專利名稱：細(xì)胞集合體的非靜態(tài)懸浮培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括高濃度細(xì)胞集合體的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，以及制造所述高濃度細(xì)胞集合體的方法。所述集合體可包括干細(xì)胞。干細(xì)胞可包括非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞、非胚胎生殖細(xì)胞的細(xì)胞，并且其表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物。所述細(xì)胞可分化為外胚層胚胎胚層、內(nèi)胚層胚胎胚層和中胚層胚胎胚層中至少兩種的細(xì)胞類型。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)隨著干細(xì)胞用于細(xì)胞治療和藥物毒性篩選的潛力的增長(zhǎng)，有不斷增長(zhǎng)的設(shè)計(jì)用于干細(xì)胞的可放大擴(kuò)增和分化的強(qiáng)大生物過(guò)程的需要。因此，為滿足每次治療約IO9-1Oltl個(gè)細(xì)胞的臨床需要，需要工 作體積在IOOml至幾升的范圍的生物反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)已被用于鼠和人胚胎干細(xì)胞(ESC)的擴(kuò)增和分化，這是通過(guò)將它們作為集合體或在微載體上培養(yǎng)(Abranches et al.2007;Cameron et al.2006;Cormieret al.2006;Dang et al.2004;Fok and Zandstra2005;Krawetz et al.2009;Lock andTzanakakis2009; Oh et al.2009; zur Nieden et al.2007)。也可在懸浮液中培養(yǎng)成體干細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(Li et al.2006)、神經(jīng)干細(xì)胞(Gilbertson et al.2006)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC) (Frauenschuh et al.2007; Yu et al.2009)。大多數(shù)涉及 MSC 的研究已經(jīng)將細(xì)胞接種到微載體上(Frauenschuh et al.2007)或植入到3D聚合物支架內(nèi)(Zhaoand Ma2005)。在最近的研究中，作為多細(xì)胞三維(3D)集合體的MSC的培養(yǎng)被證明可作為另一種在懸浮液中培養(yǎng)的模式(Frith et al.2009)。除了在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞生產(chǎn)的益處外，有越來(lái)越多的證據(jù)表明，3D集合體比傳統(tǒng)的二維(2D)單層培養(yǎng)方法有顯著更好的體內(nèi)表型和生物反應(yīng)的重演性。這被認(rèn)為是由于細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、細(xì)胞形狀、空間梯度的差異，導(dǎo)致了基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。因此，這些3D系統(tǒng)的潛在應(yīng)用還可擴(kuò)展到開(kāi)發(fā)“仿生” 3D組織/類器官，以及作為研究分化、器官發(fā)生、遷移、腫瘤生物學(xué)和高通量藥物篩選的體外模型(Griffith and Swartz2006;Keller et al.2006; Liuet al.2009;Ong et al.2009;Pampaloni et al.2007;Yamada and Cukierman2007)o

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞集合體一即使是在靜態(tài)培養(yǎng)中形成，當(dāng)在非靜態(tài)條件例如攪拌的懸浮液中進(jìn)一步培養(yǎng)時(shí)可繼續(xù)增大。這些起始集合體可在這些條件下繼續(xù)生長(zhǎng)的事實(shí)表明，非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)中的生長(zhǎng)對(duì)作為集合體的細(xì)胞的細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)不是破壞性的。現(xiàn)在可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的事實(shí)使得可產(chǎn)生高密度的干細(xì)胞培養(yǎng)物，這對(duì)臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)是實(shí)用且需要的。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括但不限于以下這些。本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其包括非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)的干細(xì)胞集合體，其中所述細(xì)胞密度范圍可為約5X IO4個(gè)細(xì)胞/ml至IO8個(gè)細(xì)胞/ml?？捎脧睦鐢M胚體形成的集合體來(lái)接種所述高密度培養(yǎng)物。在這些擬胚體中，所述集合體的最大尺寸可以為約500 μ m。每集合體的最大細(xì)胞數(shù)可以為約25,000。在所述非靜態(tài)培養(yǎng)中，所接種的(初始)集合體可生長(zhǎng)至每集合體中約50，000個(gè)細(xì)胞的平均最大值，平均最大直徑為約1mm。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)培養(yǎng)中形成的集合體的尺寸范圍為約ΙΟμπι-lmm。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞密度范圍為約5X IO4-1O8個(gè)細(xì)胞 /ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)的體積范圍為約10ml-20000L。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)是非貼壁的。非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的類型包括但不限于，實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)瓶、搖瓶和混合釜生物反應(yīng)器。本發(fā)明還提供了制備上述組合物的方法。所述方法包括將集合體接種到非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)條件中，并培養(yǎng)擴(kuò)增這些集合體，直到它們達(dá)到需要的尺寸(細(xì)胞數(shù))并且每ml的細(xì)胞數(shù)達(dá)到需要的密度。因此，本發(fā)明涉及一種通過(guò)將細(xì)胞集合體引入到非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)制備細(xì)胞培養(yǎng)組合物的方法，在所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)中每集合體的平均細(xì)胞數(shù)增加。增加的范圍可從約2倍至5，000倍。例如，起始時(shí)平均起始數(shù)為10個(gè)細(xì)胞的集合體可生長(zhǎng)為平均細(xì)胞數(shù)為50，000或更多的集合體。因此，最高范圍為約5，000X。在這種情況中，以約10個(gè)細(xì)胞(平均)的集合體起始并增長(zhǎng)至約50，000個(gè)細(xì)胞(平均)的集合體，是增長(zhǎng)5，000 X。以約100個(gè)細(xì)胞的集合體起始并增長(zhǎng)至約50，000個(gè)細(xì)胞的集合體，是約增長(zhǎng)500 X。以約1，000個(gè)細(xì)胞的集合體起始并增長(zhǎng)至約50，000個(gè)細(xì)胞的集合體，是增長(zhǎng)50 X。以約5，000個(gè)細(xì)胞的集合體起始并增長(zhǎng)至約50，000個(gè)細(xì)胞的集合體，是增長(zhǎng)10 X。因此，可以從下限為約10個(gè)細(xì)胞至上限甚至為約25，000個(gè)細(xì)胞的集合體起始。然后，可以使這些集合體的每個(gè)達(dá)到約50，000個(gè)細(xì)胞的上限或達(dá)到少于50，000個(gè)細(xì)胞的集合體大小。起始的集合體越小，就必須增加越高的倍數(shù)來(lái)獲得非常大的集合體，例如25，000至50，000個(gè)細(xì)胞。起始的集合體越大，必須增加的倍數(shù)就越小。因此，在懸浮培養(yǎng)物中可保持為完整集合體的每個(gè)集合體中的平均細(xì)胞數(shù)的范圍可以為(每集合體)5，000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000,10, 000,11, 000,12, 000,13, 000、14，000、15，000、16，000、17，000、18，000、19，000,20, 000、約 20，000 至 25，000、約 25，000至 30，000、約 30，000 至 35，000、約 35，000 至 40，000、約 40，000 至 45，000、約 45，000 至50，000，并可能更多。中間的范圍也被包括在內(nèi)(例如21，000、22，000等)。初始平均細(xì)胞數(shù)為約1，000時(shí)，本發(fā)明涵蓋的倍數(shù)增加范圍最高達(dá)約50倍(即每集合體約50，000個(gè)細(xì)胞)，例如 IOX 至 15 X、15 X 至 20X、20X 至 25X、25X 至 30X、30X 至 35X、35X 至 40X、40X至45X、45X至50X，以及更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)培養(yǎng)中形成的集合體的尺寸范圍約為ΙΟμπι-lmm.
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞密度范圍為5 X IO4-1O8個(gè)細(xì)胞/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)的體積范圍為10ml_20000L。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)是非貼壁的。非貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的類型包括但不限于，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)瓶、旋轉(zhuǎn)瓶、搖瓶和混合釜生物反應(yīng)器。所述方法還還包括，通過(guò)將可藥用載體與上述方法所產(chǎn)生的集合體混合來(lái)制備藥物組合物。所述方法還包括，通過(guò)解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體來(lái)制備源自細(xì)胞集合體的細(xì)胞。所述方法還包括，通過(guò)將源自上述方法所產(chǎn)生的集合體的細(xì)胞引入到培養(yǎng)基中來(lái)制備細(xì)胞培養(yǎng)組合物。所述方法還包括，通過(guò)將可藥用載體與源自上述方法所產(chǎn)生的集合體的細(xì)胞混合來(lái)制備藥物組合物。所述方法還包括，通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件來(lái)制備分化的細(xì)胞。所述方法還包括，通過(guò)將可藥用載體與通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而制備的分化細(xì)胞相混合來(lái)制備藥物組合物。

所述方法還包括，通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件來(lái)制備分化的細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種通過(guò)將分化細(xì)胞與可藥用載體混合來(lái)制備藥物組合物的方法，所述細(xì)胞是通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括將上述方法所產(chǎn)生的集合體給予受試者。所述方法還包括，將包含可藥用載體和上述方法所產(chǎn)生的集合體的藥物組合物給予受試者。所述方法還包括，將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞給予受試者。所述方法還包括，將藥物組合物給予受試者，所述藥物組合物包含可藥用載體和通過(guò)解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞。所述方法還包括，將分化的細(xì)胞給予受試者，所述分化的細(xì)胞是通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括，將包含可藥用載體和分化細(xì)胞的藥物組合物給予受試者，所述分化細(xì)胞是通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括，將分化的細(xì)胞給予受試者，所述分化的細(xì)胞是通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括，將包含可藥用載體和分化細(xì)胞的藥物組合物給予受試者，所述分化細(xì)胞是通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括，通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體與試劑接觸并檢測(cè)所述試劑對(duì)集合體中細(xì)胞的影響來(lái)鑒定活性試劑。本發(fā)明還提供一種通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞與試劑接觸并檢測(cè)所述試劑對(duì)所述源自集合體的細(xì)胞的影響來(lái)鑒定活性試劑的方法。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的上述方法所產(chǎn)生的集合體來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法。
所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的藥物組合物來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法，所述藥物組合物包括可藥用載體和上述方法所產(chǎn)生的集合體。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的藥物組合物來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法，所述藥物組合物包括可藥用載體和通過(guò)解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的分化細(xì)胞來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法，所述分化細(xì)胞是通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的藥物組合物來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法，所述藥物組合物包括可藥用載體和分化細(xì)胞，所述分化細(xì)胞是通過(guò)將上述方法所產(chǎn)生的集合體暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的分化細(xì)胞來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法，所述分化細(xì)胞是通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。所述方法還包括一種通過(guò)給予治療有效量的藥物組合物來(lái)治療需要治療的受試者中的病癥的方法，所述藥物組合物包括可藥用載體和分化細(xì)胞，所述分化細(xì)胞是通過(guò)將解聚上述方法所產(chǎn)生的集合體而產(chǎn)生的細(xì)胞暴露于可產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件而產(chǎn)生的。根據(jù)以上陳述，所述細(xì)胞集合體可包括非胚胎干細(xì)胞、非胚胎生殖細(xì)胞、非生殖細(xì)胞的細(xì)胞，可分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中的至少兩種細(xì)胞類型，并且/或者表達(dá)一種或多種多能性標(biāo)志物。

本發(fā)明涉及的細(xì)胞可表達(dá)多能性標(biāo)志物，例如oct4。它們還可以表達(dá)與延長(zhǎng)復(fù)制能力相關(guān)的標(biāo)志物，例如端粒酶。其他的多能性特征可以包括分化為多于一種胚層，例如外胚層胚胎胚層、內(nèi)胚層胚胎胚層和中胚層胚胎胚層的兩種或三種，的細(xì)胞類型的能力。在培養(yǎng)物中這種細(xì)胞可以是或可以不是永生化的或轉(zhuǎn)化的。所述細(xì)胞可以高度擴(kuò)增而不轉(zhuǎn)化并維持正常的核型。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍增，例如50次、60次或更多次，其中所述細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)化并具有正常核型。所述細(xì)胞可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的兩種中每一種的至少一種細(xì)胞類型，并可以包括分化為所有的三種譜系。進(jìn)一步地，所述細(xì)胞可以是不致瘤的，例如不會(huì)產(chǎn)生畸胎瘤。如果細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的或致瘤的，并且需要使用它們來(lái)侵入，通過(guò)防止細(xì)胞增殖形成腫瘤的處理，這種細(xì)胞可以失能，因此它們不會(huì)在體內(nèi)形成腫瘤。這種處理在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。細(xì)胞包括但不限于以下編號(hào)的實(shí)施方案:1.分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍增，其中所述細(xì)胞表達(dá)oct4，沒(méi)有轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。2.如以上I所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其還表達(dá)端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2中的一種或多種。3.如以上I所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、夕卜胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的至少兩個(gè)中的至少一種細(xì)胞類型。4.如以上3所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其還表達(dá)端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2中的一種或多種。5.如以上3所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、夕卜胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的每個(gè)的至少一種細(xì)胞類型。6.如以上5所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其還表達(dá)端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2中的一種或多種。7.分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，是通過(guò)培養(yǎng)非胚胎、非生殖組織獲得的，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少40次細(xì)胞倍增，其中所述細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。8.如以上7所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其表達(dá)oct4、端粒酶、rex-Urox-1或sox-2中的一種或多種。9.如以上7所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、夕卜胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的至少兩個(gè)中的至少一種細(xì)胞類型。10.如以上9所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其表達(dá)oct4、端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2中的一種或多種。11.如以上9所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的每個(gè)的至少一種細(xì)胞類型。12.如以上11所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其表達(dá)oct4、端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2中的一種或多種。 13.分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍增，其中所述細(xì)胞表達(dá)端粒酶，沒(méi)有轉(zhuǎn)化，并具有正常的核型。14.如以上13所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其進(jìn)還表達(dá)0Ct4、reX-l、r0X-l或sox-2中的一種或多種。15.如以上13所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的至少兩個(gè)中的至少一種細(xì)胞類型。16.如以上15所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞,其還表達(dá)oct4、rex-l、rox_l、或sox-2中的一種或多種。17.如以上15所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的每個(gè)的至少一種細(xì)胞類型。18.如以上17所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其還表達(dá)oct4、reX-l、roX-l或sox-2中的一種或多種。19.分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的至少兩個(gè)中的至少一種細(xì)胞類型，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)物中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍增。20.如以上19所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其表達(dá)oct4、端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2中的一種或多種。21.如以上19所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的每個(gè)的至少一種細(xì)胞類型。
