻入序列基序，所述序列基序被認(rèn)為對(duì)于該酶促活性是重要的)，或者具有已知的三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)(其被通過引入一處或多處突變來修飾)。誘變(導(dǎo)致突變或突變的核苷酸序列或突變的蛋白質(zhì))意思是在核苷酸序列方面，添加、移除或替換至少一個(gè)核苷酸。在蛋白質(zhì)方面其意思是添加、移除或替換至少一個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明誘變的蛋白質(zhì)特別是其編碼核苷酸序列包含編碼來自南極假絲酵母的脂肪酶B(CalB)的核苷酸序列的蛋白質(zhì)，或者其編碼核普酸序列相對(duì)于編碼來自南極假絲酵母脂肪酶B(CalB)的核苷酸序列而言具有至少一處突變的蛋白質(zhì)，或者其編碼核苷酸序列與來自南極假絲酵母脂肪酶B(CalB)的編碼核苷酸序列同源的蛋白質(zhì)，或者與來自南極假絲酵母脂肪酶B(CalB)功能性等價(jià)的蛋白質(zhì)。對(duì)于所有這些蛋白質(zhì)，編碼分別的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的誘變不必須導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白質(zhì)的M^列的改變。如已經(jīng)描述的，優(yōu)化基因的核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如在提供用于表達(dá)的宿主生物中優(yōu)選的密碼子選擇方面，避免mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)或特定的序列基序(例如來自基因阿特公司(GeneArt，Regensburg，德國)的GeneOptimizer技術(shù))。這些優(yōu)化可以用于在轉(zhuǎn)錄水平和在翻譯水平上都改良表達(dá)，并且同時(shí)，使用允許用于某些氨基酸的一些堿基三聯(lián)體的簡并密碼子，用于翻譯未改變的蛋白質(zhì)。在該情形中，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法被用作監(jiān)控功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)。另一方面，通過編碼核苷酸序列的誘變，可以產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與未經(jīng)誘變的初始序列所表達(dá)的蛋白質(zhì)相比是不同的。在該情形中，使用根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以確認(rèn)由誘變的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，與由未經(jīng)誘變的初始序列編碼的蛋白質(zhì)相比，是否具有未改變的水解活性或經(jīng)纟務(wù)飾的水解活性，例如在酶促活性的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)方面被減少(或缺乏)、增加或改變。作為所述參數(shù)，可以考慮例如底物特異性、對(duì)映選擇性或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換數(shù)以及其對(duì)例如溫度、pH、離子濃度和/或可能的抑制劑或激活物的存在的依賴性，所述參數(shù)特別可以是由條件選擇所測(cè)試的，其中根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法步驟ii)，將具有假定的三酰甘油脂肪酶活性的誘變的蛋白質(zhì)與可水解底物相接觸。通過靼向改變核苷酸序列(例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR))以及通過非定向改變(例如通過化學(xué)誘變)的誘變是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且描述在例如Roufa1996或Kirchhoff和Desrosiers1996中。根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)方法的上述用途特別適合于篩選基因文庫。例如，可以通過在核酸水平的組合誘變(例如通過合成寡核苷酸混合物的i^l連接)來產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體的文庫。有大量方法可以用于從簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在的同源物的文庫。簡并的基因序列的化學(xué)合成可以在自動(dòng)DNA合17成儀中進(jìn)行，隨后該合成的基因可以被連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。使用簡并的基因的組使得在混合物中提供所有序列成為可能，所述混合物編碼所需的潛在蛋白質(zhì)序列組。合成簡并的寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如Narang1983;Itakura等人，1984;Itakura等人1984;Ike等人1983)。根據(jù)本發(fā)明的用途特別適合于樣品的高通量篩選，例如在短時(shí)間內(nèi)接連篩選大量的樣品或者同時(shí)篩選許多平行的樣品或其組合。因此，特別地，其是用于篩選上文所述的基因文庫的適當(dāng)?shù)姆椒ā＠?，可以就展示出三酰甘油脂肪酶的特別高的功能性表達(dá)的克隆或者表達(dá)具有改變的性質(zhì)的三酰甘油脂肪酶的那些克隆進(jìn)行篩選。關(guān)于這一點(diǎn)，特別是使用微量滴定板對(duì)于表達(dá)一種或多種研究的蛋白質(zhì)和/或確定它/它們的水解活性是有利的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以通過自動(dòng)控制實(shí)現(xiàn)高樣品通量，例如用移液自動(dòng)裝置，其將包含具有假定的水解酶活性的蛋白質(zhì)的上清液從用于表達(dá)這些蛋白質(zhì)的微量滴定板的孔中轉(zhuǎn)移至用于檢測(cè)水解活性的孔中，或者將檢測(cè)試劑移液到包含所述上清液的孔中。此外，使用微量滴定板的光度評(píng)估可以特別地用平板讀數(shù)器來進(jìn)行，所述平板讀數(shù)器自動(dòng)測(cè)量包含在單個(gè)孔中的溶液的消光。當(dāng)使用瓊脂平板時(shí)，通過水解活性產(chǎn)生的清晰的暈輪或者以其它方式可視覺檢測(cè)的暈輪(如上述已經(jīng)描述的)，可以例如使用適當(dāng)?shù)膱D像處理系統(tǒng)(例如Quantimet500Qwin;雷卡公司(Leica，Cambridge)，英國)來檢測(cè)。本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及產(chǎn)生三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的方法，其中通過上述檢測(cè)方法之一檢測(cè)具有三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1,1.3)活性的表達(dá)的蛋白質(zhì)，將表達(dá)該蛋白質(zhì)的菌林培養(yǎng)在表達(dá)月旨肪酶的條件下，并且任選地，分離所表達(dá)的脂肪酶?？