專利名稱：裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法，具體涉及可生產(chǎn)β-葡糖苷酶的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法。
背景技術(shù)：
為了由木材或稻草、稻殼、雜草等纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)作為發(fā)酵原料的糖并進(jìn)而生產(chǎn)生物乙醇等生物質(zhì)燃料，必須降解作為植物細(xì)胞壁的主要構(gòu)成成分的纖維素。纖維素的降解有濃硫酸糖化法或稀硫酸糖化法等酸糖化法、利用酶的酶糖化法等方法，在近年來生物技術(shù)迅猛發(fā)展的背景下，進(jìn)行了大量酶糖化法的研究開發(fā)。纖維素的酶糖化利用被總稱為纖維素酶的一類酶。首先，具有隨機(jī)切斷纖維素鏈的活性的內(nèi)切葡聚糖酶(EG)將纖維素的非晶體區(qū)域降解，使葡萄糖末端露出。露出的葡萄糖末端被纖維二糖水解酶(CBH)降解，纖維二糖游離。接著，β-葡糖苷酶(BGL)將游離的纖維二糖降解，從而葡萄糖游離。
由于可生產(chǎn)用于降解結(jié)晶纖維素進(jìn)行糖化的各種纖維素酶或半纖維素酶并可將這些酶大量分泌至細(xì)胞外，纖維素的酶糖化廣泛采用曲霉屬和木霉屬等絲狀菌。
此外，也進(jìn)行了通過異種株表達(dá)這些絲狀菌的纖維素酶的嘗試，非專利文獻(xiàn)I中揭示了通過編碼作為絲狀菌之一的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β _葡糖苷酶I (BGL I )的基因?qū)ψ鳛槌鲅拷湍傅尼劸平湍?Saccharomyces cerevisiae)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使所得的轉(zhuǎn)化體表達(dá)了這些酶。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1:G.Ta naka 等,Biosc1.Biotechnol.Biochem.，62(8)，1615-1618，1998.
發(fā)明的概要
發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
然而，酶糖化法的情況下，存在下述問題:如果葡萄糖隨著基于酶的纖維素的水解反應(yīng)進(jìn)行而在反應(yīng)體系內(nèi)積聚，積聚的葡萄糖會抑制β -葡糖苷酶，纖維二糖積聚，進(jìn)而積聚的纖維二糖抑制內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶，結(jié)果纖維素?zé)o法完全降解。因此，希望 葡糖苷酶高功能化。
另一方面，與曲霉屬和木霉屬相比，裂殖酵母屬酵母的基因分析更深入，具有確立了各種有用的變異株和基因?qū)胗幂d體、適合于蛋白質(zhì)的工業(yè)化大量生產(chǎn)的優(yōu)點，但裂殖酵母屬酵母不具有固有的β-葡糖苷酶基因，無法對纖維二糖進(jìn)行同化。
非專利文獻(xiàn)I中，完全沒有提到使出芽酵母生產(chǎn)的葡糖苷酶的葡萄糖抑制。
于是，本發(fā)明的目的在于提供可生產(chǎn)葡糖苷酶的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法。
解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案
本發(fā)明人為了解決上述課題而進(jìn)行了認(rèn)真研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過采用染色體中具有來源于絲狀菌的編碼β-葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列等或具有這些序列作為染色體外基因的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，可解決上述課題，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法為下述[I] [14]。[I]裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體,其特征在于，染色體中具有來源于絲狀菌的編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列或者作為染色體外基因具有這些序列。[2]如[I]所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其中，所述β_葡糖苷酶為BGL1。[3]如[I]或[2]所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其中，所述絲狀菌為曲霉(Aspergillus)屬的微生物。[4]如[I] [3]中的任一項所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其中，所述β-葡糖苷酶為由以序列編號I表示的氨基酸序列形成或者由該氨基酸序列中存在I個以上的氨基酸的缺失、置換或插入的氨基酸序列形成且具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷鍵的水解反應(yīng)的活性的β-葡糖苷酶。[5]如[I] [4]中的任一項所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其中，所述編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列的5’末端側(cè)具有在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號的結(jié)構(gòu)基因序列。[6]裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法,其特征在于,通過包含來源于絲狀菌的編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列的載體對裂殖酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。[7]如[6]所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，所述編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列的5’末端側(cè)具有在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號的結(jié)構(gòu)基因序列。