專利名稱：同時(shí)利用蔗糖和甘油的新的產(chǎn)琥珀酸突變微生物和利用其生產(chǎn)琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能同時(shí)利用蔗糖和甘油作為碳源的產(chǎn)琥珀酸突變微生物。尤其是，本發(fā)明涉及一種能同時(shí)利用蔗糖和甘油以生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)琥珀酸突變微生物，該突變微生物通過解除產(chǎn)琥珀酸微生物中的蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制而獲得。
背景技術(shù)：
琥珀酸是一種包含四個(gè)碳原子的二羧酸并能夠被用于多種工業(yè)應(yīng)用。琥珀酸可作為工業(yè)重要化學(xué)品(包括己二酸、1，，4- 丁二醇、乙二胺二琥珀酸鹽、衣康酸、Y - 丁內(nèi)酯、Y-氨基丁酸和四氫呋喃)的前體使用，并且琥珀酸(包括其前體)的全球市場(chǎng)規(guī)模估計(jì)大約 150 億美兀(McKinlay 等,Appl.Microbiol.Biotechnol., 76:727, 2007)。隨著當(dāng)下對(duì)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的興趣和因石油儲(chǔ)備量減少和由此導(dǎo)致的價(jià)格波動(dòng)，過去十年進(jìn)行了生物基玻拍酸生產(chǎn)方面的全球性研究(McKinlay 等，Appl.Microbiol.Biotechnol.76:727, 2007 ；Song 等，Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006 ； Jantama 等，Biotechnol.Bioeng.,99:1140,2008)。盡管如此，時(shí)至今日已發(fā)現(xiàn)的任何種類的菌株都沒有能夠最大化琥珀酸的生產(chǎn)能力和產(chǎn)量的同時(shí)最小化副產(chǎn)物的產(chǎn)生。當(dāng)生產(chǎn)能力高時(shí)，效率低，反過來，當(dāng)效率高時(shí),生產(chǎn)能力低。進(jìn)一步說，當(dāng)生產(chǎn)能力高時(shí)，也產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物。因此,一種能夠增加生產(chǎn)能力和產(chǎn)量同時(shí)只生產(chǎn)琥拍酸的理想菌株尚未被發(fā)現(xiàn)(Jantama等，Biotechnol.Bioeng.，99:1140，2008)。蔗糖的價(jià)格是常用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的葡萄糖價(jià)格的大約1/4。同時(shí)，隨著全球生物柴油制造的快速增長，產(chǎn)生了作為副產(chǎn)物的甘油，其價(jià)格因超量供應(yīng)和需要一種處理甘油的適當(dāng)?shù)姆椒ǘ陆?。因此，甘油的價(jià)格非常低并持續(xù)的下降(Miller-KleinAssociates, Oct.2006)。大部分微生物從不同的碳·源混合物中優(yōu)先利用首選的碳源。為使其成為可能，大多數(shù)微生物擁有當(dāng)首選碳源可用時(shí)抑制非首選碳源利用的分解代謝抑制機(jī)制(Gorke等，Nature Reviews, 6:613, 2008)。在受分解代謝抑制機(jī)制調(diào)節(jié)的碳源的優(yōu)先利用方面,眾所周知，如1942年Monod et al.所報(bào)道的，大腸桿菌在葡萄糖和乳糖都存在時(shí)呈現(xiàn)二次生長。在這里，首選的碳源是葡萄糖，大腸桿菌的二次生長曲線中，顯示了葡萄糖徹底消耗后的短的滯后期后，開始消耗非首選碳源乳糖。因?yàn)檫@個(gè)分解代謝抑制機(jī)制，對(duì)于常規(guī)曼海姆菌株很難同時(shí)利用蔗糖和甘油。不過，利用甘油作為碳源具有許多優(yōu)勢(shì)。甘油是高度還原性的，當(dāng)它作為碳源使用時(shí)，在中間體磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的生產(chǎn)中，比糖類(例如葡萄糖、木糖和蔗糖)產(chǎn)生多2倍的量的還原當(dāng)量(熟0!1，嫩0 !^40!12等)。因此，甘油對(duì)于還原性化學(xué)品的生長是引人注目的碳源。(Yazdani等,Curr.0pin.Biotechnol., 18:213, 2007)。盡管如此，在很多情況下，在厭氧條件下的利用甘油的細(xì)胞生長速度比利用其他糖類的低，也因此使得利用甘油作為單一碳源雖然就還原力方面而言是有優(yōu)勢(shì)的，但是其顯示出的低生長速度，使得在增加所需的生物產(chǎn)品的生產(chǎn)能力上受限制。
為克服該限制，如果能通過同時(shí)利用比甘油有更高利用速度且能使細(xì)胞生長處于更高水平和速度的糖類(例如蔗糖)增加甘油的利用速度，細(xì)胞便可以以高速度生長的同時(shí)可利用甘油的高還原力的優(yōu)勢(shì)，由此可以有效地生產(chǎn)還原性化合物，特別是琥珀酸。因此，本發(fā)明人為開發(fā)通過同時(shí)利用廉價(jià)的蔗糖和甘油以高效率生產(chǎn)高純度的琥珀酸的方法進(jìn)行了廣泛的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)通過從產(chǎn)琥珀酸微生物中刪除果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因或向微生物引入甘油激酶編碼基因而獲得的產(chǎn)琥珀酸突變微生物時(shí)，可解除突變微生物中的分解代謝抑制機(jī)制從而使該突變微生物實(shí)現(xiàn)以常規(guī)方法不能達(dá)到的同時(shí)利用蔗糖和甘油生產(chǎn)琥珀酸、使副產(chǎn)物的產(chǎn)生最小化，和以高效率和非常高的生產(chǎn)能力生產(chǎn)均一琥拍酸(homo-succinic acid),從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種突變微生物，其中解除了分解代謝抑制機(jī)制以便該微生物能夠同時(shí)利用蔗糖和甘油，最大化琥珀酸的產(chǎn)量以接近理論水平，同時(shí)最小化副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生均一琥珀酸。本發(fā)明的另一個(gè) 目的是提供一種在厭氧條件下利用蔗糖和甘油作為碳源在所述的突變微生物中生產(chǎn)均一琥珀酸且不產(chǎn)生副產(chǎn)物的方法。技術(shù)方案為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種能夠同時(shí)利用蔗糖和甘油以生產(chǎn)琥珀酸的突變微生物，該突變微生物通過解除產(chǎn)琥珀酸微生物中蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制而獲得。本發(fā)明還提供了一種制備能利用蔗糖和甘油以獲得產(chǎn)琥珀酸突變微生物的方法，該方法包括解除產(chǎn)琥珀酸微生物中蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括步驟:在厭氧條件下培養(yǎng)前述產(chǎn)琥珀酸突變微生物；和從發(fā)酵液中回收琥珀酸。附圖簡述