梢愿鶕?jù)需要通過常規(guī)測(cè)試被改變用于特定蛋白質(zhì)的適當(dāng)?shù)姆蛛x方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且例如如下所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，可以將方法類似地應(yīng)用于脂肪酶，所述脂肪酶在其功能性形式中需要一個(gè)或多個(gè)S-S橋，例如每條肽鏈l、2、3、4、5或6個(gè)S-S橋，并且S-S橋可以在相同肽鏈的含硫M酸之間形成(分子內(nèi))和/或不同肽鏈的含硫M酸之間形成(分子間)。本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及通過上述產(chǎn)生方法獲得的三酰甘油脂肪酶，例如在原核宿主細(xì)胞環(huán)境中存在的三酰甘油脂肪酶或者部分、大部分或完全純化的三酰甘油脂肪酶。特別適合的三酰甘油脂肪酶是來自南極假絲酵母的脂肪酶B(其在至少一個(gè)氨基酸上不同于以登錄號(hào)CAA83122.1存儲(chǔ)在GenBank的序列)，以及與以GenBank登錄號(hào)CAA83122.1存儲(chǔ)的序列同源的蛋白質(zhì)，其代表功能性等價(jià)物。"功能性等價(jià)物"意思是，特別地根據(jù)本發(fā)明，這樣的突變體，其在至少一處序列位置上不同于作為基礎(chǔ)的三酰甘油脂肪酶(特別地任何脂肪酶B)的M酸序列，但是仍然具有一種前述生物學(xué)活性，例如恒定的、減少的或增加的水解活性，或者改變的底物特異性、對(duì)應(yīng)選擇性或轉(zhuǎn)換數(shù)，以及其對(duì)于例如溫度、pH、離子濃度、或可能的抑制劑或激活物的存在的依賴性。因此，"功能性等價(jià)物"包含通過一個(gè)或多個(gè)M酸添加、取代、缺失和/或倒位獲得的突變體，其中所述改變發(fā)生在任何序列位置中，條件是它們導(dǎo)致具有根據(jù)本發(fā)明性質(zhì)的模式的突變體。如果突變體和未改變的多肽之間的反應(yīng)模式在質(zhì)上是一致的，即例如相同的底物以不同的速率被轉(zhuǎn)化，則功能等價(jià)性特別也是存在的。描述的多肽的"前體"和多肽的"功能性衍生物，，和"鹽"也是上述含義中的"功能性等價(jià)物"。"前體"是有或沒有所需生物學(xué)活性的多肽的天然或合成的初步階段。在本文上下文中表述"鹽，，意思是本發(fā)明蛋白質(zhì)分子的^基團(tuán)的鹽和氨基基團(tuán)的酸加成的鹽?；鶊F(tuán)的鹽可以通過熟知的方法產(chǎn)生并且包含無機(jī)鹽，例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽和鋅鹽，以及具有有機(jī)堿的鹽，例如胺，例如三羥乙基胺、精氨酸、賴氨酸、哌啶等。酸加成的鹽例如具有礦物質(zhì)酸(例如鹽酸或硫酸)的鹽和具有有機(jī)酸(例如乙酸和草酸)的鹽也是本發(fā)明的目標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明的酶的"功能性衍生物"也可以通過已知的技術(shù)在功能性氛基酸側(cè)基或在其N-或C-末端上產(chǎn)生。所述衍生物包含例如羧酸基團(tuán)的脂族酯、羧酸基團(tuán)的酰胺(通過與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)獲得的)；游離氨基的N-酰基衍生物(通過與酰基基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)生的)；或游離羥基基團(tuán)的O-?；苌?通過與酰基基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)生的)。"功能性等價(jià)物"天然還包含可以從其它生物獲得的多肽以及天然存在的變體。例如，可以通過序列比較建立同源序列區(qū)域，并且可以在本發(fā)明的具體說明書的基礎(chǔ)上確定等價(jià)酶。"功能性等價(jià)物，，還包含根據(jù)本發(fā)明多肽的片段，特別是單個(gè)結(jié)構(gòu)域或序列基序，它們例如具有所需的生物學(xué)活性。此外，"功能性等價(jià)物"是具有以功能性N-或C-末端連接的天然消旋酶序列或來自其的功能性等價(jià)物之一以及至少一種其它功能性不同的異源序列(即無融合蛋白部分的顯著相互功能性損害)的融合蛋白。此類異源序列的非限制性實(shí)例為例如信號(hào)肽或酶。本發(fā)明包括的"功能性等價(jià)物"是與天然蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)。它們與天然M酸序列之一具有至少60。/。、優(yōu)選至少75%、特別是至少85%、例如至少卯％、95%或99%的同源性，這是根據(jù)Pearson和Lipman(Pearson和Lipman1988)算法計(jì)算的。根據(jù)本發(fā)明的同源多肽百分比同源性意思特別是基于本發(fā)明酶或酶亞基的氨基酸序列之一的總長度的氨基酸殘基的百分比同一性。本發(fā)明特別包含根據(jù)上述定義的功能性等價(jià)物，其額外與初始序列具有至少60%、優(yōu)選至少75%、特別是至少85%、例如至少90%、95%或99%的同源性。在可能的蛋白質(zhì)糖基化的情形中，根據(jù)本發(fā)明的"功能性等價(jià)物"包含去糖基化形式或糖基化形式以及通過改變糖基化模式獲得的經(jīng)修飾形式的上述指定類型的蛋白質(zhì)。可以使用本發(fā)明的方法確定功能性等價(jià)物。例如，可以通過本發(fā)明的表達(dá)方法表達(dá)并且通過本發(fā)明的檢測(cè)方法研究待被確定其與三酰甘油脂肪酶并且特別是CalB的功能等價(jià)性的蛋白質(zhì)。具有水解活性，特別是與三酰甘油脂肪酶或CalB相比改變的水解活性的表達(dá)的蛋白質(zhì)是功能性等價(jià)物。關(guān)于這一點(diǎn)，可以通過已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵表達(dá)本發(fā)明三酰甘油脂肪酶的原核生物。隨后，如果多肽未分泌到培養(yǎng)基中，將細(xì)胞>5皮壞并且通過已知的蛋白質(zhì)分離方法將產(chǎn)物從裂解物中獲得。任選地可以通過高頻超聲、通過高壓(例如在弗氏壓碎器中)，通過滲透溶胞(osmolysis)、通過去污劑、分解酶(lyticenzyme)或有機(jī)溶劑作用、使用勻漿器或通過組合幾種所列方法來破壞細(xì)胞。通過已知色鐠方法以及通過其它常規(guī)方法可以純化多肽，所述色i普方法例如分子篩色諳(凝膠過濾)，例如Q-sepharose色語、離子交換色語、親和色鐠和疏水色謙，所述其它常規(guī)方法例如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和天然凝膠電泳。適當(dāng)?shù)姆椒枋鲈诶鏑ooper(1980)或Scopes(1981)中。本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及編碼三酰甘油脂肪酶的核酸，特別是編碼來自南極假絲酵母的脂肪酶B的核酸，其包含根據(jù)SEQIDNO:1的編碼核苷酸序列，或者包含與SEQIDNO:2有至少一個(gè)核苷酸不同的核苷酸序列，或者包含與其同源的核苷酸序列。