[8]如[6]或[7]所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，所述來源于絲狀菌的編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因整合至裂殖酵母屬酵母的染色體的I處以上。[9]如[8]所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，向染色體的整合通過同源重組進(jìn)行。[10]如[9]所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，將載體整合至轉(zhuǎn)座子基因Tf2位點。[11] β-葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，從對[I] [4]中的任一項所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)而得的菌體獲得β_葡糖苷酶。[12]β_葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，從對[5]所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)而得的培養(yǎng)液獲得β_葡糖苷酶。[13]纖維素的降解方法，其特征在于，使用通過[11]或[12]所述的制造方法得到的β_葡糖苷酶。[14]纖維素的降解方法，其特征在于，在纖維素的存在下對[5]所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)。
發(fā)明的效果
通過本發(fā)明，能夠提供可生產(chǎn)β -葡糖苷酶的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法。
此外，本發(fā)明的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體可產(chǎn)生對葡萄糖抑制的耐受性高的 葡糖苷酶。
附圖的簡單說明


圖1是表達(dá)載體pSL6AaBGLl的構(gòu)成圖。
圖2是表達(dá)載體pSL6P3AaBGLl的構(gòu)成圖。
圖3是表示試驗例7的最適溫度試驗的結(jié)果的圖表，表示通過試驗例6得到的粗純化葡糖苷酶的各溫度下的活性。
圖4是表示試驗例7的最適pH試驗的結(jié)果的圖表,表示通 過試驗例6得到的粗純化β -葡糖苷酶的各pH下的活性。
圖5是表示試驗例7的熱穩(wěn)定性試驗的結(jié)果的圖表，表示對通過試驗例6得到的粗純化β -葡糖苷酶在各溫度下處理10分鐘后的活性。
圖6是表示試驗例7的pH穩(wěn)定性試驗的結(jié)果的圖表,表示對通過試驗例6得到的粗純化β -葡糖苷酶在各pH下進(jìn)行37°C、24小時的處理后的活性。
圖7是表示試驗例8的采用纖維二糖的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)試驗的結(jié)果的圖表。(A)表示采用YH)培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果，(B)表示采用YP+纖維二糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果。
圖8是表示試驗例9的葡萄糖抑制試驗的結(jié)果的圖表。
圖9是表示試驗例10的SDS-PAGE的結(jié)果的照片。
圖10是表示試驗例10的熱穩(wěn)定性試驗的結(jié)果的圖表。
圖11是表示試驗例10的葡萄糖抑制試驗的結(jié)果的圖表。
圖12是表示試驗例11的N-連接型糖鏈除去的結(jié)果的照片。
圖13是表示試驗例11的熱穩(wěn)定性試驗的結(jié)果的圖表。
圖14是表示試驗例11的葡萄糖抑制試驗的結(jié)果的圖表。
圖15是表示試驗例12的來源于ASP3326株的BGLl的活性增強(qiáng)效果的圖表。
圖16是表示試驗例12的來源于ASP3326株、ASP3396株和ASP3397株的BGLl的活性增強(qiáng)效果的圖表。
實施發(fā)明的方式
[轉(zhuǎn)化體]
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，染色體中具有來源于絲狀菌的編碼β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列或者作為染色體外基因具有這些序列。
(宿主)
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的宿主是裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母。本發(fā)明中使用的裂殖酵母屬酵母可以是野生型，也可以是根據(jù)用途使特定的基因缺失或失活的突變型。作為使特定的基因缺失或失活的方法，可使用公知的方法。具體來說，可通過使用Latour 法(記載于 Nucreic Acids Res (2006) 34: ell、國際公開第 2007/063919 號等)來使基因缺失。此外，可通過以采用誘變劑的突變分離法(《酵母分子遺傳學(xué)實驗法》，1996年，學(xué)會出版中心)或利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的隨機(jī)突變法(PCR Methods Appl.，1992年，第2卷，28-33頁)等向基因的一部分導(dǎo)入突變而使該基因失活。作為使特定基因缺失或失活的裂殖酵母屬酵母宿主，記載于例如國際公開第2002/101038號、國際公開第2007/015470 號等。
另外，作為宿主的裂殖酵母屬酵母較好是使用具有用于篩選轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記物的酵母。例如，較好是使用因某一基因缺失而在生長發(fā)育中需要特定營養(yǎng)成分的宿主。通過包含目標(biāo)基因序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來制造轉(zhuǎn)化體的情況下，通過向載體中整合該缺失的基因(營養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)標(biāo)記物)，轉(zhuǎn)化體中宿主的營養(yǎng)缺陷性消失。可通過該宿主與轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)缺陷性的差異對兩者進(jìn)行區(qū)分而獲得轉(zhuǎn)化體。