22.如以上21所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞，其表達(dá)oct4、端粒酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一種或多種。上文所述的細(xì)胞可從任何需要的組織來(lái)源制備，包括但不限于骨髓、臍帶血、臍帶基質(zhì)、外周血、胎盤(pán)、胎盤(pán)血、肌肉、腦、腎和其他實(shí)體器官。它們還可源自分泌的流體，例如尿和月經(jīng)血。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞源自人組織。39.在一個(gè)實(shí)施方案中，所述集合體中的細(xì)胞和源自所述集合體的細(xì)胞表達(dá)oct3/4、端粒酶、rex_l、rox_l、nanog、GATA6 和 sox_2 中的一種或多種。40.在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 集合體中的細(xì)胞和源自所述集合體的細(xì)胞可分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系的全部三種細(xì)胞類型。41.在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使所述集合體或源自所述集合體的細(xì)胞分化而產(chǎn)生的分化細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)胚層分化標(biāo)志物。42.在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使所述集合體或源自所述集合體的細(xì)胞分化而產(chǎn)生的分化細(xì)胞可表達(dá)外胚層分化標(biāo)志物。43.在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使所述集合體或源自所述集合體的細(xì)胞分化而產(chǎn)生的分化細(xì)胞可表達(dá)中胚層分化標(biāo)志物。44.在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使所述集合體或源自所述集合體的細(xì)胞分化而產(chǎn)生的分化細(xì)胞表型，具有選自肝細(xì)胞、胰島B細(xì)胞和神經(jīng)元的細(xì)胞的特征。45.在一個(gè)實(shí)施方案中，所述集合體為約IOOii m-800iim并且在培養(yǎng)物中的密度為IO5-1O8個(gè)細(xì)胞/ml。46.本發(fā)明還提供了本文的組合物，其中起始細(xì)胞是通過(guò)懸滴法或強(qiáng)制聚集方法而聚集的。47.本發(fā)明還提供了本文的方法，其中所述病癥為肝臟疾病或病癥、GVHD、心肌梗死、充血性心力衰竭、糖尿病、造血移植、外傷性腦損傷、脊髓損傷或中風(fēng)。48.本發(fā)明還提供了本文的方法，其中所述病癥包括受損的組織，所述組織為心臟、神經(jīng)元、眼、軟骨、骨、骨骼肌、平滑肌、骨髓、脾、肝臟、肺、腦、免疫系統(tǒng)、結(jié)締組織、血管、胰腺、CNS、PNS和腎組織的一種或多種。在本發(fā)明的以上陳述中，源自所述集合體的細(xì)胞可保持分化能力和/或表達(dá)所述聚集細(xì)胞的多能性標(biāo)志物(例如上文列出的那些)。


圖1示出了用于從單層(2D)培養(yǎng)的大鼠MAPC形成集合體的懸滴法以及隨后的分化。在MAPC培養(yǎng)基和5%氧氣中的懸滴中形成集合體4-5天后，將細(xì)胞集合體轉(zhuǎn)移到超低附著板以在相應(yīng)的分化培養(yǎng)基中分化。右側(cè)子圖示出了 2D單層中的細(xì)胞、未分化的細(xì)胞集合體和分化的細(xì)胞集合體的形態(tài)。圖2示出了在不同培養(yǎng)基條件下從大鼠MAPC形成的集合體。在最佳MAPC培養(yǎng)基條件下，所述集合體生長(zhǎng)為有明確邊界的球狀簇。從MAPC培養(yǎng)基中去除LIF誘導(dǎo)形成了對(duì)應(yīng)于分化早期征兆的有不規(guī)則邊界的集合體。在分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞集合體由于非最佳的生長(zhǎng)條件而小很多。
圖3示出了表達(dá)oct3/4的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(與MAPC的未分化狀態(tài)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子)。在76%的在2D單層中表達(dá)oct3/4的細(xì)胞中，70%當(dāng)在MAPC培養(yǎng)基和5%氧氣中形成集合體時(shí)在MAPC集合體中仍然保持表達(dá)oct3/4。其他條件是不同的培養(yǎng)基組成:_無(wú)LIF的MAPC培養(yǎng)基、分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，氧氣水平的選擇-5% (含氧量低)或21% (含氧量正常)。圖4示出了在通過(guò)懸滴法和強(qiáng)制聚集方法形成的MAPC2D和3D培養(yǎng)物中幾種未分化和分化標(biāo)志物的表達(dá)的QRT-PCR比較。不論哪種形成方法，oct3/4和GATA6的表達(dá)在2DMAPC和3D MAPC集合體之間都是類似的。在與MAPC2D類似的3D MAPC集合體中，早期內(nèi)胚層標(biāo)志物HNF3b和Goosecoid (Gsc)有少量表達(dá)，成熟期的內(nèi)胚層標(biāo)志物例如AFP、白蛋白、a -1-抗胰蛋白酶(AAT)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(TAT)無(wú)表達(dá)。圖5示出了 7天中在MAPC培養(yǎng)基和5%氧氣中的2D培養(yǎng)中由低oct3/4的MAPC形成的低oct3/4的MAPC集合體。在分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基和21%氧氣中自發(fā)分化時(shí)，集合體分化為形態(tài)上像脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞。圖6示出了受胰蛋白酶作用并重新鋪板到纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中的在MAPC培養(yǎng)基和5%氧氣中的高oct3/4的MAPC集合體。所述細(xì)胞的形態(tài)是典型的MAPC，它們能夠進(jìn)行顯示為細(xì)胞數(shù)隨著時(shí)間而增加的擴(kuò)增，并可在重新鋪板后的第I代(2D PI)和第2代(2DP2)以產(chǎn)生它們的MAPC集合體的表達(dá)水平保持表達(dá)MAPC標(biāo)志物oct3/4和GATA6。早期分化標(biāo)志物例如Goosecoid (Gsc)或Brachyury (Bry)的有少量表達(dá)或無(wú)表達(dá),更成熟的標(biāo)志物例如a -胎蛋白(AFP)無(wú)表達(dá)。圖7示出了在有2%血清的分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中MAPC集合體的自發(fā)多譜系分化。
oct3/4的水平隨著分化而下降,并觀察到三種胚層的標(biāo)志物-Nestin、Pax6 (神經(jīng)外胚·層)、SM22、Flk-l (中胚層)、AFP、白蛋白(內(nèi)胚層)——的表達(dá)增加。圖8示出了使用QRT-PCR對(duì)MAPC集合體的表征。圖9示出了使用多步方案分化的結(jié)果。圖10示出了 21天的分化(IOX)后集合體的形態(tài)。圖11示出了在2D對(duì)比3D條件中從維持未分化的大鼠MAPC譜系R2old和19起始定向分化成肝細(xì)胞(A)、內(nèi)皮細(xì)胞(B)和神經(jīng)前體(C)。圖12示出了，集合體保持MAPC表型。(a)表面培養(yǎng)的MAPC (□/■)和MAPC集合
體(第4天，資/■)的多能性、原始內(nèi)胚層和分化標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄本水平(2個(gè)譜系的數(shù)據(jù)各自顯示)。(b)集合體和表面培養(yǎng)的MAPC中0ct4蛋白的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果(兩種情形中都示出了陰性同種型對(duì)照和0ct4抗體處理的樣品)(c)0ct4 (篇)和AFP ( u )的轉(zhuǎn)錄本水
平，(d)在21%氧氣或在分化誘導(dǎo)條件中形成的集合體中0ct4的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果(陰性同種型對(duì)照和0ct4抗體處理的樣品分別顯示為紅色和藍(lán)色)。圖13示出了 MAPC集合體的表征。(a) MAPC集合體(第4天)的形態(tài)，(比例尺200 u m) (b)在集合體形成的最初48小時(shí)內(nèi)集合體大小的變化(c)集合體形成過(guò)程中的細(xì)胞增殖(e) MAPC集合體的TEM切片(d) E-鈣粘蛋白染色。圖14示出了 MAPC集合體的靜態(tài)培養(yǎng)。在集合體培養(yǎng)的16天培養(yǎng)物(■ / □)中(a)0ct4和(b)AFP轉(zhuǎn)錄本水平的變化；(A/A)分化培養(yǎng)基中的集合體。黑色和白色符號(hào)表示不同的MAPC譜系(c)，(d);兩個(gè)大鼠MAPC譜系中第16天的MAPC集合體中0ct4的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果(陰性同種型對(duì)照和0ct4抗體處理的樣品分別顯示為紅色和藍(lán)色)。圖15示出了源自集合體的MAPC的定向分化(第16天)。(a)神經(jīng)分化中神經(jīng)祖細(xì)胞(progenitor)標(biāo)志物Sox2、Nestin、Pax6的轉(zhuǎn)錄本水平(b)內(nèi)皮細(xì)胞分化中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物Flk-1、Ve-鈣粘蛋白、vWF、enos的轉(zhuǎn)錄本水平(c)肝細(xì)胞分化中肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、
白蛋白、AAT、TAT的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)(□/■):表面培養(yǎng)物(嶔/■)源自第16天集合體的細(xì)胞
(顯示了兩個(gè)不同細(xì)胞系各自的數(shù)據(jù)，n=3次分化的均值)。圖16示出了在旋轉(zhuǎn)瓶中MAPC細(xì)胞集合體的擴(kuò)增。(a)細(xì)胞增殖譜(b) MAPC集合體(第 4 天)的活體染色(c) MAPC 標(biāo)志物——(B)0ct4 ； (A) Rexl ;(x)CD31 ；(#)Sall4 ；( ) AFP——的轉(zhuǎn)錄本水平(三次旋轉(zhuǎn)瓶試驗(yàn)的平均值)(d)在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的終點(diǎn)(第4天)以及在對(duì)照2D培養(yǎng)(第4天)中在MAPC集合體中0ct4的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果(陰性同種型對(duì)照和0ct4抗體處理的樣品分別顯示為紅色和藍(lán)色)(e)在從旋轉(zhuǎn)擴(kuò)增培養(yǎng)的(□):第0天；(醫(yī)第2天；(■):第4天 細(xì)胞起始的靜態(tài)培養(yǎng)中在肝細(xì)胞分化條件中肝細(xì)胞標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄本水平。圖17示出了MAPC/原始內(nèi)胚層標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄本水平，(□):表面培養(yǎng)物(歿):靜
態(tài)培養(yǎng)中的MAPC細(xì)胞集合體和(■):懸浮培養(yǎng)中的MAPC細(xì)胞集合體。圖18示出了，(a)表面培養(yǎng)物(2D MAPC)、細(xì)胞集合體(3D MAPC)中纖連蛋白的轉(zhuǎn)錄本水平和大鼠一般mRNA水平，(b) MAPC在被纖連蛋白或集合體培養(yǎng)條件培養(yǎng)基(3D CM)或表面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基(2D CM)包被的板上或無(wú)包被的板上的生長(zhǎng)。圖19示出了 MAPC集合體的重新鋪板，(A)在MAPC的表面培養(yǎng)(□)、集合體(第4天，■)和源自集合體的細(xì)胞(第2代，■)的重新鋪板表面培養(yǎng)中多能性和分化標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄本水平，(B)表面培養(yǎng)的MAPC的形態(tài)，(C)源自集合體的細(xì)胞的重新鋪板表面培養(yǎng)的形態(tài)。圖20示出了在維持培養(yǎng)基中MAPC (□)和MAPC集合體(第4天，■)的表面培養(yǎng)中，以及在分化培養(yǎng)基中MAPC的表面培養(yǎng)(DM，■)中的細(xì)胞周期分布。圖21示出了，在靜態(tài)培養(yǎng)第10天MAPC集合體的形態(tài)，以說(shuō)明來(lái)自每個(gè)細(xì)胞集合體的小團(tuán)細(xì)胞開(kāi)始出芽。圖22示出了另一個(gè)大鼠MAPC譜系在旋轉(zhuǎn)瓶中的MAPC集合體的擴(kuò)增(a)兩次擴(kuò)增試驗(yàn)的細(xì)胞增殖譜，(b)MAPC集合體上MAPC標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄本水平(第0天，口；第I次試驗(yàn)第4天，■;第2次試驗(yàn)第4天，■)，(c)在第4天在MAPC集合體中0ct4的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量結(jié)果(陰性同種型對(duì)照和0ct4抗體處理的樣品分別顯示為紅色和藍(lán)色)。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于本文所述的具體方法、方案、試劑等，因此這些可以變化。本文使用的術(shù)語(yǔ)只為描述具體的實(shí)施方案的目的，不是意欲限制所公開(kāi)的發(fā)明的范圍，所述范圍僅由權(quán)利要求限定。本文使用的段落標(biāo)題僅出于組織的目的，而不應(yīng)被解釋為任何形式的對(duì)所述主題的限制。除非另外指明，本申請(qǐng)中的方法和技術(shù)通常按本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法和本說(shuō)明書(shū)中引用和論述的多種一般性及更專業(yè)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行。參見(jiàn)，例如，Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001) ；Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992) JPHarlow andLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.(1990)。定義用于本文時(shí)，以下術(shù)語(yǔ)具有如下定義的意義。“2D”是指細(xì)胞通過(guò)附著(粘附)到基質(zhì)上而生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)。這樣的細(xì)胞形成單層細(xì)胞或集落，其中所述細(xì)胞各自附著到基質(zhì)上(其中所述基質(zhì)不是所述細(xì)胞本身)。“3D”是指其中的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞相互之間的結(jié)合而不是通過(guò)與非所述細(xì)胞本身的基質(zhì)結(jié)合而作為集合體生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)。在本領(lǐng)域中，“3D”可以指粘附到支架或基質(zhì)上的細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是，用于本文時(shí)，3D按上述使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，初始時(shí)細(xì)胞可生長(zhǎng)在基質(zhì)上，其中一些細(xì)胞與所述基質(zhì)結(jié)合(粘附到所述基質(zhì))，但是進(jìn)一步生長(zhǎng)形成了細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合(聚集)，所述細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合不依賴于所述進(jìn)一步生長(zhǎng)的細(xì)胞與所述基質(zhì)的結(jié)合(粘附)。細(xì)胞飼養(yǎng)層也被認(rèn)為是基質(zhì)。因此，細(xì)胞附著到飼養(yǎng)層也是一種貼壁培養(yǎng)形式(非集合體)，因?yàn)樗黾?xì)胞的附著不是相互的而是附著到飼養(yǎng)層中的細(xì)胞?！ㄒ?〃或〃一個(gè)〃在本文中是指一個(gè)或多于一個(gè)；至少一個(gè)。當(dāng)本文中使用復(fù)數(shù)形式時(shí)，通常包括單數(shù)形式。“集合體”是指細(xì)胞的結(jié)合，其中所述結(jié)合是由細(xì)胞-細(xì)胞相互作用而不是由粘附至IJ基質(zhì)導(dǎo)致的。在2D單層培養(yǎng)中，細(xì)胞是相互“結(jié)合的”，但是是通過(guò)附著到基質(zhì)材料(例如塑料或表面涂層)的方式。在集 合體中，兩個(gè)或更多細(xì)胞通過(guò)彼此的生物附著而相互結(jié)合。這可以通過(guò)表面蛋白，例如胞外基質(zhì)蛋白?！凹?xì)胞庫(kù)”是為將來(lái)使用而培養(yǎng)和儲(chǔ)存的細(xì)胞的工業(yè)術(shù)語(yǔ)。細(xì)胞可以儲(chǔ)存為小份。它們可以直接從儲(chǔ)存中取用或可以在儲(chǔ)存后擴(kuò)增。這很方便以至有可用的“現(xiàn)成的”細(xì)胞用來(lái)給予。細(xì)胞可以是已儲(chǔ)存在藥用賦形劑中，因此可以直接給予，或者在細(xì)胞從儲(chǔ)存中釋放時(shí)可以和適當(dāng)?shù)馁x形劑混合。細(xì)胞可以是冷凍的或儲(chǔ)存為保留活力的形式。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，建立了細(xì)胞庫(kù)，其中的細(xì)胞已就需要的性質(zhì)進(jìn)行了選擇。在從儲(chǔ)存釋放后，給予所述受試者之前，優(yōu)選地就所述性質(zhì)的保留再次測(cè)定細(xì)胞。然后，具有需要的性質(zhì)的細(xì)胞可以給予所述受試者用于治療?？梢允褂脕?lái)源于要治療的個(gè)體的細(xì)胞(來(lái)自他們出生前組織例如胎盤(pán)、臍帶血或臍帶基質(zhì)或在出生后任何時(shí)間從所述個(gè)體擴(kuò)增)(自體的)來(lái)建立細(xì)胞庫(kù)。或者，細(xì)胞庫(kù)可以含有用于同種異體用途的細(xì)胞。主細(xì)胞庫(kù)是細(xì)胞的貯存器，以提供可被進(jìn)一步擴(kuò)增以提供用于給予受試者的劑量的小份細(xì)胞。“臨床相關(guān)的”細(xì)胞數(shù)是指足夠影響臨床反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)；即受試者中不需要的病理狀態(tài)的預(yù)防、減少、改善等。具體的實(shí)施方案關(guān)于足以建立主細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞數(shù)。“共給予”是指彼此結(jié)合、一起、配合地給予，包括同時(shí)或依次給予兩種或多種試劑。在沒(méi)有其他限制的情況下，“包含”是指必須包括所指事物，但不對(duì)其他可包括的事物進(jìn)行限制或排除。例如，“包含X和J的組合物”包括含有X和J的任何組合物，而不管所述組合物中是否存在其他組分。同樣，“包含步驟X的方法”包括其中進(jìn)行X (不管X是所述方法中的唯一步驟還是只是步驟之一)的任何方法，不管可能存在多少其他步驟，也不管X與這些步驟相比多么簡(jiǎn)單或復(fù)雜。“包括”和使用詞根“含”的類似短語(yǔ)在本文中用作“包含”的同意詞并具有相同的含義?！鞍ā笔恰鞍钡耐x詞(見(jiàn)上)?！皸l件細(xì)胞培養(yǎng)基”是本領(lǐng)域公知的術(shù)語(yǔ)，指細(xì)胞已在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基。本文中這是指將細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間以分泌可有效地達(dá)到所需效果的因子。條件細(xì)胞培養(yǎng)基是指細(xì)胞已在其中培養(yǎng)從而將因子分泌到所述培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基。