前述核苷酸序列編碼例如CalB的功能性等價(jià)物。根據(jù)特定的實(shí)施方案，核酸包含根據(jù)SEQIDNO:1的編碼核苷酸序列或與其同源的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及包含編碼三酰甘油脂肪酶的核酸的重組載體，所述核酸與至少一個(gè)調(diào)節(jié)核酸序列有效連接。根據(jù)另一特定的實(shí)施方案，編碼三酰甘油脂肪酶的核酸序列包含根據(jù)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核苷酸序列。"有效連接"意思是啟動(dòng)子、編碼序列、終止子以及任選地其它調(diào)節(jié)元件的順序排列，其以這樣的方式，即調(diào)節(jié)元件中的每一個(gè)可以在所定義的編碼序列表達(dá)中實(shí)現(xiàn)其功能。可有效連接的序列的實(shí)例是耙序列和增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)等。其它調(diào)節(jié)元件包含可選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)等。適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列描述在例如Goedde11990中。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)例如特別地，在與pGR07共表達(dá)時(shí)，增加了calB—syn(SEQIDNO:l)和calB—wt(SEQIDNO:2)的功能性表達(dá)。除了質(zhì)粒和噬菌體外，"載體，，還表示本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有其它載體，因此例如病毒(如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒)、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、勦粒、以及線性或環(huán)形DNA。這些載體可以在宿主生物中自主復(fù)制，或者可以通過染色體復(fù)制。這些載體代表本發(fā)明的其它實(shí)施方案。適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是例如大腸桿菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC19、pKC30，pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pINIII113-Bl、lgtll或pBdCI;鏈霉菌屬(S^印to/fy;c^)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361;芽孢桿菌屬(5"c/〃"s)中的pUB110、pC194或pBD214;棒桿菌屬(CWj"ekcten"附)中的pSA77或pAJ667。前述質(zhì)粒代表可能質(zhì)粒的少量選擇。其它質(zhì)粒^f艮顯然是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以例如在書CloningVectors(publ.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444904018)中找到。適當(dāng)?shù)妮d體是允許核苷酸序列功能性表達(dá)的那些，所述核苷酸序列編碼具有三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)隨后可以通過上述檢測(cè)方法確定。特定的實(shí)施方案包含載體pET32b(+)和pET載體家族(諾華基因公司(Novagen)1999)的其它代表(特別是pET-32a-c、pET-41a-c和pET-42a-c)，以及pCOLDIII和pCOLD載體家族的其它代表(例如pCOLDI、pCOLDII、pCOLDIV、pCOLDTF，例如從塔卡拉歐洲S.A.S生物公司(TakaraBioEuropeS爭(zhēng)A.S)，Ge騰villiers，法國獲得)。根據(jù)非常特定的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明作為包含編碼三酰甘油脂肪酶的核酸的重組栽體，制備pET-32b(+)/calB—syn(SEQIDNO:7，pET畫32b(+)中calB—syn)、pET-32b(+)/calB一wt(SEQIDNO:8，pET-32b(+)中ealB一wt)、pCOLDIII/calB一syn(SEQIDNO:9，pCOLDIII中calB—syn)以及pCOLDIII/calBwt(SEQIDNO:IO，pCOLDIII中calB—wt)。本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及包含此類編碼三酰甘油脂肪酶的載體或核酸的重組宿主細(xì)胞，其包含才艮據(jù)SEQIDNO:1的編碼核苷酸序列或與其同源的核苷酸序列。重組細(xì)胞特別可以是原核細(xì)胞，特別是大腸桿菌細(xì)胞。原核細(xì)胞的其它實(shí)例是革蘭氏陰性細(xì)菌中，腸桿菌科(五"^^6a"en'fl"fle)的代表例如沙門氏菌屬(S"/附o"e〃a)、志賀氏菌屬(S/^ge//")、賽氏桿菌屬(SwmftVi)、變形桿菌屬(/Vofe船)、克雷伯氏菌屬(ZT/e^/e//")或腸桿菌屬(￡>ife^i"^)、假單胞菌屬(jR^wflfo附omw);革蘭氏陽性細(xì)菌中例如芽孢桿菌屬的代表例如枯草芽孢桿菌(及s"^/fc)和地衣芽孢桿菌(_6.//(^附/<鼎/51)。本發(fā)明的其它目標(biāo)涉及根據(jù)本發(fā)明的編碼核酸序列、才艮據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于實(shí)行表達(dá)功能性三酰甘油脂肪酶的本發(fā)明的方法、用于檢測(cè)功能性三酰甘油脂肪酶的本發(fā)明的方法或用于產(chǎn)生功能性三酰甘油脂肪酶的本發(fā)明的方法的用途。發(fā)現(xiàn)當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的載體用于本發(fā)明的表達(dá)方法中時(shí)(特別是在低孵育溫度下)，calB_wt和calB—syn令人驚訝地在pET-32b(+)(SEQIDNO:8或SEQIDNO:7)或在pCOLDIII(SEQIDNO:10或SEQIDNO:9)中以增加的程度功能性表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)與pG-KJE8共表達(dá)時(shí)，特別是與pGR07、pG-Tf2或pTfl6共表達(dá)時(shí)，calB—syn(SEQIDNO:l)和calB—wt(SEQIDNO:2)功能性表達(dá)至特別高的程度。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見，用于表達(dá)功能性三酰甘油脂肪酶的本發(fā)明的方法、用于其檢測(cè)的方法和產(chǎn)生其的方法也可類似地應(yīng)用于除三酰甘油脂肪酶外的其它酶。