圖1示意性地顯示了蔗糖和甘油的代謝途徑和曼海姆菌株中的分解代謝抑制機(jī)制。確切地說，圖1A顯示了蔗糖和甘油常規(guī)的代謝途徑和其中的分解代謝抑制機(jī)制，圖1B顯示了圖1A中為解除分解代謝抑制機(jī)制有可能被代謝操作的部分(GLY，甘油；G3P，甘油-3-磷酸；SCR,蔗糖；G6P,葡萄糖-6-磷酸；FRU,果糖；F1P,果糖-1-磷酸；FBP, I, 6- 二磷酸果糖(果糖-1，6-二磷酸)；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；SUC，琥珀酸；PYR，丙酮酸；IIBCF，果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)IIBC單元(fructose PTS IIBC unit) ;IIBCS，蔗糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)IIBC單元(sucrose PTS IIBC unit) ;EI，酶I ;HPr，組氨酸蛋白；IIA，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)酶IIA (PTS enzyme IIA) ;Fpr，雙功能果糖特異性IIA/HPr蛋白；AC，腺苷酸環(huán)化酶；cAMP，環(huán)腺苷酸；CRP，環(huán)腺苷酸受體蛋白)。圖2為一組顯示了獲自曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK(圖2A)、曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK(圖2B)和曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG (圖2C)的分批補(bǔ)料培養(yǎng)物的細(xì)胞生長情況和代謝產(chǎn)物的圖表。圖3為顯示了獲自以增加的量接種的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK菌株的分批補(bǔ)料培養(yǎng)物的細(xì)胞生長情況和代謝產(chǎn)物的圖表。
圖4A為顯示了 MCRB培養(yǎng)方法的示意圖，其中實(shí)線表示液流(培養(yǎng)基、包含細(xì)胞的培養(yǎng)基、包含代謝物的培養(yǎng)基等)，虛線表示氣流(二氧化碳)。圖4B為顯示獲自使用MCRB培養(yǎng)方法的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK株的培養(yǎng)物的細(xì)胞生長情況和代謝產(chǎn)物的圖表。
具體實(shí)施例方式除非另有定義，在此使用的全部科技術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。通常地，在此使用的術(shù)語是眾所周知的和常規(guī)地用于本領(lǐng)域。一方面，本發(fā)明涉及能同時(shí)利用蔗糖和甘油以生產(chǎn)琥珀酸的突變微生物，該突變微生物通過解除產(chǎn)琥珀酸微生物中蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制而獲得。本文使用的術(shù)語“分解代謝抑制機(jī)制”涉及當(dāng)微生物在有多種碳源存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，在首選碳源存在的情況下，抑制該微生物的非首選碳源的利用的機(jī)制(Gorke等，Nature Reviews,6:613，2008)。對(duì)于產(chǎn)琥珀酸的曼海姆菌株，因?yàn)樵摲纸獯x機(jī)制而不能同時(shí)利用蔗糖和甘油以
生產(chǎn)琥珀酸。通常地，當(dāng)蔗糖和甘油共存時(shí)，在首選碳源蔗糖被消耗后，才消耗甘油。并且，相對(duì)于甘油，曼海姆菌更優(yōu)選蔗糖，所以蔗糖和甘油同時(shí)存在時(shí)，其更快速地代謝蔗糖。本發(fā)明的目的在于人為地解除這個(gè)分解代謝抑制機(jī)制。分解代謝抑制機(jī)制主要分為兩種:轉(zhuǎn)錄抑制和變構(gòu)抑制(Deutscher等，Microbiol.Mol.Biol.Rev., 70: 939, 2006 ; Gorke 等，Nature reviews,6:613,2008 ；Pettigrew 等，J.Bacterio1., 178:2846,1996 ;Zwaig 等,J.Bacterio1., 102:753, 1970)。就轉(zhuǎn)錄抑制而言，GlpR調(diào)節(jié)子抑制參與細(xì)胞內(nèi)甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的基因的轉(zhuǎn)錄。本文使用的術(shù)語“變構(gòu)抑制”涉及甘油激酶活性的減少，其由果糖1，6 二磷酸(FBP)或EIIA與甘油代謝中扮演關(guān)鍵角色的甘油激酶的結(jié)合而導(dǎo)致。在蔗糖和甘油同時(shí)存在的環(huán)境中，GlpR調(diào)節(jié)子引起的轉(zhuǎn)錄抑制與FBP和EIIA引起的變構(gòu)抑制同時(shí)發(fā)生，所以甘油代謝通常被抑制。能解除這一分解代謝機(jī)制的策略避免了 GlpR引起的轉(zhuǎn)錄抑制以及FBP和EIIA引起的變構(gòu)抑制。圖1示意性地顯示了曼海姆菌株中蔗糖和甘油的代謝途徑以及分解代謝抑制機(jī)制。確切地說，圖1A顯示了蔗糖和甘油常規(guī)的代謝途徑和分解代謝抑制機(jī)制；圖1B顯示了解除分解代謝抑制機(jī)制，圖1A中可能被代謝操作的部分。圖1中，實(shí)線箭頭表示蔗糖和甘油的代謝途徑，其粗度表示相對(duì)的代謝速度。細(xì)的虛線箭頭表示磷?；B續(xù)地從PEP到磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)IIBC單元的轉(zhuǎn)移過程，粗的虛線箭頭示意性地顯示了能誘導(dǎo)glp操縱子表達(dá)的多種途徑，包括起始自磷酸化的IIA的途徑、起始自腺苷酸環(huán)化酶(AC)的途徑、起始自CRP-cAMP的途徑、起始自G3P-GlpR的途徑等。在末端有T形狀的粗的虛線表示在glp操縱子中扮演關(guān)鍵角色的甘油激酶(GlpK)由非磷酸化的IIA和/或1，6-二磷酸果糖(FBP)引起的變構(gòu)抑制的相對(duì)程度。如圖1A中所示，蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制主要分為由GlpR等引起的轉(zhuǎn)錄抑制，和由FBP和EIIA引起的變構(gòu)抑制。如圖1B中所示，克服抑制的方法包括通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種活化劑而克服 轉(zhuǎn)錄抑制的方法，通過減少FBP或IIA的濃度來解除GlpK介導(dǎo)的變構(gòu)抑制的方法等等。