細(xì)胞可通過(guò)足夠數(shù)量的細(xì)胞分裂來(lái)生長(zhǎng)以產(chǎn)生有效量的所述因子，使得所述培養(yǎng)基具有所述效果?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法將細(xì)胞從所述培養(yǎng)基中除去，所述方法包括但不限于離心、過(guò)濾、免疫耗竭(例如通過(guò)加標(biāo)記的抗體和磁性柱)和FACS分選。“分散物”是指源自所述集合體并且保留了集合體形式中細(xì)胞的功能一仍然可以分化為多于一種胚層的細(xì)胞類型和/或表達(dá)如本文所公開(kāi)的多能性標(biāo)志物一的細(xì)胞?！坝行Я俊蓖ǔＶ缚商峁┬枰木植炕蛉硇Ч牧?。例如，有效量是足以實(shí)現(xiàn)有益或需要的臨床效果的量。所述有效量可以單次給藥的形式一次全部提供或以多次給藥提供所述有效量的形式分份提供。對(duì)什么量會(huì)被認(rèn)為是有效量的準(zhǔn)確確定可基于每個(gè)受試者的個(gè)人因素，包括他們的身高體重、年齡、損傷和/或待治療的疾病或損傷以及距損傷發(fā)生或疾病開(kāi)始的時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于這些本領(lǐng)域中慣常的考慮確定給予受試者的有效量。當(dāng)用于本文時(shí)，“有效劑量”與“有效量”意義相同?！坝行?劑量”通常指可提供需要的局部或全身效應(yīng)(例如增強(qiáng)的表現(xiàn))的量。例如，有效劑量是足以實(shí)現(xiàn)有益或需要的臨床結(jié)果的量。所述劑量可在一次或多次給藥中給予并可包括任意預(yù)先選擇的量的細(xì)胞。對(duì)多少量會(huì)被認(rèn)為是有效劑量的準(zhǔn)確確定可基于每個(gè)受試者的個(gè)人因素，包括他們的身高體重、年齡、損傷和/或待治療的疾病或損傷以及距損傷發(fā)生或疾病開(kāi)始的時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員，尤其是醫(yī)師，能夠確定可構(gòu)成有效劑量的細(xì)胞數(shù)?！坝行緩健蓖ǔＪ侵柑峁┯糜趯⒁环N試劑送遞至所需腔室、系統(tǒng)或位置的途徑。例如，有效途徑是給予試劑以在所需的作用位點(diǎn)提供量足以實(shí)現(xiàn)有益或所需的臨床效果的所述試劑的途徑?！芭咛ジ杉?xì)胞(ESC)”為本領(lǐng)域所熟知并已從多種不同哺乳動(dòng)物種中制得。胚胎干細(xì)胞是源自被稱為胚泡的早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的干細(xì)胞。它們能夠分化為三種原胚層:夕卜胚層、內(nèi)胚層和中胚層的所有衍生物。這些包括成體內(nèi)超過(guò)220種細(xì)胞類型的每一種。ES細(xì)胞可成為體內(nèi)除胎盤(pán)外的任何組織。只有桑椹胚細(xì)胞是全能性的，能夠成為所有組織和胎盤(pán)。某些類似于ESC的細(xì)胞可以通過(guò)將體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到去細(xì)胞核的受精卵來(lái)產(chǎn)生。ES(和EG)細(xì)胞可通過(guò)用SSEAlGhIl^P SSEA4(人)的抗體進(jìn)行的陽(yáng)性染色來(lái)鑒別。在分子水平，ES和EG細(xì)胞表達(dá)許多這些未分化細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子包括oct3/4和rex_l。還發(fā)現(xiàn)了 LIF-R(小鼠中)和轉(zhuǎn)錄因子sox_2和rox_l。Rox-1和sox_2還在非ES細(xì)胞中表達(dá)。ES細(xì)胞的標(biāo)志為端粒酶活性，其可為這些細(xì)胞提供無(wú)限的體外自我更新潛能。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利 N0.5，453，357,5, 656，479,5, 670，372,5, 843，780,5, 874，301、5，914，268、6，110，739、6，190，910、6，200，806、6，432，711,6, 436，701,6, 500，668、6，703，279,6, 875，607,7, 029，913,7, 112，437,7, 145，057,7, 153，684 和 7，294，508，其各自以引用的方式納入本文以教導(dǎo)ES細(xì)胞以及制備所述ES細(xì)胞的方法。ES細(xì)胞已被以集合體形式培養(yǎng)。當(dāng)不附著到基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，它們能夠形成擬胚體。oct3/4 (在人中是oct3)是在原腸形成前期胚胎、卵裂期早期胚胎、囊泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞和胚胎癌(EC)細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(Nichols et al.，Cell95:379-91 (1998))，當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)分化時(shí)其表達(dá)下調(diào)。oct3/4的表達(dá)在胚胎發(fā)生和分化的早期確定性步驟中起重要作用。0ct3/4與rox-1聯(lián)合導(dǎo)致了鋅指蛋白rex-1的轉(zhuǎn)錄激活，oct3/4也是維持未分化的 ES 細(xì)胞需要的(Rosf jord and Rizzino, Biochem Biophys Res Commun203:1795-802(1997);Ben-Shushan et al.,Mol Cell Bioll8:1866-78(1998))。另夕卜，在ESC/EC中表達(dá)，但也在其他分化程度更高的細(xì)胞中表達(dá)的sox-2，與oct3/4 —起是保持未分化狀態(tài)所需要的(Uwanogho et al.,Mech Dev49:23-36 (1995))。鼠ES細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的維持需要LIF的存在。在人中oct3/4基因被轉(zhuǎn)錄為至少兩種剪接變體:oct3A和oct3B。所述oct3B剪接變體出現(xiàn)在很多分化細(xì)胞中，而oct3A剪接變體(以前也稱為oct3/4)被報(bào)告是未分化的ES細(xì)胞特有的。參見(jiàn)Shimozaki et al.Developmentl30:2505-12(2003)?！皵U(kuò)增”是指細(xì)胞的增殖，不發(fā)生分化。使用術(shù)語(yǔ)“包括”并非意圖進(jìn)行限制。例如，說(shuō)，干細(xì)胞“包括” IPS細(xì)胞并不意味著排除其他干細(xì)胞?！霸黾印币庵冈陬A(yù)先沒(méi)有存在時(shí)完全誘導(dǎo)，或者程度增加?！罢T導(dǎo)的多能干細(xì)胞(IPSC或IPS細(xì)胞)”是被再編程的體細(xì)胞，例如通過(guò)引入賦予所述體細(xì)胞分化程度較低的表型的外源基因產(chǎn)生的體細(xì)胞。然后，這些細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為分化程度較低的 后代。使用首先在2006年公開(kāi)的方法的改進(jìn)方法可獲得IPS細(xì)胞(Yamanaka, S.et al., Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007))。例如，在一個(gè)實(shí)例中，為形成 IPS細(xì)胞，科學(xué)家以皮膚細(xì)胞開(kāi)始，隨后通過(guò)用反轉(zhuǎn)錄病毒將基因插入到細(xì)胞DNA中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)對(duì)所述皮膚細(xì)胞進(jìn)行了改良。在一個(gè)實(shí)例中，所插入的基因?yàn)?ct4、SoX2、Lif4和c-myc,這些基因已知作為天然調(diào)控因子一起作用以使細(xì)胞保持在與胚胎干細(xì)胞相似的狀態(tài)。文獻(xiàn)已對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了描述。參見(jiàn)，例如，Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861(2008);Jaenisch et al., Cell, 132:567-582(2008);Hanna et al.，Cell, 133:250-264(2008);和 Brambrink et al., Cell Stem Cell, 2:151-159 (2008)。這些參考文獻(xiàn)以引用的方式納入以教導(dǎo)IPSC和制備它們的方法。也可通過(guò)特定培養(yǎng)條件(暴露于特定試劑)獲得這些細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“分離的”指不與一種或多種細(xì)胞結(jié)合或者不與在體內(nèi)與所述一種細(xì)胞或多種細(xì)胞結(jié)合的一種或多種細(xì)胞組分結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。“富集群”指需要的細(xì)胞相對(duì)于體內(nèi)或原代培養(yǎng)物中一種或多種其他細(xì)胞類型的數(shù)量上相對(duì)增加。然而，本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”不表示僅干細(xì)胞的存在情況。而是，術(shù)語(yǔ)“分離的”表示細(xì)胞從其天然組織環(huán)境中取出并以相對(duì)所述正常組織環(huán)境更高的濃度存在。因此，“分離的”細(xì)胞群可進(jìn)一步包括干細(xì)胞以外的細(xì)胞類型并可包括其他組織組分。這還可用例如細(xì)胞的倍增來(lái)表示。細(xì)胞可在體外或離體進(jìn)行10、20、30、40次或更多次的倍增，從而相對(duì)其在體內(nèi)或在原始組織環(huán)境(例如骨髓、外周血、脂肪組織等)中的原始數(shù)量被富集?！癕APC”是“多能成體祖細(xì)胞”的首字母縮略詞。它是指非胚胎干細(xì)胞或非生殖細(xì)胞但具有這兩種細(xì)胞的某些特征的細(xì)胞。MAPC可以以許多其他描述來(lái)表征，每一個(gè)描述在被發(fā)現(xiàn)時(shí)均賦予所述細(xì)胞以新特征。因此，它們可以用這些描述中的一個(gè)或多個(gè)來(lái)表征。第一，它們無(wú)需轉(zhuǎn)化(發(fā)生腫瘤)而具有在培養(yǎng)物中長(zhǎng)期復(fù)制的能力并具有正常核型。第二，它們?cè)诜只瘯r(shí)可以生成多于一個(gè)胚層，例如兩個(gè)或全部三個(gè)胚層(即，內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)，的細(xì)胞后代。第三，雖然它們不是胚胎干細(xì)胞或生殖細(xì)胞，但它們可以表達(dá)這些原始細(xì)胞類型的標(biāo)志物，因此MAPC可以表達(dá)Oct 3/4 (即Oct 3A)、rex-1和rox-1中的一種或多種。它們還可以表達(dá)sox-2和SSEA-4中的一種或多種。第四，像干細(xì)胞一樣，它們可以自我更新，也就是無(wú)需轉(zhuǎn)化而具有長(zhǎng)期復(fù)制能力。這意味著這些細(xì)胞可表達(dá)端粒酶(即具有端粒酶活性)。因此，以“MAPC”命名的細(xì)胞類型可以由通過(guò)若干新性質(zhì)描述該細(xì)胞的替代的基本特征來(lái)表征。MAPC中的術(shù)語(yǔ)“成體”是非限制性的。它是指非胚胎體細(xì)胞。MAPC核型正常并且在體內(nèi)不形成畸胎瘤。該首字母縮略詞在美國(guó)專利N0.7，015，037中首次用于描述從骨髓分離的多能細(xì)胞。但是，隨后發(fā)現(xiàn)了具有多能性標(biāo)志物表達(dá)和/或分化潛能的細(xì)胞，對(duì)于本發(fā)明的目的，這些細(xì)胞可以等價(jià)于這些首次被命名為“MAPC”的細(xì)胞。MAPC類型細(xì)胞的基本描述在上文本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容中提供。術(shù)語(yǔ)“MAPC”中涉及的“多能的”是指在分化時(shí)產(chǎn)生多于一個(gè)(例如全部三個(gè))原始胚層(即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞譜系的能力。該術(shù)語(yǔ)與文獻(xiàn)中的使用不一致。MAPC 代表比 MSC 更原始的祖細(xì)胞群(Verfaillie, CM.，Trends Cell Biol12:502-8(2002), Jahagirdar，B.N.,et al., Exp HematoI, 29:543-56(2001);Reyes, M.and CM.Verfaillie, Ann N Y Acad Sci, 938: 231-233 (2001) ; Jiang, Y.et al., ExpHematol, 30896-904(2002);和 Jiang, Y.et al., Nature, 418:41-9.(2002))。術(shù)語(yǔ)“MukiStem ”是基于美國(guó)專利N0.7，015，037的MAPC的細(xì)胞制品的商品名稱，即如上所述的非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞。Mu〖tiStemiK)可按照本專利申請(qǐng)中公開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)方法制備，特別是低氧和高血清?！胺庆o態(tài)培養(yǎng)條件”包括其中液體細(xì)胞培養(yǎng)物運(yùn)動(dòng)的條件。這可通過(guò)可攪動(dòng)培養(yǎng)基的任何方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)例包括旋轉(zhuǎn)瓶(攪拌懸浮)、滾瓶、灌流、通氣、攪拌或旋轉(zhuǎn)，例如在旋轉(zhuǎn)壁式容器或旋轉(zhuǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中?！翱伤幱幂d體”是用于本發(fā)明中所用細(xì)胞的任何可藥用介質(zhì)。所述介質(zhì)可保持等滲性、細(xì)胞代謝、PH等。所述介質(zhì)與對(duì)受試者的體內(nèi)給藥相容，因此可用于細(xì)胞遞送和治療。術(shù)語(yǔ)“效能”是指細(xì)胞實(shí)現(xiàn)所需效果的能力?？膳囵B(yǎng)并刺激“原始胚胎生殖細(xì)胞”(PG或EG細(xì)胞)以產(chǎn)生很多分化程度較低的細(xì)胞類型。

“祖細(xì)胞”是在干細(xì)胞分化過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞，其具有它們的最終分化子代的特性的一些但非全部。確定的祖細(xì)胞例如“心臟祖細(xì)胞”可形成細(xì)胞譜系，而不形成具體的或終末分化的細(xì)胞類型。首字母縮略詞“MAPC”中使用的術(shù)語(yǔ)“祖”并不將這些細(xì)胞限制于具體的細(xì)胞譜系。祖細(xì)胞可以形成比所述祖細(xì)胞分化程度更高的子代細(xì)胞。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“減少”是指阻止以及下降。在上下文所述的治療中，“減少”是阻止或改善一種或多種臨床癥狀。臨床癥狀是如果不予處理將對(duì)受試者的生活質(zhì)量(健康)產(chǎn)生或?qū)a(chǎn)生消極影響的一種(或多種)癥狀。這還適用于潛在的生物學(xué)效應(yīng)。“選擇”具有所需水平的效能的細(xì)胞可以指鑒別(如通過(guò)測(cè)定)、分離和擴(kuò)增細(xì)胞。這能夠產(chǎn)生具有比分離出所述細(xì)胞的親代細(xì)胞群更高效能的細(xì)胞群。選擇可實(shí)現(xiàn)所需效果的細(xì)胞包括確定所述細(xì)胞是否可實(shí)現(xiàn)所需效果的測(cè)定，并且還包括獲得這些細(xì)胞。所述細(xì)胞可天然地實(shí)現(xiàn)所需要的效果，因?yàn)樗黾?xì)胞沒(méi)有與可誘導(dǎo)所述效果的試劑一起孵育或暴露于所述試劑。在進(jìn)行所述測(cè)定前，可以不知道所述細(xì)胞是否可實(shí)現(xiàn)所需要的效果。因?yàn)樾Ч梢蕾囉诨虮磉_(dá)和/或分泌，所以還可以在一種或多種可導(dǎo)致所述效果的基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。選擇可以來(lái)自組織中的細(xì)胞。例如，在這種情況下，將細(xì)胞從所需的組織中分離、在培養(yǎng)物中擴(kuò)增、對(duì)實(shí)現(xiàn)所需要的效果進(jìn)行選擇，并對(duì)選擇的細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增。選擇還可以來(lái)自離體的細(xì)胞，例如培養(yǎng)物中的細(xì)胞。在這種情況下，就實(shí)現(xiàn)所需要的效果來(lái)測(cè)定培養(yǎng)物中的所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，并且獲得的可實(shí)現(xiàn)所需要的效果的細(xì)胞可以被進(jìn)一步擴(kuò)增。還可以就實(shí)現(xiàn)所需要效果的能力增強(qiáng)來(lái)選擇細(xì)胞。在這種情況下，從中獲得增強(qiáng)細(xì)胞的細(xì)胞群已經(jīng)具有所需要的效果。增強(qiáng)的效果意指每種細(xì)胞的平均量比親代細(xì)胞群更聞。從中選擇增強(qiáng)細(xì)胞的親代細(xì)胞群可以是大體上同種的(相同細(xì)胞類型)。從該細(xì)胞群中獲得這種增強(qiáng)細(xì)胞的一種方式是形成單細(xì)胞或細(xì)胞池并測(cè)定這些細(xì)胞或細(xì)胞池來(lái)獲得天然地具有所述效果(相對(duì)于用可誘導(dǎo)或增加所述效果的調(diào)節(jié)劑來(lái)處理細(xì)胞)的克隆，然后擴(kuò)增這些天然地增強(qiáng)的細(xì)胞。

但是，還可用一種或多種試劑與可誘導(dǎo)或增加所述效果的調(diào)節(jié)劑一起來(lái)處理細(xì)胞。因此，可以處理大體上同種的細(xì)胞群來(lái)增強(qiáng)調(diào)節(jié)。如果所述細(xì)胞群不是大體上同種的，那么優(yōu)選在要處理的親代細(xì)胞群中含有至少100個(gè)在其中尋求增強(qiáng)效果的需要的細(xì)胞類型，更優(yōu)選為至少1，000個(gè)細(xì)胞，還更優(yōu)選為10，000個(gè)細(xì)胞。處理之后，這個(gè)亞群可以通過(guò)公知的細(xì)胞選擇技術(shù)從異種細(xì)胞群中回收，如果需要的話可進(jìn)一步地?cái)U(kuò)增。因此，效果的所需水平可以是高于給定在前的細(xì)胞群的水平。例如，被放入來(lái)自組織的原代培養(yǎng)物并通過(guò)不是特別設(shè)計(jì)用來(lái)產(chǎn)生所述效果的培養(yǎng)條件擴(kuò)增和分離的細(xì)胞，可以提供親代細(xì)胞群。這樣的親代細(xì)胞群可以經(jīng)過(guò)處理來(lái)增強(qiáng)每細(xì)胞的效果或篩選出細(xì)胞群內(nèi)沒(méi)有故意處理就表現(xiàn)出更高程度的效果的細(xì)胞。然后，可以擴(kuò)增這些細(xì)胞來(lái)提供較高(所需)表達(dá)的細(xì)胞群?！白晕腋隆笔侵府a(chǎn)生復(fù)制子代干細(xì)胞的能力，所述子代干細(xì)胞具有與其來(lái)自的親代細(xì)胞相同的分化潛能。本文中使用的類似術(shù)語(yǔ)是“增殖”?！盁o(wú)血清培養(yǎng)基”是指這樣的培養(yǎng)基，其中沒(méi)有血清，或者，如果有的話，血清組分的水平對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)或變化性沒(méi)有影響(即實(shí)際上是不必要的，例如殘留量或微量)?！办o態(tài)培養(yǎng)條件”包括其中液體細(xì)胞培養(yǎng)物不動(dòng)的那些條件。這意指沒(méi)有施加攪拌或混合所述培養(yǎng)基的外力。
“干細(xì)胞”是指可以進(jìn)行自我更新(S卩，子代具有相同的分化潛能)并且也可以產(chǎn)生分化潛能更受限的子代細(xì)胞的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，干細(xì)胞還可以涵蓋分化程度更高的細(xì)胞，其已經(jīng)通過(guò)例如以下方式去分化:通過(guò)核轉(zhuǎn)移、通過(guò)與更原始的干細(xì)胞融合、通過(guò)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子或者通過(guò)在特定條件下培養(yǎng)。參見(jiàn)，例如，Wilmut et al.,Nature, 385:810-813(1997);Ying et al., Nature, 416:545-548(2002);Guan et al.,Nature, 440:1199-1203(2006);Takahashi et al.，Cell, 126:663-676(2006);Okita etal., Nature, 448:313-317(2007);和 Takahashi et al.，Cell, 131:861-872(2007)。去分化還可以通過(guò)給予一些化合物或在體內(nèi)或體外暴露于可以弓I起去分化的物理環(huán)境而引起。干細(xì)胞還可以來(lái)自異常組織，例如畸胎癌和一些其他來(lái)源，例如胚狀體(盡管這些可被認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儊?lái)自胚胎組織，盡管不是直接來(lái)自于內(nèi)細(xì)胞團(tuán))。干細(xì)胞還可以通過(guò)將與干細(xì)胞功能相關(guān)的基因?qū)敕歉杉?xì)胞例如誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中而產(chǎn)生?！笆茉囌摺睘榧棺祫?dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括但不限于人、農(nóng)畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sport animals)和寵物。需要通過(guò)本發(fā)明的方法治療的受試者包括患有由于身體或疾病相關(guān)損傷造成的功能缺失的受試者。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指被確定可在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生任何治療反應(yīng)的量。例如，有效量的治療細(xì)胞或細(xì)胞相關(guān)的試劑可以延長(zhǎng)患者的存活力，和/或抑制明顯的臨床癥狀。在本文使用的術(shù)語(yǔ)的含義范圍內(nèi)，治療有效的治療包括改善患者的生活質(zhì)量的治療，即使它們沒(méi)有改善疾病結(jié)果本身。這樣的治療有效量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)對(duì)受試者群體的常規(guī)應(yīng)用例如在臨床試驗(yàn)和臨床前試驗(yàn)中確定。因此，“治療”是指送遞這樣的量。本發(fā)明中廣泛使用術(shù)語(yǔ)“治療(“Treat”、“treating”或“treatment，，)”，其中包括防止、改善、抑制或者治愈缺陷、機(jī)能障礙、疾病或其他有害的過(guò)程，包括干擾治療的和/或由治療導(dǎo)致的那些?！膀?yàn)證”是指確認(rèn)。確認(rèn)細(xì)胞是具有所需效能的表達(dá)子。然后，這使得可以使用具有合理的期望效能的細(xì)胞(用于治療、入細(xì)胞庫(kù)、藥物篩選等)。因此，進(jìn)行驗(yàn)證是指確認(rèn)，原先被發(fā)現(xiàn)具有/確立具有所需要效果的細(xì)胞實(shí)際上保持所述能力。因此，驗(yàn)證是涉及原先確定和后續(xù)確定的兩事件過(guò)程的確認(rèn)事件。此處第二個(gè)事件是指“驗(yàn)證”。形成初始集合體同樣來(lái)自本發(fā)明人的WO 2009/092092公開(kāi)了，非胚胎干細(xì)胞可成功地形成集合體，其中所述細(xì)胞可保持單個(gè)非胚胎干細(xì)胞的未分化表型。因此，所述集合體能夠產(chǎn)生具有分化程度更高的表型的子代。該申請(qǐng)以引用的方式納入本文以教導(dǎo)從單個(gè)細(xì)胞形成集合體。有用的細(xì)胞包括未被轉(zhuǎn)化的或非致瘤性的并可具有正常核型的細(xì)胞。例如，已知一些細(xì)胞例如MAPC在體內(nèi)不形成畸胎瘤并且在培養(yǎng)中具有正常核型?？赏ㄟ^(guò)使用任何用于非貼壁生長(zhǎng)的方法，例如本領(lǐng)域已知方法的任一種來(lái)形成所述集合體。這些包括懸滴法(Kurosawa and Hopfl,在下文引用)、強(qiáng)制聚集方法(離心)(Ng,在下文引用)、細(xì)胞被培養(yǎng)在非貼壁塑料上的方法、懸浮培養(yǎng)(靜態(tài)或攪拌)、生物反應(yīng)器擴(kuò)增平臺(tái)和非附著或特殊的涂層，例如溫度敏感的基于聚合物的培養(yǎng)板、控制集落大小的微接觸印刷的孔以及微 流體裝置。