例如這些方法可以凈皮改變以適用于EC類3.1(酯水解酶)的酶，或通常適用于EC類3(水解酶)的那些擴(kuò)展至可以使用這些方法中公開的一般原理表達(dá)、檢測(cè)或產(chǎn)生的所有酶，特別是一個(gè)或多個(gè)S-S橋(例如l、2、3、4、5或6個(gè)S-S橋)的形成對(duì)于其功能性是必需的那些酶，其中S-S橋可以在相同肽鏈的含硫氨基酸之間形成(分子內(nèi))和/或不同肽鏈的含硫氨基酸之間形成(分子間))。ac.uk/iubmb/enzvme/)。根據(jù)本發(fā)明的方法因此可以實(shí)施例I.一般信息化學(xué)物除非另外說明，所有化學(xué)物從弗拉卡公司(Fluka(Buchs,瑞士))、西格瑪-阿爾德里克公司((Taufkirchen，德國))和羅斯有P艮公司(RothGmbH(Karlsruhe,德國))獲得。菌林和質(zhì)粒大腸桿菌DH5a獲得自克隆泰克公司(Clontech)(Heidelberg,德國)。大腸桿菌OrigamiTM2(DE3)、OrigamiB和質(zhì)粒pET-32b(+)獲得自諾華基因公司(Novagen)(Darmstadt,德國)。質(zhì)粒pUC18獲得自MBI菲門特公司(MBIFermentas)(St.Leon-Rot，德國)，pColdlll和包含質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7、pKJe7、pG-Tf2和pTfl6的分子伴倡-質(zhì)粒組獲得自塔卡拉公司(Takara)(Otsu，日本)。包含密碼子優(yōu)化的calB基因的構(gòu)建體pPCR/CalB由GENEART公司(Regensburg，德國)合成。構(gòu)建體pPICZaA/calB以前描述過(Rusnak2004)。ca/必變體的克隆使用引物wt_pUC18—fw和wt—pUC18_rev(表1)，從模板構(gòu)建體pPICZaA/calB擴(kuò)增calB—wt，然后，將其克隆進(jìn)載體pUC18，獲得構(gòu)建體pUC18/calB一wt。為了亞克隆進(jìn)pET曙32b(+)，使用引物wt—pET誦32b(+)—fw和wt_pET32b(+)_rev(表1，見下)擴(kuò)增脂肪酶基因，然后通過EcoRl和Notl限制性位點(diǎn)克隆到載體中(pET-32b(+)/calB—wt)。為了亞克隆到pColdlll中，使用引物wt__pColdlll—fw和wt—pColdlll—rev(表l)擴(kuò)增CalB，然后4吏用標(biāo)準(zhǔn)方法克隆到載體中(pColdlll/CalB—wt)。4吏用引物syn—pUC18/pET陽32b(+)—fw和syn_pUC18—rev、syn—pUC18/pET-32b(+)_fw和syn—pET-32b(+)_rev或syn—pColdlllfw和syn-pColdlll—rev(表l)從pPCR/calB擴(kuò)增CalB—syn，然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法克隆到質(zhì)粒pUC18/calB—syn、pET-32b(+)/calB—syn和pColdlll/calB—syn中，獲得構(gòu)建體pUC18/calB—syn、pET-32b(+)/calB_syn和pColdlII/calB一syn。下列表l顯示了用于亞克隆calB變體的引物。限制性位點(diǎn)以下劃線顯示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>脂肪酶表達(dá)和分子伴侶的共表達(dá)將表達(dá)實(shí)驗(yàn)重復(fù)4-6次并且將活性表示為平均值。pUC18表達(dá)將OrigamiTMB和DH5a細(xì)胞用pUC18構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。將細(xì)胞在100mlLB培養(yǎng)基(Luria1960)中，37°C、180rev/分鐘生長到600nm處0.6的光密度，所述培養(yǎng)基包含100iiig/ml氨芐青霉素(LBamp)。然后通過添加IPTG(終濃度lmM)誘導(dǎo)脂肪酶表達(dá)。將細(xì)胞在30'C和180rev/分鐘生長額外4小時(shí)，并且通過在4'C4000g離心30分鐘來收獲。pET畫32b(+)-表達(dá)將OrigamiTM2(DE3)細(xì)胞用pET32b(+)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。在100mlLBamp中37。C和180rev/分鐘將細(xì)胞生長至600nm處0.6的光密度，并且按前述處理?？蛇x地，在誘導(dǎo)前將細(xì)胞在水上冷卻并且在15X:進(jìn)行24小時(shí)表達(dá)。pColdIII-表達(dá)將OrigamiB細(xì)胞用pColdIII構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。在100mlLBamp中37'C和180rev/分鐘將細(xì)胞生長至600nm處0.4-0.6的光密度。然后將培養(yǎng)物在冰上冷卻30分鐘并且通過添加IPTG(終濃度lmM)誘導(dǎo)脂肪酶表達(dá)。將細(xì)胞在15匸和180rev/分鐘生長另外24小時(shí)，并且通過在4X:4000g離心30分鐘收獲所述細(xì)胞。分子伴侶質(zhì)粒和pColdIII構(gòu)建體的共表達(dá)將OrigamiTMB細(xì)胞用分子伴侶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將細(xì)胞在包含34照/ml氯霉素的100mlLB中在37X:生長，并且通過常規(guī)方法產(chǎn)生感受態(tài)細(xì)胞。將重組細(xì)胞用pColdlII構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并且在LB③+amp上選擇。為了表達(dá)，將細(xì)胞在LBcm+amp中，37L和180rev/分鐘生長至600nm處的0.4-0.6的光密度，所述LBcm+amp(在pGro7、pKJE7和pTfl6的情形中)包含1mg/ml的L-阿拉伯糖和(在pG-Tf2的情形中)5ng/ml的四環(huán)素或(在pG-KJE8的情形中)包含濃度為如上所述的L-阿拉伯糖和四環(huán)素。將培養(yǎng)物在冰上冷卻30分鐘。然后通過添加IPTG(終濃度lmM)誘導(dǎo)脂肪酶表達(dá)。將細(xì)胞在15。C和180rev/分鐘生長另外24小時(shí)，并且在4'C在4000g離心30分鐘進(jìn)行收獲。丁酸甘油酯-瓊脂平板測(cè)定將細(xì)胞在LB-瓊脂板上培養(yǎng)，所述LB-瓊脂板在pGro7、pKJE7或pTfl6的共表達(dá)中包含1。/。乳化的丁酸甘油酯和相應(yīng)的抗生素以及l(fā)mg/mlL-阿拉伯糖，在pG-TO的共表達(dá)中包含5ng/ml的四環(huán)素，或者在pG-KJE8的共表達(dá)中包含L-阿拉伯糖和四環(huán)素。在37。C生長細(xì)胞24小時(shí)后，將平板用包含lmMIPTG的軟瓊脂層(水中0.6%瓊脂)覆蓋，在30匸、15°C或室溫下孵育用于表達(dá)。功能性脂肪酶的表達(dá)由菌落周圍清晰的暈輪形成所指示。脂肪酶活性測(cè)定、SDS-PAGE和光密度分析在50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中通過超聲處理三次每次30s的時(shí)期來破壞細(xì)胞，通過離心移除細(xì)胞碎片。