例如，其為以下方法:從圖1B的部分I移除IIBCF使得磷酸化的IIA的濃度相應(yīng)增加以誘導(dǎo)AC表達(dá)，從而更多地產(chǎn)生cAMP以增加CRP-cAMP的產(chǎn)生，因而誘導(dǎo)glp操縱子的表達(dá)。因此由額外表達(dá)的GlpK產(chǎn)生的G3P將轉(zhuǎn)錄抑制物GlpR從glp調(diào)節(jié)子(glpABC、glpF、glpK等)的DNA結(jié)合位點(diǎn)上分離以促進(jìn)glp調(diào)節(jié)子基因的轉(zhuǎn)錄。與此同時(shí)，保持非磷酸化的IIA的濃度在一個(gè)相對(duì)低的水平，且因移除IIBCF而減少蔗糖的總代謝導(dǎo)致FBP的濃度相對(duì)減少，從而緩解變構(gòu)抑制。這兩個(gè)因素的同步效果導(dǎo)致甘油代謝的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，其為以下方法:增加圖1B部分2中的磷酸化的IIA的濃度以誘導(dǎo)AC的表達(dá)，從而更多的產(chǎn)生cAMP以增加CRP-cAMP的產(chǎn)生，因而誘導(dǎo)glp操縱子的表達(dá)。因此由額外表達(dá)的GlpK產(chǎn)生的G3P使得轉(zhuǎn)錄抑制物GlpR從glp調(diào)節(jié)子的DNA結(jié)合位點(diǎn)上分離以促進(jìn)glp調(diào)節(jié)子基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致甘油代謝的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，其為以下方法:誘導(dǎo)圖1B部分3中的AC過表達(dá)使更多地產(chǎn)生cAMP以增加CRP-cAMP的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)glp操縱子的表達(dá)。由額外表達(dá)的GlpK產(chǎn)生的G3P將轉(zhuǎn)錄抑制物GlpR從glp調(diào)節(jié)子的DNA結(jié)合位點(diǎn)上分離以促進(jìn)glp調(diào)節(jié)子基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致甘油代謝的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，其為以下方法:同時(shí)誘導(dǎo)圖1B部分4中的CRP過表達(dá)和圖1B部分3的AC過表達(dá)從而增加CRP-cAMP的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)glp操縱子的表達(dá)。由額外表達(dá)GlpK產(chǎn)生G3P,使得轉(zhuǎn)錄抑制物GlpR從glp調(diào)節(jié)子的DNA結(jié)合位點(diǎn)上分離以促進(jìn)glp調(diào)節(jié)子基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致甘油代謝的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，其為以下方法:誘導(dǎo)圖1B部分4中的CRP過表達(dá)，從而增加CRP-cAMP的產(chǎn)生，因此誘導(dǎo)glp操縱子的表達(dá)。通過額外表達(dá)的GlpK產(chǎn)生的G3P將轉(zhuǎn)錄抑制物GlpR從glp調(diào)節(jié)子的DNA結(jié)合位點(diǎn)上分離以促進(jìn)glp調(diào)節(jié)子基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致甘油代謝的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，其為誘導(dǎo)圖1B部分5中的GlpK過表達(dá)從而增加G3P的產(chǎn)生的方法。其將轉(zhuǎn)錄抑制物GlpR從glp操縱子的DNA結(jié)合位點(diǎn)上分離以促進(jìn)glp操縱子基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致甘油代謝的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，其為過表達(dá)glp操縱子的所有基因或過表達(dá)一些基因的多種組合從而導(dǎo)致甘油代謝增加的方法。作為另一個(gè)實(shí)例，其為以下方法:將沒有GlpR可以結(jié)合的位點(diǎn)的過表達(dá)啟動(dòng)子引入啟動(dòng)子位點(diǎn)以表達(dá)圖1B部分5中的染色體上的glp操縱子的每一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，從而根本性地阻斷GlpR導(dǎo)致的抑制且過表達(dá)glp調(diào)節(jié)子，從而導(dǎo)致甘油代謝增加。此外，還有移除GlpR因而解除glp操縱子的表達(dá)抑制從而導(dǎo)致甘油代謝增加的方法。作為另一個(gè)實(shí)例，其為減少圖1B部分6和7中的IIA和/或FBP的濃度從而減弱GlpK引起的變構(gòu)抑制的程度，由此導(dǎo)致甘油代謝增加的方法。除前述所列方法以外，還有這些方法可能的組合，例如，設(shè)計(jì)源自異源菌株的甘油激酶以受到較少的變構(gòu)抑制或受到變構(gòu)抑制時(shí)過表達(dá)從而導(dǎo)致甘油代謝的增加的方法。此夕卜，還有解除分解代謝抑制機(jī)制從而激活甘油代謝的方法。