例如，可將乳清酸核苷5’ -磷酸脫羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而呈尿嘧啶缺陷性的裂殖酵母屬酵母作為宿主，通過具有ura4基因(營養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)標(biāo)記物)的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，篩選尿嘧啶缺陷性消失的酵母，從而獲得整合了載體的轉(zhuǎn)化體。宿主中因缺失而呈營養(yǎng)缺陷性的基因只要是可用于轉(zhuǎn)化體的篩選即可，并不僅限于ura4基因，可以是異丙基蘋果酸脫龜!酶基因(Ieul基因)等。
作為裂殖酵母屬酵母,可例舉粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八抱裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus)等。上述裂殖酵母屬酵母中，因為可利用各種有用的突變株，較好是粟酒裂殖酵母。
(轉(zhuǎn)化體)
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在染色體中具有編碼β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列或者作為染色體外基因具有這些序列。在染色體中具有上述表達(dá)盒是指在裂殖酵母屬酵母的染色體中的I處以上整合有表達(dá)盒，作為染色體外基因具有是指在細(xì)胞內(nèi)具有包含表達(dá)盒的質(zhì)粒。由于轉(zhuǎn)化體的繼代培養(yǎng)容易，較好是在染色體中具有上述表達(dá)盒。
表達(dá)盒是指表達(dá)β -葡糖苷酶所需的DNA的組合，包括β -葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因以及在裂殖酵母屬酵母內(nèi)其作用的啟動子和終止子。
上述表達(dá)盒中可進(jìn)一步包含I個以上的5’ -非翻譯區(qū)域和/或3’ -非翻譯區(qū)域。優(yōu)選的表達(dá)盒是來源于絲狀菌的β -葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因、啟動子、終止子、5’-非翻譯區(qū)域、3’ -非翻譯區(qū)域均包含在內(nèi)的表達(dá)盒。還可具有營養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)標(biāo)記物等基因。
此外，由于分泌至裂殖酵母屬酵母的細(xì)胞外的β -葡糖苷酶增大，β -葡糖苷酶的回收、純化變得容易，較好是β_葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)具有編碼在裂殖酵母屬酵母內(nèi)其作用的分泌信號序列的堿基序列(分泌信號的結(jié)構(gòu)基因)。β_葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)是指β -葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)上游,與β -葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的5’末端鄰接的位置。此外，可除去不影響葡糖苷酶活性的編碼N末端側(cè)的數(shù)個氨基酸的堿基序列，在該位置導(dǎo)入編碼信號序列的基因。
啟動子和終止子只要是可在作為宿主的裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用且來源于絲狀菌的表達(dá)葡糖苷酶的啟動子和終止子即可。作為在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的啟動子，可使用裂殖酵母屬酵母本來具有的啟動子(較好是轉(zhuǎn)錄開始活性高的啟動子)或裂殖酵母屬酵母本來不具有的啟動子(來源于病毒的啟動子等)。啟動子在載體內(nèi)可存在2種以上。
作為裂殖酵母屬酵母本來具有的啟動子，可例舉例如乙醇脫氫酶基因啟動子、參與硫胺素代謝的nmtl基因啟動子、參與葡萄糖代謝的果糖-1，6- 二磷酸酶基因啟動子、參與分解代謝物抑制的轉(zhuǎn)化酶(蔗糖酶，Invertase)基因的啟動子(參照國際公開第99/23223號)、熱休克蛋白基因啟動子(參照國際公開第2007/26617號)等。
作為裂殖酵母屬酵母本來不具有的啟動子，可例舉例如日本專利特開平5-15380號公報、日本專利特開平7-163373號公報、日本專利特開平10-234375號公報中記載的來源于動物細(xì)胞病毒的啟動子，較好是hCMV啟動子、SV40啟動子。
作為在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的終止子，可使用裂殖酵母屬酵母本來具有的終止子或裂殖酵母屬酵母本來不具有的終止子。終止子在載體內(nèi)可存在2種以上。
作為終止子，可例舉例如日本專利特開平5-15380號公報、日本專利特開平7-163373號公報、日本專利特開平10-234375號公報中記載的來源于人的終止子，較好是人脂皮質(zhì)蛋白I的終止子。
( β -葡糖苷酶)
β -葡糖苷酶(EC.3.2.1.21)被用作特異性催化β -D-吡喃葡萄糖苷鍵的水解反應(yīng)的酶的總稱。特別是因?qū)⒗w維二糖分解為葡萄糖而又被稱為纖維二糖酶，廣泛分布于細(xì)菌、絲狀菌、植物和動物。各種生物種內(nèi)大多存在多種編碼葡糖苷酶的基因，例如作為絲狀菌中的I種的米曲霉(Aspergillus oryzae)被報道存在bgll bgl7 (《大豆蛋白質(zhì)研究(Soy protein Research))),日本 12，78-83，2009，日本專利特開 2008-086310 號公報)。其中，由于活性的高低等原因，較好是編碼BGLl的bgll。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體所具有的β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因來源于絲狀菌。絲狀菌是指菌類中由被稱為菌絲的管狀細(xì)胞構(gòu)成的真核細(xì)胞微生物。作為絲狀菌，可例舉例如曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)屬、鍵刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)和支頂孢屬(Acremonium)等。本發(fā)明的β _葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因可以是來源于任何產(chǎn)生β_葡糖苷酶的絲狀菌，由于酶活性的高低等原因，較好是來源于曲霉屬的絲狀菌的β-葡糖苷酶。作為曲霉屬的絲狀菌，可例舉例如構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、粉狀曲霉(Aspergillus pulverulentus)。由于結(jié)晶纖維素降解能力高,單糖生成能力良好，較好是來源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的編碼β_葡糖苷酶的基因，更好是來源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的編碼BGLl (AaBGLl)的基因。