使用pHStat裝置(美瑟姆公司(Metrohm)，F(xiàn)ilderstadt，德國)就活性測(cè)試細(xì)胞裂解物。通過用10mMNaOH滴定監(jiān)控底物的水解(5%丁酸甘油酯，在具有2%阿拉伯樹膠的水中被乳化)。通過Bradford測(cè)定(Bradford1976)測(cè)量細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)含量。將一個(gè)脂肪酶活性單位定義為每分鐘lpmol的脂肪酸的釋放。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Laemmli1970),使用50照澄清的細(xì)胞裂解物(對(duì)應(yīng)于0.2-0.4ml的細(xì)胞培養(yǎng)物)或來自0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)物的不可溶細(xì)胞碎片，通過SDS-PAGE研究不可溶和可溶的級(jí)分。將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。相對(duì)于總細(xì)胞蛋白質(zhì)的可溶性CalB的百分比通過光密度測(cè)定法，使用"ScionImage"程序(弗雷德里克公司(Frederick),Maryland,USA)來確定。高通量表達(dá)和活性測(cè)定在包含150^1LB，+amp加分子伴侶誘導(dǎo)物(見上)的96孔微量滴定板(格林耐/>司(Greiner)，Niirtingen，德國)中在37*€和400rev/分鐘將pColdIII構(gòu)建體和具有分子伴倡質(zhì)粒的OrigamiTMB細(xì)胞生長至0.4-0.6的光密度。將細(xì)胞在冰上冷卻30分鐘，通過將IPTG添加至終濃度lmM誘導(dǎo)脂肪酶表達(dá)。在15"C，200rev/分鐘搖動(dòng)下表達(dá)24小時(shí)后，通過離心收獲細(xì)胞，并且通過添加50inl裂解緩沖液(50mM磷酸鈉pH7.5，1mg/ml溶菌酶，l|nl/DNAse)將細(xì)胞裂解。將裂解物在37'C搖動(dòng)(300rev/分鐘)孵育，并且在冰上冷卻30分鐘。在-80。C孵育1小時(shí)后，將細(xì)胞在室溫(RT)融化，并且通過在4"C4000rev/分鐘離心30分鐘來移除細(xì)胞碎片。為了檢測(cè)脂肪酶活性，將20h1澄清的細(xì)胞裂解物添加到180nl測(cè)定溶液(162pl溶液B(1gTritonX-100+200ml0.1MTris曙HClpH7.5中的0.2g阿拉伯樹膠)+18pl溶液A(20ml正丙醇中的60mgpNPP))。對(duì)硝基酚酯(p-nitrophenolate)的形成在5分鐘后通過測(cè)量410nm處的消光來測(cè)量(SpectraMax340PC，分子^殳備7>司(MolecularDevicesCorp.),Sunnyvale,CA，USA)?？蛇x地，通過pHStat測(cè)定(如上所述)定量脂肪酶活性。II.應(yīng)用實(shí)例1.從南極假絲酵母克隆calB將沒有編碼N-末端前肽原序列的核苷酸序列的calB—wt基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pUC18、pET-32b(+)或pColdIII(表2)中。包含來自南極假絲酵母的calB基因的pPICZaA/calB構(gòu)建體(Rusnak2004)作用為模板用于擴(kuò)增脂肪酶基因。使用GeneOptimizerTM技術(shù)優(yōu)化calB基因。除了優(yōu)化密碼子偏好外，如果可能，避免具有非常高(>80%)或低(<30%)的GC含量的區(qū)域。此外順式作用的序列基序，例如內(nèi)部TATA框、Chi位點(diǎn)、核糖體連接位點(diǎn)、ARE、INS和CRS序列元件以及重復(fù)序列和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)被避免。該優(yōu)化的基因(calB—syn)在253個(gè)核苷酸(26.5%)上不同于calB_wt序列，有效的改變顯示在圖1中。在M酸水平上，合成基因編碼公開的蛋白質(zhì)(CAA83122.1)。然后，將合成的基因亞克隆到表2中所述的表達(dá)載體中。表2質(zhì)粒目的基因Pro誘導(dǎo)物Ori抗性標(biāo)記參考pPICZocA/calBcalB一wtAOX1甲醇pUCZeozinTM(英杰生命科學(xué)公司(Invitrogen)2002)pPCR/calBcalB一syn//ColEl氨芐青霉素根納特公司(Geneart)(Regensburg，德國)pUC18/calBcalB一wt/calB一synlacIPTGpBR322氨芐青霉素MBI菲門特公司(MBIFermentas)28(St.Leon-Rot,德國)pCol犯I/calBcalB一wt/calB—syncspA冷激+IPTGColEl氨芐青霉素(塔卡拉公司(Takara)2003)pET32-b(+)/calBTrx-calB—wt/Trx-calB一synT7IPTGPBR322氨芐青霉素(諾華基因公司(Novagen)1998)pGro7groES-groELamBL-阿拉伯糖pACYC氯霉素(塔卡拉公司(Takara)2003)pG-Tf2groES-groEL-tigPztl四環(huán)素pACYC氯霉素(塔卡拉公司(Takara)2003)pTfl6araBL-阿拉伯糖pACYC氯霉素(塔卡拉公司(Takara)2003)pKJE7dnaK-dnaJ-grpEL-阿拉伯糖pACYC氣審素(塔卡拉公司(Takara)2003)pG-KJE8dnaK-dnaJ-grpEGroES-groELaraBPztlL-阿拉伯糖四環(huán)素pACYC孰審素(塔卡拉公司(Takara)2003)菌抹基因型參考DH5asupE44AlacU169(①801acZAM15)hsdR17recAlendAlgyrA96thilrelAl克隆泰克公司(Clontech)(Heidelberg,德國)OrigamiTMBAara-leu7697AlacX74AphoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsLF，[lac+(lacIq)pro]gor522::Tn10(TcR)trxB::kan(諾華基因公司(Novagen)2004)Origami2(DE3)A(ara-leu)7697AlacX74AphoApvullphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsLF'[lac+laclqproj(DE3)gor522::Tn10trxB(StrR，TetR)(諾華基因公司(Novagen)2004)表2:所使用的質(zhì)粒和菌林。Pro:啟動(dòng)子，Ori:復(fù)制起點(diǎn)2.三個(gè)不同載體系統(tǒng)中的脂肪酶表達(dá)為了表達(dá)編碼calB的載體，使用菌林大腸桿菌OrigamiTMB和OrigamiTM2(DE3)，其特征在于它們的硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原i^:乏。用pUC18/calB_wt轉(zhuǎn)化的OrigamiTMB細(xì)胞在丁酸甘油酯-瓊脂板上顯示出暈輪形成，而對(duì)于相當(dāng)?shù)木諨H5a沒有顯示此(數(shù)據(jù)未顯示)。