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細(xì)胞片疊層化物的制造方法、由該方法得到的具有血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物及其利用方法

文檔序號(hào):407628閱讀:137來源:國知局
專利名稱:細(xì)胞片疊層化物的制造方法、由該方法得到的具有血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物及其利用方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在醫(yī)學(xué)、生物、藥物開發(fā)、藥學(xué)等領(lǐng)域有用的細(xì)胞片疊層化物的制造方法、由該方法得到的具有血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物及其利用方法。本申請(qǐng)是主張2010年9月14日提出的日本申請(qǐng)(日本特愿2010-225200)為基礎(chǔ)的優(yōu)先權(quán)的申請(qǐng)。
背景技術(shù)
今天,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)顯著進(jìn)步,以動(dòng)物細(xì)胞為對(duì)象的研究開發(fā)也廣泛在各種領(lǐng)域被實(shí)施。成為對(duì)象的動(dòng)物細(xì)胞的使用方法也不僅是開發(fā)當(dāng)初的將細(xì)胞本身制品化、將其產(chǎn)生物制品化,現(xiàn)在通過分析細(xì)胞和/或其細(xì)胞表層蛋白質(zhì)來設(shè)計(jì)有效的藥物、將患者本人的細(xì)胞在活體外再生、或者提高其功能然后送回活體內(nèi)進(jìn)行治療等方式也在逐漸被實(shí)施?,F(xiàn)在,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)、以及評(píng)價(jià)、分析、利用的技術(shù)是研究者關(guān)注的一個(gè)領(lǐng)域。但是,包含人細(xì)胞在內(nèi),動(dòng)物細(xì)胞大多是附著依賴性的。即,要在活體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí),需要使它們一次性附著于基材表面。并且,不能將培養(yǎng)的細(xì)胞剝離成一個(gè)一個(gè),還需要保持在該基材表面上培養(yǎng)的形態(tài)使其剝離。特別對(duì)于使患者本人的細(xì)胞在活體外再生的技術(shù)而言,近年來,將治療困難的臟器替換成他人的臟器的臟器移植已經(jīng)一般化。成為對(duì)象的臟器也實(shí)際上多樣化為皮膚、角膜、腎臟、肝臟、心臟等,另外,術(shù)后恢復(fù)也特別良好,作為一種醫(yī)療技術(shù)已經(jīng)逐漸被確立。作為一例列舉角膜移植,約50年前日本也設(shè)立眼庫開始了移植活動(dòng)。然而,據(jù)說供體數(shù)尚且少,僅國內(nèi)每年需要角膜移植的患者約由2萬人,與此相對(duì),實(shí)際進(jìn)行移植治療的患者僅為約1/10的2000人左右。雖然有角膜移植這樣基本確立的技術(shù),但由于供體不足這樣的問題,現(xiàn)狀是要求其他的醫(yī)療技術(shù)。基于這樣的背景,開發(fā)了要將患者本人的正常細(xì)胞培養(yǎng)至所需大小將其移植的技術(shù)。日本特開平02-21 1865號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)I)顯示了在用對(duì)水的上限或者下限臨界溶解溫度為0 80°C的聚合物包覆了基材表面而得的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上,將細(xì)胞在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上培養(yǎng),然后調(diào)整到上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下,從而無酶處理而剝離培養(yǎng)細(xì)胞的新的細(xì)胞培養(yǎng)法。另外,日本特開平
05-192138號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)2)記載了,通過利用該溫度應(yīng)答性細(xì)胞培養(yǎng)基材將皮膚細(xì)胞在上限臨界溶解溫度以下或者下限臨界溶解溫度以上培養(yǎng),然后調(diào)整至上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下,從而以低損傷剝離培養(yǎng)皮膚細(xì)胞。通過利用溫度應(yīng)答性細(xì)胞培養(yǎng)基材,可以對(duì)現(xiàn)有的培養(yǎng)技術(shù)謀求各種新的展開。進(jìn)而,日本再表02-008387號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)3)中發(fā)現(xiàn),在用溫度應(yīng)答性聚合物包覆了基材表面的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上培養(yǎng)心肌組織的細(xì)胞,得到心肌樣細(xì)胞片,然后,使培養(yǎng)液溫度為上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下,使培養(yǎng)的多層化細(xì)胞片粘附于聚合物膜,直接與聚合物膜一起剝離,并且用規(guī)定的方法使其3維結(jié)構(gòu)化,從而可以構(gòu)建結(jié)構(gòu)缺陷少、作為活體外(in vitro)的心肌樣組織具有數(shù)種功能的細(xì)胞片、和3維結(jié)構(gòu)。然而,在上述的現(xiàn)有技術(shù)中,心肌樣細(xì)胞片的疊層化不能無限進(jìn)行,3層左右為極限,強(qiáng)烈要求能夠簡便地多次疊層化的技術(shù)。為了解決如上問題,F(xiàn)ASEB.J.,20 (6),708-710 (2006)(非專利文獻(xiàn)I)中嘗試了在活體內(nèi)將細(xì)胞片疊層化,顯示得到了厚的心肌片疊層化物。其中,已知為了獲得有厚度的細(xì)胞片疊層化物,必須向被疊層化的各細(xì)胞或者各細(xì)胞片供給營養(yǎng)和/或氧,但在FASEB.J.,20 (6),708-710 (2006)(非專利文獻(xiàn)I)的方法中,需要反復(fù)向活體內(nèi)移植細(xì)胞片,其必須相應(yīng)于其次數(shù)地將移植部位開口,是對(duì)于被移植側(cè)強(qiáng)加了大的負(fù)擔(dān)的方法,強(qiáng)烈要求解決該課題的、能夠簡便地多次疊層化的技術(shù)?,F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開平02-211865號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開平05-192138號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:日本再表02-008387號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:FASEB.J.,20(6) ,708-710(2006)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明的目的是解決如上所述的關(guān)于細(xì)胞片的疊層化的問題。即,本發(fā)明提供基于與現(xiàn)有技術(shù)完全不同想法創(chuàng)造的新的細(xì)胞片疊層化物的制造方法、由該方法得到的具有血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物及其利用方法。用于解決課題的方法本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題而從各種角度實(shí)施研究而進(jìn)行了研究開發(fā)。其結(jié)果發(fā)現(xiàn),可以制作具有動(dòng)靜脈袢、且構(gòu)建了毛細(xì)血管網(wǎng)的血管床,向該血管床上疊層細(xì)胞片,通過在活體外灌注培養(yǎng)基而在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng),從而能簡便地將細(xì)胞片較厚地進(jìn)行疊層化。另外,利用由該方法得到的帶血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物,可在活體外評(píng)價(jià)藥劑對(duì)活體組織的效果。本發(fā)明是基于該見解而完成的。S卩,本發(fā)明提供一種細(xì)胞片疊層化物的制造方法,其特征在于,制作具有動(dòng)靜脈袢、構(gòu)建了毛細(xì)血管網(wǎng)的血管床,向該血管床上疊層細(xì)胞片,相對(duì)于活體內(nèi)的組織片,通過在活體外灌注培養(yǎng)基而在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng)。進(jìn)而,本發(fā)明提供利用該細(xì)胞片疊層化物的方法。認(rèn)為本發(fā)明是使用由利用血管床而能夠在活體外制作有厚度的細(xì)胞片疊層化物這樣的在世界上沒有類似的新的想法而獲得的細(xì)胞結(jié)構(gòu)物而首次實(shí)現(xiàn)的極為重要的發(fā)明。另夕卜,在本發(fā)明中,有時(shí)將細(xì)胞片疊層化物表達(dá)為細(xì)胞片疊層體、多層化細(xì)胞片疊層體,但都表示將細(xì)胞片進(jìn)行多片疊層而得的物質(zhì),并不因這些表達(dá)的不同而受到任何限制。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明所示的制造方法,只要在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng),將該細(xì)胞片疊層化,就可以簡便地制作有厚度的細(xì)胞片疊層化物。這樣的有厚度的細(xì)胞片疊層化物可以作為活體內(nèi)組織樣的物質(zhì)進(jìn)行移植,可期待成為在各種組織的再生醫(yī)療中有用的物質(zhì)。另外,利用通過利用血管床得到的帶有血管網(wǎng)的細(xì)胞片疊層化物,從而可以簡便地在活體外評(píng)價(jià)藥劑對(duì)活體組織的效果。這樣的評(píng)價(jià)體系不僅可代替實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,還可得到不依賴動(dòng)物的個(gè)體差異的穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。