很多不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的。這些培養(yǎng)基可以加入或不加入血清(或具有變化的血清濃度，例如0.5%-20%或更多)使用。當(dāng)無(wú)血清或血清減少時(shí)，普通技術(shù)人員會(huì)了解可使用生長(zhǎng)因子來(lái)補(bǔ)充所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基，包括但不限于EGF和/或TOGF。氧氣濃度可從大氣濃度減少至范圍為1-5、5-10、10-15、15-20%以及中間數(shù)值。所述干細(xì)胞可來(lái)自多種組織，例如骨髓、胎盤(pán)、外周血、臍帶血和組織、皮膚和脂肪。本申請(qǐng)中例示了文獻(xiàn)中稱為“MAPC”的細(xì)胞。但是本發(fā)明還涵蓋任何可形成多于一種胚胎胚層的細(xì)胞類型的非胚胎干細(xì)胞。參見(jiàn)，例如U.S.7，311，905、2003/0059414、2002/0164794，其均以引用的方式納入本文以教導(dǎo)這些細(xì)胞以及制備它們的方法。另外，分化程度較低的干細(xì)胞可來(lái)自多種操作，例如，通過(guò)在分化細(xì)胞中轉(zhuǎn)染并表達(dá)特定基因來(lái)對(duì)未分化狀態(tài)進(jìn)行基因重編程、將體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于比所述體細(xì)胞分化程度更低的表型的基因表達(dá)的環(huán)境、在足以維持多能性的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件中培養(yǎng)(例如，“MAPC培養(yǎng)基”和擴(kuò)增方案)、通過(guò)將體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞融合進(jìn)行核重編程、培養(yǎng)物誘導(dǎo)的重編程-細(xì)胞外植，以及用卵母細(xì)胞或多能細(xì)胞的細(xì)胞提取物處理體細(xì)胞核(Hochedlinger and Jaenisch, Nature441:1061-1067(2006))。本發(fā)明涉及來(lái)自任何物種的干細(xì)胞，特別是涉及哺乳動(dòng)物物種，更特別涉及人。在物種內(nèi)，可使用(例如將細(xì)胞給予受試者)同種異體的細(xì)胞?？缥锓N時(shí)，可使用異種細(xì)胞。在受試者內(nèi)，細(xì)胞可以是自體的。對(duì)于本發(fā)明，集合體被 定義為至少10個(gè)細(xì)胞。但是范圍包括，不過(guò)大從而內(nèi)部細(xì)胞壞死的集合體。這可以包括100-300ii的集合體以及中間的數(shù)值，例如150-250ii。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到所述范圍內(nèi)任何可用的數(shù)值。對(duì)臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)集合體的可用數(shù)值為大于50。細(xì)胞數(shù)可以有變化，范圍從數(shù)百至數(shù)萬(wàn)或更多，例如100-1000 (約200、300、400、500、600、700、800、900 個(gè)細(xì)胞)、1000-10，000、(約 2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000 個(gè)細(xì)胞)、10，000-50，000 (約 20，000,30, 000,40, 000 個(gè)細(xì)胞)或更多。在培養(yǎng)中所述集合體的密度范圍可以為約IO4-1O8個(gè)細(xì)胞/ml。因此，也涵蓋了約105、IO6和IO7的密度(每ml)。還涵蓋了中間的范圍，例如約2 X 104、3 X 104、4X 104、5 X 104、6X 104、7X 104、8X 104、9X 104、2X 105、3X 105、4X 105、5X 105、6X 105、7X 105、8X 105、9X 105、2X 106、3X 106、4X 106、5X 106、6X 106、7X 106、8X 106、9X 106、2X 107、3X 107、4X IO7,5X IO7,6X IO7,7X IO7,8X IO7,9X IO70還涵蓋了這些密度內(nèi)的其他子范圍。在非靜態(tài)條件下形成的集合體中的平均細(xì)胞數(shù)可以為寬范圍，例如從約1,000至50，OOO或更大(每集合體)。還涵蓋了中間的范圍，例如約10，000、20，000、30，OOO和40，000。還涵蓋了這些范圍內(nèi)的子范圍，例如 2，000,3, 000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000、8，000,9, 000、10，000-20，000,20, 000-30，000,30, 000-40，000,40, 000-50，000，以及這些范圍之間的子范圍。在起始集合體(即用于接種所述培養(yǎng)物的集合體)中的平均細(xì)胞數(shù)可以為寬范圍，例如從約10個(gè)細(xì)胞至約25，OOO個(gè)細(xì)胞。還涵蓋了中間的范圍，例如10-100、200、300、400、500、600、700、800、900 和 I, 000-10，000、10，000-15，000、15，000-20，000,20, 000-25，000，以及這些數(shù)值之間的子范圍，例如 2，000,3, 000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000、11,000,12,000,13,000,14, OOO (即以1000的增量增加到25，000)或甚至這些范圍之間的數(shù)值。
因此，每集合體中細(xì)胞數(shù)的平均倍數(shù)增加包括2 X (每集合體25，000 — 50, 000個(gè)細(xì)胞)至5，000X (10 — 50，000)的范圍。所述增加倍數(shù)取決于初始集合體和擴(kuò)增后的集合體中的細(xì)胞數(shù)。可以從以上給定的任何數(shù)值計(jì)算增加倍數(shù)。在具體實(shí)施方案中，起始集合體平均含有1，000-5，000個(gè)細(xì)胞。本申請(qǐng)中提供的實(shí)施例使用了已經(jīng)被命名為多能成體祖細(xì)胞(“MAPC”)的細(xì)胞。但是本發(fā)明涉及不是胚胎細(xì)胞但可以分化為多于一種胚層(例如2種或3種)的所有類型和/或表達(dá)多能性標(biāo)志物的任何及所有干細(xì)胞。在集合體形成中的另一個(gè)參數(shù)是用于形成集合體的分離的干細(xì)胞群的純度。因此，在本發(fā)明中，集合體可以由存在于也含有其他細(xì)胞的群中的所需干細(xì)胞形成。例如，骨髓細(xì)胞包括混合的細(xì)胞群，其可被純化至足以產(chǎn)生所需效果的程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用多種公知的方法例如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)來(lái)容易地確定群中所需細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。還可根據(jù)群內(nèi)的基因表達(dá)譜來(lái)確定給定的干細(xì)胞的純度。包括給定干細(xì)胞的群的純度范圍為約50-55%、55-60%和65_70%。其他范圍包括約70-75%、75-80%、80-85%的純度。其他范圍還包括約85_90%、90_95%和95-100%的純度。但是，還可以使用更低純度的群，例如約25-30%、30-35%、35-40%、40-45%和45_50%。在集合體中，所述非胚胎細(xì)胞例如MAPC可以是基本上同種的，或被發(fā)現(xiàn)達(dá)不到基本上同種的形式。因此，集合體的純度可以如上述變化。此外，當(dāng)形成集合體時(shí)可以混有其他細(xì)胞類型。在將所述集合體置于分化條件中以產(chǎn)生若干本申請(qǐng)論述的分化細(xì)胞類型的方法中，這些條件中的很多——即使不是大多數(shù)——是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以獲得的。參見(jiàn)，例如 Mays et al., Expert Opinion Biol Ther2:173-184(2007)以及其中提到的分化方案；肝細(xì)胞(J Clin Invest 109:1291-302);造血(hematopoietic) (J ExpMed204:129-39)、平滑肌( J Clin Investll6:3139-3149 (2006))。這些分化條件以引用的方式納入本文。很多分化條件在U.S.7，015，037和Mays et al.(上文)中，因?yàn)檫@些方法將其以引用的方式納入本文。形成所述集合體的一個(gè)方案是使用DMEM-低葡萄糖、MCDB、2%胎牛血清、PDGF-BB、EGF、LIF、BSA、胰島素-硒-轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)、亞油酸和脂質(zhì)混合物以及5%氧氣?？蓛?yōu)選使用可增強(qiáng)oct3/4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的條件，例如在2D (貼壁)培養(yǎng)物中MAPC的表達(dá)水平下。_0] 初始聚集方法至少有兩種方法形成所述集合體:(a)懸滴(基于表面張力的方法)；(b)強(qiáng)制聚集(以1500rpm離心4分鐘將細(xì)胞物理地離心到96孔超低附著U型底培養(yǎng)板(Corning)的底部)。雖然兩種方法都可用于形成集合體，但是要產(chǎn)生大量集合體懸滴法是更經(jīng)濟(jì)的。其他方式包括攪拌懸浮或在無(wú)附著的培養(yǎng)板/瓶中生長(zhǎng)。形成受控制大小的集合體的其他可能方法可以是例如微接觸印刷方法。這些方法在如下引文中說(shuō)明，所述弓丨文以引用的方式納入本文用于教導(dǎo)多種無(wú)附
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Watt, F., Trans R Soc Lond B BiolSci353:831 (1997) ;Alison et al., Hepatology29:678-683 (1998))、以及來(lái)自骨髓的細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)公布文本N0.2003/0059414和2006/0147246)，其各自以引用的方式納入本文以教導(dǎo)這些細(xì)胞。重編程體細(xì)胞的方法已經(jīng)使用了一些不同的方法(例如核移植、細(xì)胞融合和培養(yǎng)誘導(dǎo)的重編程)來(lái)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚胎狀態(tài)。以下引用的參考文獻(xiàn)以引用的方式納入本文以教導(dǎo)怎樣制備這些細(xì)胞并描述它們。核轉(zhuǎn)移包括將體細(xì)胞核注射進(jìn)入去核卵母細(xì)胞，當(dāng)所述卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入代理母親中時(shí)，可以形成克隆(“生殖性克隆”)，或者當(dāng)所述卵母細(xì)胞在培養(yǎng)物中外植時(shí)，可以形成遺傳匹配的胚胎干(ES)細(xì)胞(“體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移”，SCNT)。體細(xì)胞與ES細(xì)胞的細(xì)胞融合致使產(chǎn)生顯示多能ES細(xì)胞的全部特性的雜合體。培養(yǎng)物中的體細(xì)胞的外植可選擇用于可以是多能(pluripotent or multipotent)的無(wú)限增殖細(xì)胞系。目前,精原干細(xì)胞是來(lái)源自出生后動(dòng)物的多能細(xì)胞的唯一來(lái)源。用規(guī)定的因子轉(zhuǎn)導(dǎo)體細(xì)胞可以啟動(dòng)重編程至多能狀態(tài)。對(duì)這些試驗(yàn)方法有大量綜述(Hochedlinger and Jaenisch, Nature441:1061-1067 (2006)和 Yamanaka, S.，Cell Stem Celll:39-49 (2007))。核轉(zhuǎn)移 核移植(NT)，也被稱作體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT)，是指將來(lái)自供體體細(xì)胞的核導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞以產(chǎn)生克隆動(dòng)物(Wilmut et al., Nature 385:810-813(1997))。通過(guò)NT產(chǎn)生活的動(dòng)物證明了體細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)，包括終末分化的細(xì)胞可被重編程至胚胎狀態(tài)。體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的融合將體細(xì)胞核表觀遺傳重編程至未分化狀態(tài)，已經(jīng)被胚胎細(xì)胞與體細(xì)胞的融合證明。多種體細(xì)胞與胚胎癌細(xì)胞(Solter，D.，Nat Rev Genet, 7:319-327 (2006))、胚胎生殖細(xì)胞(EG)或 ES 細(xì)胞(Zwaka and Thomson, Development, 132:227-233 (2005))之間的雜合體有很多與親本胚胎細(xì)胞相同的特性，表明多能表型在這樣的融合產(chǎn)物中是主要的。對(duì)于小鼠(Tada et al.，Curr Biol, 11:1553-1558 (2001))，人ES細(xì)胞具有在融合之后重編程體細(xì)胞核的潛能(Cowan et al.，Science, 309:1369-1373 (2005) ; Yu et al., Science, 318:1917-1920(2006))。沉默的多能性標(biāo)志物例如oct4可以被激活(Do and Scholer, StemCells22:941-949 (2004))。當(dāng)與神經(jīng)干細(xì)胞融合時(shí)，在ES細(xì)胞中Nanog的強(qiáng)制過(guò)表達(dá)可促進(jìn)多能性(Silva et al.，Nature441:997-1001 (2006))。培養(yǎng)物誘導(dǎo)的重編程已經(jīng)從胚胎源得到了多能細(xì)胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM) (ES細(xì)胞)、上胚層(EpiSC細(xì)胞)、原始生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)和出生后精原干細(xì)胞(“maGSCsm”，“ES樣”細(xì)胞)。以下的多能細(xì)胞，與它們的供體細(xì)胞/組織一起，描述如下:單性生殖ES細(xì)胞(parthogenetic ES cell)來(lái)自鼠卵母細(xì)胞(Narasimha et al., Curr Biol, 7:881-884(1997));胚胎干細(xì)胞來(lái)自卵裂球(Wakayamaet al.，Stem Cells, 25:986-993(2007));內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(來(lái)源不適用)(Eggan etal.，Nature, 428:44-49 (2004));胚胎生殖細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞來(lái)自原始生殖細(xì)胞(Matsuiet al.，Cell, 70:841-847(1992) ) ;GMCS、maSSC 和 MASC 來(lái)自精原干細(xì)胞(Guan et al., Nature, 440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara et al., Cell, 119:1001-1012 (2004);和 Seandel et al.，Nature, 449:346-350 (2007) ) ;EpiSC 細(xì)胞來(lái)自上胚層(Brons et a1., Nature, 448:191-195 (2007);Tesar et al., Nature, 448:196-199 (2007))；單性生殖 ES 細(xì)胞來(lái)自人卵母細(xì)胞(Cibelli et al., Science, 295L819 (2002) ; Revazova etal., Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007));人 ES 細(xì)胞來(lái)自人胚泡(Thomson et al.,Science, 282:1145-1147(1998) ) ;MAPC 來(lái)自骨髓(Jiang et al., Nature, 418:41-49 (2002) ; Phinney and Prockop, Stem Cells, 25:2896-2902 (2007));胳帶血細(xì)胞(來(lái)自胳帶血)(van de Ven et al., Exp Hematol, 35:1753-1765 (2007));神經(jīng)球(neurosphere)衍生的細(xì)胞來(lái)自神經(jīng)細(xì)胞(Clarke et al.，Science, 288:1660-1663 (2000))。來(lái)自生殖細(xì)胞譜系的供體細(xì)胞(例如PGC或精原細(xì)胞干細(xì)胞)已知在體外是單能性的，但是已證明多能ES 樣細(xì)胞(Kanatsu-Shinohara et al.，Cell, 119:1001-1012 (2004))或 maGSC (Guan etal.，Nature, 440:1199-1203 (2006))在體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后可被分離。盡管大部分這些多能細(xì)胞類型能夠在體外分化和形成畸胎瘤，但依據(jù)更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，僅ES、EG、EC和精原干細(xì)胞衍生的maGCS或ES樣細(xì)胞是多能的，因?yàn)樗鼈兡軌蛐纬沙錾笄逗象w并且成為生殖種系。最近，多能成體精原干細(xì)胞(MASC)從成體小鼠的睪丸精原干細(xì)胞中得到，并且這些細(xì)胞具有與 ES 細(xì)胞不同(Seandel et al.，Nature, 449:346-350 (2007))但是與 EpiSC 細(xì)胞類似的表達(dá)譜，所述EpiSC細(xì)胞來(lái)自植入后小鼠胚胎的上胚層(Brons et al., Nature, 448:191-195(2007);Tesar et al.，Nature, 448:196-199 (2007))。