琥珀酸是典型的還原性化學(xué)品，其包括二個(gè)羧基，并以PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)作為中間前體的C4化合物。產(chǎn)琥珀酸微生物是指與其他微生物相比生產(chǎn)更多琥珀酸并能用于商業(yè)化地發(fā) 酵生產(chǎn)琥珀酸的微生物。典型的產(chǎn)琥珀酸微生物包括瘤胃細(xì)菌。已知的瘤胃細(xì)菌包括放線桿菌屬菌(Actinobacillus sp.),厭氧螺菌屬菌(Anaerobiospirillumsp.)和曼海姆菌屬菌(Mannheimia sp.,其包括 Basfia 屬菌(Basfia sp.), Basfia 屬最初分離時(shí)被命名為曼海姆菌屬，后命名為“Basfia屬”，且其16S rRNA序列與曼海姆菌屬菌具有99.8%的同一性，因此Basfia屬在本發(fā)明也被稱為“曼海姆菌屬”/Scholten等，W02009/024294A ;Kuhnert 等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60:44)。從已知多種生產(chǎn)玻珀酸的瘤胃細(xì)菌的部分基因信息(16s rRNA)、酶分析和發(fā)酵結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些瘤胃細(xì)菌中從碳源生產(chǎn)琥珀酸的主要生物合成途徑幾乎與瘤胃細(xì)菌曼海姆菌屬菌生產(chǎn)琥珀酸的生物合成途徑相同。特別是參與琥珀酸生產(chǎn)的所有瘤胃細(xì)菌利用二氧化碳固定酶將C3化合物(磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸鹽)轉(zhuǎn)化成C4化合物(草酰乙酸和蘋果酸)并將C4化合物轉(zhuǎn)化成延胡索酸，從而產(chǎn)生玻拍酸(Zeikus 等,App1.Microbiol.Biotechnol., 51:545,1999 ；Lee 等，Appl.Environ.Microbiol.，72:1939，2006)。換言之，所有的瘤胃細(xì)菌(包括曼海姆菌屬菌)有相同的生物合成琥珀酸的途徑，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的基因突變能應(yīng)用到除本發(fā)明實(shí)施例中所示的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌以外的源自瘤胃細(xì)菌的產(chǎn)琥珀酸菌株上是顯而易見的。本發(fā)明中，產(chǎn)琥珀酸微生物可以是瘤胃細(xì)菌。該瘤胃細(xì)菌可以選自由曼海姆菌屬菌、放線桿菌屬菌和厭氧螺菌屬菌組成的組。本發(fā)明中，曼海姆菌屬菌株可以是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)。本發(fā)明中，可以通過刪除編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因解除分解代謝抑制機(jī)制，并且突變微生物可以是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTC11694BP)。本發(fā)明中，可以通過引入編碼甘油激酶的基因解除分解代謝抑制機(jī)制，并且產(chǎn)琥珀酸突變微生物可以是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)。本發(fā)明中，通過基因操縱產(chǎn)琥珀酸微生物的瘤胃細(xì)菌而構(gòu)建提供琥珀酸的最高產(chǎn)量且不產(chǎn)生其他有機(jī)酸的產(chǎn)琥珀酸突變微生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)·例中，通過從曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)的基因組DNA中刪除果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因(fruA)而構(gòu)建具有同時(shí)代謝蔗糖和甘油的能力的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)。該構(gòu)建的菌株以高產(chǎn)量和生產(chǎn)能力產(chǎn)生琥珀酸且不產(chǎn)生副產(chǎn)物。本發(fā)明中，通過采用同源重組方法失活該目標(biāo)基因而刪除基因。盡管如此，在本發(fā)明中可以使用任何基因操縱方法而沒有特殊的限定，只要其可以修飾或消除目標(biāo)基因從而不產(chǎn)生該目標(biāo)基因編碼的酶。本發(fā)明中，可以通過任何常規(guī)發(fā)酵過程中已知方法培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸突變微生物和回收琥珀酸。本發(fā)明中，在曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)和常規(guī)突變株(曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP))之間比較琥珀酸的產(chǎn)量、副產(chǎn)物的產(chǎn)生和碳源代謝能力。曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)是通過從曼海姆菌屬菌株基因組中刪除乳酸脫氫酶編碼基因(ldhA)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因(pta)和乙酸激酶編碼基因(ackA)而獲得的突變微生物，其是未刪除果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因(fruA)的本發(fā)明突變微生物曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌 PALFK (KCTC11694BP)的親本株。與產(chǎn)琥珀酸突變株曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KTCT10973BP)相比，本發(fā)明的產(chǎn)琥珀酸突變微生物曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK(KCTC11694BP)的副產(chǎn)物(包括乳酸、丙酮酸、乙酸和甲酸)的產(chǎn)生最小化并且增加了琥珀酸的生產(chǎn)能力并接近理論產(chǎn)量(1.71-1.86mol/mol),表明其是生產(chǎn)琥拍酸的優(yōu)良菌株。另一方面，本發(fā)明涉及制備能利用蔗糖和甘油生產(chǎn)琥珀酸的突變微生物的方法，該方法包括解除產(chǎn)琥珀酸微生物中的蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制。