圖1是顯示實(shí)施例1的血管床制作時(shí)的概要的圖。圖2是顯示向?qū)嵤├?中得到的血管床灌注培養(yǎng)基時(shí)的情況的圖。圖3是顯示向?qū)嵤├?中使用的血管床循環(huán)的培養(yǎng)基的概要的圖。圖4是顯示實(shí)施例1的細(xì)胞片疊層化物內(nèi)的血管網(wǎng)的情況的圖。圖5是顯示實(shí)施例1的細(xì)胞片疊層化物內(nèi)的血管網(wǎng)的情況的圖。圖6是顯示實(shí)施例2的細(xì)胞片疊層化物的活性的圖。圖7是顯示將實(shí)施例3的細(xì)胞片疊層化物進(jìn)一步疊層時(shí)的情況的圖。圖8是顯示探索促進(jìn)實(shí)施例4的細(xì)胞片疊層化物的血管新生的細(xì)胞因子的結(jié)果的圖。由大鼠采取血液,用ELISA法測定血清中所含有的細(xì)胞因子濃度。圖9是顯示實(shí)施例5的血管床制作時(shí)的概念圖的圖。圖10是顯示在實(shí)施例4中制作的血管床內(nèi)新形成的毛細(xì)血管的圖。箭頭所夾的區(qū)域?yàn)樾律拿?xì)血管。圖11是為了確認(rèn)實(shí)施例4中制作的細(xì)胞片疊層化物的功能而向活體內(nèi)進(jìn)行再移植的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是簡便地制作具有厚度的細(xì)胞片疊層化物。因此,要求如上述那樣在細(xì)胞片疊層化物中構(gòu)建血管網(wǎng)。為了簡便地構(gòu)建該血管網(wǎng),本發(fā)明的特征在于,采取具有動(dòng)脈及靜脈且具有血流的活體組織片,通過在活體外灌注培養(yǎng)基而制成血管床,通過向該血管床疊層細(xì)胞片而在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng)。血管床是在活體組織、臟器中可見的結(jié)構(gòu),是指合并了毛細(xì)血管與其周圍的組織的結(jié)構(gòu)。血管床介由無數(shù)地遍布于在血管床內(nèi)的毛細(xì)血管的薄壁,實(shí)現(xiàn)交換活體組織內(nèi)的氧、葡萄糖、其他營養(yǎng)素的功能。像二氧化碳這樣的老廢物向血管床的毛細(xì)血管內(nèi)滲出。在活體組織中組織液相對(duì)保持一定是因?yàn)榇嬖谕ㄟ^毛細(xì)血管的物質(zhì)交換。本發(fā)明中,為了在細(xì)胞片內(nèi)有效地構(gòu)建毛細(xì)血管網(wǎng),并供給營養(yǎng)素、氧等而利用血管床。在本發(fā)明中利用的血管床只要是具有動(dòng)脈及靜脈且具有血流的活體組織片、皮瓣、或具有動(dòng)脈及靜脈的人工血管床,任一種均可,沒有特別限定。例如,作為活體組織片,肌肉、腸系膜、大網(wǎng)膜等已經(jīng)高度地構(gòu)建有血管網(wǎng),因而優(yōu)選。其中,肌肉是活體組織上營養(yǎng)、氧充分被供給的部位,即更進(jìn)一步高度地構(gòu)建有血管網(wǎng),因而更優(yōu)選。本發(fā)明中,可以對(duì)這些組織片、皮瓣、以及具有動(dòng)脈及靜脈的人工血管床進(jìn)一步構(gòu)建血管網(wǎng)。對(duì)其方法沒有特別限定,可舉出例如:對(duì)組織片、皮瓣封閉一部分血管,在活體內(nèi)進(jìn)行處理直至進(jìn)一步構(gòu)建血管網(wǎng)而血流循環(huán)的方法;此時(shí)在無菌的容器內(nèi)封入該組織片、皮瓣,制作與活體僅通過動(dòng)靜脈連接的狀態(tài),在活體內(nèi)進(jìn)行處理直至血管網(wǎng)進(jìn)一步構(gòu)建 而血流循環(huán)的方法;施與VEGF, FGF等促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子的方法等。對(duì)本發(fā)明中使用的血管床的動(dòng)物種的來源,沒有特別限制,可舉出例如,人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、絨猴、兔、狗、貓、綿羊、豬、山羊、猴、黑猩猩或它們的免疫缺陷動(dòng)物等,將本發(fā)明的細(xì)胞片疊層化物用于人的治療的情況下,優(yōu)選使用來源于人、豬、猴、黑猩猩的血管床。動(dòng)靜脈袢是指構(gòu)建有如下那樣的流路的血管流路,S卩,動(dòng)脈與靜脈連接,使血液、培養(yǎng)基等液體成分由一個(gè)部位或多個(gè)部位的血管流入時(shí),液體成分由除了流入的血管以外的一個(gè)部位或多個(gè)部位的血管流出這樣的流路。對(duì)于動(dòng)靜脈袢的長度沒有特別限定,可根據(jù)血管床的大小來適當(dāng)決定。對(duì)于連接動(dòng)脈與靜脈的方法沒有特別限定,可在動(dòng)脈與靜脈之間構(gòu)建毛細(xì)血管網(wǎng),也可以使被切斷的動(dòng)脈的一端與被切斷的靜脈的一端吻合來制作。對(duì)于在動(dòng)脈與靜脈之間構(gòu)建毛細(xì)血管網(wǎng)的方法沒有特別限定,例如可舉出,將動(dòng)脈與靜脈分別連接的活體組織片用電手術(shù)刀等切離,制作出活體組織片與動(dòng)脈和靜脈各一根連接的狀態(tài),維持該狀態(tài)在活體內(nèi)留置一周左右的方法。其結(jié)果是,在動(dòng)脈與靜脈之間發(fā)生毛細(xì)血管的短路(動(dòng)靜脈袢),構(gòu)建了由動(dòng)脈介由毛細(xì)血管網(wǎng)返回靜脈的流路。本發(fā)明中的人工血管床是指構(gòu)了建毛細(xì)血管網(wǎng),并將毛細(xì)血管網(wǎng)之間用凝膠和/或細(xì)胞填充而得的血管床樣結(jié)構(gòu)物。來源于活體組織的血管床,除了構(gòu)成毛細(xì)血管的細(xì)胞之外,還包含來源于組織的各種細(xì)胞。因此,在來源于活體組織的血管床上灌注培養(yǎng)細(xì)胞片疊層化物時(shí),有時(shí)來源于血管床的細(xì)胞代謝物也混入細(xì)胞片疊層體?;烊氲募?xì)胞代謝物有時(shí)對(duì)于血管床上的細(xì)胞片的維持培養(yǎng)是優(yōu)選的,和/或促進(jìn)細(xì)胞片內(nèi)的血管網(wǎng)形成而是優(yōu)選的。另一方面,混入的細(xì)胞代謝物也有時(shí)根據(jù)構(gòu)成細(xì)胞片的細(xì)胞的種類不同,而給維持培養(yǎng)帶來不良影響,和/或根據(jù)疊層化的細(xì)胞片的使用用途(例如,在移植中利用、或評(píng)價(jià)細(xì)胞片的活性的情況下)不同而不優(yōu)選。選擇來源于活體的血管床還是人工血管床,根據(jù)目的來選擇即可,沒有特別限定。對(duì)制作具有動(dòng)脈及靜脈的人工血管床的方法沒有特別限定,可舉出例如以下方法:使被無菌的容器內(nèi)分隔的區(qū)域內(nèi),內(nèi)包與活體內(nèi)的動(dòng)脈和靜脈吻合的動(dòng)靜脈袢,在被分隔的區(qū)域內(nèi)填充凝膠,通過留置于活體內(nèi)來構(gòu)建毛細(xì)血管網(wǎng)。作為制作人工血管床的容器,只要是活體適合性基材則沒有特別限定,可以使用在醫(yī)療用器具等的領(lǐng)域通常的材料。作為具體例,可舉出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚氨酯、聚脲、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸衍生物、聚丙烯腈、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酰胺衍生物、聚砜、聚碳酸酯、纖維、纖維衍生物、聚硅氧烷、玻璃、陶瓷、金屬等。這些材料可以單獨(dú)使用,也可以組合使用。人工血管床的大小,可根據(jù)制作的細(xì)胞片疊層化物、移植的細(xì)胞片疊層化物、制作人工血管床的活體組織的部位等適當(dāng)進(jìn)行最優(yōu)化,沒有特別限定。對(duì)填充人工血管床的凝膠沒有特別限定,在為了將得到的細(xì)胞片疊層化物用于向活體內(nèi)移植治療的情況下,包含生物降解性聚合物的凝膠是適合的。另外,這種情況下,生物降解性聚合物部分在活體內(nèi)消失,本發(fā)明的細(xì)胞片疊層化物與活體通過血管連接。對(duì)這樣的生物降解性聚合物的種類沒有特別限定,可舉出膠原、纖維蛋白、凝膠、多糖類、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、殼多糖、脫乙酰殼多糖等的單獨(dú)物質(zhì)、或者2種以上的混合物??稍谔畛溆谌斯ぱ艽驳哪z中混合細(xì)胞。混合于凝膠中的細(xì)胞可舉出由活體組織直接采取的細(xì)胞、直接采取并通過培養(yǎng)系等使其分化后的細(xì)胞、或者細(xì)胞株,對(duì)其種類沒有任何限制。