但是，CalB活性在用pUC18/calB—wt或pUC18/calB—syn轉(zhuǎn)化的OrigamiTMB細(xì)胞中非常低，并且對(duì)于兩個(gè)構(gòu)建體來說，對(duì)應(yīng)于每克總可溶性蛋白質(zhì)僅約2U丁酸甘油酯的水解(圖4)。1U(單位)被定義為每分鐘lnmol底物的轉(zhuǎn)換。在SDS-PAGE分析中，在可溶性級(jí)分中沒有檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于CalB(33kD)的量的蛋白質(zhì)條帶(數(shù)據(jù)未顯示)，而不溶性級(jí)分的CalB含量是10-12%(表3)。表3不溶性級(jí)分的可溶性級(jí)分的總細(xì)胞蛋白質(zhì)的總細(xì)胞蛋白質(zhì)中CalB含量[%CalB含量[%]CalB含量[%可溶性CalB的含_量[%<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表3:來自多個(gè)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞提取物中的CalB含量的光密度分析。用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠使用ScionImage程序評(píng)估。n.d.:未檢測(cè)到。為了增加活性酶的產(chǎn)量，將基因calB一wt和calB_syn使用載體pET-32b(+)與硫氧還蛋白-標(biāo)簽(Trx*TAGTM)融合，并且在大腸桿菌OrigamiTM2(DE3)中表達(dá)。在室溫下孵育時(shí)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞顯示出清楚的暈輪形成，而在37'C下培養(yǎng)時(shí)沒有產(chǎn)生任何可檢測(cè)的SI^活性。在301C搖瓶培養(yǎng)物中的Trx-CalB的表達(dá)導(dǎo)致在不可溶級(jí)分中酶量的顯著增加(18-19%，表3)，但是沒有產(chǎn)生溶解度的增加以及因此CalB活性的增加，在15。C表達(dá)時(shí)產(chǎn)生高達(dá)17U/mg可溶性蛋白質(zhì)(用wt-基因(calB_wt))和8U/mg(用合成基因(calB—syn))(圖4)。此外，在此系統(tǒng)中，僅在低培養(yǎng)溫度下觀察到丁酸甘油酯瓊脂平板上的暈輪形成?？墒?，即使在15'C表達(dá)時(shí)，使用SDS-PAGE，從pET-32b(+)(24%和26%)和從pColdIII(42%和38%)表達(dá)時(shí)仍檢測(cè)到大量不可溶蛋白質(zhì)(圖2，表3)。3.用共表達(dá)分子伴侶的脂肪酶表達(dá)根據(jù)應(yīng)用2的實(shí)例將pColdIII構(gòu)建體與一些分子伴侶組合共表達(dá)，所述分子伴侶是塔卡拉分子伴侶質(zhì)粒組(TaKaRaChaperonePlasmidSet)提供的(見下表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表4:來自塔卡拉(TaKaRa)的分子伴侶質(zhì)粒組的組成在15。C的孵育溫度下，所有具有CalB和分子伴侶表達(dá)質(zhì)粒的重組OrigamiB細(xì)胞在丁酸甘油酯-瓊脂平板上顯示出清楚的暈輪形成，以及搖瓶M^莫的CalB表達(dá)(圖3)，而可溶性脂肪酶的量則顯著不同(圖4)。在與pGro7—^^達(dá)時(shí)，CalB—wt最有效地表達(dá)(61U/mg)(圖4)。還通過與pG-TO(33U/mg)、pTfl6(24U/mg)—^^達(dá)增加了功能性酶的表達(dá)，并且通過與pG-KJE8(18U/mg)—起表達(dá)以較小程度增加了功能性酶的表達(dá)。與pKJE7—起共表達(dá)對(duì)于CalB的表達(dá)沒有顯著影響?；钚詼y(cè)定的結(jié)果通過光密度測(cè)定法來確定，在與pGro7共表達(dá)中發(fā)現(xiàn)了最大量的可溶性CalB,隨其后的是與pG-TO和pTfl6共表達(dá)時(shí)(表3)。用合成的calB基因獲得類似的結(jié)果，因此顯示pGro7、pG-TO、pTfl6和pG-KJE8共表達(dá)的正向作用。如在pET-32b(+)和pColdIII表達(dá)中一樣，與用野生型基因caffi—wt相比，用合成基因calB_syn就脂肪酶活性和可溶酶含量獲得的值更低(圖4，表3)。4.在丁酸甘油酯-瓊脂板上的脂肪酶表達(dá)在15X:孵育時(shí)，表達(dá)GroES和GroEL(由pGro7編碼)和calB—wt或calB—syn的OrigamiB細(xì)胞在補(bǔ)充丁酸甘油酯的瓊脂板上顯示出清楚的暈輪形成。對(duì)于包含相同構(gòu)建體的DH5a細(xì)胞和對(duì)于包含pGro7載體和無脂肪酶基因的pColdIII載體的OrigamiTMB對(duì)照細(xì)胞，都沒有觀察到暈輪形成(數(shù)據(jù)未顯示)。5.微量滴定板M^莫的脂肪酶表達(dá)作為用于來自CalB的酶變體的高通量篩選系統(tǒng)的才莫型，calB_wt或calB—syn與pGro7的共表達(dá)在OrigamiTMB細(xì)胞中進(jìn)行(96孔孩吏量滴定板規(guī)模)。使用pNPP作為底物，通過比色測(cè)定定量澄清的細(xì)胞裂解物的活性。如黃色的對(duì)硝基酚鹽的形成所示(圖6)，兩個(gè)構(gòu)建體以相當(dāng)?shù)牧抗δ苄员磉_(dá)。無脂肪酶基因的對(duì)照細(xì)胞顯示在410nm的顯著減少的消光值。為了比較微量滴定板中表達(dá)的活性與在搖瓶中共表達(dá)構(gòu)建體pColdlll/calB—wt和pGro7獲得的值，通過pHStat測(cè)定研究具有底物丁酸甘油酯的5個(gè)代表性孔的活性。單個(gè)孔中的生長條件是相同的。發(fā)現(xiàn)的結(jié)果是在澄清的細(xì)胞裂解物中特異性活性為從57-81U/mg可溶性蛋白質(zhì)，或總活性為10-15U/ml細(xì)胞培養(yǎng)物?？字锌傊久傅谋磉_(dá)水平通過光密度分析確定為0.04±0.01jagCalB/ml細(xì)胞培養(yǎng)物。參考文獻(xiàn)AndersonE.M.，Larsson,K.M.，Kirk，O.，丑/o,nwis/of附.16:181—204(1998)Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y"1989BaneyxF.，MujacicM.，7VWwe丑/ofedwo/.22(11):1399-408(2004)BoelE.，Huge-JensenB.，ChristensenM.，ThimL.，F(xiàn)illN.P.，h》iVfo23:701-706(1988)BradfordM.M.，爿w"/.72:248-254(1976)ChodrorgeM.，F(xiàn)ourageL.，UlhnannC.，DuvivierV.，MassonJ.M.，LeftvreF.，爿dv.5);w仇C"紐/.347:1022-1026(2005)CooperT.G.，"BiochemischeArbeitsmethoden"，WalterdeGruyter-Verlag，Berlin,1.Aufl.，1980，Seite334-379GiacaloneM.J.，GentileA.M.,LovittB.T.，BerkleyN丄.，GundersonC.W.，SurberM.W，40(3):355-364(2006)GiladiH.