通過(guò)規(guī)定的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行重編程體細(xì)胞可被重編程至ES 樣狀態(tài)(Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676 (2006))。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)oct4、sox2、c-myc和Klf4，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和成體成纖維細(xì)胞被編程至多能ES樣細(xì)胞。細(xì)胞被稱為iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)。同時(shí)遺傳實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定 0ct4和 Sox2 是多能性必需的(Chambers and Smith, 0ncogene23:7150-7160 (2004) ; Ivanona et al., Nature442:5330538(2006);Masui et al., Nat CellBiol9:625-635 (2007))，c-myc 和 Klf4 可以是非必須的(Nakagawa et al., Nat Biotechnol26:191-106 (2008) ;fferning et al., Nature 448:318-324 (2008);Yu et al.，Science318:1917-1920(2007))。MAPC本發(fā)明的示例性細(xì)胞被命名為“MAPC”。MAPC是“多能成體祖細(xì)胞”(非ES、非EG、非生殖細(xì)胞)的首字母縮略詞，其具有分化為全部三個(gè)原始胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細(xì)胞類型的能力。在ES細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因也發(fā)現(xiàn)于MAPC中(例如端粒酶、0ct3/4、reX-l、rox-l、sox-2)。0ct3/4 (在人中是0ct3A)似乎是ES和生殖細(xì)胞特有的。MAPC代表比MSC更原始的祖細(xì)胞群，并顯示出涵蓋上皮譜系、內(nèi)皮譜系、神經(jīng)譜系、生肌譜系、造血譜系、成骨譜系、肝原性譜系、軟骨形成譜系和脂肪形成譜系的分化能力(Verfaillie, CM.，TrendsCell Biol 12:502-8, 2002, Jahagirdar et al., Exp Hematol29:543-56, 2001;Reyesand Verfaillie, Ann N Y Acad Sci938:231-233, 2001;Jiang et al.,ExpHematol30896-904, 2002;和 Jiang et al.，Nature418:41-9，2002)。因此，MAPC 模仿了 ES細(xì)胞的廣泛生物可塑性特征，同時(shí)保持了使非胚胎干細(xì)胞有吸引力的其他特征(例如正常核型并且不形成畸胎瘤)。人MAPC記載于美國(guó)專利7，015, 037和申請(qǐng)N0.10/467, 963中，因?yàn)樗鼈儗?duì)MAPC的描述將它們的內(nèi)容以引用的方式納入本文。已經(jīng)在其他哺乳動(dòng)物中鑒定了 MAPC。MAPC可從多個(gè)來(lái)源分離，所述來(lái)源包括但不限于骨髓、胎盤(pán)、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝臟、脊髓、血液和皮膚。MAPC的分離和牛長(zhǎng)在形成集合體之前，可以使用本文和美國(guó)專利7，015，037公開(kāi)的方法分離并培養(yǎng)MAPC，因?yàn)檫@些方法將所述專利以引用的方式納入本文。MAPC分離方法是本領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利7，015，037，這些方法連同MAPC的表征(表型)以引用的方式納入本文。MAPC可從多個(gè)源分離，所述源包括但不限于骨髓、胎盤(pán)、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝臟、脊髓、血液或皮膚。因此，可能獲得骨髓抽吸物、腦或肝臟活檢樣品和其他器官，并且使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的陽(yáng)性或陰性選擇技術(shù)，其依賴于這些細(xì)胞表達(dá)(或者不表達(dá))的基因(例如，通過(guò)功能性或形態(tài)學(xué)測(cè)定例如上文引用的申請(qǐng)中公開(kāi)的那些，所述申請(qǐng)以引用的方式納入本文)分離所述細(xì)胞。MAPC 還可以 通過(guò)在 Breyer et al., ExperimentalHematology, 34:1596-1601 (2006)和 Subramanian et al.,Cellular Programmingand Reprogramming:Methods and Protocols;S.Ding(ed.), Methods in MolecularBiology, 636:55-78 (2010)中描述的改進(jìn)方法來(lái)獲得，這些方法以引用的方式納入本文。美國(guó)專利7，015，037中描述的來(lái)自人骨髓的MAPCMAPC不表達(dá)共有的白細(xì)胞抗原⑶45或成紅細(xì)胞特異的血型糖蛋白_A (Gly-A)0將細(xì)胞的混合群進(jìn)行Ficoll Hypaque分離。然后，以使用抗⑶45的抗體和抗Gly-A的抗體的陰性選擇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，耗盡CD45+和Gly-A+細(xì)胞的群，然后回收剩余的約0.1%的骨髓單核細(xì)胞。還可將細(xì)胞鋪板于纖連蛋白包被的孔中，并且如下文所述培養(yǎng)2-4周以耗盡0)45+和Gly-A+細(xì)胞。在貼壁骨髓細(xì)胞(adherent bone marrow cell)的培養(yǎng)物中，很多貼壁基質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞倍增約 30次時(shí)發(fā)生復(fù)制性衰老，更同質(zhì)的細(xì)胞群繼續(xù)擴(kuò)增并且保持長(zhǎng)的端粒?；蛘?，可以通過(guò)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的組合使用陽(yáng)性選擇來(lái)分離細(xì)胞。陽(yáng)性和陰性選擇技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的，并且本領(lǐng)域中可得到很多適于陰性選擇目的的單克隆和多克隆抗體(參見(jiàn)，例如，Leukocyte Typing V, Schlossman, et al., Eds.(1995)Oxford University Press),其可從許多來(lái)源市購(gòu)得到。從細(xì)胞群混合物中分離哺乳細(xì)胞的技術(shù)也已經(jīng)由Schwartz et al.在美國(guó)專利
5,759, 793 中(磁性分離)、Basch et al., 1983 (免疫親和層析)和 Wysocki and Sato, 1978(熒光激活的細(xì)胞分選)記載。細(xì)胞可在低血清或無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)物MAPC的無(wú)血清培養(yǎng)基記載于美國(guó)專利7，015，037中。通常使用的生長(zhǎng)因子包括但不限于血小板衍生的生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利 N0.7，169，610,7, 109，032,7, 037，721,6, 617，161、6，617，159,6, 372，210,6, 224，860,6, 037，174,5, 908，782,5, 766，951,5, 397，706 和4，657，866 ;全部以引用的方式納入本文用于教導(dǎo)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。另外的培養(yǎng)方法在另外的實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)MAPC的密度可以是從約100個(gè)細(xì)胞/cm2或約150個(gè)細(xì)胞/cm2至約10，000個(gè)細(xì)胞/cm2變化，包括約200個(gè)細(xì)胞/cm2至約1500個(gè)細(xì)胞/cm2至約2000個(gè)細(xì)胞/cm2。所述密度可隨種類的不同而變化。此外，最佳密度可依賴于培養(yǎng)條件和細(xì)胞來(lái)源而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定對(duì)于給定培養(yǎng)條件和細(xì)胞的組的最佳密度。同樣，在培養(yǎng)物中，在MAPC的分離、生長(zhǎng)和分化過(guò)程中的任何時(shí)間都可以使用低于約10%，包括約1-5%，尤其是3-5%的有效大氣氧濃度?？稍诙喾N血清濃度下(例如約2-20%)培養(yǎng)細(xì)胞?？梢允褂锰ヅＱ濉８叩难鍧舛瓤梢耘c更低的氧張力結(jié)合使用，例如約15-20%。不必在貼壁至培養(yǎng)皿之前選擇細(xì)胞。例如，在Ficoll梯度離心之后，將細(xì)胞以例如250，000-500，000/cm2直接鋪板。可以挑出貼壁集落，可以將其合并并且擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，在實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法中使用的高血清(約15-20%)和低氧(約3-5%)條件被用于細(xì)胞培養(yǎng)物。具體地，將來(lái)自集落的貼壁細(xì)胞以約1700-2300個(gè)細(xì)胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下(具有TOGF和EGF)中鋪板并傳代。在特異針對(duì)MAPC的實(shí)施方案中，補(bǔ)充物是允許MAPC保持分化為多于一個(gè)胚胎譜系例如所有三個(gè)譜系的細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞因子或組分。這可以通過(guò)未分化狀態(tài)的特定標(biāo)志物例如Oct 3/4 (Oct 3A)和/或高擴(kuò)增能力標(biāo)志物例如端粒酶的表達(dá)來(lái)指示。從分化細(xì)胞的未分化對(duì)應(yīng)物中鑒定并分離所述分化細(xì)胞的方法可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行?？梢酝ㄟ^(guò)在分化細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)未分化細(xì)胞的條件下選擇性地培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)鑒定已使用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)至分化的細(xì)胞。類似地，可以通過(guò)分化細(xì)胞的形態(tài)改變以及在其未分化對(duì)應(yīng)物中不存在的特征(例如細(xì)胞大小和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器分布的復(fù)雜度)來(lái)鑒定分化細(xì)胞。還涵蓋了，通過(guò)特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物例如細(xì)胞受體和跨膜蛋白的表達(dá)來(lái)鑒定分化細(xì)胞的方法。針對(duì)這些細(xì)胞表面標(biāo)志物的單克隆抗體可被用于鑒定分化細(xì)胞。檢測(cè)這些細(xì)胞可通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)實(shí)現(xiàn)。從特定基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的觀點(diǎn)看，分化細(xì)胞經(jīng)常顯示出與未分化細(xì)胞不同的基因表達(dá)水平。也可使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或RT-PCR來(lái)監(jiān)控對(duì)分化響應(yīng)的基因表達(dá)的改變。使用微陣列技術(shù)的全基因組分析也 可被用于鑒定分化細(xì)胞。因此，一旦鑒定了分化細(xì)胞，如果必要，就可以將其從其未分化對(duì)應(yīng)物中被分離。以上文詳述的鑒定方法還提供了分離方法，例如FACS、優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)方法、ELISA、磁珠及其組合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涵蓋了基于細(xì)胞表面抗原表達(dá)使用FACS來(lái)鑒定和分離細(xì)胞。藥物制劑U.S.7，015，037以引用的方式納入本文用于教導(dǎo)藥物制劑。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群存在于組合物中，所述組合物被改造為適于遞送，也就是生理學(xué)相容的。在一些實(shí)施方案中，用于給予受試者的細(xì)胞(或條件培養(yǎng)基)的純度是約100% (基本同質(zhì))。在其他實(shí)施方案中，純度是95%至100%。在一些實(shí)施方案中，純度是85%至95%。特別地，對(duì)于與其他細(xì)胞的混合物的情況，所述百分比可以是約10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%_40%、40%_45%、45%_50%、60%_70%、70%_80%、80%_90% 或 90%_95%。或者，分離/純度可以細(xì)胞倍增的方式表示，其中所述細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了例如10-20、20-30、30-40,40-50或更多次的細(xì)胞倍增。對(duì)于給定應(yīng)用，用于給予所述細(xì)胞的制劑的選擇將依賴于多種因素。其中主要的因素是受試者的種類；待治療的病癥的性質(zhì)，它的狀態(tài)和在所述受試者中的分布；所給予的其他療法和試劑的性質(zhì)；給藥的最佳途徑；經(jīng)所述途徑的存活力；給藥方案和對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的其他因素。例如，合適載體和其他添加劑的選擇會(huì)依賴于給藥的確切路徑和具體劑型的性質(zhì)。細(xì)胞/培養(yǎng)基的水性懸液的最終制劑一般包括將所述懸液的離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至等滲(即，約0.1至0.2)并且調(diào)節(jié)至生理pH (8卩，約？?jī)?cè).8至7.5)。最終制劑一般還會(huì)包含流體潤(rùn)滑劑。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞/培養(yǎng)基被配制為單位劑量的可注射形式的制劑，所述的可注射形式例如溶液劑、懸液劑或乳劑。適于注射細(xì)胞/培養(yǎng)基的藥物制劑一般是無(wú)菌的水性溶液和分散液。用于可注射制劑的載體可以是包含例如以下物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì):水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明方法中給予的組合物中的細(xì)胞和任選的添加劑、賦形物和/或載體的量。一般地，任意添加劑(除所述細(xì)胞之外)的存在量為在溶液中(例如在磷酸鹽緩沖鹽水中)0.001至50wt%。活性成分以微克至毫克的量級(jí)存在，例如為約0.0001至約5wt%，優(yōu)選約0.0001至約lwt%，最優(yōu)選為約0.0001至約0.05wt%或者約0.001至約20wt%，優(yōu)選約0.01至約10wt%，最優(yōu)選為約0.05至5wt%。確定劑暈組合物可以分劑量并通過(guò)醫(yī)藥和獸醫(yī)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來(lái)給予，給予時(shí)應(yīng)考慮一些因素例如具體患者的年齡、性別、體重和病癥，以及將要給予的制劑(例如固體對(duì)比液體)。用于人或其他哺乳動(dòng)物的劑量無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容、本文引用的文獻(xiàn)和本領(lǐng)域中的知識(shí)確定。根據(jù)本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案，適合使用的細(xì)胞的劑量會(huì)依賴于許多因素。對(duì)于不同的情況其可以顯著地變化。確定主要和輔助療法所給予的最佳劑量的參數(shù)一般會(huì)包括以下中的一些或全部:待治療的疾病及其階段；受試者的種類、其健康情況、性別、年齡、體重和代謝速率；受試者的免疫活性；正給予的其他治療法；和根據(jù)所述受試者的病史或基因型預(yù)測(cè)的可能并發(fā)癥。所述參數(shù)還包括:所述細(xì)胞是否是同源的、自體同源的、同種異體的或者異種的；它們的效能(具體活性)；所述細(xì)胞若要有效則必須靶向的位點(diǎn)和/或分布；以及所述位點(diǎn)的特性例如細(xì)胞的可及性(accessibility)和/或細(xì)胞的植入。其他參數(shù)包括與其他因子(例如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子)的共給予。給定情況的最佳劑量還將考慮制備所述細(xì)胞的方式，給予所述細(xì)胞的方式，以及所述細(xì)胞在給藥之后在所述靶位點(diǎn)處集中(localize)的程度。最終，確定最佳劑量將必需提供這樣的有效劑量，即該有效劑量既不在最大有益效果的閾值之下，也不在與所述劑量相關(guān)的有害效果超過(guò)劑量增加帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)的閾值之上。對(duì)于一些實(shí)施方案，細(xì)胞的最佳劑量可以在用于自體同源單核骨髓移植的劑量范圍內(nèi)。對(duì)于完全純的細(xì)胞制品，多個(gè)實(shí)施方案中的最佳劑量的范圍是每次給藥IO4至IO8個(gè)細(xì)胞/kg受體體重。在一些實(shí)施方案中，每次給藥的最佳劑量為IO5至IO7個(gè)細(xì)胞/kg。在很多實(shí)施方案中 ，每次給藥的最佳劑量為5 X IO5至5 X IO6個(gè)細(xì)胞/kg。作為參考，前述的較高劑量類似于自體同源單核細(xì)胞骨髓移植中使用的有核細(xì)胞的劑量。一些較低的劑量類似于自體同源單核骨髓移植中使用的CD34+細(xì)胞數(shù)目/kg。
應(yīng)理解，可以一次全部地、部分地或在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)地遞送單劑量。整個(gè)劑量還可被遞送至單個(gè)位置或分部分地?cái)U(kuò)散到幾個(gè)位置。 在多個(gè)實(shí)施方案中，可以以初始劑量給予細(xì)胞，之后通過(guò)進(jìn)一步給藥來(lái)維持。初始可用一種方法給予細(xì)胞，之后通過(guò)相同的方法或者一種或多種不同的方法給予?？赏ㄟ^(guò)所述細(xì)胞的持續(xù)給藥來(lái)維持所述水平。多個(gè)實(shí)施方案通過(guò)靜脈注射來(lái)初始給予所述細(xì)胞和/或在所述受試者中維持其水平。在多個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)患者的病癥和其他因素(在本文他處描述)可使用其他形式的給藥。應(yīng)注意，通常治療人受試者的時(shí)間比治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更長(zhǎng)；但是，治療時(shí)間長(zhǎng)度通常與所述疾病過(guò)程的長(zhǎng)度和治療有效性成比例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)考慮到，可使用其他的在人和/或動(dòng)物例如大鼠、小鼠、非人靈長(zhǎng)類等中進(jìn)行的操作的結(jié)果，來(lái)確定對(duì)人適合的劑量?；谶@些考慮并且考慮到由本公開(kāi)和現(xiàn)有技術(shù)提供的指導(dǎo)，技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可作出這樣的確定。用于初次給予和進(jìn)一步給藥或用于依次給予的合適方案可以全部相同或可以變化。合適的方案可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容、本文引用的文獻(xiàn)和本領(lǐng)域中的知識(shí)確定。治療的劑量、頻率和持續(xù)時(shí)間可以依賴于很多因素，包括疾病的性質(zhì)、受試者以及可能給予的其他治療。因此，可以使用多種方案來(lái)給予所述細(xì)胞/培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞以一次劑量被給予受試者。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞以系列的兩次或更多次的劑量被連續(xù)地給予受試者。在某些其他實(shí)施方案中，細(xì)胞以一次劑量、兩次劑量和/或多于兩次的劑量被給予，所述劑量可以是相同或不同的，并且在給予它們的中間可以有相等或不等的間隔。細(xì)胞可在很寬的時(shí)間范圍內(nèi)以多種頻率給予。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞在少于一天的時(shí)間內(nèi)給予。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞在兩天、三天、四天、五天或六天內(nèi)給予。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞在數(shù)周內(nèi)以每周一次或多次給予。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞在一個(gè)月到幾個(gè)月的若干周內(nèi)給予。在多個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在數(shù)月內(nèi)給予。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞在一年或多年內(nèi)給予。一般地，治療的時(shí)間長(zhǎng)度會(huì)與所述疾病過(guò)程的長(zhǎng)度、實(shí)行的治療的效力以及接受治療的受試者的病癥和反應(yīng)成比例。用涂可用的細(xì)胞為集合體形式或來(lái)自所述集合體的細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)聚集方法產(chǎn)生大量的細(xì)胞，但是可將要進(jìn)一步使用的細(xì)胞取出，例如從集合體解聚或分散。因此，例如，藥物組合物可以包括集合體形式的細(xì)胞或來(lái)自所述集合體的細(xì)胞(例如通過(guò)分散)。同樣地，分化因子可被應(yīng)用于所述集合體形式的細(xì)胞或應(yīng)用于來(lái)自所述集合體的細(xì)胞。因此，可以用通過(guò)將分化條件應(yīng)用于所述集合體或來(lái)自所述集合體的細(xì)胞而形成的分化細(xì)胞來(lái)制備藥物組合物。進(jìn)一步地，以下描述的臨床用途涉及所述未分化集合體和來(lái)自所述集合體的未分化細(xì)胞以及所述集合體的分化子代和來(lái)自所述集合體的細(xì)胞的分化子代的體內(nèi)用途。如其分化子代一樣，未分化細(xì)胞是有用的，因?yàn)樗鼈兛梢栽隗w內(nèi)產(chǎn)生這些子代。(即使當(dāng)未分化細(xì)胞不分化時(shí)，它們也可用于其他有益目的，例如血管生成、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞形成、營(yíng)養(yǎng)等)。