專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種以甘油為碳源的制備植酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物制品的發(fā)酵技術(shù)，以甘油為碳源的制備植酸酶的方法。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)生產(chǎn)植酸酶的方法是利用葡萄糖作碳源。葡萄糖作為碳源在滅菌過(guò)程中，產(chǎn)生焦糖化反應(yīng)，使得發(fā)酵培養(yǎng)基溶液呈褐色或醬油色。其弊端是第一，焦糖化反應(yīng)產(chǎn)生有害物，不利于酵母菌的生長(zhǎng)；第二，深色發(fā)酵液的后處理工作需要脫色，增加生產(chǎn)工序和費(fèi)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，可顯著增加植酸酶產(chǎn)量達(dá)20%—30%，不需脫色，降低生產(chǎn)成本。以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，以畢赤酵母做載體，其特征在于以甘油為碳源，菌種采用搖瓶培養(yǎng)，然后經(jīng)一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，在產(chǎn)酶前的生長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中以甘油為唯一碳源；在生產(chǎn)的誘導(dǎo)表達(dá)階段，以甲醇誘導(dǎo)基因工程菌產(chǎn)植酸酶。本發(fā)明方法以甘油代替?zhèn)鹘y(tǒng)的葡萄糖為碳源，以畢赤酵母做載體產(chǎn)植酸酶基因工程菌所產(chǎn)生的積極效果是a.甘油作為碳源在生產(chǎn)中的應(yīng)用，產(chǎn)生乙醇乙酸代謝阻遏物比以葡萄糖為碳源時(shí)顯著減少；b.由于代謝阻遏物減少，從而使甘油生產(chǎn)工藝生產(chǎn)植酸酶的酶活力提高10%-30%;c.甘油作為碳源在生產(chǎn)中的應(yīng)用，對(duì)發(fā)酵液的顏色有了很大改觀(guān)，甘油作為碳源在高溫滅菌過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生焦糖化反應(yīng)，酵母菌正常生長(zhǎng)，發(fā)酵液顏色淺不需脫色處理，減少發(fā)酵液處理費(fèi)用；降低生產(chǎn)費(fèi)用，本方法比傳統(tǒng)工藝降低成本1/3左右。具體實(shí)施例方式一種以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，采用以畢赤酵母做載體的產(chǎn)植酸酶基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于以甘油為碳源，作為碳源的甘油在發(fā)酵階段分兩步加入第一步隨基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基加入，第二步是在生產(chǎn)發(fā)酵中以50%甘油溶液流加加入。具體工序如下~"■、i肯養(yǎng)基1.種子培養(yǎng)基甘油0.55%，蛋白胨0.55%，酵母粉O.12%，按溶積百分比計(jì)，其余是水；2.發(fā)酵培養(yǎng)基甘油110%，磷酸二氫鉀18%，氯化鉀12%，硫酸銨O.33%，氫氧化鉀O.55%，生物素O.020.2%，其余是水；3.微量元素為PTM1型，添加量分別為上述培養(yǎng)基容積的0.2~2%。二、種子培養(yǎng)菌種的搖瓶培養(yǎng)a.取適量生產(chǎn)用產(chǎn)植酸酶菌種培養(yǎng)斜面，分別接入34只1000ml三角瓶中，內(nèi)裝500ml種子培養(yǎng)基；b.搖瓶培養(yǎng)條件3032°C，250350pm，生長(zhǎng)2030小時(shí)。三、種子發(fā)酵工藝1.一級(jí)發(fā)酵即一級(jí)種子培養(yǎng)-a.在O.5噸不銹鋼種子罐中裝入種子培養(yǎng)基約占發(fā)酵罐容積的7(T75%，蒸汽滅菌121。C，15min，冷卻至30。C;b.養(yǎng)好的搖瓶菌種接入一級(jí)發(fā)酵罐中，培養(yǎng)30°C，200300pm，生長(zhǎng)2030小時(shí)；2.二級(jí)發(fā)酵即二級(jí)種子培養(yǎng)a.在3噸不銹鋼種子罐中有發(fā)酵培養(yǎng)基占容積的7075%，蒸汽滅菌121。C，15min，冷卻至30。C;b.將一級(jí)發(fā)酵罐中的菌種液無(wú)菌狀態(tài)下接入二級(jí)種子罐中；c.培養(yǎng):3(TC，200300pm，ph恒定5.06.0，生長(zhǎng)2030小時(shí)；四、生產(chǎn)發(fā)酵a.在20噸容積不銹鋼發(fā)酵罐中投入相當(dāng)于罐容積的3540%的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)消毒、接種、流加等工序，至停止發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液體積增加到罐體積的70-75%。b.無(wú)菌狀態(tài)接入二級(jí)種子，培養(yǎng)發(fā)酵30°C，180250pm，恒定ph5.0，通氣量12vvm。