，GoldenbergD.，KobyS.，OppenheimA.B.，/VwiVrfJaw/CASJ92:184-188(1995)Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)GoldsteinJ.，PollittN.S.，InouyeM.，/Voc.TV"汰Sc尺CASJ87(1):283—7(19卯)HaleR.S.，Thompson,G.,/V幽ViE，12:18S~188(1988)HoeghI.,Patkar，S.，Halkier,T.，Hansen,M.T.，/5d73:869—875(1995)IkeY，IkutaS,SatoM,HuangT,ItakuraK.,7V"c/"ci^.11:477-488(1983)IkuraK.,KokubuT.，NatsukaS.，IchikawaA.,AdachiM.，NishiharaK.，YanagiH.,UtsumiS.,5/oc/re附.5!》tec/^0/.32(2):189—205(2002)ItakuraK,RossiJ.J.，WallaceR.B.，jwm.及ev.J5/oc/re附.53:323-356(1984)ItakuraK,HiroscT,CreaR,RiggsAD，HeynekerHL，BolivarF，BoyerHW，198:1056-1063(1984)KirchhoffF.，DesrosiersR.C"M^/^AA^/所o/.57:323-33(1996)LaemmliU.K.,Nature227:680-685(1970)LonghiS.，F(xiàn)usettiF.，GrandoriR.，LottiM.，VanoniM.，AlberghinaL.5"dh附J/op/^s^"fl1131:227-232(1992)LutzR.，BujardH.，7V"c/e/c^"Vfe及m.25(6):1023-1210(1997)MartinelleM.，HolmquistM.，HultK.,5/ocA/附.丑i》/^)^.爿c似1258(3):272—6(1995)NakashimaK.，KanamaruK.，MizunoT.，HorikoshiK.，/丑ac&nV/.178:2994-2997(1996)Narang，S.A.，r"m/^腦39:3(1983)NishiharaK.，KanemoriM.，YanagiH.，YuraT.,￡>iW/wi.M/m嵐66(3):884—9(2000)Novagen(1999)pETSytemManualOllisD.L.，Cheah,E.，Cygler，M.，Dijkstra,B.，F(xiàn)rolow,F.，F(xiàn)ranken,S.M.，Harel，M.，Remingon，S.M.，Silman，L，Schrag,J.D.，/V她/"5:197-211(1992).PatkarS.，VindJ.，KelstmpE.，ChristensenM.W.，SvendsenA.，BorchK.，KirkO.，CAe附.93(1-2):95~101(1988)PearsonW.R.undLipman，D.J.，/亂脂/.爿一(tAS"4)85(8):2444-2448(1988)PrinzW.A.,AslundF.，HolmgrenA.，BeckwithJ./C7te附.272(25):15661-7(1997)QingG.,MaL.-C.，KhorchidA.，SwapnaG.V.T.，MaiT.K.,TakayamaM.M.，XiaB.，PhadtareS.，KeH.，ActonT.，MontelioneG.，IkuraM.undI細(xì)yeM.，5/她c/mo/.22(7):877-882(2004)QoronflehM.W.,DebouckC.KellerJ,/174:7902-7卯9(1992)RotticciD."UnderstandingandEngineeringtheEnantioselectivityofCandidaantarcticaLipaseBtowardssec-Alcohols".Stockholm:RoyalinstituteofTechnology1—61(2000)Rotticci畫MulderJ.C.，"ExpressionandmutagenesisstudiesofOm力V/flfl她/rricfllipaseB[PhD]".Stockholm:AlbaNovaUniversityCentre1—74(2003)Rotticci-MulderJ.C.，GustavssonM.，HolmquistM.，HultK.，MartinelleM.，/V幽Vi￡"，21(3):386—92(2001)RoufaD.J.，M"/^AAfo/.祝o/.57:357-367(1996)RusnakM.，，UntersuchungenzurenzymatischenEnantiomerentrennungvonGlykolethernundEtablierungneuerMethodertdessynthetischenShufflings".Universit5tStuttgart(2004)SchmidR.D.,Verger,R.，爿"gew./wt37:1608-33(1998)SchofieldD.A.，WestwaterC.，DolanJ.W.，NorrisJ.S.，SchmidtM.G.，Owr.Af/cTY^/o/.44(6):425-430(2002)ScopesR."ProteinPurification.PrinicplesandPractise".SpringerVerlag，NewYork,1.Aufl.，1981Suen,W.C.，Zhang,N.，Xiao,L,Madison,V.，Zaks，A.iV他/""仏17(2):133-40(2004)塔卡拉公司(TaKaRa)(2003)冷激表達(dá)系統(tǒng)(ColdShockExpressionSystem)pColdDNA，手冊(cè)1-9塔卡拉/〉司(TaKaRa)(2003b)分子伴侶質(zhì)粒組(ChaperonePlasmidSet)手冊(cè)1-7TsuchiyaA.，NakazawaH.，ToidaJ，OhnishiK，SekiguchiJ，Af,cra&V/Ze汰143:63-7(1996)UppenbergJ"Hansen,M.T.，Patkar，S.，Jones,A.，Amc似re2:293—308(1994)YamaguchiS.，MaseT.，TakeuchiK.,G騰103:61-67(1991)ZhangN.，S腦W.C.，WindsorW.，XiaoL.，MadisonV.，ZaksA.，尸她/"16(8):599—605(2003)在上述說明書中涉及的下列序列或質(zhì)粒在指明的SEQIDNO下包括在序列表中calB—syn:SEQIDNO:lcalB—wt:SEQIDNO:2T7啟動(dòng)子SEQIDNO:3cspA啟動(dòng)子(大腸桿菌)SEQIDNO:4pUC19中calB一syn(pUC18/calB一syn):SEQIDNO:5pUC19中calB_wt(pUC18/calB_swt):SEQIDNO:6pET-32b(+)中caIB_syn(pET-32b(+)/calB—syn):SEQIDNO:7pET畫32b(+)中calB_wt(pET-32b(+)/calB—wt):SEQIDNO:8pCOLDIII中calB—syn(pCOLDIII/calBsyn):SEQIDNO:9pCOLDIII中calB一wt(pCOLDIII/calB—wt):SEQIDNO:IOpPCR/CalB:SEQIDNO:11CalB(CAA83122.1):SEQIDNO:12具有T57A和A89T交換的CalB:SEQIDNO:1權(quán)利要求1.