根據(jù)坂本禮一郎博士的論文(《關(guān)于棘孢曲霉編號F-50的纖維素酶系的研究(Aspergillus aculeatus N0.F-50 < -t 7 —K' 系(二関 t 石研究)》，大阪府立大學(xué)，1984年)，由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)純化的野生型的AaBGLl的分子量約為133KDa,最適pH為4.0，穩(wěn)定pH范圍為3 7 (25°C，24小時)。
AaBGLl的氨基酸序列為以序列編號I表示的序列。編碼本發(fā)明的β _葡糖苷酶的基因序列較好是編碼由以序列編號I表示的氨基酸序列形成的β_葡糖苷酶的基因序列。此外，可以是編碼由以序列編號I表示的氨基酸序列中加入了 I 數(shù)十個、較好是I 數(shù)個、更好是I 9個氨基酸的缺失、置換或插入的氨基酸序列形成且具有催化β -D-吡喃葡萄糖苷鍵的水 解反應(yīng)的活性的β-葡糖苷酶的基因序列。由以序列編號I表示的氨基酸序列形成的β -葡糖苷酶是即使加入I 數(shù)十個氨基酸的缺失、置換或插入也具有催化β -D-吡喃葡萄糖苷鍵的水解反應(yīng)的活性的β -葡糖苷酶。
可直接使用上述的來源于絲狀菌的編碼β -葡糖苷酶的基因，但為了增大裂殖酵母屬酵母內(nèi)的表達(dá)量，較好是將上述基因序列轉(zhuǎn)變?yōu)榱阎辰湍笇俳湍傅母弑磉_(dá)基因中使用頻率高的密碼子。
[轉(zhuǎn)化體的制造方法]
本發(fā)明的裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法的特征在于，通過包含來源于絲狀菌的編碼β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列的載體對裂殖酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
對于作為宿主的裂殖酵母屬酵母、β_葡糖苷酶、絲狀菌、用于使結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列，如上所述。
(載體)
本發(fā)明中的載體包含上述的表達(dá)盒。此外，較好是包含選擇標(biāo)記物。例如，較好是使用根據(jù)宿主的營養(yǎng)缺陷性整合有所述營養(yǎng)缺陷性互補(bǔ)標(biāo)記物的載體。
另外，本發(fā)明中的載體較好是具有在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因。分泌信號基因的位置為β_葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的5’末端側(cè)。在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因為編碼具有使表達(dá)的異種蛋白質(zhì)分泌至宿主細(xì)胞外的機(jī)能的氨基酸序列的基因。由結(jié)合有分泌信號基因的異種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)出N末端添加有分泌信號的異種蛋白質(zhì)。該異種蛋白質(zhì)在分泌信號通過宿主內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等被切斷后，除去了分泌信號的異種蛋白質(zhì)被分泌至細(xì)胞外。分泌信號基因(和分泌信號)必須在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用。作為在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號基因，可使用例如國際公開第1996/23890號中記載的基因。
本發(fā)明中，通過將該分泌信號的結(jié)構(gòu)基因?qū)毽耞葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的5’末端偵牝可表達(dá)在N末端添加了上述分泌信號的β-葡糖苷酶，使葡糖苷酶分泌至裂殖酵母屬酵母的菌體外。作為在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號，特別好是國際公開第1996/23890號中記載的Ρ3信號。
本發(fā)明中的載體是具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)或線狀DNA結(jié)構(gòu)的載體。制造上述表達(dá)盒在裂殖酵母屬酵母的細(xì)胞內(nèi)作為染色體外基因保持的轉(zhuǎn)化體的情況下，載體較好是包含用于在裂殖酵母屬酵母內(nèi)被復(fù)制的序列、即、自主復(fù)制序列(Autonomously ReplicatingSequence:ARS)的質(zhì)粒。
制造上述表達(dá)盒整合到裂殖酵母屬酵母的染色體中的轉(zhuǎn)化體的情況下，較好是將載體以線狀DNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入宿主。
如上所述，從繼代培養(yǎng)的角度來看，較好是表達(dá)盒整合到裂殖酵母屬酵母的染色體中的轉(zhuǎn)化體。以下，對用于制造整合到裂殖酵母屬酵母的染色體中的轉(zhuǎn)化體的載體進(jìn)行說明。
表達(dá)盒向染色體中的整合可以采用同源重組或非同源重組，從可整合到染色體中的任意位置的角度來看，較好是采用同源重組。
將載體以線狀DNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入宿主的情況下，如果是具有通常所用的質(zhì)粒DNA那樣的環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體，較好是用限制酶將載體切開成線狀后導(dǎo)入裂殖酵母屬酵母的細(xì)胞。該情況下，切開具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體的位置在重組部位內(nèi)。由此，切開的載體兩端分別部分存在重組部位，載體整體通過同源重組被整合至染色體的靶部位。