c.流加甘油當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油利用完全后，用甘油檢測(cè)方法測(cè)定甘油含量為0時(shí)，再進(jìn)行下步補(bǔ)料流加工序以10-50ml/h/l的流速，流加甘油水溶液至發(fā)酵培養(yǎng)基中。(1)配制濃度為50%甘油水溶液，其中含0.22%PTM1，滅菌降溫備用；(2)甘油勻速流加時(shí)間為4h或更長(zhǎng)時(shí)間，至細(xì)菌生產(chǎn)量為200250g濕重/L發(fā)酵液無(wú)可見(jiàn)的重組蛋白的產(chǎn)生；d.誘導(dǎo)(1)誘導(dǎo)劑甲醇，添加0.2-2PTM1;(2)當(dāng)流加的甘油利用完全后，采用甘油檢測(cè)方法測(cè)定甘油含量為O時(shí)，再進(jìn)行下步補(bǔ)料流加工序；(3)啟用濃度99%以上甲醇，添加0.2-2%PTMl流加飼喂，速度為l-10ml/h/L起始發(fā)酵液體積；(4)在開(kāi)始3—5小時(shí)，酵母對(duì)碳源的適應(yīng)期中甲醇在發(fā)酵液中累積，當(dāng)培養(yǎng)物適應(yīng)甲醇后，將消耗甲醇；(5)甲醇作為畢赤酵母工程菌的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)其產(chǎn)植酸酶；(6)隨著培養(yǎng)的持續(xù)及目的產(chǎn)物的快速生成，應(yīng)相應(yīng)增大發(fā)酵液中的溶氧，溶氧值大于30%;(7)整個(gè)甲醇流加過(guò)程持續(xù)約70—100小時(shí)。五、生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程結(jié)束當(dāng)細(xì)菌鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)菌開(kāi)始自溶時(shí)，酶活力降至3000u/g以下，停止發(fā)酵。六、本發(fā)明方法與傳統(tǒng)工藝的效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)工藝與本發(fā)明方法的效果對(duì)比表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>說(shuō)明1.從上表中可以看出連續(xù)6批對(duì)比發(fā)酵，甘油型的優(yōu)勢(shì)大于葡萄糖型;2.甘油型發(fā)酵最終酶活力比葡萄糖型發(fā)酵最終酶活力要高出10—30Q/^不等；3.發(fā)酵液的后處理過(guò)程中，脫色成本則更顯甘油型發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)，降低成本至葡萄糖型發(fā)酵的1/3左右。權(quán)利要求1、一種以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，采用以畢赤酵母做載體的產(chǎn)植酸酶基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于以甘油為碳源，取適量生產(chǎn)用菌種，在種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，再經(jīng)一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)工序，在種子培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶前的菌體生長(zhǎng)階段的唯一碳源為甘油；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基液中甘油消耗完全后，開(kāi)始流加50％甘油溶液至培養(yǎng)基中，待甘油耗盡后，開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)植酸酶。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，其特征在于作為碳源的甘油在發(fā)酵階段分兩步加入第一步隨基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基加入，第二步是在生產(chǎn)發(fā)酵中以50%甘油溶液流加加入。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，其特征在于一級(jí)發(fā)酵即一級(jí)種子培養(yǎng)-a.在O.5噸不銹鋼種子罐中裝入種子培養(yǎng)基約占發(fā)酵罐容積的7075%，蒸汽滅菌12rC，15min，冷卻至30。C;b.養(yǎng)好的搖瓶菌種接入一級(jí)發(fā)酵罐中；培養(yǎng)30°C,200300pm，生長(zhǎng)2030小時(shí)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，其特征在于培養(yǎng)基(1).一級(jí)種子培養(yǎng)基甘油0.55%，蛋白胨0.55%，酵母粉0.l2%，其余是水；(2).發(fā)酵培養(yǎng)基甘油110%，磷酸二氫鉀18%，氯化鉀12%，硫酸銨O.33%,氫氧化鉀O.55%，生物素0.020.2%,其余是水；(3).