在原核生物中表達(dá)功能性三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的方法，其中編碼三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列在原核宿主細(xì)胞中在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。2.如權(quán)利要求l中所述的方法，其中三酰甘油脂肪酶的表達(dá)在低溫下發(fā)生。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中低溫選自1匸至25。C的范圍。4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中表達(dá)在硫氧還蛋白還原酶缺乏的和谷胱甘肽還原酶缺乏的大腸桿菌菌林中發(fā)生。5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列編碼來自南極假絲酵母(CVmAWaflwto/rrictf)的脂肪酶B(calB)。6.如權(quán)利要求5中所述的方法，其中脂肪酶B由根據(jù)SEQIDNO:l(calB—syn)或SEQIDNO:2(calB—wt)的核苷酸序列或由與其同源的核苷酸序列編碼。7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列在T7啟動(dòng)子(SEQIDNO:3)的控制下。8.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼三酰甘油脂肪酶的核苷酸序列在冷激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是大腸桿菌cspA基因的啟動(dòng)子(SEQIDNO:4)。10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中一個(gè)或多個(gè)分子伴倡共表達(dá)。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中一個(gè)或多個(gè)共表達(dá)的分子伴侶選自大腸桿菌的GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、GrpE和引發(fā)因子(TF)。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中GroEL和GroES是共表達(dá)的。13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中DnaK、DnaJ和GrpE是共表達(dá)的。14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中引發(fā)因子任選地與GroES和GroEL—起是共表達(dá)的。15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中DnaK、DnaJ、GrpE、GroES和GroEL是共表達(dá)的。16.用于檢測(cè)三酰甘油脂肪酶的方法，其中i)根據(jù)權(quán)利要求1至15中所述的方法之一表達(dá)假定具有三酰甘油脂肪酶活性的蛋白質(zhì)，ii)將表達(dá)產(chǎn)物與可被三酰甘油脂肪酶水解的底物相接觸，以及iii)確定水解活性。17.如權(quán)利要求16中所述的方法，其中蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或其水解活性的確定在微量滴定板上進(jìn)行。18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中根據(jù)步驟i)的蛋白質(zhì)的表達(dá)在可被脂肪酶水解的底物存在時(shí)發(fā)生。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中蛋白質(zhì)的表達(dá)在包含可被脂肪酶水解的底物的培養(yǎng)基上發(fā)生。20.如4又利要求16或17所述的方法，其中i)將表達(dá)的蛋白質(zhì)從細(xì)胞培養(yǎng)物分離，ii)與可被三酰甘油脂肪酶水解的底物相接觸，以及iii)確定水解活性。21.如權(quán)利要求20中所述的方法，其中從可水解底物的減少或氷解產(chǎn)物的增加來光度確定水解活性。22.如權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的方法的用途，其用于就三酰甘油脂肪酶活性篩選誘變的蛋白質(zhì)或由誘變的核酸編碼的蛋白質(zhì)。23.如權(quán)利要求22中所述的用途，其中蛋白質(zhì)在來自南極假絲酵母的脂肪酶B(calB)的編碼核苷酸序列中具有至少一處突變。24.如權(quán)利要求16至23中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中作為高通量篩選方法進(jìn)行所述方法用于檢測(cè)三酰甘油脂肪酶。25.產(chǎn)生三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的方法，其中檢測(cè)使用如權(quán)利要求16至24中任一項(xiàng)所述的方法表達(dá)的具有三酰甘油脂肪酶(E.C.3.1丄3)活性的蛋白質(zhì)，在表達(dá)脂肪酶的條件下培養(yǎng)表達(dá)該蛋白質(zhì)的大腸桿菌菌林，并且任選地分離表達(dá)的脂肪酶。26.通過如權(quán)利要求25所述的方法獲得的三酰甘油脂肪酶。27.編碼三酰甘油脂肪酶的核酸，其中其包含根據(jù)SEQIDNO:1的編碼核苷酸序列，或者包含在至少一個(gè)核苷酸上不同于SEQIDNO:2的核苷酸序列，或者包含在每種情形中與其同源的核苷酸序列。28.重組載體，其中其包含如權(quán)利要求27所述的編碼核酸，所述編碼核酸與至少一個(gè)調(diào)節(jié)核酸序列有效連接。29.重組宿主細(xì)胞，其中其包含如權(quán)利要求27所述的核酸和/或如權(quán)利要求28所述的重組載體。30.如權(quán)利要求27所述的編碼核酸序列、如權(quán)利要求28所述的載體或如權(quán)利要求29所述的宿主細(xì)胞用于進(jìn)行如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法的用途。全文摘要本發(fā)明涉及編碼三酰甘油脂肪酶的核酸、包含此類核酸的載體、包含此類核酸或載體的宿主細(xì)胞、在原核生物中表達(dá)三酰甘油脂肪酶的方法、檢測(cè)和產(chǎn)生三酰甘油脂肪酶的方法，以此方式獲得的三酰甘油脂肪酶，以及編碼三酰甘油脂肪酶的核酸、載體和重組宿主細(xì)胞用于上述方法的用途。文檔編號(hào)C12N9/20GK101460613SQ200780020728公開日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年4月5日優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日發(fā)明者B·豪爾,C·布蘭尼比,D·劉,D·黑林,M·魯斯納克,R·施密德申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司