本發(fā)明的另一實(shí)例，通過將大腸桿菌甘油激酶編碼基因?qū)肼Ｄ樊a(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)的基因組DNA中而構(gòu)建具有同時(shí)代謝蔗糖和甘油能力的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG (KTCT11693BP)。該構(gòu)建的菌株以高生產(chǎn)能力和產(chǎn)量生產(chǎn)琥珀酸且不產(chǎn)生副產(chǎn)物。也以之前描述的方式比較了產(chǎn)琥珀酸微生物曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG(KCTC11693BP)。另一方面，本發(fā)明還提供生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括步驟:在厭氧條件下培養(yǎng)前述產(chǎn)琥珀酸突變微生物；和從發(fā)酵液中回收琥珀酸。本發(fā)明中，可在含有蔗糖和甘油二者的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，且作為副產(chǎn)物的其他有機(jī)酸的產(chǎn)量是琥珀酸產(chǎn)量的1#%或更少。另一方面，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)能力提高的生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括步驟:(a)在厭氧條件下培養(yǎng) 以高產(chǎn)量生產(chǎn)琥珀酸的同時(shí)很少或不產(chǎn)生副產(chǎn)物的突變微生物，或者為了能夠同時(shí)利用蔗糖和甘油而解除蔗糖介導(dǎo)的甘油分解抑制機(jī)制所獲得的突變微生物；(b)濃縮發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞達(dá)到高濃度；(C)培養(yǎng)該高濃度細(xì)胞；和((1)從發(fā)酵液中回收琥珀酸。本發(fā)明中，濃縮發(fā)酵液中的細(xì)胞達(dá)到高濃度的步驟(b)可以通過接種高濃度生產(chǎn)菌株的接種法或膜式細(xì)胞循環(huán)生物反應(yīng)器(MCRB)法(以下簡稱“MCRB法”)實(shí)現(xiàn)。依照使用能同時(shí)利用蔗糖和甘油以生產(chǎn)琥珀酸的本發(fā)明突變微生物的產(chǎn)琥珀酸的方法，可以以接近理論產(chǎn)量的超高產(chǎn)量生產(chǎn)琥珀酸且沒有副產(chǎn)物。蔗糖的價(jià)格是通常用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的葡萄糖價(jià)格的大約1/4。而且，隨著全球生物柴油制造的快速增長，產(chǎn)生了作為副產(chǎn)物的甘油，并因超量供應(yīng)和需要一種處理甘油的合適方法使其價(jià)格降低。因此，甘油的價(jià)格非常低并持續(xù)的下降(Miller-Klein Associates, Oct.2006)。本發(fā)明的生產(chǎn)琥珀酸的方法的極高價(jià)值體現(xiàn)在能夠低成本地通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，不是需要大量原材料成本的化學(xué)合成方法，以接近理論產(chǎn)量的超高產(chǎn)量生產(chǎn)琥珀酸，并且以超高純度生產(chǎn)琥珀酸，從而使分離和純化的成本最小化。使用本發(fā)明的PALFK株能夠以非常高的接近理論產(chǎn)量(1.71到1.86mol/mol)的產(chǎn)量生產(chǎn)均一琥珀酸且沒有副產(chǎn)物。三個(gè)因素(包括生產(chǎn)能力、產(chǎn)量和副產(chǎn)物/琥珀酸的比率)是琥珀酸生產(chǎn)的工業(yè)化中最關(guān)鍵的因素。確切地說，與初始投資成本和能源成本相關(guān)的生產(chǎn)能力以及產(chǎn)量是原材料的有效使用的衡量標(biāo)準(zhǔn)，并且與占據(jù)生物工藝成本重要部分的原材料成本有關(guān)；副產(chǎn)物/琥珀酸的比例與占據(jù)生物工藝總成本的一半或更多的分離和純化成本有關(guān)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，使用PALFK菌株，使產(chǎn)量最大化并且使副產(chǎn)物/琥珀酸的比例最小化，將如前所述的三個(gè)關(guān)鍵因素中的兩個(gè)(產(chǎn)量和副產(chǎn)物/琥珀酸的比率)改進(jìn)到可達(dá)到的最高水平。此外，為找到改進(jìn)生產(chǎn)能力的方法進(jìn)行了廣泛的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種法和MCRB法增加發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度并提高琥珀酸生產(chǎn)能力，分別是親本株的至少2倍和10倍。實(shí)施例以下，在關(guān)于實(shí)例的更多細(xì)節(jié)方面描述本發(fā)明。顯然對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，這些實(shí)例僅為說明用途而不能解釋為限制本發(fā)明的范圍。尤其是，為了依據(jù)本發(fā)明刪除基因，下述實(shí)例僅舉例說明特定性的載體和作為宿主細(xì)胞的產(chǎn)琥珀酸微生物曼海姆菌屬菌。盡管如此，顯然對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，使用其他種類的產(chǎn)琥珀酸微生物也能夠提供產(chǎn)高純度琥珀酸的突變微生物。實(shí)施例1:構(gòu)建fru-A刪除載體(pSacHR06fruA)為了通過同源重組從產(chǎn)琥珀酸微生物的基因組中刪除fruA基因(果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因)，以下述方式構(gòu)建基因交換載體(交換基因的載體)。首先，以曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌MBEL55E(KCTC0769BP)的基因組DNA作為模板，以引物對(duì)SEQ ID N0S:1和2、引物對(duì)SEQID N0S: 3和4以及引物對(duì)SEQ ID N0S: 5和6分別進(jìn)行PCR，從而分別獲得包括fruA左側(cè)同源區(qū)域(HL)、氯霉素(Cm)抗性基因和fruA右側(cè)同源區(qū)域(HR)的PCR片段。