例如,在以心肌組織的再生、或者評(píng)價(jià)心肌功能的方法為目的的情況下,作為使用的細(xì)胞,可列舉心肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、 來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以肝組織的再生、模擬肝組織的人工肝臟的制作、或者評(píng)價(jià)肝組織的功能的方法等為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞(KupfTer cell)、陷窩細(xì)胞(pit cell)、膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以腎組織的再生、模擬腎組織的人工腎臟的制作、或者評(píng)價(jià)腎功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉腎細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、中間細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以腎上腺組織的再生、模擬腎上腺的人工腎上腺的制作、或者評(píng)價(jià)腎上腺功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、球狀帶細(xì)胞、束狀帶細(xì)胞、網(wǎng)狀帶細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以皮膚的再生、或者評(píng)價(jià)皮膚功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、豎毛肌細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以粘膜組織的再生、或者評(píng)價(jià)粘膜組織的功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,使用從構(gòu)成粘膜的組織采取的細(xì)胞。作為粘膜的種類,可列舉頰粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜等。可列舉從粘膜組織采取的細(xì)胞中任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。對(duì)于上述的細(xì)胞的含有比率沒有特別限定。此時(shí),如果在人工血管床內(nèi)混合血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞等,則人工血管床內(nèi)的血管網(wǎng)的構(gòu)建可高效地進(jìn)行,因而優(yōu)選。可以通過在填充于人工血管床的凝膠中預(yù)先混合促進(jìn)血管新生的血管生長因子等,來構(gòu)建血管網(wǎng)。對(duì)在人工血 管床中實(shí)施血管誘導(dǎo)的方法也沒有特別限定,可舉出例如,在凝膠中直接混合血管生長因子的方法;將作為血管生長因子的FGF包埋于微球,將該微球與凝膠進(jìn)行混合,長時(shí)間由微球放出FGF的方法等。對(duì)在血管床中灌注的培養(yǎng)基的流速?zèng)]有特別限定,將不破壞血管床內(nèi)的流路的程度的流速作為最大的流速,灌注的培養(yǎng)基向血管床內(nèi)浸出、培養(yǎng)基可到達(dá)血管床表面的流速作為最小的流速即可。作為其數(shù)值,受到流路的大小和/或血管床的性質(zhì)、大小、細(xì)胞片的大小等的因子很大影響,因此不能具體地顯示。本發(fā)明將這樣操作得到的具有血管網(wǎng)的活體組織片、皮瓣,或具有動(dòng)脈及靜脈的人工血管床分離于活體外并設(shè)置于活體外的灌注培養(yǎng)裝置中,在移植于血管床上的細(xì)胞片上構(gòu)建血管網(wǎng)。此時(shí),在血管床內(nèi)循環(huán)的為培養(yǎng)基、血液、血清等,不特別限定,作為操作簡便的物質(zhì)可列舉培養(yǎng)基。對(duì)于該培養(yǎng)基的種類,根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞的種類按照常用方法進(jìn)行適當(dāng)選擇即可,沒有特別限定,優(yōu)選適合構(gòu)成在血管床上培養(yǎng)的細(xì)胞片的細(xì)胞的培養(yǎng)基。例如,如果將由心肌細(xì)胞形成的細(xì)胞片在血管床上疊層化,則優(yōu)選培養(yǎng)心肌細(xì)胞的M199培養(yǎng)基等。對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞片中使用的細(xì)胞的種類不特別限定,只要使用所得的細(xì)胞片疊層化物,并使用來自要移植的部位的細(xì)胞、或要評(píng)價(jià)的臟器或者來自組織的細(xì)胞即可。例如,在以心肌組織的再生、或者評(píng)價(jià)心肌功能的方法為目的的情況下,作為使用的細(xì)胞,可列舉心肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以肝組織的再生、模擬肝組織的人工肝臟的制作、或者評(píng)價(jià)肝組織的功能的方法等為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞、陷窩細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以腎組織的再生、模擬腎組織的人工腎臟的制作、或者評(píng)價(jià)腎功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉腎細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、中間細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以腎上腺組織的再生、模擬腎上腺的人工腎上腺的制作、或者評(píng)價(jià)腎上腺功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、球狀帶細(xì)胞、束狀帶細(xì)胞、網(wǎng)狀帶細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以皮膚的再生、或者評(píng)價(jià)皮膚功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞,可列舉表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、豎毛肌細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、來自骨髓的細(xì)胞、來自脂肪的細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。在以粘膜組織的再生、或者評(píng)價(jià)粘膜組織的功能的方法為目的的情況下,例如,作為使用的細(xì)胞 ,使用從構(gòu)成粘膜的組織采取的細(xì)胞即可。作為粘膜的種類,可列舉頰粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜等??闪信e從粘膜組織采取的細(xì)胞中的任I種、或者2種以上的細(xì)胞混合而成的混合物等,對(duì)于其種類沒有任何限制。對(duì)于上述的細(xì)胞的含有比率沒有特別限定。此時(shí),如果在細(xì)胞片內(nèi)混合血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮前體細(xì)胞等,則人工血管床內(nèi)的血管網(wǎng)的構(gòu)建能有效進(jìn)行,因而優(yōu)選。本發(fā)明中使用的細(xì)胞可列舉從活體組織直接采取的細(xì)胞、直接采取并用培養(yǎng)系等使其分化后的細(xì)胞、或者細(xì)胞株,對(duì)其種類沒有任何限制。對(duì)這些的細(xì)胞的來源不特別限制,可列舉例如,人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、貓、綿羊、豬、山羊、猴、黑猩猩或它們的免疫缺陷動(dòng)物等,在將本發(fā)明的細(xì)胞片疊層化物用于人的治療的情況下,優(yōu)選使用來自人、豬、猴、黑猩猩的細(xì)胞。對(duì)本發(fā)明中所利用的細(xì)胞不特別限定,例如可以是將細(xì)胞通過試劑、蛋白質(zhì)、基因等的至少I種以上方法進(jìn)行熒光染色和/或色素染色而得的細(xì)胞。在利用導(dǎo)入了報(bào)告基因的細(xì)胞時(shí),只要檢測由報(bào)告基因表達(dá)而形成的報(bào)告蛋白產(chǎn)生的熒光、或報(bào)告蛋白與特異性底物反應(yīng)時(shí)放出的熒光,就可以知道細(xì)胞片或細(xì)胞片疊層體的活性。對(duì)利用的報(bào)告基因、或報(bào)告蛋白質(zhì)不特別限定,可列舉例如,綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、DsReD, ^ -葡糖醛酸糖苷酶、LacZ、力工于''、螢光素酶、堿性磷酸酶等。向細(xì)胞導(dǎo)入基因的方法只要按照常規(guī)即可,不特別限定,可列舉例如,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒載體法、磷酸鈣法、電穿孔法、DEAE葡聚糖法、微注射法等。另外,可以利用這些基因?qū)敕?,也可以利用來自?bào)告基因已經(jīng)被導(dǎo)入宿主基因組內(nèi)的基因?qū)雱?dòng)物(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)的細(xì)胞。對(duì)于調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá)的啟動(dòng)子序列不特別限定,根據(jù)報(bào)告基因表達(dá)的檢測目的適宜選擇即可。