只要可形成兩端分別存在重組部位的一部分的線狀DNA結(jié)構(gòu)即可，載體可通過將具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體切開的方法以外的方法、例如采用PCR的酶擴(kuò)增法或化學(xué)合成法來構(gòu)筑。
為了構(gòu)筑本發(fā)明中的載體，可優(yōu)選采用例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等來源于大腸桿菌的質(zhì)粒。使用來源于大腸桿菌的質(zhì)粒構(gòu)筑的載體通常具有大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制所需的被稱為“ori”的復(fù)制起始點。此外，即使是不采用如上所述的來源于大腸桿菌的質(zhì)粒的情況下，也可在為了構(gòu)筑本發(fā)明中的載體進(jìn)行擴(kuò)增而采用大腸桿菌時利用上述“ori ”，獲得具有“ori ”的載體。
用于同源重組時的載體較好是除去了大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制所需的被稱為“ori”的復(fù)制起始點。由此， 將上述的載體整合至染色體中時，可使其整合效率提高(參照日本專利特開 2000-262284 號公報)。
除去了復(fù)制起始點的載體的構(gòu)筑方法無特別限定，較好是使用日本專利特開2000-262284號公報中所記載的方法。即，較好是使預(yù)先構(gòu)筑在重組部位內(nèi)的剪切位點插入有復(fù)制起始點的前體載體，如上所述在形成線狀DNA結(jié)構(gòu)的同時切出復(fù)制起始點的方法。由此，可簡便地獲得除去了復(fù)制起始點的載體。
此外，還可以是采用日本專利特開平5-15380號公報、日本專利特開平7-163373號公報、國際公開第96/23890號、日本專利特開平10-234375號公報等中所記載的表達(dá)載體及其構(gòu)筑方法，構(gòu)筑具有表達(dá)盒和重組部位的前體載體，再通過常規(guī)的基因工程方法從該前體載體除去復(fù)制起始點而獲得用于同源重組的載體的方法。
載體中的表達(dá)盒的數(shù)量可以是僅I個，也可以是2個以上。即使載體中的表達(dá)盒的數(shù)量為I個，裂殖酵母屬酵母的染色體的同一位點可能會整合有2個以上的表達(dá)盒。此外，如果載體中的表達(dá)盒的數(shù)量為2個以上，則裂殖酵母屬酵母的染色體的同一位點連續(xù)整合有多個表達(dá)盒。
本發(fā)明中的載體較好是具有I 8個表達(dá)盒，特別好是2 4個。
如果載體所具有的表達(dá)盒的數(shù)量為2個以上，則容易增加整合至裂殖酵母屬酵母的染色體的表達(dá)盒的數(shù)量，進(jìn)一步加大異種蛋白質(zhì)的表達(dá)量。但是，本發(fā)明中后述靶部位的數(shù)量多時可盡可能地增加所整合的表達(dá)盒的數(shù)量。此外，如果載體所具有的表達(dá)盒的數(shù)量為8個以下，則容易抑制載體過大而導(dǎo)致基于同源重組的載體的重組效率的下降。如果表達(dá)盒的數(shù)量為4個以下，則可進(jìn)一步提高重組效率。
載體的重組部位為具有可對裂殖酵母屬酵母的染色體中的同源重組靶部位進(jìn)行同源重組的堿基序列的部位。此外，靶部位為成為裂殖酵母屬酵母的染色體內(nèi)整合表達(dá)盒的目標(biāo)的部位。靶部位可通過使載體的重組部位為對該靶部位進(jìn)行同源重組的堿基序列來自由地進(jìn)行設(shè)定。
為了進(jìn)行同源重組，需要使所述重組部位的堿基序列與靶部位的堿基序列的同一性在70%以上。此外，從容易進(jìn)行同源重組的角度來看，重組部位的堿基序列與靶部位的堿基序列的同一性較好是在90%以上，更好是在95%以上。通過使用具有這樣的重組部位的載體，表達(dá)盒通過同源重組被整合到靶部位。
重組部位的長度較好是20 2000bp。如果重組部位的長度在20bp以上，則容易進(jìn)行同源重組。此外，如果重組部位的長度在2000bp以下，則容易防止載體過長而導(dǎo)致難以進(jìn)行同源重組。重組部位的長度更好是在IOObp以上，進(jìn)一步更好是在200bp以上。此夕卜，重組部位的長度更好是在SOObp以下，進(jìn)一步更好是在400bp以下。
(宿主的靶部位)
整合表達(dá)盒的靶部位在裂殖酵母屬酵母所具有的染色體中較好是(I)存在于各染色體的2處以上的靶部位、或(2)以其間夾有I個以上的必需基因的方式存在于同一染色體的多處的2處以上的靶部位、或同時滿足(I)和(2)的多個靶部位。這2處以上的靶部位為具有實質(zhì)上相同的喊基序列的部位。其中，實質(zhì)上相同的喊基序列是指各自的革G部位的堿基序列的同一性在90 %以上。靶部位之間的同一性較好是在95 %以上，更好是在99 %以上。
上述的必需基因是指該基因缺失或失活時無法生長的基因，是本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的生長不可缺少的基因。因此，夾著該必需基因?qū)氲谋磉_(dá)盒如果脫落，則必需基因也脫落，轉(zhuǎn)化體無法生長。由此，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)中，表達(dá)盒脫落的轉(zhuǎn)化體與表達(dá)盒未脫落的轉(zhuǎn)化體一起生長的可能性減小，異種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)效率下降的可能性降低。通常表達(dá)盒脫落的轉(zhuǎn)化體的增殖速度快，因此較好是向滿足上述(2)的靶部位導(dǎo)入表達(dá)盒。
由于像這樣靶部位在裂殖酵母屬酵母的染色體中分散存在，表達(dá)盒分散整合至染色體中，因此所整合的表達(dá)盒不易脫落，繼代中的維持穩(wěn)定性極高。因此，可穩(wěn)定地以高生產(chǎn)性制造異種蛋白質(zhì)。
此外，通過像這樣使堿基序列為實質(zhì)上相同的靶部位，即使在不同的位置存在多個靶部位，也可通過I種載體向這些靶部位簡便地整合載體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法中，較好是整合載體的靶部位為5處以上。如果靶部位在5處以上，則容易使整合至染色體的表達(dá)盒的數(shù)量增加，因此異種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性進(jìn)一步提高。
此外,靶部位更好是10 60處。如果靶部位在10處以上，則容易使整合至染色體的表達(dá)盒的數(shù)量進(jìn)一步增加，異種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性進(jìn)一步提高。如果靶部位在60處以下，則容易抑制整合至染色體的表達(dá)盒過多而使異種蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少。