添加微量元素PTM1，添加量分別為培養(yǎng)基體積的0.22%。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，其特征在于二級(jí)發(fā)酵即二級(jí)種子培養(yǎng)a.在3噸不銹鋼種子罐中有發(fā)酵培養(yǎng)基占容積的7075%，蒸汽滅菌121。C，15min，冷卻至30。C;b.將一級(jí)發(fā)酵罐中的菌種液無(wú)菌狀態(tài)下接入二級(jí)種子罐中；c.培養(yǎng):30°C，200300pm，ph恒定5.06.0，生長(zhǎng)2030小時(shí)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，其特征在于生產(chǎn)發(fā)酵工序a.在20噸容積不銹鋼發(fā)酵罐中投入相當(dāng)于罐容積的3540%的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)消毒、接種、流加等工序，至停止發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液體積增加到罐體積的70-75%;b.無(wú)菌狀態(tài)接入二級(jí)種子，培養(yǎng)發(fā)酵30°C，180250pm，恒定ph5.0，通氣量12vvm;c.流加甘油當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油利用完全后，采用甘油檢測(cè)方法測(cè)定甘油含量為0時(shí)，再進(jìn)行下步補(bǔ)料流加工序(1)配制濃度為50%甘油水溶液，添加0.22XPTM1，滅菌降溫備用；(2)甘油勻速流加時(shí)間為4h或更長(zhǎng)時(shí)間，至細(xì)菌生產(chǎn)量為200250g濕重/L發(fā)酵液無(wú)可見(jiàn)的重組蛋白的產(chǎn)生；d.誘導(dǎo)(1)誘導(dǎo)劑:甲醇為濃度99%以上，添加0.2-2PTMl;(2)當(dāng)流加的甘油利用完全后，再進(jìn)行流加甲醇；(3)甲醇,添加0.2-2%PTMl流加飼喂，速度為l-10ml/h/L起始發(fā)酵液體積；(4)在開(kāi)始3—5小時(shí)，酵母對(duì)碳源的適應(yīng)期中甲醇在發(fā)酵液中累積，當(dāng)培養(yǎng)物適應(yīng)甲醇后，將消耗甲醇；(5)甲醇作為畢赤酵母工程菌的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)其產(chǎn)植酸酶；(6)隨著培養(yǎng)的持續(xù)及目的產(chǎn)物的快速生成，應(yīng)相應(yīng)增大發(fā)酵液中的溶氧，溶氧值大于30%;(7)整個(gè)甲醇流加過(guò)程持續(xù)約70—100小時(shí)；e.生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程結(jié)束當(dāng)細(xì)菌鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)菌開(kāi)始自溶時(shí)，酶活力降至3000u/g以下，停止發(fā)酵。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，其特征在于c.當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油消耗完全后，用甘油檢測(cè)方法測(cè)定甘油含量為0時(shí)，以10-50ml/h/1的流速流加50%甘油水溶液至發(fā)酵培養(yǎng)基中。全文摘要一種以甘油為碳源的制備植酸酶的方法，采用以畢赤酵母做載體的產(chǎn)植酸酶基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于以甘油為碳源，取適量生產(chǎn)用菌種，在種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，再經(jīng)一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)工序，在種子培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶前的菌體生長(zhǎng)階段的唯一碳源為甘油；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基液中甘油消耗完全后，開(kāi)始流加50％甘油溶液至培養(yǎng)基中，待甘油耗盡后，開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)植酸酶，在生產(chǎn)階段甲醇還充當(dāng)碳源。積極效果是甘油作為碳源使最終產(chǎn)植酸酶量增加20-30％，酶活力提高20％-30％，發(fā)酵液顏色淺不需脫色處理，降低生產(chǎn)費(fèi)用，本方法比傳統(tǒng)工藝降低成本1/3左右。文檔編號(hào)C12N9/16GK101182499SQ200710158099公開(kāi)日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日發(fā)明者王武良,韓國(guó)寶申請(qǐng)人:沈陽(yáng)市信利生物技術(shù)發(fā)展有限公司