本發(fā)明中的細(xì)胞片可以如下得到的:在表面包覆了水合力在0 80°C的溫度范圍變化的聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上,在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域培養(yǎng)細(xì)胞,然后,將培養(yǎng)基變化至形成聚合物的水合力強(qiáng)的狀態(tài)的溫度,從而將培養(yǎng)的細(xì)胞剝離成片狀。此時(shí),細(xì)胞在表面包覆了水合力在0 80°C的溫度范圍變化的聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)支撐體上,在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域被培養(yǎng)。該溫度通常優(yōu)選作為培養(yǎng)細(xì)胞的溫度的37°C。本發(fā)明中使用的溫度應(yīng)答性高分子可以使均聚物、共聚物的任一者。作為這樣的高分子,可列舉例如,日本特開平2-211865號(hào)公報(bào)所記載的聚合物。具體例如,可通過以下單體的均聚或共聚來獲得。作為可使用的單體,可列舉例如,(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N,N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或乙烯基醚衍生物,在共聚物的情況下,可以使用其中任意2種以上。進(jìn)而,還可以使用與除了上述單體以外的單體類的共聚物、聚合物彼此的接枝或共聚、或聚合物、共聚物的混合物。另外,在不損害聚合物本來的性質(zhì)的范圍內(nèi)還可以進(jìn)行交聯(lián)。此時(shí),由于被培養(yǎng)、剝離的是細(xì)胞,因而分離在5°C 50°C的范圍進(jìn)行,因此作為溫度應(yīng)答性聚合物,可列舉聚-N-正丙基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度21°C )、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度27V )、聚-N-異丙基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度32°C )、聚-N-異丙基甲基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度43°C )、聚-N-環(huán)丙基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度45°C )、聚-N-乙氧基乙基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約35V )、聚-N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約45°C )、聚-N-四氫糠基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約28°C )、聚-N-四氫糠基甲基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度約35°C )、聚-N,N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度56°C )、聚-N,N- 二乙基丙烯酰胺(均聚體的下限臨界溶解溫度32°C)等。作為用于本發(fā)明中使用的共聚的單體,可列舉聚丙烯酰胺、聚-N,N-二乙基丙烯酰胺、聚-N,N-二甲基丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸羥基乙 酯、聚丙烯酸羥基乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素、羧甲基纖維素等含水聚合物等,但不特別限制。對(duì)本發(fā)明中使用的、向上述各聚合物的基材表面的包覆方法不特別限制,可以通過例如,將基材和上述單體或聚合物通過電子線照射(EB)、y射線照射、紫外線照射、等離子體處理、電暈處理、有機(jī)聚合反應(yīng)的任一方法,或者涂布、混煉等物理性吸附等來進(jìn)行。向培養(yǎng)基材表面的溫度應(yīng)答性聚合物的包覆量可以為1.1 2.3i!g/Cm2的范圍,優(yōu)選為1.4 1.9 ii g/cm2,進(jìn)一步優(yōu)選為1.5 1.8 ii g/cm2。當(dāng)包覆量少于1.1 ii g/cm2時(shí),即使給予刺激也難以剝離該聚合物上的細(xì)胞,操作效率顯著變差,因而不優(yōu)選。相反如果為2.3 y g/cm2以上,則細(xì)胞難以附著到該區(qū)域,使細(xì)胞充分附著變得困難。這種情況下,如果在溫度應(yīng)答性聚合物包覆層之上進(jìn)一步包覆細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì),則基材表面的溫度應(yīng)答性聚合物包覆量也可以為2.3 ii g/cm2以上,此時(shí)的溫度應(yīng)答性聚合物的包覆量可以為
9.0ii g/cm2以下,優(yōu)選為8.0ii g/cm2以下,最優(yōu)選7.0ii g/cm2以下。如果溫度應(yīng)答性聚合物的包覆量為9.0y g/cm2以上,則即使在溫度應(yīng)答性聚合物包覆層之上進(jìn)一步包覆細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì),細(xì)胞也難以附著,因而不優(yōu)選。對(duì)這樣的細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì)的種類沒有任何限定,可列舉例如,膠原、層粘連蛋白、層粘連蛋白5、纖連蛋白、基質(zhì)凝膠(Matrigel)等的單獨(dú)、或者2種以上的混合物。另外,這些細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì)的包覆方法按照常規(guī)方法即可,通常采取將細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì)的水溶液涂布在基材表面,然后除去該水溶液淋洗的方法。本發(fā)明是利用溫度應(yīng)答性培養(yǎng)皿盡可能利用細(xì)胞片本身的技術(shù)。因此,溫度應(yīng)答性聚合物層上的細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì)的包覆量極度多是不優(yōu)選的。溫度應(yīng)答性聚合物的包覆量、以及細(xì)胞粘附性蛋白質(zhì)的包覆量的測定按照常規(guī)方法即可,可列舉例如,使用FT-1R-ATR直接測量細(xì)胞附著部的方法、將預(yù)先標(biāo)記化的聚合物用同樣的方法固定化而通過固定化于細(xì)胞附著部的標(biāo)記化聚合物量來推測的方法等,可以使用任一方法。在本發(fā)明的方法中,培養(yǎng)時(shí)接種的細(xì)胞數(shù)根據(jù)使用細(xì)胞的動(dòng)物種不同而不同,一般可以為0.4 X IO6 2.5 X IO6個(gè)/cm2,優(yōu)選為0.5 X IO6 2.1 X IO6個(gè)/cm2,進(jìn)一步優(yōu)選為
0.6X106 1.7X106個(gè)/cm2。接種濃度為0.4 X IO6個(gè)/cm2以下時(shí),一般細(xì)胞的增殖差,所得的細(xì)胞片的功能的表達(dá)程度惡化,在實(shí)施本發(fā)明的方面不優(yōu)選。在本發(fā)明中,為了從溫度應(yīng)答性基材剝離回收培養(yǎng)的細(xì)胞片,通過使培養(yǎng)的細(xì)胞附著的培養(yǎng)基材的溫度為培養(yǎng)基材上的包覆聚合物的上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下,而可以使其剝離。此時(shí),可以在培養(yǎng)基中進(jìn)行,也可以在其他等滲液中進(jìn)行,可以根據(jù)目的選擇。更快、更高效地剝離、回收細(xì)胞,可以單獨(dú)或合并使用輕敲、搖晃基材的方法、以及使用移液器攪拌培養(yǎng)基的方法等。除溫度以外的培養(yǎng)條件按照常規(guī)方法即可,不特別限制。例如,對(duì)于使用的培養(yǎng)基,可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培養(yǎng)基,另外,也可以是未添加這樣的血清的無血清培養(yǎng)基。作為溫度應(yīng)答性聚合物,以聚(N-異丙基丙烯酰胺)為例來說明以上內(nèi)容。聚(N-異丙基丙烯酰胺)作為在31°C 具有下限臨界溶解溫度的聚合物被已知,在游走狀態(tài)下,在水中在31°C以上的溫度發(fā)生脫水合而聚合物鏈凝集、白濁。相反在31°C以下的溫度下聚合物鏈水合,變成溶于水的狀態(tài)。在本發(fā)明中,將該聚合物包覆、固定于培養(yǎng)皿等的基材表面。因此,在31°C以上的溫度下,基材表面的聚合物也同樣地脫水合,由于聚合物鏈包覆、固定于基材表面,因而基材表面顯示疏水性。相反,在31°C以下的溫度下,基材表面的聚合物水合,由于聚合物鏈被包覆、固定于基材表面,因而基材表面顯不親水性。這時(shí)的疏水表面是細(xì)胞能夠附著、增殖的適度的表面,另外,親水表面成為細(xì)胞不能附著程度的表面,培養(yǎng)中的細(xì)胞、或者細(xì)胞片也僅通過冷卻就可以使其剝離。作為被施加了包覆的基材,可以使用通常細(xì)胞培養(yǎng)中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物,以及一般能夠賦予形態(tài)的物質(zhì),例如,可以使用除上述以外的聚合物化合物、陶瓷類等所有物質(zhì)。對(duì)本發(fā)明中的培養(yǎng)基材的形狀不特別限制,可列舉例如在皿、多板、燒瓶、多孔膜上培養(yǎng)的細(xì)胞插入樣形態(tài)的基材、或者平膜狀的基材等。