從將表達(dá)盒一次性以I種載體整合至分散存在于裂殖酵母屬酵母的多個染色體中的靶部位的角度來看，靶部位較好是轉(zhuǎn)座子基因Tf2中的堿基序列。Tf2是在粟酒裂殖酵母中于3條染色體存在合計13處的長度(堿基數(shù))為約4900bp的轉(zhuǎn)座子基因，堿基序列之間的同一性為 99.7% (參照 Nathan J.Bowen 等，Genome Res.200313:1984-1997)。
但是，靶部·位不限于上述的部位。例如，除了轉(zhuǎn)座子基因Tf2以外，可將具有所述重組部位的長度以上的長度且染色體中具有多個實質(zhì)上相同的堿基序列的部位(基因等)作為靶部位。此外，例如可在染色體中新導(dǎo)入多個具有所述重組部位的長度以上的長度且具有實質(zhì)上相同的堿基序列的基因(靶部位)而形成靶部位后，向這多個靶部位導(dǎo)入載體。
(轉(zhuǎn)化方法)
使用上述載體，對作為宿主的裂殖酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法可使用任何公知的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化方法。作為這樣的轉(zhuǎn)化方法，可例舉例如乙酸鋰法、電穿孔法、球狀質(zhì)體法、玻璃珠法等目前公知的方法和日本專利特開2005-198612號公報記載的方法等。此外，還可使用市售的酵母轉(zhuǎn)化用試劑盒。
進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，通常對所得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選。作為篩選方法，可例舉例如以下所示的方法。通過能以所述營養(yǎng)缺陷性標(biāo)記物選擇轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，從所得的群落選擇多個。接著，將它們分別進(jìn)行液體培養(yǎng)后，考察各培養(yǎng)液中的異種蛋白質(zhì)的表達(dá)量，篩選異種蛋白質(zhì)的表達(dá)量更多的轉(zhuǎn)化體。此外，通過對這些篩選的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行采用脈沖場凝膠電泳法的基因組分析，可考察整合至染色體的載體的數(shù)量和表達(dá)盒的數(shù)量。
(培養(yǎng)方法)
用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的培養(yǎng)液可使用公知的酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基，只要包含裂殖酵母屬酵母可同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等而可高效地進(jìn)行裂殖酵母屬酵母的培養(yǎng)即可。作為培養(yǎng)液，可使用天然培養(yǎng)基，也可使用合成培養(yǎng)基。
作為碳源，可例舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。
作為氮源，可例舉例如氨、氯化銨和乙酸銨等無機(jī)酸或無機(jī)酸的銨鹽、蛋白胨、酪蛋白氨基酸。
作為無機(jī)鹽類，可例舉例如磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉。
培養(yǎng)可使用公知的酵母培養(yǎng)方法，可通過例如振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)等進(jìn)行。
此外，培養(yǎng)溫度較好是23 37°C。此外，培養(yǎng)時間可適當(dāng)確定。
此外，培養(yǎng)可以是分批培養(yǎng),也可以是連續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而從培養(yǎng)液或菌體分離β -葡糖苷酶的情況下，可使用公知的蛋白質(zhì)分離方法。例如，可在培養(yǎng)后將菌體從培養(yǎng)液分離，破壞菌體而獲得含葡糖苷酶的細(xì)胞破碎液，從該細(xì)胞破碎液用例如鹽析、柱純化、色譜法、免疫沉淀等公知的蛋白質(zhì)分離方法獲得β -匍糖苷酶。
此外，使用具有結(jié)合有分泌信號基因的β_葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)化體的情況下，β_葡糖苷酶被分泌至培養(yǎng)液中，因此可從培養(yǎng)液使用公知的蛋白質(zhì)分離方法獲得 葡糖苷酶。也可以重復(fù)進(jìn)行從培養(yǎng)了一定時間的培養(yǎng)液通過離心等回收含葡糖苷酶的培養(yǎng)上清并向剩下的菌體加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)的操作，連續(xù)地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而使其產(chǎn)生葡糖苷酶。
還可以不從含葡糖苷酶的培養(yǎng)液或細(xì)胞破碎液分離葡糖苷酶，使該培養(yǎng)液或細(xì)胞破碎液直接與作為降解對象的纖維素接觸。
[纖維素的降解方法]
本發(fā)明的纖維素的降解方法使用從培養(yǎng)上述本發(fā)明的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體而得的菌體或培養(yǎng)液獲得的β_葡糖苷酶。此外，使用具有結(jié)合有分泌信號基因的β_葡糖苷酶結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)化體的情況下，也可以在存在纖維素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，通過分泌至培養(yǎng)液的β-葡糖苷酶降解培養(yǎng)液中的纖維素。
對作為降解對象的纖維素的形態(tài)無特別限定，可以是純化纖維素，也可以是木材或稻草、稻殼、雜草等生物質(zhì)中所含的纖維素。