之后，使用上述三個(gè)PCR片段作為模板以及引物SEQ ID N0S:1和6進(jìn)行重疊PCR，DNA片段用SacI和PstI消化并插入pSacHR06載體，從而構(gòu)建獲得pSacHR06fruA載體。SEQ ID NO:1:5’-ATCGCGGATCCGGTGGAAACCCTCGGTTTATTSEQ ID NO:2:5’-AATCTGCTCTGATGCGCAGCTAAAACCTGGTGCAATASEQ ID NO:3:5’-CCAGGTTTTAGCTGCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGSEQ ID NO:4:5' -AATTACACTTGAAACCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACSEQ ID NO:5:5’-ATCCACAGAATCAGGGTTTCAAGTGTAATTGGCGGAGSEQ ID NO:6:5’-TCGACGCGTCGACTTCATCTAACCCCAACGCTTG實(shí)施例2:構(gòu)建曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK株使用出于刪除fruA基因的目的而在實(shí)施例1中構(gòu)建的pSacHR06fruA載體從曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)的基因組中刪除fruA而構(gòu)建突變株。尤其是，接種曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)到BHI (Brain-HeartInfusion)固體培養(yǎng)基，39°C培養(yǎng)36小時(shí)。將形成的克隆接種到IOmL BHI液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)12小時(shí)。以1%的濃度將充分生長的細(xì)胞發(fā)酵液接種到IOOmL BHI液體培養(yǎng)基并在39°C下靜態(tài)培養(yǎng)器中培養(yǎng)。大約4-5小時(shí)后，發(fā)酵液的0D_達(dá)到大約0.3-0.5時(shí)，0_4°C保持20分鐘使得細(xì)胞不再生長。之后，4°C、4，500rpm離心發(fā)酵液15分鐘以收集細(xì)胞。之后，在4°C下用200mL10%的甘油溶液重懸細(xì)胞并在前述條件下離心。重懸和離心共進(jìn)行三次，同時(shí)每次減少1/210%甘油溶液的體積。最終獲得的細(xì)胞用等體積10%甘油溶液重懸，分裝并儲(chǔ)藏在_80°C。如前所述獲得的該細(xì)胞濃縮懸液與實(shí)施例1中構(gòu)建的基因刪除載體pSacHR06fruA混合并在2.5kV、25 μ F和200ohms的條件下進(jìn)行電穿孔以用載體轉(zhuǎn)化曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)。添加電穿孔細(xì)胞到BHI液體培養(yǎng)基并在39°C下靜態(tài)培養(yǎng)器中孵育I小時(shí)。之后，接種培養(yǎng)液到包含6.8 μ g/mL抗生素氯霉素的BHI固體培養(yǎng)基上并在39°C下靜態(tài)培養(yǎng)器中孵育48小時(shí)或更長時(shí)間。為了篩選發(fā)生雙交叉的克隆，將形成的克隆接種到包含氯 霉素(6.8 μ g/mL)和100g/L蔗糖的BHI固體培養(yǎng)基上并培養(yǎng)24小時(shí),此后將形成的克隆再次接種到同樣的培養(yǎng)基上。在包含抗生素的BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已在培養(yǎng)基上形成的突變株，并用Rochelle 等的方法(Rochelle 等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，100:59，1992)從培養(yǎng)的菌株中分離基因組DNA。用突變株中分離的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，并且對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳以確定fruA基因是否從基因組DNA中刪除。通過下述方式進(jìn)行兩次PCR確定是否刪除了 fruA基因。首先，以突變株基因組DNA作為模板和引物對(duì)SEQ ID N0S:7和8以及引物對(duì)SEQ ID N0S:9和10分別進(jìn)行PCR。對(duì)兩次PCR獲得的PCR片段進(jìn)行電泳以通過大小確定fruA的刪除。結(jié)果，構(gòu)建了曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTC11694BP)并保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures),韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology),保藏編號(hào)KCTCl1694BP。SEQ ID NO:7:5’ -CTATGATTTGGTCGGGCGTTTSEQ ID NO:8:5’-TGAATGGCAGAAATTCGAAASEQ ID NO:9:5’ -TGATCTTCCGTCACAGGTATSEQ ID NO:10:5’ ’ TTGACCGCACTTTGCACATC實(shí)施例3:構(gòu)建pME18glpK22載體和構(gòu)建轉(zhuǎn)入該載體的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG株為了獲取包含大腸桿菌甘油激酶編碼基因(glpK22)的DNA，使用大腸桿菌(Escherichia coli) K-12MG1655 (ATCC47076 ;美國典型培養(yǎng)物保藏中心，馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國)的基因組DNA和引物對(duì)SEQ ID NOS: 11和12、引物對(duì)SEQ ID N0S: 13和14以及引物對(duì)SEQ ID N0S : 15和 16分別進(jìn)行PCR。之后，以獲得的三個(gè)PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物包含glpK22基因，所述glpK22基因中編碼序列的第913對(duì)堿基由原始大腸桿菌K-12MG1655的glpK基因的鳥嘌呤變?yōu)橄佘?。