作為被施行包覆的基材,可以使用通常細(xì)胞培養(yǎng)中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物,以及一般能夠賦予形態(tài)的物質(zhì),例如,可以使用除上述以外的高分子化合物、陶瓷類等所有物質(zhì)。本發(fā)明中的細(xì)胞片在培養(yǎng)時(shí)不會(huì)受到由以分散酶(Dispase)、胰蛋白酶等為代表的蛋白質(zhì)分解酶所產(chǎn)生的損傷。因此,從基材被剝離的細(xì)胞片具有粘附性蛋白質(zhì),在使細(xì)胞剝離成片狀時(shí)以某種程度保持細(xì)胞-細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)。由此,可以在向血管床上裝載時(shí)良好地粘附,高效生著。一般關(guān)于作為蛋白質(zhì)分解酶的分散酶,已知對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞間的橋粒結(jié)構(gòu)可以以10 40%保持的狀態(tài)剝尚,但由于基本破壞了細(xì)胞-基材間的基底I旲樣蛋白質(zhì)等,因而所得的細(xì)胞片強(qiáng)度弱。與此相對(duì),本發(fā)明的細(xì)胞片是橋粒結(jié)構(gòu)、基底膜樣蛋白質(zhì)共同60%以上殘存的狀態(tài),因而可以獲得如上所示的各種效果。對(duì)于制作本發(fā)明中的細(xì)胞片的疊層體的方法不特別限定,例如,可通過將培養(yǎng)細(xì)胞以片狀剝離,根據(jù)需要使用培養(yǎng)細(xì)胞移動(dòng)夾具使培養(yǎng)細(xì)胞片彼此疊層化來獲得。此時(shí),關(guān)于培養(yǎng)基的溫度,在包覆于培養(yǎng)基材表面的上述聚合物具有上限臨界溶解溫度的情況下,為該溫度以下,另外在上述聚合物具有下限臨界溶解溫度的情況下,只要為該溫度以上就不特別限制。但是,自不待言,培養(yǎng)細(xì)胞不增殖那樣的低溫域、或培養(yǎng)細(xì)胞死滅那樣的高溫域下培養(yǎng)是不合適的。除溫度以外的培養(yǎng)條件按照常規(guī)方法即可,不特別限制。例如,對(duì)于使用的培養(yǎng)基,可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培養(yǎng)基,另外,也可以是未添加這樣的血清的無血清培養(yǎng)基。另外,根據(jù)需要,還可以利用用于使細(xì)胞片移動(dòng)的夾具。作為這樣的夾具,只要能夠捕捉剝離的細(xì)胞片,則對(duì)材質(zhì)、形狀都沒有任何限定,作為這些材質(zhì),通常,聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、硅、聚乙烯基醇、聚氨酯、纖維素及其衍生物、殼多糖、脫乙酰殼多糖、膠原、凝膠、纖維蛋白膠等材料制成膜狀、多孔膜狀、無紡布狀、機(jī)織布狀使其與細(xì)胞片接觸來使用。這樣通過本發(fā)明,可得到有厚度的細(xì)胞片疊層化物。未像本發(fā)明這樣構(gòu)建血管網(wǎng)的情況下,為了疊層化的細(xì)胞片繼續(xù)生存,只能疊層3層左右。根據(jù)本發(fā)明,可以將細(xì)胞片4層以上疊層化。此時(shí),對(duì)疊層化方法不特別限定,與一次疊層化細(xì)胞片相比,優(yōu)選將3層以下的細(xì)胞片分多次疊層化。另外,其疊層化時(shí)間優(yōu)選為與血管床聯(lián)系的血管網(wǎng)被充分構(gòu)建時(shí)。疊層化次數(shù)適宜根據(jù)細(xì)胞片疊層化物的使用目的即可,不特別過問,優(yōu)選為5層以上,更優(yōu)選為10層以上,進(jìn)一步優(yōu)選為15層以上。如果細(xì)胞片疊層化物的厚度增加,則可以顯著獲得本發(fā)明的效果,另外可以在被移植位置移植大量的細(xì)胞,因而優(yōu)選。另外,在本發(fā)明中,通過使2片的細(xì)胞片疊層化物的頂面彼此重合,可以獲得在細(xì)胞片疊層化物的上面?zhèn)群拖旅鎮(zhèn)入p方具有流路的結(jié)構(gòu)體,通過將該流路與活體側(cè)連接,還可以高效地在細(xì)胞片疊層物內(nèi)導(dǎo)入營養(yǎng)、氧。作為促進(jìn)細(xì)胞片疊層化物內(nèi)、和細(xì)胞片疊層化物與血管床之間的毛細(xì)血管網(wǎng)的構(gòu)建的方法,可列舉在灌注于血管床的培養(yǎng)液、或浸潰血管床全體的培養(yǎng)液、或者這兩方的培養(yǎng)液中添加促進(jìn)血管新生的因子的方法。作為這里添加的因子,只要是誘導(dǎo)血管新生的因子即可,不特別限定。例如,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子-P (TGF-P)、胎盤生長因子(PIGF)、MMP、或上述因子的家族蛋白等。作為在培養(yǎng)液中添加的促進(jìn)血管新生的因子,可以從上述中選擇一種,也可以二種以上組合。在培養(yǎng)液中添加的促進(jìn)血管新生的因子的濃度受到細(xì)胞片所含的細(xì)胞的種類、數(shù)、細(xì)胞片的大小、血管床的種類以及各種因子較大影響,因而只要適宜最適化即可,這里不能具體顯示。另外,本申請(qǐng)說明書中“培養(yǎng)液”和“培養(yǎng)基”這樣的用語表示相同的含義。VEGF被稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子, 是作為配基與一般位于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(VEGFR)結(jié)合的糖蛋白。刺激生長、游走、分化,和/或促進(jìn)纖溶酶原激活物、膠原酶等蛋白酶活性、以及膠原凝膠中的血管樣結(jié)構(gòu)形成的所謂血管新生的全部階段,在體內(nèi)(in vivo)也促進(jìn)血管新生的因子已知。VEGF具有增強(qiáng)微血管的血管身體性等的作用,還與單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活化有關(guān)。在本發(fā)明的情況下,作為添加于培養(yǎng)液中的濃度,可以是lpg/mL以上,優(yōu)選10pg/mL以上,最優(yōu)選20pg/mL以上。HGF被稱為指肝細(xì)胞生長因子,通常由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生,是主要以作為控制上皮系細(xì)胞的生長和/或功能的旁分泌因子的作用為特征的因子。HGF不僅在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中,而且在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也具有促進(jìn)游走能力、誘導(dǎo)管腔形成等的形態(tài)形成的作用、抗細(xì)胞凋亡作用、血管新生作用及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用等。在本發(fā)明的情況下,作為培養(yǎng)液中添加的濃度,可以是15ng/mL以上,優(yōu)選20Ng/mL以上,最優(yōu)選25ng/mL以上。FGF被稱為成纖維細(xì) 胞生長因子,是對(duì)以成纖維細(xì)胞為代表的各種細(xì)胞顯示出生長活性和/或分化誘導(dǎo)等多種作用的多功能性細(xì)胞間信號(hào)因子?,F(xiàn)在為止由結(jié)構(gòu)上的類似性,在人中形成了由23種類組成的家族。其中,已知bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)也用于在心肌的缺血部位進(jìn)行注射的冠狀血管新生療法,顯示促進(jìn)心臟的血管新生。在本發(fā)明的情況下,作為在培養(yǎng)液添加的濃度,可以添加10ng/mL以上的bFGF,優(yōu)選15ng/mL以上,最優(yōu)選20ng/mL以上。TOGF被稱為血小板衍生生長因子,是除了與間充質(zhì)系細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等)的游走及生長等的調(diào)節(jié)有關(guān)以外,還與胎兒的生長和/或血管新生有關(guān)的生長因子。主要由巨核細(xì)胞產(chǎn)生,此外在血小板的a顆粒中也含有。I3DGF由上皮細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞等各種細(xì)胞產(chǎn)生。I3DGF中存在TOGF-A、B、C及D至少4種,A鏈及B鏈通過形成二硫鍵而采取同二聚體或異二聚物結(jié)構(gòu),從而具有3種同種型(H)GF-AA、AB、BB)。本領(lǐng)域技術(shù)人員有時(shí)將I3DGF-AA表達(dá)為roGF-aa、roGF-AB表達(dá)為H)GF-ab、PDGF-BB表達(dá)為H)GF-bb,不能由于這些表達(dá)的不同而加以任何限制。在本發(fā)明的情況下,作為在培養(yǎng)液添加的濃度,PDGF-BB可以為4ng/mL以上,優(yōu)選5ng/mL以上,最優(yōu)選7ng/mL以上。IGF被稱為胰島素樣生長因子,是與胰島素序列高度類似的多肽。認(rèn)為IGF-2是初始的發(fā)生所要求的第一生長因子,相對(duì)于此,IGF-1的表達(dá)在之后的階段被發(fā)現(xiàn)。胰島素樣生長因子I (IGF-1)主要在肝臟由生長激素(GH)的刺激的結(jié)果而分泌。人體的大部分細(xì)胞,特別是肌肉、骨、肝臟、腎臟、神經(jīng)、皮膚及肺的細(xì)胞受到IGF-1的影響。還已知IGF-1促進(jìn)血管新生。在本發(fā)明的情況下,作為在培養(yǎng)液添加的IGF-1的濃度,可以為600ng/mL以上,優(yōu)選800ng/mL以上,最優(yōu)選1000ng/mL以上??