所述聚集的細(xì)胞或來(lái)自所述集合體的細(xì)胞可 具有被誘導(dǎo)以分化形成中胚層、神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層起源的至少一種分化細(xì)胞類型的能力。例如，所述細(xì)胞可具有被誘導(dǎo)以分化形成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞類型中的至少一種細(xì)胞的能力。本發(fā)明還提供從上述細(xì)胞獲得的分化細(xì)胞，其中所述子代細(xì)胞可以是骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、外分泌細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元或少突膠質(zhì)細(xì)胞。所述分化子代細(xì)胞可以是皮膚上皮細(xì)胞、肝上皮細(xì)胞、胰上皮細(xì)胞、胰內(nèi)分泌細(xì)胞或胰島細(xì)胞、胰外分泌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞或表皮相關(guān)結(jié)構(gòu)。 所述細(xì)胞或其分化子代可被用于糾正遺傳疾病、退行性疾病、心血管疾病、代謝貯積病(metabolic storage disease)、神經(jīng)疾病或癌癥疾病過(guò)程。它們可被用于產(chǎn)生牙銀樣材料以治療牙周病。它們可被用于開(kāi)發(fā)可被用于皮膚移植和整形手術(shù)的細(xì)胞衍生的皮膚上皮組織。它們可被用于增強(qiáng)肌肉，例如在陰莖或心臟中。它們可被用于產(chǎn)生離體血液用于治療用途，或用于產(chǎn)生人造血細(xì)胞和/或產(chǎn)前或產(chǎn)后的動(dòng)物血液以用于人。它們可被用作治療藥物以幫助，例如，患者從癌癥治療、自身免疫性疾病的治療的化學(xué)治療或放射治療中的恢復(fù)，以在所述接受者中誘導(dǎo)耐受性。它們可被用于治療AIDS或其他傳染病。神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞可被用于治療失明，所述失明由其中包括但不限于神經(jīng)視網(wǎng)膜疾病的疾病導(dǎo)致，所述神經(jīng)視網(wǎng)膜疾病由其中包括但不限于黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性的疾病導(dǎo)致。所述細(xì)胞或來(lái)自所述細(xì)胞的心肌細(xì)胞可被用于治療心臟病，所述心臟病包括但不限于心肌炎、心肌病、心力衰竭、由心臟病發(fā)作導(dǎo)致的損傷、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟瓣膜功能障礙。它們還可被用于治療涉及CNS缺損或損傷的疾病。進(jìn)一步地，所述干細(xì)胞或其神經(jīng)分化的子代細(xì)胞可被用于治療涉及神經(jīng)缺損或變性的疾病，所述疾病包括但不限于中風(fēng)、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、AIDS相關(guān)的癡呆、脊髓損傷以及影響腦和其他神經(jīng)組織的代謝病。細(xì)胞或其分化子代，例如 基質(zhì)細(xì)胞可被用于在體內(nèi)或體外支持其他細(xì)胞類型的生長(zhǎng)和分化，所述其他細(xì)胞類型包括但不限于造血細(xì)胞、胰島細(xì)胞或B細(xì)胞、肝細(xì)胞等。所述細(xì)胞或分化的軟骨子代細(xì)胞可被用于治療關(guān)節(jié)或軟骨疾病，包括但不限于軟骨撕裂、軟骨變薄和骨關(guān)節(jié)炎。此外，所述細(xì)胞或其分化的成骨細(xì)胞子代可被用于改善對(duì)骨有有害效果的過(guò)程，所述過(guò)程包括但不限于骨折、不愈合骨折、骨關(guān)節(jié)炎、由擴(kuò)散至骨的腫瘤(例如前列腺癌、乳癌、多發(fā)性骨髓瘤等)導(dǎo)致的骨“穿孔”。使用適合的生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子，細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化以形成許多譜系，包括例如中胚層表型的多種細(xì)胞、神經(jīng)外胚層表型的細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元)和內(nèi)胚層表型的細(xì)胞。這些包括成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨和骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和上皮細(xì)胞。成骨細(xì)胞:已被誘導(dǎo)分化形成骨細(xì)胞的細(xì)胞可在以下疾病中的用作細(xì)胞治療或用于組織再生:骨質(zhì)疏松、佩吉特氏病、骨折、骨髓炎、骨壞死、軟骨發(fā)育不全、成骨不全癥、遺傳性多發(fā)性外生骨疣、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、瑪麗安氏綜合征、粘多糖貯積癥、神經(jīng)纖維瘤病或脊柱側(cè)凸、局部畸形的重建手術(shù)、脊柱裂、半椎骨或椎骨融合、肢體異常、腫瘤損傷組織的重建以及感染例如中耳感染后的重建。
軟骨細(xì)胞:已被誘導(dǎo)分化形成軟骨細(xì)胞的細(xì)胞可在老化相關(guān)疾病或損傷、運(yùn)動(dòng)相關(guān)損傷或特定疾病中的用于細(xì)胞治療或組織再生，所述特定疾病有例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏關(guān)節(jié)炎(Reiter’s arthritis)、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、強(qiáng)直性脊柱炎、骨關(guān)節(jié)炎、外耳的重建手術(shù)、鼻的重建手術(shù)以及環(huán)狀軟骨的重建手術(shù)。脂肪細(xì)胞:已被誘導(dǎo)分化形成脂肪細(xì)胞的細(xì)胞可被用于重建手術(shù)或整容手術(shù)的重塑，包括但不限于乳房切除后的乳房重建、由其他手術(shù)(例如從臉或手除去腫瘤)導(dǎo)致失去的組織的重塑、乳房增大以及減少皺紋。還可用于II型糖尿病的治療。這樣產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞還可以提供用于研究脂肪調(diào)節(jié)的有效體外模型系統(tǒng)。成纖維細(xì)胞:來(lái)自所述細(xì)胞的成纖維細(xì)胞可被用于細(xì)胞治療或組織修復(fù)以促進(jìn)傷口愈合或提供結(jié)締組織支持(例如為整容手術(shù)提供支架)。骨骼肌:已被誘導(dǎo)分化·形成骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞可在以下疾病的治療中用于細(xì)胞治療或組織修復(fù):進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良、貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良、骨骼肌病以及修復(fù)骨骼肌損傷的重建手術(shù)。平滑肌:已被誘導(dǎo)分化形成平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞可在以下疾病的治療中用于細(xì)胞治療或組織修復(fù):胃腸系統(tǒng)的發(fā)育異常(例如食管閉鎖、腸閉鎖和腸套疊)以及腸梗塞或結(jié)腸造口術(shù)手術(shù)后的組織替換。平滑肌細(xì)胞還可被用于膀胱或子宮重建、新血管形成、由例如動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)脈瘤損傷的血管的修復(fù)。平滑肌前體細(xì)胞(腎小球系膜細(xì)胞)可被用作腎小球疾病的體外模型或用于糖尿病性神經(jīng)病變中的細(xì)胞治療或組織再生。平滑肌前體還可被用于修復(fù)遠(yuǎn)曲小管或腎小球旁組織的致密斑。心肌細(xì)胞:心肌細(xì)胞可在心肌梗死(伴隨在瓣膜替換過(guò)程中由先天性心臟畸形導(dǎo)致的或者由心肌病或心內(nèi)膜炎導(dǎo)致的充血性心力衰竭)之后心臟組織受損的治療中用于細(xì)胞治療或組織修復(fù)。小膠質(zhì)細(xì)胞:小膠質(zhì)細(xì)胞可被用于治療脊髓損傷和神經(jīng)退行性疾病，例如亨廷頓氏病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化和阿爾茨海默病，以及用于修復(fù)在影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳染病過(guò)程中受損的組織。已被遺傳改變以產(chǎn)生細(xì)胞因子的小膠質(zhì)細(xì)胞還可被用于移植以治療由于血腦屏障而使進(jìn)入受限的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病。膠質(zhì)細(xì)胞還可被用于產(chǎn)生生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子抑制劑，以用于中風(fēng)(由多發(fā)性硬化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和腦癌導(dǎo)致)后神經(jīng)組織的再生以及用于脊髓損傷后的再生?；|(zhì)細(xì)胞:基質(zhì)細(xì)胞可被用作移植細(xì)胞用于化學(xué)治療后骨髓替換和骨髓移植。內(nèi)皮細(xì)胞:內(nèi)皮細(xì)胞可被用于治療第八凝血因子缺乏癥以及用于產(chǎn)生新血管生成的血管發(fā)生。內(nèi)皮細(xì)胞還可以提供用于使用血管生成抑制劑進(jìn)行腫瘤抑制的體外模型，以及用于血管炎、超敏反應(yīng)和凝固障礙的體外模型。造血細(xì)胞:造血細(xì)胞可被用于在高劑量化學(xué)治療后重新填充骨髓。來(lái)自所述集合體細(xì)胞的造血細(xì)胞可被進(jìn)一步分化形成儲(chǔ)存在血庫(kù)中的血細(xì)胞，緩解輸血時(shí)血液供應(yīng)受限制的問(wèn)題。神經(jīng)外胚層細(xì)胞:小膠質(zhì)細(xì)胞可被用于治療脊髓損傷和神經(jīng)退行性疾病，例如亨廷頓氏病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化和阿爾茨海默病，以及用于修復(fù)在影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳染病過(guò)程中受損的組織。已被遺傳改變以產(chǎn)生細(xì)胞因子的小膠質(zhì)細(xì)胞還可被用于移植以治療由于血腦屏障而使進(jìn)入受限的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病。膠質(zhì)細(xì)胞還可被用于產(chǎn)生生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子抑制劑，以用于中風(fēng)(由多發(fā)性硬化、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和腦癌導(dǎo)致)后神經(jīng)組織的再生以及用于脊髓損傷后的再生。被誘導(dǎo)形成少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞，可被用于例如移植到脫髓鞘的組織，尤其是脊髓，在此所述細(xì)胞發(fā)揮作用使周?chē)纳窠?jīng)組織髓鞘化。所述細(xì)胞還可被用于細(xì)胞替換治療和/或基因治療以治療先天性神經(jīng)退行性疾病或貯積癥，例如粘多糖貯積病、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、卡納萬(wàn)病)、巖藻糖苷沉積癥、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、尼曼-皮克病、圣菲利波綜合征、沃爾曼氏病和泰-薩克斯病。它們還可被用于外傷性病癥例如中風(fēng)、CNS出血和CNS創(chuàng)傷；用于周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)病癥例如脊髓損傷或脊髓空洞癥；用于視網(wǎng)膜病癥例如視網(wǎng)膜剝離、黃斑變性和其他退行性視網(wǎng)膜病癥，以及糖尿病視網(wǎng)膜病變。外胚層上皮細(xì)胞:細(xì)胞可被用于細(xì)胞替換治療和/或基因治療以治療或緩解皮膚病癥的癥狀，例如脫發(fā)、皮膚缺損例如燒傷創(chuàng)面和白化病。內(nèi)胚層上皮細(xì)胞:上皮細(xì)胞可被用于細(xì)胞替換治療和/或基因治療以治療或緩解多種器官病癥的癥狀。所述細(xì)胞可被用于治療或緩解先天性肝臟病癥，例如，貯積癥例如粘多糖貯積病、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥；膽紅素增加的病癥，例如克里格勒一納賈爾綜合征；氨病癥，例如先天性尿素循環(huán)失調(diào)，例如鳥(niǎo)氨酸脫羧酶缺乏癥、瓜氨酸血癥和精氨基琥珀酸尿；先天性氨基酸和有機(jī)酸失調(diào)，例如苯丙酮尿癥、遺傳性酪氨酸血癥和a-抗胰蛋白酶缺乏癥；以及凝固障礙例如第八因子和第九因子缺乏癥。所述細(xì)胞還可被用于治療由病毒感染導(dǎo)致的獲得性肝臟病癥。所述細(xì)胞還可被用于離體應(yīng)用，例如用以生成人工肝臟，以產(chǎn)生凝固因子并產(chǎn)生由肝臟上皮細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)或酶。所述上皮細(xì)胞還可被用于細(xì)胞替換治療和/或基因治療以治療或緩解膽病癥的癥狀，例如膽汁性肝硬化和膽管閉鎖。所述上皮細(xì)胞還可被用于細(xì)胞替換治療和/或基因治療以治療或緩解胰腺病癥的癥狀，例如胰管閉鎖、胰腺炎癥和a-抗胰蛋白酶缺乏癥。進(jìn)一步地，因?yàn)榭梢灾苽湟认偕掀ぜ?xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，所以可以生成B細(xì)胞。這些細(xì)胞可被用于治療糖尿病(皮下植入或者胰內(nèi)或肝內(nèi)植入)。進(jìn)一步地，所述上皮細(xì)胞還可被用于細(xì)胞替換治療和/或基因治療以治療或緩解腸上皮病癥的癥狀，例如腸閉鎖、炎癥性腸道病癥、腸梗塞和腸切除。細(xì)胞用于組織·修復(fù):細(xì)胞還可被用于組織修復(fù)。細(xì)胞可被植入到骨中以增強(qiáng)修復(fù)過(guò)程，加強(qiáng)變?nèi)醯墓牵蜻M(jìn)行關(guān)節(jié)面再造。軟骨細(xì)胞可被注入到關(guān)節(jié)以進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨面再造。Caplan et al.(美國(guó)專利N0.5，855，619)描述了一種生物基質(zhì)植入物,其包括已摻入間充質(zhì)干細(xì)胞的收縮的(contracted)凝膠基質(zhì)。所述植入物被設(shè)計(jì)用于修復(fù)組織缺損,尤其用于腱、韌帶、關(guān)節(jié)盤(pán)或肌肉的損傷。例如，軟骨可通過(guò)在多孔的三維支架(例如由膠原、合成聚乙醇酸纖維或合成聚乳酸纖維制備)周?chē)闹苯訁^(qū)域加入軟骨細(xì)胞而形成。發(fā)明人已經(jīng)證明，本發(fā)明的細(xì)胞可分化形成軟骨細(xì)胞，例如其可以堆積在膠原、合成聚乙醇酸或合成聚乳酸或其他支架材料中及其周?chē)蕴峁┲踩胛镆詭椭M織修復(fù)。細(xì)胞還可被用于產(chǎn)生用于移植的組織或器官。Oberpenning et al.(NatureBiotechnologyl7:149-155 (1999))報(bào)告了可工作膀胱的形成,是通過(guò)培養(yǎng)來(lái)自犬膀胱外部的肌肉細(xì)胞和來(lái)自所述犬膀胱內(nèi)部的襯細(xì)胞，從這些培養(yǎng)物制備組織薄片，并用其包覆小的聚合物球，使肌肉細(xì)胞在外側(cè)，襯細(xì)胞在內(nèi)側(cè)。然后，將所述球加入到狗的泌尿系統(tǒng)，在此其開(kāi)始作為膀胱起作用。Nicklason et al.(Science284:489-493 (1999))報(bào)告了從培養(yǎng)的平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種長(zhǎng)度的血管移植材料。用于從培養(yǎng)的細(xì)胞形成組織層的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見(jiàn)例如Vacanti et al.，美國(guó)專利N0.5，855，610)。為了本文描述的目的，可通過(guò)直接注入到組織位點(diǎn)、全身注入、注入到可接受基質(zhì)的表面上或周?chē)?，或者結(jié)合可藥用載體而將自體的、同種異體的或異種的細(xì)胞以遺傳改變或未改變的分化或未分化形式給予患者。用于研究分化途徑的模型系統(tǒng)本發(fā)明提供一種使用所述集合體或來(lái)自所述集合體的細(xì)胞來(lái)表征對(duì)生物試劑或藥學(xué)試劑的細(xì)胞反應(yīng)的方法，包括使所述細(xì)胞與一種或多種生物試劑或藥學(xué)試劑接觸并鑒定對(duì)所述一種或多種生物試劑或藥學(xué) 試劑的一種或多種細(xì)胞反應(yīng)。這樣的試劑可具有多種活性。它們可以影響分化、代謝、基因表達(dá)、活力等。因此，所述細(xì)胞可用于例如毒性測(cè)試以及鑒定分化因子。本發(fā)明的細(xì)胞還可用于進(jìn)一步研究發(fā)育過(guò)程。例如Ruley et al.(W0 98/40468)已經(jīng)描述了用于抑制特定基因表達(dá)以及獲得這些被抑制基因的DNA序列的載體和方法。可以用載體例如由Ruley描述的那些載體來(lái)處理本發(fā)明的細(xì)胞，所述載體可抑制可通過(guò)DNA序列分析來(lái)鑒定的基因的表達(dá)。然后，可將所述細(xì)胞誘導(dǎo)至分化，并且可以表征改變的基因型/表型的效應(yīng)。例如，Hahnet al.(Nature400:464-468 (1999))證明了，當(dāng)將之前與癌癥有關(guān)的基因組合引入到正常的人上皮成纖維細(xì)胞時(shí)，所述細(xì)胞可被誘導(dǎo)發(fā)生致瘤性轉(zhuǎn)化。使用含有可誘導(dǎo)表達(dá)元件的載體控制基因表達(dá)，提供了一種研究特定基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞分化的效應(yīng)的方法?？烧T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這種系統(tǒng)之一是由Noet al.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:3346-3351 (1996))描述的可蛻皮激素誘導(dǎo)的系統(tǒng)。細(xì)胞可被用于研究特定基因改變、毒性物質(zhì)、化療劑或其他試劑對(duì)發(fā)育通路的效應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的組織培養(yǎng)技術(shù)使得可大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)自不同個(gè)體的成百上千的細(xì)胞樣品，這提供了對(duì)被懷疑是例如致畸或誘變的化合物進(jìn)行快速篩選的機(jī)會(huì)。為研究發(fā)育通路，可用特定的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或其他試劑(包括可疑的致畸化學(xué)品)來(lái)處理細(xì)胞。還可使用本領(lǐng)域已知的方法和載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。此夕卜，可使用反義技術(shù)或用引入到所述細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理來(lái)改變細(xì)胞以改變固有基因序列的表達(dá)。例如，可使用信號(hào)肽序列來(lái)將需要的肽或多肽引入到細(xì)胞中。一種尤其有效的將多肽和蛋白質(zhì)引入到細(xì)胞中的技術(shù)已經(jīng)由Rojas, et al.在NatureBiotechnologyl6:370-375 (1998)進(jìn)行了描述。該方法產(chǎn)生了多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其可被引入到培養(yǎng)基中并易位跨越細(xì)胞膜到達(dá)所述細(xì)胞的內(nèi)部?？梢砸赃@種方式使用任何數(shù)量的蛋白質(zhì)來(lái)確定革巴蛋白對(duì)細(xì)胞分化的效應(yīng)?；蛘?，可使用由Phelan et al.(NatureBiotech.16:440-443(1998))描述的技術(shù)將皰疹病毒蛋白VP22連接到功能蛋白上以導(dǎo)入細(xì)胞中。還可通過(guò)引入外源DNA或通過(guò)沉默或切除基因組DNA來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，以產(chǎn)生具有缺陷表型的分化細(xì)胞，以測(cè)試潛在的化療劑或基因治療載體的效果。試劑盒細(xì)胞可與適當(dāng)?shù)陌b材料一塊在試劑盒中提供。例如，可以以凍存液的形式提供細(xì)胞，附有獨(dú)立包裝的如本文之前所述的適當(dāng)因子和培養(yǎng)基，用于在正常單層中培養(yǎng)和/或作為未分化狀態(tài)的集合體培養(yǎng)。另外，還可以提供用于誘導(dǎo)分化的獨(dú)立包裝的因子。