用通過將轉(zhuǎn)化體在纖維素的存在下進(jìn)行培養(yǎng)而分泌的β -葡糖苷酶降解纖維素的情況下，培養(yǎng)條件可采用裂殖酵母屬酵母的常規(guī)培養(yǎng)條件。培養(yǎng)液的優(yōu)選pH為3.0 8.0，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為23 37°C。使用將轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的產(chǎn)物分離、純化而得的β -葡糖苷酶降解纖維素的情況下，反應(yīng)條件可使用公知的葡糖苷酶的反應(yīng)條件。采用葡糖苷酶的降解反應(yīng)液中的優(yōu)選pH為3.0 8.0，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為20 65°C。
作為具體 的纖維素的降解方法，可例舉例如下述方法:培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)液或菌體分離或純化β -葡糖苷酶，與含纖維素的生物質(zhì)和內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶一起進(jìn)行孵育。此外，使用分泌β-葡糖苷酶的轉(zhuǎn)化體的情況下，還可例舉將上述生物質(zhì)與培養(yǎng)的上述轉(zhuǎn)化體混合后進(jìn)行孵育的方法、在上述生物質(zhì)的存在下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體的方法。實施例
以下，示出實施例和比較例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。但是，本發(fā)明并不受到下述記載的限定。
[試驗例I]表達(dá)載體的制備
根據(jù)已知的來源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)F-50的β -葡糖苷酶I (Kawaguchi, T.等，〃Gene〃vol.173 (2)，pp.287-288 (1996))(以下稱為 AaBGLl)的肽序列設(shè)計用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的高表達(dá)型密碼子置換了的基因序列(參照序列編號2，以下稱為AaBGLl基因)。在起始密碼子前添加Kpn 1、BspH I識別序列。在終止密碼子后添加Xba I ,Sac I識別序列。將含該序列的質(zhì)粒(由德國雷根斯堡的基因工藝公司(一 > 7 —卜社)合成)用限制酶BspH I > Xba I消化。
另一方面，在其同時另外將pSL61acZ用限制酶Aar 1、Xba I消化,進(jìn)行堿性磷酸酶處理。該處理后，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從瓊脂糖凝膠切出載體PSL6片段和上述的AaBGLl基因片段，進(jìn)行連接后導(dǎo)入大腸桿菌DH5ci (寶生物技術(shù)株式會社(夕力7 ^才社)制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過所得的轉(zhuǎn)化體制備載體，獲得作為目標(biāo)的表達(dá)載體pSL6AaBGLl (參照圖1、序列編號3)。根據(jù)限制酶圖譜的繪制確認(rèn)為目標(biāo)載體。
此外，為了制造將作為分泌信號的P3信號添加于N末端的AaBGLl，以pSL6AaBGLl為模板用In-fusion引物通過PCR法擴(kuò)增AaBGLl基因片段。另一方面，將pSL6P31acZ用限制酶Afl II ,Xba I消化。將該片段和通過PCR得到的上述AaBGLl基因片段用In-fusion法環(huán)化后，導(dǎo)入大腸桿菌DH5ci進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過所得的轉(zhuǎn)化體制備載體，獲得作為目標(biāo)的表達(dá)載體pSL6P3AaBGLl (參照圖2、序列編號4)。根據(jù)限制酶圖譜的繪制和部分堿基序列的確認(rèn)而確認(rèn)為目標(biāo)載體。
[試驗例2]轉(zhuǎn)化體的制備
使作為宿主的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的亮氨酸缺陷株(基因型:h-、leul-32，東京大學(xué)研究生院理學(xué)系研究科附屬基因?qū)嶒炘O(shè)施的飯野雄一教授提供)(ATCC38399)用YES (0.5 %酵母提取物、3 %葡萄糖、0.lmg/ml SP補(bǔ)充劑)培養(yǎng)基生長至0.6X IO7細(xì)胞數(shù)/ml。集菌并清洗后，按照1.0X IO8細(xì)胞數(shù)/ml的條件懸浮于0.1M乙酸鋰(ρΗ5.0)。然后，向100μ I懸浮液中加入Iyg將上述中得到的載體pSL6AaBGLl或pSL6P3AaBGLl用限制酶Not I消化而得的產(chǎn)物，再加入290 μ 150% (w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液充分?jǐn)嚢韬?，按?0°C下60分鐘、42°C下5分鐘、室溫下10分鐘的順序孵育。通過離心除去PEG4000，清洗后懸浮于150 μ I的滅菌水，涂布于極限瓊脂培養(yǎng)基。
3天后，獲得轉(zhuǎn)化體(AaBGLl表達(dá)株)。將用pSL6AaBGLl轉(zhuǎn)化了的菌株記作ASP3325株。將用pSL6P3AaBGLl轉(zhuǎn)化了的菌株記作ASP3326株。
[試驗例3]轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)
將上述中得到的AaBGLl表達(dá)株用YES培養(yǎng)基在30°C培養(yǎng)I天。將100 μ I該培養(yǎng)液移至5ml YH)培養(yǎng)基(1%酵母 提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)，在30°C培養(yǎng)2天。將該培養(yǎng)液離心分離而獲得培養(yǎng)上清。
[試驗例4]基于活性測定的AaBGLl的確認(rèn)
使用上述中得到的AaBGLl表達(dá)株的培養(yǎng)上清制備酶稀釋樣品，按照下述方法進(jìn)行活性測定(活性測定法)。
向20mM對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(以下略作pNPG) 10 μ I中加入IM乙酸鈉緩沖液(ΡΗ4.5) 10 μ I和130 μ I水，添加50 μ I酶稀釋樣品，在37°C使其反應(yīng)10分鐘。將100 μ I反應(yīng)液加入100 μ I的2%碳酸鈉溶液中使反應(yīng)停止，以450nm的波長對游離的對硝基苯酚進(jìn)行比色定量。
將每I分鐘生成相當(dāng)于I μ mo I的對硝基苯酚的酶量設(shè)為1U。