梢詫⒈景l(fā)明所得的細(xì)胞片疊層化物移植到活體內(nèi)的規(guī)定部位。對(duì)其方法不特別限制,可列舉將設(shè)置在本發(fā)明的細(xì)胞片疊層化物中的流路與活體側(cè)的血管連接的方法、使細(xì)胞片疊層化物表面向活體附著的方法等,此時(shí),也可以在移植部位預(yù)先進(jìn)行血管誘導(dǎo),不特別限定。這里,對(duì)施行血管誘導(dǎo)的方法也不特別限定,可列舉例如:將作為血管增殖因子的FGF包埋于微球,一邊改變?cè)撐⑶虻慕M成、大小、注入范圍,一邊對(duì)活體作用8 10天的方法;將聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯篩網(wǎng)切割成任意大小,制成袋狀,在該袋的內(nèi)側(cè)加入溶解于高濃度瓊脂糖溶液的FGF,8 10天后,除去該袋,從而制作血管誘導(dǎo)的空間的方法等。如果對(duì)人利用本發(fā)明的細(xì)胞片疊層體,則移植的細(xì)胞片疊層體在人的活體內(nèi)長時(shí)間表達(dá)功能。而且,可以通過剝離的細(xì)胞片疊層體的大小、形狀、或者兩者來控制功能的表達(dá)量。這樣的細(xì)胞片疊層體,例如如果構(gòu)成的細(xì)胞為心肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞這樣的構(gòu)成心臟組織的細(xì)胞,則可以用于伴有選自心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、擴(kuò)張期肥厚型心肌病和擴(kuò)張型心肌病中的疾患或障害的各疾患的治療。另外,例如,如果為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞、陷窩細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞這樣的構(gòu)成肝組織的細(xì)胞,則可用于肝酶缺陷癥、血友病、凝固異常癥、肝功能不全癥、重癥肝炎、肝硬化、肝切除患者的治療、感染癥等的治療、或肝功能的輔助。另外,例如,如果是腎細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、中間細(xì)胞、腎小球細(xì)胞這樣的構(gòu)成腎組織的細(xì)胞,則可用于腎功能障礙、腎功能不全、腎小球腎炎的治療、感染癥等的治療、或腎功能的輔助。另外,例如,如果作為使用的細(xì)胞為腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、球狀帶細(xì)胞、束狀帶細(xì)胞、網(wǎng)狀帶細(xì)胞這樣的構(gòu)成腎上腺組織的細(xì)胞,則可用于腎上腺皮質(zhì)功能不全、腎上腺皮質(zhì)功能低下癥、庫欣綜合癥、醛固酮癥、腎上腺低形成癥、腎上腺酶缺陷癥的治療、感染癥等的治療、或腎上腺功能的輔助。另外,例如,如果作為使用的細(xì)胞為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、豎毛肌細(xì)胞、毛囊細(xì)胞這樣的構(gòu)成表皮組織的細(xì)胞,則可用于皮膚移植、毛發(fā)移植。另外,例如,如果是由頰粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜等組織采取的構(gòu)成粘膜的細(xì)胞,可用于粘膜疾病的治療,感染癥的治療。它們可根據(jù)使用的細(xì)胞種類適當(dāng)特定被移植部位,沒有特別限定。通過利用本發(fā)明的在血管床疊層化的細(xì)胞片疊層化物,可對(duì)于藥劑的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如,如果作為在血管床上疊層化的構(gòu)成細(xì)胞片的細(xì)胞為心肌細(xì)胞、心成肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞這樣的構(gòu)成心臟組織的細(xì)胞,可評(píng)價(jià)用于伴有選自心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、擴(kuò)張期肥厚型心肌病和擴(kuò)張型心肌病中的疾患或障害的各疾患的治療的藥劑等的效果。另外,例如,如果是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞、陷窩細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、間充質(zhì)系干細(xì)胞這樣的構(gòu)成肝組織的細(xì)胞,則可進(jìn)行用于肝酶缺陷癥、血友病、凝固異常癥、肝功能不全癥、重癥肝炎、肝硬化、肝切除患者的治療、感染癥等治療的藥劑等的評(píng)價(jià)。另外,例如,如果是腎細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、中間細(xì)胞、腎小球細(xì)胞這樣的構(gòu)成腎組織的細(xì)胞,則可進(jìn)行用于腎功能障礙、腎功能不全、腎小球腎炎的治療、感染癥等治療的藥劑等的評(píng)價(jià)。另 外,例如,如果作為使用的細(xì)胞為腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、球狀帶細(xì)胞、束狀帶細(xì)胞、網(wǎng)狀帶細(xì)胞這樣的構(gòu)成腎上腺組織的細(xì)胞,則可進(jìn)行用于腎上腺皮質(zhì)不全、腎上腺皮質(zhì)功能低下癥、庫欣綜合癥、醛固酮癥、腎上腺低形成癥、腎上腺酶缺損癥的治療、感染癥等的治療的藥劑等的評(píng)價(jià)。另外,例如,如果作為使用的細(xì)胞為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、豎毛肌細(xì)胞、毛囊細(xì)胞這樣的構(gòu)成皮膚組織的細(xì)胞,可進(jìn)行用于皮膚移植、毛發(fā)移植、毛發(fā)再生的藥劑等的評(píng)價(jià)。另外,例如,如果是由頰粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宮粘膜等組織采取這樣的構(gòu)成粘膜的細(xì)胞,則可進(jìn)行用于粘膜疾病的治療、感染癥的藥劑等的評(píng)價(jià)。對(duì)于利用本發(fā)明的在血管床疊層化的細(xì)胞片疊層化物的在活體外的藥劑等的評(píng)價(jià)方法,沒有特別限定,例如可舉出,檢測在構(gòu)成疊層化的細(xì)胞片的細(xì)胞中導(dǎo)入的報(bào)告基因的表達(dá)的方法。作為報(bào)告基因沒有特別限定,例如可舉出利用恒常地表達(dá)螢光素酶基因作為報(bào)告基因的細(xì)胞。可通過在灌注培養(yǎng)基中添加作為螢光素酶蛋白的底物的螢光素使其發(fā)光。流入細(xì)胞片內(nèi)的底物量與細(xì)胞片內(nèi)所構(gòu)建的毛細(xì)血管網(wǎng)的量成比例。通過測定熒光強(qiáng)度,可比較細(xì)胞片內(nèi)的毛細(xì)血管網(wǎng)的構(gòu)建程度。另外,由螢光素酶蛋白引起的發(fā)光也與細(xì)胞內(nèi)的ATP量成比例地變化。即,通過比較發(fā)光量,可比較細(xì)胞的代謝。利用該原理,通過在血管床上的細(xì)胞片疊層化物中灌注添加了任意藥劑等的培養(yǎng)基,然后灌注底物,也可評(píng)價(jià)藥劑對(duì)細(xì)胞片疊層化物的效果。根據(jù)所檢測的發(fā)光量的變化,可進(jìn)行與細(xì)胞的代謝有關(guān)的藥劑等的評(píng)價(jià)。此外,灌注添加了任意藥劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)之后,通過檢測培養(yǎng)基中溶出的細(xì)胞因子和/或其他的蛋白質(zhì)、細(xì)胞代謝物,可評(píng)價(jià)藥劑等對(duì)細(xì)胞片疊層化物的效果,檢測由細(xì)胞產(chǎn)生的電信號(hào)。如果使用利用了本發(fā)明的在血管床上疊層化的細(xì)胞片疊層化物的活體外的藥劑等的評(píng)價(jià)方法,則在活體外也能評(píng)價(jià)目前為止必須施與動(dòng)物或人才能評(píng)價(jià)的藥劑等的效果。另外,由于利用模擬任意的組織的細(xì)胞片疊層化物,因而可以在幾乎不受由其他的組織帶來的影響的狀態(tài)下,穩(wěn)定且簡便地評(píng)價(jià)藥劑效果。期待本發(fā)明可用于新藥劑等的開發(fā)。如果對(duì)動(dòng)物移植本發(fā)明的細(xì)胞片及細(xì)胞片疊層體,則成為藥品評(píng)價(jià)用動(dòng)物。并且,可以通過剝離的細(xì)胞片疊層體的大小和/或形狀來控制功能的表達(dá)量。這里使用的動(dòng)物可列舉大鼠、小鼠、豚鼠、絨猴、兔子、狗、豬、山羊、猴、黑猩猩或它們的免疫缺陷動(dòng)物等,沒有特別限定。這樣的移植動(dòng)物,例如,可以將被檢物質(zhì)施與該動(dòng)物,用于判定該被檢物質(zhì)對(duì)心功能的影響的心功能評(píng)價(jià)系統(tǒng)等,不特別限定。實(shí)施例以下,根據(jù)實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明,但本發(fā)明不受這些實(shí)施例限制。實(shí)施例1作為促進(jìn)向移植疊層化心肌組織內(nèi)的血管新生的手段,切開大鼠的大腿部的表皮,通過電手術(shù)刀將包含 大腿動(dòng)靜脈的四頭肌骨格肌組織以1.5cmX2.0cm見方進(jìn)行切離,制作出僅大腿動(dòng)靜脈與1.5cmX2.0cm見方的四頭肌骨格肌組織連接的狀態(tài),維持該狀態(tài)下,僅縫合切開的表皮。將以1.5cmX2.0cm見方切離的四頭肌骨格肌組織在活體內(nèi)留置一周,由此產(chǎn)生毛細(xì)血管的短路(動(dòng)靜脈袢),制作具有由動(dòng)脈返回靜脈的血管網(wǎng)的臟器樣的血管床(圖1)。