已知相?duì)于非突變glpK，glpK基因表達(dá)產(chǎn)生的甘油激酶遭受較少的FBP和IIA引起的變構(gòu)抑制(Pettigrew等，J.Bacteriol.,178:2846，1996)。SEQ ID NO:11:5’-ACTCCGGAATTCAACGCACTGACAATCTCACTTSEQ ID NO:12:5' -CAGCGAAGCTTTTTGGGTAGAAAGTATAAAGACAGAATCACASEQ ID NO:13:5’-TTTATACTTTCTACCCAAAAAGCTTCGCTGTAATATGSEQ ID NO:14:5’-CCATAAACACCGCACTTTCCAACGCATAGTTCACTTCSEQ ID NO:15:5’-AACTATGCGTTGGAAAGTGCGGTGTTTATGGCAGGSEQ ID NO:16:5’-ACCTGCGAGCTCATTATTGATGTGTGCGGGGT將如上獲得的PCR 產(chǎn)物克隆到 pME18 (Jang 等，Appl.Environ.Microbiol.，73:5411，2007)的EcoRI和SacI位點(diǎn)，從而構(gòu)建pME18glpK22載體。并且使用引物SEQ IDN0S: 17到21由Sogent公司(韓國)對(duì)載體進(jìn)行測(cè)序。SEQ ID NO:17:5’-TAGCTATGTGTTAAAGCCTTSEQ ID NO:18:5' -ACCAGGGCACCACCAGCTCC
SEQ ID NO:19:5’ -CCGATTACACCAACGCCTCTSEQ ID NO:20:5’-ATGTGGTTCCGGCATTTACCSEQ ID NO:21:5’ -TTATGCCGCATCCGGTAGTCCC
將如前所述構(gòu)建的pME18glpK22載體轉(zhuǎn)入曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK(KCTC10973BP)以構(gòu)建曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG (KCTC11693BP)株。為了導(dǎo)入該表達(dá)載體，如實(shí)施例2中所描述的進(jìn)行細(xì)胞濃縮懸液的制備和電穿孔，并且將細(xì)胞接種到含有25 μ g/mL氨芐青霉素(代替氯霉素)的BHI固體培養(yǎng)基上，并在39°C下靜態(tài)培養(yǎng)器中培養(yǎng)48小時(shí)。生成的純克隆在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時(shí)，之后與甘油溶液混合使終濃度為15% (w/v)，在這之后，細(xì)胞溶液被儲(chǔ)存在_80°C備用。實(shí)施例4:使用曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK株和PALKG株生產(chǎn)均一琥珀酸在含有10g/L蔗糖的IOmL MH5培養(yǎng)基(每升，2.5g酵母提取物，2.5g蛋白胨，IgNaCl,0.02g CaCl2.2Η20，0.2g MgCl2.6H20, 8.7g K2HPO4, andl0.0gNaHCO3)中和 39 °C 厭氧條件下，培養(yǎng)實(shí)施例2和3中構(gòu)建的曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTCl 1694BP)或PALKG(KCTC11693BP)達(dá)8小時(shí)。之后，在300mL同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株。接種發(fā)酵液到包含2.5L 合成培養(yǎng)基(每升，Ig NaCl, 2g(NH4)2ΗΡ04, 0.02g CaCl2.2H20, 0.2g MgCl2.6H20, 8.709gK2HPO4, 0.5g半胱 氨酸，0.5g甲硫氨酸，0.5g丙氨酸,0.5g天冬酰胺，0.5g天冬氨酸，2.46g脯氨酸，0.5g絲氨酸，0.005g煙酸，0.005g泛酸鈣，0.005g鹽酸吡哆醇，0.005g硫胺，0.005g抗壞血酸和0.005g生物素)的微生物反應(yīng)器(Bioflo3000，New BrunswickScientific C0., Edison,新澤西州，美國)中進(jìn)行發(fā)酵。在22.25g/L (65mM)起始鹿糖濃度、4.6g/L (50mM)起始甘油濃度、39°C的溫度、200rpm，同時(shí)向反應(yīng)器中以(X2VVm (二氧化碳體積/培養(yǎng)器工作體積/每分)的速度通入純二氧化碳的條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中，使用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH值到6.5，并且添加以下抗生素:對(duì)于PALK添加50 μ g/mL壯觀霉素，對(duì)于PALFK添加6.8 μ g/mL氯霉素，對(duì)于PALKG添加25 μ g/mL氨芐青霉素。為生產(chǎn)高濃度的琥珀酸，當(dāng)碳源完全消耗時(shí)，半連續(xù)地將700g/L蔗糖和甘油溶液添加到發(fā)酵液中。為與PALFK的性能相比較，以前述相同的方式培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸菌株曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)。用分光光度計(jì)測(cè)量并用之前測(cè)量的分光光度計(jì)的吸收值和干細(xì)胞重量的驗(yàn)證試驗(yàn)計(jì)算發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度。發(fā)酵期間，定期地從生物反應(yīng)器中收集樣品。13，OOOrpm離心所收集的樣品10分鐘，之后通過高效液相色譜(HPLC)分析上清液中的多種代謝物、琥珀酸、蔗糖和甘油的濃度。結(jié)果，如圖2和表I中所示，與曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK (KCTC10973BP)相比，曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK (KCTC11694BP)顯示了更高的琥珀酸產(chǎn)量并且產(chǎn)生了高純度的琥珀酸且不產(chǎn)生副產(chǎn)物。甘油攝取的減少與增加大約7倍的琥珀酸表現(xiàn)的程度一致，并且甘油的攝取與副產(chǎn)物產(chǎn)生的減少直接相關(guān)，因?yàn)榕c使用蔗糖不同，使用甘油沒有介導(dǎo)與副產(chǎn)物直接相關(guān)的丙酮酸鹽的產(chǎn)生。此外，增加的甘油攝取可以減少需用的蔗糖的量，從而使用減少的碳源量以高產(chǎn)量生產(chǎn)均一琥珀酸。曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG (KCTC11693BP)還顯示了與PALFK株稍微不同的模式，其中在不削弱蔗糖利用和細(xì)胞生長的范圍內(nèi)增加PALKG株中甘油的利用，并因此維持丙酮酸鹽的積累與PALK株相同的水平。然而，PALKG株利用甘油的能力比PALK株至少高兩倍，結(jié)果，PALKG株以1.39mol/mol的產(chǎn)量生產(chǎn)琥珀酸，其比PALK株(1.24mol/mol)高。表1:曼海姆株培養(yǎng)物的特征