其結(jié)果是，來自ASP3326株的酶稀釋樣品的活性為0.85U/ml，來自ASP3325株的酶稀釋樣品的活性為0.12U/ml，來自添加了 P3信號的AaBGLl表達(dá)株(ASP3326株)的酶稀釋樣品的活性相對于來自未添加P3信號的表達(dá)株(ASP3325株)的酶稀釋樣品的活性為約7倍。
[試驗例5]P3信號添加AaBGLl表達(dá)株(ASP3326株)的分批補(bǔ)料式培養(yǎng)
在IOOml的YES培養(yǎng)基中接種ASP3326株，在30°C預(yù)培養(yǎng)至OD66tl=IO左右。接著，使用發(fā)酵罐將預(yù)培養(yǎng)液加入IOOOml的Yro培養(yǎng)基中，在葡萄糖為1%以下的情況下以葡萄糖不枯竭的條件流加下述表I記載的組成的流加培養(yǎng)基，在30°c培養(yǎng)2天。pH通過1.5NNaOHU.5M KOH溶液的添加控制保持為4.5。培養(yǎng)后，通過離心分離獲得培養(yǎng)上清。
流加培養(yǎng)基組成
[表 I]
權(quán)利要求
1.裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，染色體中具有來源于絲狀菌的編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列或者作為染色體外基因具有這些序列。
2.如權(quán)利要求1所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述葡糖苷酶為BGLl。
3.如權(quán)利要求1或2所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述絲狀菌為曲霉(Aspergillus)屬的微生物。
4.如權(quán)利要求1 3中的任一項所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述β-葡糖苷酶為由以序列編號I表示的氨基酸序列形成或者由該氨基酸序列中存在I個以上的氨基酸的缺失、置換或插入的氨基酸序列形成且具有催化β -D-吡喃葡萄糖苷鍵的水解反應(yīng)的活性的葡糖苷酶。
5.如權(quán)利要求1 4中的任一項所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述編碼β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列的5’末端側(cè)具有在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號的結(jié)構(gòu)基因序列。
6.裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法,其特征在于,通過包含來源于絲狀菌的編碼β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列以及用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列的載體對裂殖酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
7.如權(quán)利要求6所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，所述編碼β_葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列的5’末端側(cè)具有在裂殖酵母屬酵母內(nèi)起作用的分泌信號的結(jié)構(gòu)基因序列。
8.如權(quán)利要求6或7所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，所述來源于絲狀菌的編碼葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因整合至裂殖酵母屬酵母的染色體的I處以上。
9.如權(quán)利要求8所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，向染色體的整合通過同源重組進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求9所述的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，將載體整合至轉(zhuǎn)座子基因Tf2位點。
11.β_葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，從對權(quán)利要求1 4中的任一項所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)而得的菌體獲得β_葡 糖苷酶。
12.β -葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，從對權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)而得的培養(yǎng)液獲得β_匍糖苷酶。
13.纖維素的降解方法，其特征在于，使用通過權(quán)利要求11或12所述的制造方法得到的葡糖苷酶。
14.纖維素的降解方法，其特征在于，在纖維素的存在下對權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供可生產(chǎn)β-葡糖苷酶的裂殖酵母屬酵母的轉(zhuǎn)化體及其制造方法。裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，染色體中具有來源于絲狀菌的編碼β-葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列、用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列或者作為染色體外基因具有這些序列。此外，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，通過包含來源于絲狀菌的編碼β-葡糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因序列、用于使該結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動子序列和終止子序列的載體對裂殖酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
文檔編號C12P19/14GK103180442SQ20118005137
公開日2013年6月26日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者東田英毅, 岡田和士 申請人:旭硝子株式會社