將產(chǎn)生動(dòng)靜脈袢的血管床由大鼠的大腿部完全切離,分別將大腿動(dòng)脈、大腿靜脈與灌注培養(yǎng)基的管連接,制作可使培養(yǎng)基在血管床內(nèi)循環(huán)的組織灌注生物反應(yīng)器(圖2)。與血管床生物反應(yīng)器的制作并行,進(jìn)行心肌細(xì)胞片的制作。心肌細(xì)胞使用由出生后0天的SD系大鼠的心臟分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞。由幼大鼠摘出心臟后,使用作為分解組織主要構(gòu)成要素的膠原的酶的II型膠原酶(Worthington社制)來分離心肌細(xì)胞。將分離的心肌細(xì)胞以320XIO4個(gè)細(xì)胞/皿的濃度接種于溫度應(yīng)答性培養(yǎng)皿(q>35 mm, DishUpcell Type-E(Cell Seed社制))。4天后,心肌細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面成為匯合狀態(tài)時(shí),使溫度下降至20°C,從而回收片狀的心肌細(xì)胞群。將該片進(jìn)行3片多層化并作為心肌細(xì)胞片向連接有生物反應(yīng)器的血管床移植,結(jié)果可將細(xì)胞片疊層化物在血管床上進(jìn)行培養(yǎng)(圖2)。(使血管床內(nèi)及血管床上的細(xì)胞片疊層化物內(nèi)的毛細(xì)血管網(wǎng)成熟的方法的探索)為了探索大鼠的血清中所含有的促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子,在大鼠的心臟穿刺并進(jìn)行采血,用ELISA法嘗試檢測(n=3)。其結(jié)果確認(rèn)在大鼠血清中存在16pg/mL的bFGF(圖4A)。因此,在用組織灌注生物反應(yīng)器灌注的培養(yǎng)基中添加bFGF。作為灌注液,選擇添加了作為存在于血清中的濃度的1000倍量的16ng/mL的bFGF心肌細(xì)胞用培養(yǎng)液,進(jìn)行培養(yǎng)(圖3、4)。在血管床上移植細(xì)胞片疊層化物進(jìn)行72小時(shí)培養(yǎng)后,為了確認(rèn)血管新生及管腔結(jié)構(gòu),灌注墨汁代替培養(yǎng)基確認(rèn)被染黑的區(qū)域(圖4B),其結(jié)果是,添加了 bFGF培養(yǎng)而得的細(xì)胞片,與不添加bFGF進(jìn)行灌注培養(yǎng)而得的細(xì)胞片疊層化物相比,在血管床內(nèi)及細(xì)胞片疊層化物內(nèi)大范圍地觀察到被染黑的區(qū)域。由該結(jié)果明確,如果在培養(yǎng)基中添加bFGF,則在血管床及細(xì)胞片疊層化物內(nèi)構(gòu)建了伴有管腔形成的毛細(xì)血管網(wǎng)(圖 4B)。為了詳細(xì)確認(rèn)在心肌細(xì)胞片與血管床之間是否介由毛細(xì)血管而形成了連接,使用組織灌注生物反應(yīng)器以30 y L/分鐘的流速進(jìn)行墨汁或血液的灌注。其結(jié)果是,移植于血管床上的心肌細(xì)胞片的一部分被墨(圖5上段)或血液(圖5下段)強(qiáng)染色(圖5)。另外,在a E染色及Azan染色的組織切片的觀察中也明確了墨流入了血管床上的心肌細(xì)胞片內(nèi)部(圖5)。進(jìn)而通過使用⑶31與心肌肌鈣蛋白T抗體的免疫組織染色,可知在墨或紅血球流入的周邊部,血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀的結(jié)構(gòu),從而明確了通過血管供給營養(yǎng)、氧(圖5)。SP,明確了即使不進(jìn)行如FASEB.J.,20 (6) ,708-710(2006)(非專利文獻(xiàn)I)所試驗(yàn)的在活體內(nèi)的細(xì)胞片的疊層化,在體外條件下,也可以向心肌細(xì)胞片內(nèi)進(jìn)行血管誘導(dǎo)。實(shí)施例2(利用血管床上的心肌細(xì)胞片疊層體的藥劑效果的測定方法)在血管床上疊層化的細(xì)胞片,使用了由導(dǎo)入有螢光素酶基因的轉(zhuǎn)基因大鼠出生后0天的心臟分離的細(xì)胞。通過與實(shí)施例1同樣的方法,在血管床上疊層化細(xì)胞片,以添加FGF(16ng/mL)、不 添加的方式進(jìn)行灌注培養(yǎng),72小時(shí)后,代替培養(yǎng)基,灌注含有作為螢光素酶蛋白的底物的螢光素的培養(yǎng)基,用圖像分析儀測定熒光強(qiáng)度(圖6)。熒光強(qiáng)度通過偽色彩表現(xiàn),越為暖色則表示熒光強(qiáng)度越強(qiáng)(圖6A、C)。依賴于底物及ATP濃度發(fā)熒光,熒光越強(qiáng),表示細(xì)胞活性越高。將熒光強(qiáng)度圖形化為圖6B及D。如果添加FGF進(jìn)行灌注培養(yǎng),則與不添加進(jìn)行灌注培養(yǎng)的相比,發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度強(qiáng)的傾向。由此可知,添加FGF進(jìn)行灌注培養(yǎng)而得的細(xì)胞片疊層化物,與不添加進(jìn)行灌注培養(yǎng)而得的相比,可誘導(dǎo)成熟的血管網(wǎng),流入細(xì)胞片的培養(yǎng)基的量增加,顯示高的細(xì)胞活性。使用螢光素酶成像法嘗試對(duì)于心肌細(xì)胞片疊層化物的藥劑的評(píng)價(jià)。通過螢光素酶產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,如前述那樣依賴于細(xì)胞活性和流入細(xì)胞片的螢光素濃度。疊層化的心肌片疊層化物,在血管床上也維持搏動(dòng),配合搏動(dòng),細(xì)胞片疊層化物內(nèi)的毛細(xì)血管進(jìn)行收縮、舒張。因此,在收縮時(shí),灌注的培養(yǎng)基的量暫時(shí)減少。通過螢光素酶成像法經(jīng)時(shí)觀察熒光強(qiáng)度,結(jié)果明確了熒光強(qiáng)度增減。利用該發(fā)現(xiàn),測定影響心肌細(xì)胞的藥劑的效果。作為藥劑使用@受體阻滯劑。P受體阻滯劑是在交感神經(jīng)的腎上腺素受體中僅對(duì)P受體顯示阻滯作用的藥劑,臨床上對(duì)降壓藥、和/或勞累性心絞痛患者的心絞痛狀預(yù)防、心律不齊(心房纖維性顫動(dòng)、竇性心動(dòng)過速、期外收縮時(shí)的心跳數(shù)降低)、心力衰竭患者的心功能改善、和/或突然死亡、心肌梗塞等循環(huán)器官疾病使用。使用添加3受體阻滯劑的灌注培養(yǎng)基和不添加的培養(yǎng)基,作為通過實(shí)施例1所示的方法制作的細(xì)胞片疊層化物的灌注培養(yǎng)基,進(jìn)行培養(yǎng)72小時(shí)。然后,灌注添加了螢光素的培養(yǎng)基,通過螢光素酶成像法,經(jīng)時(shí)地觀察熒光強(qiáng)度的變化。其結(jié)果是,添加了對(duì)照藥劑的心肌細(xì)胞片的搏動(dòng)的強(qiáng)度、發(fā)光次數(shù)、發(fā)光間隔幾乎不受影響,用添加了 3受體阻滯劑的培養(yǎng)基進(jìn)行灌注培養(yǎng)的心肌細(xì)胞片疊層化物,發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度降低、發(fā)光次數(shù)減少、發(fā)光間隔延遲。由此明確了,根據(jù)本發(fā)明,通過利用心肌細(xì)胞片疊層化物,可以在體外簡便而且定量地評(píng)價(jià)影響心肌功能的藥劑的影響。實(shí)施例3(使心肌細(xì)胞片肥厚化的方法的探索)向得到的構(gòu)建了血管網(wǎng)的細(xì)胞片層上進(jìn)一步移植3層的心肌細(xì)胞片,進(jìn)而進(jìn)行6天培養(yǎng)。其結(jié)果可知,在灌注液速度為30 y L/分鐘、50 y L/分鐘的任一情況下,后安放的細(xì)胞片生存,并在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建了血管網(wǎng)(圖7)。但是,以30 y L/分鐘灌注培養(yǎng)的細(xì)胞片,第I次疊層的區(qū)域的染色弱,以50 y L/分鐘灌注培養(yǎng)時(shí)第I次、第2次共同疊層的區(qū)域的染色強(qiáng),因此在構(gòu)建厚的細(xì)胞片疊層化物時(shí),加快灌注液的流速較好。根據(jù)這些結(jié)果可確立以下方法:通過利用血管床作為血管新生的場所,在心肌片疊層化物的內(nèi)部構(gòu)建毛細(xì)血管網(wǎng)。實(shí)施例4(促進(jìn)細(xì)胞片疊 層化物內(nèi)的血管新生的細(xì)胞因子的探索)通過實(shí)施例1明確了,在利用血管床通過灌注生物反應(yīng)器將細(xì)胞片進(jìn)行疊層化的方法中,通過在灌注的培養(yǎng)液中添加bFGF,心肌細(xì)胞片內(nèi)、及血管床與細(xì)胞片之間的毛細(xì)血管形成被促進(jìn)。在實(shí)施例1中,作為由大鼠的采血方法使用對(duì)心臟的穿刺法。因此,通過穿刺施加刺激,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等,考慮可能影響血中細(xì)胞因子濃度。因此,作為不進(jìn)一步誘導(dǎo)刺激的采血方法,采用斷頭采血法進(jìn)行采血。用ELISA法測定血清中所含的與血管形成促進(jìn)有關(guān)的細(xì)胞因子濃度(圖8)。其結(jié)果判明,除了通過心臟穿刺法不能檢測出的與血管新生有關(guān)的VEGF(22±23pg/ml)以夕卜,還包含 bFGF(21±9pg/ml)、HGF (33500± 15218pg/ml)、PDGF-bb (7345±2976pg/ml)、IGF-1 (1065565±384348pg/ml),預(yù)測這些細(xì)胞因子恒常地促進(jìn)血管新生。