權(quán)利要求
1.一種能同時(shí)利用蔗糖和甘油以生產(chǎn)琥珀酸的突變微生物，該突變微生物通過解除產(chǎn)琥珀酸微生物中的蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制而獲得。
2.權(quán)利要求1所述的突變微生物，其中產(chǎn)琥珀酸微生物是瘤胃細(xì)菌。
3.權(quán)利要求2所述的突變微生物，其中所述瘤胃細(xì)菌選自以下組成的組:曼海姆菌屬(Mannheimia sp.)菌、放線桿菌屬(Actinobacillus sp.)菌和厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum sp.)菌。
4.權(quán)利要求3所述的突變微生物，其中所述曼海姆菌屬菌株是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK(Mannheimia succiniciproducens PALK) (KCTC10973BP)。
5.權(quán)利要求1所述的突變微生物，其中通過刪除編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因解除分解代謝抑制機(jī)制。
6.權(quán)利要求4所述的突變微生物，其中所述突變微生物是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALFK(Mannheimia succiniciproducens PALFK) (KCTC11694BP)。
7.權(quán)利要求1所述的突變微生物，其中通過引入編碼甘油激酶的基因解除分解代謝抑制機(jī)制。
8.權(quán)利要求7所述的突變微生物，其中所述產(chǎn)琥珀酸突變微生物是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALKG (Mannheimia succiniciproducens PALKG) (KCTC11693BP)。
9.一種制備能利用蔗糖和甘油生產(chǎn)琥珀酸的突變微生物的方法，該方法包括解除產(chǎn)琥珀酸微生物中蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述產(chǎn)琥珀酸微生物是瘤胃微生物。
11.權(quán)利要求10所述·的方法，其中所述瘤胃微生物選自以下組成的組:曼海姆菌屬菌、放線桿菌屬菌和厭氧螺菌屬菌。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述曼海姆菌屬菌株是曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌PALK(KCTC10973BP)。
13.權(quán)利要求9所述的方法，其中通過刪除編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因解除分解代謝抑制機(jī)制。
14.權(quán)利要求9所述的方法，其中通過引入編碼甘油激酶的基因解除分解代謝抑制機(jī)制。
15.一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括步驟:在厭氧條件下培養(yǎng)權(quán)利要求1至8的任一種產(chǎn)琥珀酸突變微生物；和從發(fā)酵液中回收琥珀酸。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中在含有蔗糖和甘油的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的其他有機(jī)酸的量是琥珀酸產(chǎn)量的lwt%或更少。
18.—種生產(chǎn)能力增加的產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括步驟: (a)在厭氧條件下培養(yǎng)以高產(chǎn)量產(chǎn)琥珀酸且很少或不產(chǎn)生副產(chǎn)物的突變微生物，或權(quán)利要求I至8中任一種突變微生物； (b)濃縮發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞達(dá)到高濃度； (c)培養(yǎng)該高濃度的細(xì)胞；和 (d)從發(fā)酵液中回收琥珀酸。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中通過接種法或膜式細(xì)胞循環(huán)生物反應(yīng)器(MCRB)法實(shí)施濃縮發(fā)酵液中 的細(xì)胞達(dá)到高濃度的步驟(b )。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能同時(shí)利用蔗糖和甘油作為碳源的產(chǎn)琥珀酸突變微生物。尤其是，本發(fā)明涉及一種能同時(shí)利用蔗糖和甘油生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)琥珀酸突變微生物，該突變生物是通過解除產(chǎn)琥珀酸微生物中蔗糖介導(dǎo)的甘油分解代謝抑制機(jī)制而獲。當(dāng)培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸突變微生物時(shí)，其同時(shí)地利用蔗糖和甘油，因此能以最大產(chǎn)量接近理論產(chǎn)量的高生產(chǎn)能力生產(chǎn)琥珀酸，同時(shí)最小化副產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，依據(jù)本發(fā)明，可以更低成本地產(chǎn)生以常規(guī)方法低產(chǎn)量生產(chǎn)的多種還原性化學(xué)品。
文檔編號(hào)C12P7/40GK103249832SQ201180051937
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者李相燁, 李政旭, 崔松, 李鐘浩 申請(qǐng)人:韓國科學(xué)技術(shù)院