本發(fā)明將通過(guò)參照以下詳細(xì)的實(shí)施例進(jìn)一步描述。實(shí)施例實(shí)施例1.多能成體祖細(xì)胞(MAPC)的自組裝已經(jīng)從骨髓、外周血、臍帶血、胎兒和成人肝臟中鑒定了幾種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，并且胚胎干細(xì)胞具有在體外或體內(nèi)增殖并分化為“肝細(xì)胞樣”細(xì)胞的潛能。從產(chǎn)后的大鼠、小鼠和人骨髓分離的多能成體祖細(xì)胞(MAPC)可以在體外擴(kuò)增而不衰老，在單細(xì)胞水平上在體外和體內(nèi)分化為三個(gè)胚層譜系的不同細(xì)胞類型。MAPC具有當(dāng)被移植時(shí)不形成畸胎瘤并且可從自體骨髓中選擇而不需要免疫抑制的優(yōu)勢(shì)。發(fā)明人研究了 MAPC自組裝為3D集合體的能力。MAPC被成功誘導(dǎo)為3D集合體，當(dāng)在“MAPC培養(yǎng)基”和5%氧氣中形成時(shí)，所述3D集合體展示出良好的活力、形態(tài)以及未分化表型(表達(dá)高水平的oct3/4并無(wú)分化標(biāo)志物的表達(dá))。所述集合體保留了進(jìn)行自發(fā)的多譜系分化的能力。除了獲得功能上更成熟的分化細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)以外，3D培養(yǎng)物提供了用于研究初生3D發(fā)育的獨(dú)特模型系統(tǒng)，并且可以潛在地幫助設(shè)計(jì)可被監(jiān)控和控制以增強(qiáng)分化的可放大培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，發(fā)明人鑒定了用于使3D球狀簇中的未分化MAPC最佳生長(zhǎng)的條件，并評(píng)估了其分化為幾種細(xì)胞類型(尤其是內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞類型)的潛能。他們發(fā)現(xiàn)，未分化MAPC可在培養(yǎng)中形成3D集合體，并且所述3D集合體保留了分化能力。實(shí)駘使用MAPC培養(yǎng)基、無(wú)LIF (白血病抑制因子)的MAPC培養(yǎng)基或分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在低氧和高氧兩種條件中 ，使用所述懸滴法(表面張力驅(qū)使)或強(qiáng)制聚集方法(離心)歷時(shí)4天用表達(dá)高水平oct3/4的大鼠MAPC克隆形成了 MAPC集合體。在所述兩種方法中使用了 400-4000個(gè)細(xì)胞/孔的起始細(xì)胞數(shù)。使用流式細(xì)胞術(shù)和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)對(duì)形成的MAPC集合體進(jìn)行表征，含LIF的MAPC培養(yǎng)基和低氧條件是最佳的，因?yàn)樵诩象w形成之前和之后的MAPC之間oct3/4mRNA的表達(dá)水平是相當(dāng)?shù)?，并且在集合體形成前的MAPC中表達(dá)(約79%)的細(xì)胞數(shù)的幾乎90%以形成集合體后的蛋白質(zhì)水平(約69%)表達(dá)oct3/4。進(jìn)一步地，oct3/4mRNA水平在使用懸滴法或強(qiáng)制聚集方法形成的集合體之間是相當(dāng)?shù)?。所述集合體還以與在MAPC中的表達(dá)水平相當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)GATA6、HNF3b和Goosecoid，并且沒(méi)有顯示出分化標(biāo)志物例如AFP、白蛋白、AAT和TAT的任何表達(dá)。一旦在分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基(除去了 LIFJDGF和EGF)中自發(fā)分化，所述細(xì)胞集合體就進(jìn)行自發(fā)分化以表達(dá)對(duì)應(yīng)于神經(jīng)外胚層的Nestin和Pax6、對(duì)應(yīng)于中胚層的Flk-1和SM22以及對(duì)應(yīng)于內(nèi)胚層的白蛋白。雖然上述全部工作是使用大鼠高表達(dá)oct3/4的MAPC，但是低表達(dá)oct3/4的大鼠MAPC也可形成具有分化為幾種細(xì)胞類型的能力的集合體。還證明了，來(lái)自小鼠MAPC克隆的3D集合體也保持了所述集合體中oct3/4的表達(dá)并且隨后一旦被轉(zhuǎn)移到分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基就進(jìn)行自發(fā)分化。使用之前為肝細(xì)胞分化優(yōu)化的方案使大鼠高oct3/4的MAPC集合體分化時(shí)，所述分化的結(jié)果——基于肝標(biāo)志物例如白蛋白、AFP、TTR、AAT和TAT的表達(dá)——與同時(shí)進(jìn)行的高密度2D分化是相當(dāng)?shù)?。因此，明顯地，所述3D集合體能夠從“MAPC樣”表型起始進(jìn)行顯著水平的到肝譜系的分化。所述分化集合體的功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì):白蛋白ELISA用于評(píng)估白蛋白分泌速率，PAS染色用于糖原貯積，免疫染色用于研究到基礎(chǔ)、頂點(diǎn)和側(cè)面域的極化，并使用透射電子顯微鏡(TEM)闡明超結(jié)構(gòu)的特性。另外，還探索了使用這些表達(dá)oct3/4的MAPC集合體作為用于MAPC的可放大擴(kuò)增的可能方法。材料和方法“MAPC 培養(yǎng)基”MAPC培養(yǎng)基含有60% (v/v)低葡萄糖型Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(11885，Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA)、40% (v/v)MCDB-201 (M6770, Sigma)、1% (v/v)I X胰島素-硒-轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS;Sigma)、l% (v/v) I X亞油酸牛血清白蛋白(LA-BSA; Sigma)、5X IO-8M地塞米松(Sigma)、1(T4M抗壞血酸3-磷酸(Sigma)、100單位的青霉素、1000單位的鏈霉素、2% (v/v)胎牛血清(FBS; Hyclone, Logan, UT, USA)、10ng/ml小鼠表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)、10ng/ml 人血小板衍生生長(zhǎng)因子(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)、0.54%1X ￠-巰基乙醇以及1000單位/ml小鼠白細(xì)胞抑制因子。使用22iim濾器(Millipore，Billerica, MA, USA)對(duì)培養(yǎng)基滅菌，并保持在4°C，最長(zhǎng)3_4周。

MAPC集合體的形成通過(guò)使用所述懸滴法或強(qiáng)制聚集方法來(lái)形成MAPC集合體。在懸滴法中:將MAPC以100-4000個(gè)細(xì)胞/孔接種在60孔微孔板(Nunc)的每孔20 u I MAPC培養(yǎng)基中。然后將微孔板倒置并置于5%氧氣、37°C的恒溫箱中4-5天以使集合體形成。在強(qiáng)制聚集方法中，將100-4000MAPC/孔的96孔U型底超低附著板(Corning)以1500rpm離心4分鐘，使細(xì)胞在5%氧氣、37 °C的恒溫箱中在接下來(lái)的4-5天內(nèi)聚集。MAPC集合體的分化最近開(kāi)發(fā)了針對(duì)培養(yǎng)基組分、氧氣水平和細(xì)胞外基質(zhì)優(yōu)化的四步驟、21天分化方案，用于從MAPC高效分化為具有肝細(xì)胞的形態(tài)、表型和功能特性的細(xì)胞。所述四步驟方法由以下組成:(I)用50ng/mlWnt3a和100ng/ml激活素A培養(yǎng)MAPC6天；(2)然后用IOng/mlbFGF 和 50ng/ml BMP4 培養(yǎng)步驟(I)的細(xì)胞 4 天；(3)然后用 50ng/mlaFGF、10ng/ml FGF4和25ng/ml FGF8b培養(yǎng)步驟(2)的細(xì)胞4天；(4)然后用20ng/ml HGF和100ng/ml卵泡抑素培養(yǎng)步驟(3)的細(xì)胞7天。為了區(qū)別肝細(xì)胞樣細(xì)胞或膽細(xì)胞樣細(xì)胞，用卵泡抑素抑制活化素。在所述細(xì)胞分化前，大規(guī)模擴(kuò)增未分化的MAPC直到獲得幾百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。然后，將細(xì)胞以50，000-60, 000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板在基質(zhì)膠(2%)包被的孔中。起初，在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞直到它們?cè)?6小時(shí)后達(dá)到80-90%匯合。然后，將細(xì)胞用PBS洗滌兩次并將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為分化培養(yǎng)基。為了驗(yàn)證加入細(xì)胞因子是否有真實(shí)的肝細(xì)胞誘導(dǎo)效果，僅使用基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化。將所有細(xì)胞在基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基中在低氧(5%)條件下培養(yǎng)，所述基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基由DMEM (60%)、MCDB (40%)、抗壞血酸(I X )、青霉素/鏈霉素(I X )、￠-巰基乙醇、胰島素-硒-轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS) (0.25 X ), LA-BSA (0.25 X )和地塞米松(I(T6M)。使用了高濃度的地塞米松，因?yàn)槟承└渭?xì)胞特定基因(即酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶、MRP2和色氨酸2，3雙加氧酶)是受糖皮質(zhì)激素上調(diào)的，因?yàn)樗龌蚝刑瞧べ|(zhì)激素應(yīng)答元件。完全沒(méi)有血清時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞死亡。但是，使用fct3a在無(wú)血清條件下誘導(dǎo)了分化。如果不在基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基中加細(xì)胞因子，那么加入2%血清直到第12天，然后停止。因?yàn)楦邼舛鹊牡厝姿膳c胰島素一起可誘導(dǎo)脂肪形成，所以使用了較少量的胰島素。實(shí)施例2.在2D和3D備件下大鼠MAPC譜系R2old和19分化的比較
該研究的目標(biāo)是證明，MAPC在作為3D集合體生長(zhǎng)和培養(yǎng)時(shí)的多譜系分化能力。使用了兩種譜系的大鼠MAPC:R2old和19，并將其作為3D集合體維持在MAPC維持條件(MAPC培養(yǎng)基，5%氧氣)下持續(xù)16天時(shí)間。在所述16天時(shí)間的終點(diǎn)，解離3D集合體并重新鋪板到纖連蛋白包被的皿，類似于大鼠MAPC的標(biāo)準(zhǔn)2D單層維持。隨后，進(jìn)行了生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的到肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的分化，并將所述分化與同一時(shí)間過(guò)程中進(jìn)行的維持在2D單層培養(yǎng)中的大鼠MAPC的分化相比較。圖11 (A)、(B)和(C)通過(guò)定量實(shí)時(shí)(QRT)-PCR獲得的的數(shù)據(jù)指示了對(duì)應(yīng)于不同細(xì)胞類型的標(biāo)志物的表達(dá)。從這些數(shù)據(jù)，作為3D集合體維持的細(xì)胞似乎保留了以與維持在2D培養(yǎng)中的細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃竭M(jìn)行多譜系分化的潛能。因此，MAPC可維持在3D培養(yǎng)中而不損失品質(zhì)，因此使其可以在生物反應(yīng)器中擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)施例3._3] 材料和方法大鼠MAPC譜系的建立和維持該研究中使用了兩個(gè)大鼠MAPC譜系。以前已經(jīng)描述了大鼠MAPC譜系的分離(Breyer et al.2006;Ulloa-Montoya et al.2007)。簡(jiǎn)而言之，大鼠 MAPC 譜系是從 4 周齡雌性大鼠(Fischer)的脛骨和股骨分離的。將細(xì)胞以6X IO6/孔鋪板在6孔組織培養(yǎng)板的MAPC培養(yǎng)基中，并在37°C、5%氧氣和5.5%C02中培養(yǎng)在潮濕的恒溫箱中。培養(yǎng)4周后，使用針對(duì)CD45和Terll9的磁性微珠(Miltenyi Biotec)除去造血細(xì)胞，并將剩余細(xì)胞以5個(gè)細(xì)胞/孔接種到 96孔板。隨后對(duì)孔中呈現(xiàn)小尺寸和梭形形態(tài)的細(xì)胞挑取并篩選MAPC表型(表達(dá)0ct4、Rexl和CD31)和三譜系分化潛能(Breyer et al.2006)。將建立的MAPC細(xì)胞系以300個(gè)細(xì)胞/cm2的起始細(xì)胞密度維持在37°C、5%氧氣和5_6%C02的恒溫箱中的MAPC培養(yǎng)基中，每?jī)商焓褂?.05% (w/v)的胰蛋白酶-EDTA (5mg/1 Cellgro)傳代(Breyer etal.2006)。MAPC 培養(yǎng)基MAPC培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低葡萄糖型Dulbecco改良的Eagle 培養(yǎng)基(DMEM) (Gibco, USA)和 MCDB-201 (Sigma)的 60/40 (v/v)混合物，補(bǔ)充有
0.026 u g/ml抗壞血酸3-磷酸(Sigma)、亞油酸牛血清白蛋白(LA-BSA, Sigma)(終濃度為103ii g/mlBSA和8.13 ii g/ml亞油酸)、胰島素-硒-轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS，Sigma)(終濃度為IOii g/ml胰島素、5.5 V- g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.005 u g/ml亞硒酸鈉)、0.02 u g/ml地塞米松(Sigma)、4.3 ii g/ml ￠-巰基乙醇和2% (v/v)合格的胎牛血清(Hyclone)。完全MAPC培養(yǎng)基還含有三種生長(zhǎng)因子:人血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF-BB，R&D) (10ng/ml)、小鼠表皮生長(zhǎng)因子(EGF, Sigma) (10ng/ml)和小鼠白血病抑制因子(LIF) (IO3 單位/ml) (Chemicon, ESGRO) 使用的所有培養(yǎng)基還補(bǔ)充有100IU/ml青霉素和IOOii g/ml鏈霉素(Gibco)。MAPC集合體的靜態(tài)板培養(yǎng)使用懸滴法(Kurosawa et al.2003)或強(qiáng)制聚集方法(Ng et al.2005)從MAPC的單個(gè)細(xì)胞形成MAPC集合體。簡(jiǎn)而言之，在所述懸滴法中將300-3000個(gè)單細(xì)胞懸浮在懸掛于倒置塑料表面(Nunc)的單滴培養(yǎng)基中，所述塑料表面含有60小滴的細(xì)胞和培養(yǎng)基，使每個(gè)都聚集為單獨(dú)的集合體。在強(qiáng)制聚集方法中，將懸浮液中的細(xì)胞置于超低附著圓形底96孔板(Corning)的孔中，并以1500rpm離心4分鐘，以使細(xì)胞沉降到孔底。除非另有說(shuō)明，將所述沉降的細(xì)胞在37°C、5%氧氣的恒溫箱培養(yǎng)以使集合體隨著時(shí)間形成。
對(duì)于靜態(tài)板培養(yǎng)，使用所述兩種方法的任一種形成了 MAPC集合體。當(dāng)通過(guò)懸滴法形成時(shí)，將第4天的MAPC集合體以10個(gè)集合體/孔在超低附著24孔板(Corning)中培養(yǎng)。形成了強(qiáng)制聚集方法的集合體，并且在整個(gè)培養(yǎng)期都在96孔板中培養(yǎng)。在兩種情形中，都使用了 MAPC培養(yǎng)基和5%氧氣的條件，每?jī)商旄鼡Q50%的培養(yǎng)基。同時(shí)還將MAPC集合體置于分化條件(無(wú)LIF、PDGF和EGF的MAPC培養(yǎng)基，21%氧氣)作為維持培養(yǎng)。 MAPC集合體的懸浮瓶培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)前，使用強(qiáng)制聚集方法靜態(tài)培養(yǎng)兩天來(lái)形成MAPC集合體。然后，將集合體以50，000個(gè)細(xì)胞/ml的初始細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)移到250ml旋轉(zhuǎn)瓶，將培養(yǎng)物以70rpm攪拌，并保持在有5%氧氣控制的37 °C恒溫箱內(nèi)。MAPC集合體的解離 為了將所述MAPC集合體解離為單細(xì)胞，將集合體用PBS洗滌一次并懸浮于37°C水浴中的預(yù)熱的0.05% (w/v)胰蛋白酶-EDTA中15-20分鐘。將所述集合體-細(xì)胞懸浮液用移液管吹打幾次，隨后再在水浴中孵育5分鐘，直到在顯微鏡下觀察到所述集合體解離為單細(xì)胞。RNA分離和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)使用RNAeasy microkit (Qiagen)根據(jù)所述試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)從rMAPC細(xì)胞裂解物中分離總RNA。使用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)方法從所提取的RNA合成cDNA。PCR反應(yīng)混合物由cDNA樣品、SYBR Green Mix PCR反應(yīng)緩沖液(AppliedBiosystems)以及引物(5 iim儲(chǔ)存液,序列在表I示出)組成。使用如下的程序在Realplexmastercycler(Eppendorf)上進(jìn)行 RT-qPCR 反應(yīng):50°C維持 2 分鐘，95°C維持 10 分鐘，95°C維持15秒和60°C維持I分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行解離方案以獲得融解曲線。將相對(duì)于GAPDH的轉(zhuǎn)錄本豐度表示為1g2 (相對(duì)于GAPDH的轉(zhuǎn)錄本表達(dá))并計(jì)算A Ct，A Ct是Ct (目的基因)-Ct (GAPDH)，相對(duì)于第0天的樣品中轉(zhuǎn)錄本豐度表示為1g2 (相對(duì)于第0天的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平)并計(jì)算為ACt (第0天)-ACt (取樣日)。使用臨界p值為0.05的Student’s t檢驗(yàn)來(lái)獲得不同樣品之間表達(dá)的任何顯著性差異。通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行0ct4的細(xì)胞內(nèi)染色將通過(guò)胰酶消化收獲的細(xì)胞用含3% (v/v)血清的PBS洗滌，并以每FACS管100，000個(gè)細(xì)胞懸浮在含3% (v/v)血清的PBS中。在用4%低聚甲醛固定15-20分鐘并在補(bǔ)充有10%驢血清的SAP緩沖液(含0.1% (w/v)皂苷和0.05% (w/v)疊氮化鈉的PBS)中封閉I小時(shí)后，將細(xì)胞與在SAP緩沖液中稀釋的lg/ml 0ct3/4抗體(Santa-Cruz，N19)或羊IgG同種型對(duì)照(Jackson Immunoresearch) 一起孵育I小時(shí)，然后與Cy5標(biāo)記的抗羊IgG(Jackson Immunoresearch,在SAP緩沖液中1:500)—起孵育30分鐘。最終，將細(xì)胞洗漆、過(guò)濾并重懸于500 ii IPBS中以使用FACS caliber(Becton Dickinson)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。用于評(píng)估保持MAPC分化潛能的體外定向分化神經(jīng)外胚層分化將rMAPC以1500個(gè)細(xì)胞/cm2在0.1%明膠包被的T75瓶中的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天,所述神經(jīng)分化培養(yǎng)基由50% (v/v)DMEM/F12 (Invitrogen)和50% (v/v)神經(jīng)基礎(chǔ)A 培養(yǎng)基(Invitrogen)組成并補(bǔ)充有 N2plus 補(bǔ)充物(R&D systems)、B27 (Invitrogen)、