因此,與實(shí)施例1同樣,將心肌細(xì)胞片移植于血管床,使用圖2所示的組織灌注生物反應(yīng)器,使用分別含有 VEGF 為 22pg/ml、bFGF 為 21pg/ml、HGF 為 33500pg/ml、PDGF_bb 為7345pg/ml、IGF-1為1065565pg/ml、或不含有它們的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液,以50 y L/分鐘的流速進(jìn)行72小時(shí)灌注培養(yǎng)。其結(jié)果明確了,用分別添加了 VEGF、bFGF、HGF、PDGF-bb, IGF-1的培養(yǎng)液進(jìn)行灌注培養(yǎng)的情況下,與不添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)液相比,在細(xì)胞片內(nèi)、及血管床與細(xì)胞片之間毛細(xì)血管形成被促進(jìn)。實(shí)施例5(在硅腔室內(nèi)形成動(dòng)靜脈袢的人工血管床、及利用該人工血管床的細(xì)胞片疊層化物的制作方法)作為在活體外制作細(xì)胞片疊層化物的血管床,制作利用硅腔室的人工血管床(圖9)。切開大鼠的表皮,僅將大腿動(dòng)脈和大腿靜脈由活體組織剝離。切斷大腿動(dòng)脈及大腿靜脈,使大腿動(dòng)脈與大腿靜脈的切斷面彼此吻合,制作動(dòng)靜脈袢(A-V loop)。在長1.5cm、寬1.5cm、厚度3mm的娃制的容器中,在以0.1mm厚的娃膜覆蓋的娃腔室內(nèi),插入使活體內(nèi)的動(dòng)脈與靜脈吻合而制作的動(dòng)靜脈袢,將其周圍用2%去端肽膠原、IO6個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的混合物來填充。然后,縫合切開的表皮,將內(nèi)包了動(dòng)靜脈袢的硅腔室在活體內(nèi)留置2周(圖9)。其結(jié)果是,由硅腔室內(nèi)的動(dòng)靜脈袢新生了毛細(xì)血管網(wǎng)(圖10)。圖10顯示,由利用硅腔室制作的血管床的動(dòng)脈側(cè),以墨汁代替培養(yǎng)液來灌注而得的組織切片。黑色區(qū)域顯示血管區(qū)域。箭頭所夾的區(qū)域顯示由靜脈部分新生的血管。2周后,再次切開大鼠的大腿部,切斷連接于硅腔室內(nèi)的大腿動(dòng)脈及大腿靜脈,由活體切離用硅腔室制作的人工血管床。除去硅腔室的以0.1mm厚覆蓋的一面,代替圖2所示的由活體組織片構(gòu)成的血管床,將連接于硅腔室內(nèi)的大腿動(dòng)脈及大腿靜脈與循環(huán)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基的管結(jié)合。在用硅腔室制作的人工血管床上將細(xì)胞片進(jìn)行疊層化,與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行灌注培養(yǎng)。其結(jié)果與利用活體組織的血管床制作的細(xì)胞片疊層化物同樣,在細(xì)胞片內(nèi)、及血管床與細(xì)胞片之間形成毛細(xì)血管,可制作具有厚度的細(xì)胞片疊層化物。實(shí)施例6(用于確認(rèn)細(xì)胞片疊層化物的功能的向活體的再移植)通過移植于大鼠,來確認(rèn)利用血管床制作的心肌細(xì)胞片疊層化物在移植時(shí)是否也具有功能(圖11)。使與實(shí)施例1中制作的疊層化有心肌細(xì)胞片的血管床連接的左大腿動(dòng)脈與左內(nèi)頸動(dòng)脈吻合,使血管床的左大腿靜脈與左外頸靜脈吻合。其結(jié)果確認(rèn)了血液正確地流入細(xì)胞片疊層化物。另外,確認(rèn)了心肌細(xì)胞片的搏動(dòng)被維持,從而確認(rèn)了通過該方法制作的細(xì)胞片疊層化物在移植時(shí)也維持功能。產(chǎn)業(yè)可利用性根據(jù)本發(fā)明所示的制造方法,可以在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng),如果將該細(xì)胞片進(jìn)行疊層化,則可簡便地制作具有厚度的細(xì)胞片疊層化物。這樣的具有厚度的細(xì)胞片疊層化物作為活體內(nèi)組織樣的物質(zhì),在各種組織的再生醫(yī)療中是有用的,同時(shí)在評(píng)價(jià)以治療為目的的藥劑的效果中是有用的。`
權(quán)利要求
1.細(xì)胞片疊層化物,其特征在于,在具有動(dòng)靜脈袢、且構(gòu)建有毛細(xì)血管網(wǎng)的血管床上疊層細(xì)胞片,構(gòu)建通過在活體外灌注培養(yǎng)基而得到的毛細(xì)血管網(wǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,血管床為活體組織片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,活體組織片為皮瓣。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,活體組織片來源于肌肉。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,血管床在被活體適合性基材分隔的區(qū)域內(nèi)內(nèi)包動(dòng)靜脈袢,在分隔的區(qū)域內(nèi)填充凝膠,通過留置于活體內(nèi)來構(gòu)建毛細(xì)血管網(wǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,凝膠包含生物降解性聚合物和/或細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,培養(yǎng)基包含與血管新生促進(jìn)有關(guān)的細(xì)胞因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,細(xì)胞片是如下獲得的:在表面包覆了在O 80°C的溫度范圍內(nèi)水合力變化的聚合物的細(xì)胞培養(yǎng)支持體上,在聚合物的水合力弱的溫度區(qū)域培養(yǎng)細(xì)胞,然后,使培養(yǎng)液變化至形成聚合物的水合力強(qiáng)的狀態(tài)的溫度進(jìn)行培養(yǎng),將培養(yǎng)而得的細(xì)胞以片狀剝離。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,在O 80°C的溫度范圍內(nèi)水合力變化的聚合物為聚(N-異丙基丙烯酰胺)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,細(xì)胞片被疊層化的次數(shù)為4以上。
11.根據(jù)權(quán)利要 求1 10的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片疊層化物,其中,細(xì)胞為分別構(gòu)成心臟組織、肝組織、腎組織、腎上腺組織、皮膚組織、粘膜組織的細(xì)胞,且在各個(gè)組織中,混合有任I種或2種以上的細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞片疊層化物,其包含血管內(nèi)皮細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1 12的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片疊層化物的利用方法,其特征在于,將得到的細(xì)胞片疊層化物向活體內(nèi)移植。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞片疊層化物的利用方法,其目的是向心肌組織移植,治療選自心力衰竭、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、擴(kuò)張期肥厚型心肌病和擴(kuò)張型心肌病中的至少I種心臟疾患或障害。
15.藥劑的評(píng)價(jià)方法,其中,利用權(quán)利要求11 14的任一項(xiàng)所述的細(xì)胞片疊層化物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥劑的評(píng)價(jià)方法,其中,在構(gòu)成細(xì)胞片疊層化物的細(xì)胞中導(dǎo)入有報(bào)告基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥劑的評(píng)價(jià)方法,其中,報(bào)告基因?yàn)槲灩馑孛富颉?br> 18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥劑的評(píng)價(jià)方法,其中,評(píng)價(jià)的藥劑為與心臟疾病有關(guān)的藥劑。
全文摘要
一種細(xì)胞片疊層化物的制造方法,其特征在于,制作具有動(dòng)靜脈袢、且構(gòu)建了毛細(xì)血管網(wǎng)的血管床,向該血管床上疊層細(xì)胞片,通過在活體外灌注培養(yǎng)基而在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng)。根據(jù)該制造方法,可以在細(xì)胞片內(nèi)構(gòu)建血管網(wǎng),如果將該細(xì)胞片進(jìn)行疊層化,則可簡便地制作具有厚度的細(xì)胞片疊層化物。這樣的具有厚度的細(xì)胞片疊層化物作為活體內(nèi)組織樣的物質(zhì),在各種組織的再生醫(yī)療、和/或藥劑等的評(píng)價(jià)中是有用的。
文檔編號(hào)C12N5/077GK103180437SQ20118005176
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者關(guān)根秀一, 清水達(dá)也, 岡野光夫 申請(qǐng)人:學(xué)校法人東京女子醫(yī)科大學(xué)
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