4.3g/ml ^ -巰基乙醇、0.3mg/ml谷氨酰胺(Invitrogen)。在第2天,將培養(yǎng)基完全替換為補(bǔ)充有0.3mg/ml谷氨酰胺、N2plus補(bǔ)充物、4.3 u g/ml ^ -巰基乙醇和生長(zhǎng)因子(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(R&D, bFGF, 10ng/ml)和 EGF (Sigma, 10ng/ml))的 Euromed_N 培養(yǎng)基(AnnovumEuroclone)。在第6天,將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重新鋪板在0.1%明膠包被的T25瓶中的補(bǔ)充有bFGF (10ng/ml)和EGF (10ng/ml)的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中。在5%氧氣條件下繼續(xù)分化14天，每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基。內(nèi)皮細(xì)胞分化將rMAPC以45，OOO個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度培養(yǎng)在纖連蛋白(100ng/ml)包被的24孔板中的MAPC培養(yǎng)基中。約16小時(shí)后，將培養(yǎng)基完全替換為內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基，除了沒(méi)有所述三種生長(zhǎng)因子，地塞米松為0.4g/ml并且加入10ng/ml重組人VEGF (R&D)以外，所述內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成與MAPC培養(yǎng)基是相同的。在21%氧氣條件下繼續(xù)分化20天，每?jī)商旄鼡Q50%的培養(yǎng)基。肝細(xì)胞分化將rMAPC以50，OOO個(gè)細(xì)胞/cm2的起始細(xì)胞密度培養(yǎng)在基質(zhì)膠(2%，BD)包被的24孔板孔中的MAPC培養(yǎng)基中，直到達(dá)到80-90%匯合。隨后，將擴(kuò)增培養(yǎng)基完全替換為分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，除了 ITS和LA-BSA是MAPC培養(yǎng)基中量的25%，地塞米松為0.4g/ml并且沒(méi)有所述三種蛋白因子和血清以外，所述分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成與MAPC培養(yǎng)基是相同的。此外，按如下加入額外的蛋白因子。按如下加入細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物:(i)第O天:100ng/ml的激活素 A 和 50ng/ml 的 Wnt3a (ii)第 6 天:10ng/ml 的 bFGF 和 50ng/ml 的 BMP4 (iii)第 10 天:25ng/ml 的 FGF8b、50ng/ml 的 aFGF 和 10ng/ml 的 FGF4 (iv)第 14 天:20ng/ml 的HGF和100ng/ml的卵泡抑素。在21%氧氣條件下進(jìn)行分化20天，對(duì)應(yīng)于所述分化階段每?jī)商旄鼡Q50%的培養(yǎng)基。在第0、6、10和14天，將完全培養(yǎng)基替換為含用于下個(gè)分化階段的補(bǔ)充物的新培養(yǎng)基。時(shí)差顯微鏡 將MAPC以1000個(gè)細(xì)胞/孔接種在超低附著圓底96孔板(Corning)中。通過(guò)位于37°C、5%C02以及5%或21%02的孵育系統(tǒng)中的顯微鏡(Leica)觀察細(xì)胞的初始聚集48小時(shí)。在48小時(shí)內(nèi)每4分鐘對(duì)進(jìn)行聚集的細(xì)胞拍照。從三個(gè)或更多個(gè)含有單個(gè)集合體的孔的平均值確定了集合體大小。透射電子顯微鏡將細(xì)胞集合體用0.1M 二甲砷酸鹽緩沖液洗滌三次并在2.5%戊二醛和0.1M 二甲砷酸鈉緩沖液(PH7.2)中固定40分鐘。在1%四氧化鋨和0.1M 二甲砷酸鹽緩沖液中后固定(post-fixation)后，將所述樣品在梯度系列乙醇中脫水，然后用環(huán)氧丙烷處理，并嵌入到環(huán)氧樹(shù)脂中。切下超薄切片，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并使用明尼蘇達(dá)大學(xué)表征研究所(Characterization facility at University of Minnesota)的 JEOL 1200EXII 電子顯微鏡進(jìn)行檢查。E-鈣粘蛋白染色將細(xì)胞集合體在4%低聚甲醛中固定30分鐘并用PBS洗滌。將所述樣品在PBS中的5%蔗糖中孵育過(guò)夜，用異戊烷過(guò)冷，然后在OCT中冷凍并獲得切片。使用H2O2抑制內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶并與胎牛血清(FBS)孵育以減少非特異性結(jié)合。然后，將細(xì)胞與抗E-鈣粘蛋白(BD)的抗體孵育或與同種型-匹配的陰性對(duì)照抗體(小鼠IgG2a)孵育，然后使用EnVision-過(guò)氧化物酶與DAB底物(Dako)使其可視化。細(xì)胞活力染色使用"live/deadviability/cytotoxicity kit" (Invitrogen)將集合體中的細(xì)胞用鈣黃綠素和乙啡啶染色。首先將組分B加入到DPBS (1:1000)中，然后將組分A加入到含組分B的DPBS中(1:2000)。將細(xì)胞與所述染色溶液在37°C下孵育15-30分鐘。將細(xì)胞用PBS洗滌一次并在倒置熒光顯微鏡(AXiOVert200，ZeiSS)下觀察?；罴?xì)胞和死細(xì)胞分別呈現(xiàn)綠色和紅色。對(duì)檢測(cè)死細(xì)胞的方案的驗(yàn)證是用通過(guò)在所述染色方案前30分鐘在用
0.1% (w/v)皂苷處理(以誘導(dǎo)基于透化的細(xì)胞死亡)的集合體中的細(xì)胞中觀察到的紅斑點(diǎn)來(lái)確認(rèn)的。細(xì)胞周期分析將細(xì)胞在80%乙醇中固定并儲(chǔ)存在_20°C。將固定的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后在4°C在含有50 u g/ml碘化丙啶和0.lmg/ml RNA酶的PBS中染色過(guò)夜。洗滌后，將細(xì)胞過(guò)濾并重懸在500 u I PBS中以使用FACS Calibur進(jìn)行流式細(xì)胞分析。MSMAPC自組裝為細(xì)胞集合體使用兩種已知方法——懸滴法和強(qiáng)制聚集方法——從MAPC的單個(gè)懸浮液形成了集合體。將rMAPC以3000-30，000個(gè)細(xì)胞/ml (或每孔或每滴300-3000個(gè)細(xì)胞)的起始細(xì)胞濃度接種，從每滴或每孔容易地形成了單個(gè)集合體。在5%或21%氧氣中在完全MAPC培養(yǎng)基或無(wú)LIFJDGF和EGF的MAPC培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基)中形成了集合體。對(duì)于所有研究，至少以三次重復(fù)測(cè)試了兩種大鼠 MAPC譜系。在第4天，在有5%氧氣的完全MAPC培養(yǎng)基中形成了集合體，其以與培養(yǎng)在2D表面(5%氧氣)的親代MAPC譜系相當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)0ct4、Rexl、^31和1^ 313轉(zhuǎn)錄本，但不表 達(dá)4€ ——一種當(dāng)MAPC自發(fā)分化時(shí)顯示出快速上調(diào)的基因(圖12a)。另外，通過(guò)流式細(xì)胞儀顯示，在這些集合體中維持有0ct4蛋白表達(dá)(圖12b)。相比之下，在21%氧氣的MAPC培養(yǎng)基中形成的集合體是正在分化的，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)32倍的Afp轉(zhuǎn)錄本(圖12c)，表達(dá)0ct4蛋白的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)減少約50% (圖12d)。在無(wú)LIFJDGF和EGF的MAPC培養(yǎng)基中形成集合體，即使有5%氧氣，也導(dǎo)致了 0ct4轉(zhuǎn)錄本的21倍下降(圖12c)，僅約4%的細(xì)胞表達(dá)0ct4蛋白(圖12d)。因此，在集合體形成過(guò)程中，高的環(huán)境氧氣濃度以及除去LIFJDGF和EGF均負(fù)面地影響了 0ct4表達(dá)，并導(dǎo)致分化。在完全MAPC培養(yǎng)基中在5%02下形成的MAPC集合體中的細(xì)胞還可被胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸浮液并在2D表面上重新培養(yǎng)，顯示出典型的MAPC增殖譜和表型(圖19)。MAPC集合體及其形成的表征在細(xì)胞接種后4天，MAPC集合體有幾乎不可分辨的細(xì)胞-細(xì)胞界限(圖13a)。使用時(shí)差顯微鏡觀察48小時(shí)內(nèi)集合體形成的過(guò)程。在離心沉降到孔底后，單細(xì)胞聚集在一起達(dá)到540 iim的平均大小。隨后的壓緊作用使細(xì)胞集合體有約250 iim的大小。然后在初始聚集后48小時(shí)，集合體大小增加到約460 ii m (圖13b)。每天通過(guò)胰酶消化解離10個(gè)集合體用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。每集合體中的平均細(xì)胞數(shù)在4天內(nèi)從每集合體1000增加至17，758個(gè)細(xì)胞(668 ±19 iim，十個(gè)集合體的均值和標(biāo)準(zhǔn)差)(圖13c)。在4天的形成過(guò)程中群倍增時(shí)間為約23小時(shí)，比在2D表面培養(yǎng)時(shí)觀察到的(12-14小時(shí))慢。在第I天至第3天的倍增時(shí)間約為12小時(shí)。在第3天和第4天之間，觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)減慢(圖13c)。通過(guò)流式細(xì)胞儀完成的細(xì)胞周期分析指示，與2D表面培養(yǎng)(40%)相比，集合體(第4天)中更大比例的MAPC (60%)處在G0/G1期(圖20)。集合體的TEM分析顯示出了有高核質(zhì)比(MAPC的特征)的緊湊細(xì)胞。在細(xì)胞-細(xì)胞邊界處觀察到緊密連接(圖13d)。免疫組織化學(xué)證明了集合體中的MAPC表達(dá)細(xì)胞膜相關(guān)粘附蛋白E-鈣粘蛋白(圖13e)。在培養(yǎng)中MAPC保留了分化潛能發(fā)明人然后檢查了是否可以長(zhǎng)時(shí)間地維持培養(yǎng)MAPC集合體而不喪失其特征表型。使MAPC集合體形成四天，隨后將其在完全MAPC培養(yǎng)基或無(wú)LIF、PDGF和EGF的MAPC培養(yǎng)基中再保持六天，每?jī)商旄鼡Q50%的培養(yǎng)基。使用0ct4和Afp轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的RT-qPCR來(lái)評(píng)估培養(yǎng)物的未分化狀態(tài)。MAPC集合體維持了 0ct4轉(zhuǎn)錄本水平，沒(méi)有增加Afp轉(zhuǎn)錄本水平。但是，對(duì)于培養(yǎng)在無(wú)LIFJDGF和EGF的MAPC培養(yǎng)基(有21%氧氣)中的MAPC集合體，0ct4轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下降，Afp轉(zhuǎn)錄本表達(dá)隨著時(shí)間逐漸增加(圖14a、14b)。在完全MAPC培養(yǎng)基的16天培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生了細(xì)胞增殖，這表現(xiàn)為集合體大小增加或者從單個(gè)MAPC集合體上有小團(tuán)細(xì)胞的出芽掉 落以形成較小的集合體(圖21)。培養(yǎng)16天后，通過(guò)胰酶消化將MAPC集合體解離為單細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估0ct4蛋白的表達(dá)(圖14c、14d)。在16天培養(yǎng)的終點(diǎn)繼續(xù)表達(dá)0ct4蛋白的細(xì)胞的比例(一個(gè)MAPC譜系為79%，另一個(gè)MAPC譜系為78%)與2D單層培養(yǎng)和第0天的MAPC集合體相似(圖12b)。將這些細(xì)胞重新擴(kuò)增，在2D表面以低細(xì)胞密度擴(kuò)增傳代兩次后，使集合體衍生的細(xì)胞定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞譜系，并將所述分化與在整個(gè)培養(yǎng)期以低細(xì)胞密度在2D表面培養(yǎng)維持的MAPC的分化相比較。如圖15所示，在分化中未能檢測(cè)到顯著差異(student’s t檢驗(yàn),臨界p值為0.05)。在神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，在作為集合體培養(yǎng)16天然后在2D表面培養(yǎng)的細(xì)胞以及在整個(gè)培養(yǎng)期在2D表面培養(yǎng)中維持的細(xì)胞中，均觀察到了 Sox2、Pax6和Nestin轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的類似增加(圖15a)。在內(nèi)皮細(xì)胞分化中觀察到了類似的結(jié)果，表現(xiàn)為Flk-1、Ve-鈣粘蛋白、vWF、Enos轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)增加(圖15b)，并且在肝細(xì)胞譜系分化中觀察到了類似的結(jié)果，表現(xiàn)為Afp、白蛋白、Aat和Tat轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)增力口(圖15c)。因此，MAPC可作為集合體培養(yǎng)至少16天，具有全部三個(gè)譜系的分化潛能。在懸浮培養(yǎng)中擴(kuò)增作為集合體的MAPC發(fā)明人還確定了是否可以在懸浮培養(yǎng)中擴(kuò)增作為集合體的MAPC。所述培養(yǎng)用一個(gè)MAPC細(xì)胞系重復(fù)三次(圖16)，用另一個(gè)MAPC譜系重復(fù)兩次(圖22)。在靜態(tài)培養(yǎng)條件下2天形成MAPC集合體，然后將其接種到IOOml工作體積的250ml旋轉(zhuǎn)瓶中。在靜態(tài)培養(yǎng)的前兩天(第-2天至第0天)過(guò)程中，細(xì)胞濃度從IO4增長(zhǎng)至5X IO4個(gè)細(xì)胞/ml。從懸浮培養(yǎng)的第0天至第2天，觀察到細(xì)胞數(shù)又增加了 6倍。在懸浮培養(yǎng)第2天，收獲細(xì)胞集合體，所述瓶中的細(xì)胞濃度減少至50%，加入50ml新培養(yǎng)基。在6天培養(yǎng)的終點(diǎn)，對(duì)于rMAPC-1，獲得了 7X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的最終細(xì)胞濃度(等于70倍擴(kuò)增)(圖16a)。在其他大鼠MAPC譜系的旋轉(zhuǎn)擴(kuò)增培養(yǎng)的第4天也獲得了類似的細(xì)胞濃度(圖22a)。用LIVE/DEAD細(xì)胞毒性試劑盒(Molecluar Probes)的染色證明了，所述集合體(第4天)內(nèi)的細(xì)胞保留了高活力(圖16b)。通過(guò)RT-qPCR評(píng)估了第-2天(來(lái)自2D維持培養(yǎng)的細(xì)胞)、第0天(在孔中聚集48小時(shí)后的細(xì)胞)以及第2和4天(旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中的集合體)的關(guān)鍵MAPC基因例如0ct4、Rexl、⑶31、Sall4和分化標(biāo)志物Afp的轉(zhuǎn)錄本水平。在0ct4、Rexl、⑶31和Sall4轉(zhuǎn)錄本中未能檢測(cè)到差異，未觀察到AFP表達(dá)增加(圖16c、圖22b)。另夕卜，還通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估了 0ct4蛋白的表達(dá)。在旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的終點(diǎn)繼續(xù)表達(dá)0ct4蛋白的細(xì)胞的比例(第4天，一個(gè)MAPC譜系為77%，另一個(gè)MAPC譜系為74%)與對(duì)照2D表面培養(yǎng)(第4天，79%)是相似的(圖16d、圖22c)。因此，可擴(kuò)增在攪拌懸浮培養(yǎng)中的細(xì)胞，而其無(wú)明顯分化征兆。為評(píng)估培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)器中的MAPC集合體是否持續(xù)具有相似的分化潛能，將第0、2和4天的集合體在24孔超低附著板上靜態(tài)培養(yǎng)使其進(jìn)行肝細(xì)胞分化。選擇定向到肝細(xì)胞譜系的分化是因?yàn)轶w外藥物測(cè)試應(yīng)用需要大量的肝細(xì)胞。在收集自旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)不同點(diǎn)的細(xì)胞集合體的20天分化的終點(diǎn)，通過(guò)RT-qPCR評(píng)估了肝細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)程度，在每種情況中都超過(guò)了起始細(xì)胞集合體中的表達(dá)水平。如由肝細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄本Afp、白蛋白、Aat和Tat的上調(diào)所顯示的，所述MAPC集合體(來(lái)自第0、2和4天)分化為“肝細(xì)胞樣”細(xì)胞(圖16e)。對(duì)于所有的起始細(xì)胞群來(lái)說(shuō)，這些基因的上調(diào)水平是相似的。另外，來(lái)自每個(gè)分化的分化細(xì)胞還以0.7-0.Spg/細(xì)胞/天或者以成年大鼠肝細(xì)胞分泌水平的約10%分泌白蛋白，并且以4-7 yg/天分泌尿素。因此，在旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)中擴(kuò)增的細(xì)胞也可被用于產(chǎn)生大量的“肝細(xì)胞樣”細(xì)胞。討論干細(xì)胞可為功能異常組織的再生和替換提供很大的潛能，并可作為研究正常分化過(guò)程、疾病模型以及藥物毒性測(cè)試的工具。由于其在再生醫(yī)學(xué)和研究中的重要性，開(kāi)發(fā)強(qiáng)大的生物過(guò)程以產(chǎn)生大量干細(xì)胞及其分化衍生物的興趣在增加。已經(jīng)為培養(yǎng)不同的干細(xì)胞類型測(cè)試了數(shù)種生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)(廣泛地綜述見(jiàn)(Kehoe et al.2009;King andMiller2007;Kirouac and Zandstra2008))。在不同生物反應(yīng)器中，基于攪拌爸的設(shè)計(jì)已經(jīng)被最廣泛地用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因?yàn)槠淙菀拙S持同質(zhì)環(huán)境，并可在線過(guò)程監(jiān)測(cè)和控制。此外，過(guò)去已經(jīng)積累的關(guān)于設(shè)計(jì)和操作的廣泛經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)，這將可用于放大干細(xì)胞生物過(guò)程。參考文獻(xiàn)Abranches E, Bekman E, Henrique D, Cabral JM.2007.Expansion of mouseembryonic stem cells on microcarriers.Biotechnol Bioeng 96(6): 1211-21.
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權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其包括非靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)的干細(xì)胞的集合體，其中所述細(xì)胞密度范圍可為約5X IO4個(gè)細(xì)胞/ml至約IO8個(gè)細(xì)胞/ml。
2.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述集合體的平均直徑可以最高達(dá)約Imm的直徑。
3.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物,其中每集合體的平均細(xì)胞數(shù)可以最高達(dá)約50，000個(gè)細(xì)胞。
4.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中每集合體的細(xì)胞數(shù)為約50，000個(gè)細(xì)胞，每集合體的平均直徑為約1mm。
5.一種制備權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物的方法，所述方法包括用干細(xì)胞集合體接種細(xì)胞培養(yǎng)物并擴(kuò)增所接種的集合體，從而使擴(kuò)增產(chǎn)生約5 X IO4個(gè)細(xì)胞/ml至約IO8個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。
6.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述細(xì)胞集合體包括非胚胎干細(xì)胞、非胚胎生殖細(xì)胞、非生殖細(xì)胞的細(xì)胞，并可分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中的至少兩種的細(xì)胞類型。
7.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述細(xì)胞集合體包括分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞的細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍增，其中所述細(xì)胞表達(dá)oct4，未被轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。
8.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述細(xì)胞集合體包括通過(guò)培養(yǎng)非胚胎組織、非生殖組織而獲得的分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞的細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少40次細(xì)胞倍增，其中所述細(xì)胞未被轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。
9.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述細(xì)胞集合體包括分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞的細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍增，其中所述細(xì)胞表達(dá)端粒酶，未被轉(zhuǎn)化并具有正常的核型。
10.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述細(xì)胞集合體包括分離的擴(kuò)增非胚胎干細(xì)胞、非生殖細(xì)胞的細(xì)胞，其可以分化為內(nèi)胚層胚胎譜系、外胚層胚胎譜系和中胚層胚胎譜系中的至少兩種中的至少一種細(xì)胞類型，所述細(xì)胞已經(jīng)在培養(yǎng)中經(jīng)歷至少10-40次細(xì)胞倍士豳>曰ο
11.權(quán)利要求I的細(xì)胞培養(yǎng)組合物，其中所述細(xì)胞集合體包括oct3/4、端粒酶、rex-1、rox-1、nanog、GATA6和sox_2中的一種或多種陽(yáng)性的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞集合體的組合物以及制備和使用所述細(xì)胞集合體的方法，其中所述集合體包括非胚胎干細(xì)胞但可分化為外胚層胚胎胚層、內(nèi)胚層胚胎胚層和中胚層胚胎胚層中的至少兩種的細(xì)胞類型的細(xì)胞，例如干細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/07GK103237886SQ201180051144
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者K·蘇巴馬廉, 胡維碩, C·M·維爾費(fèi)利, Y·樸 申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)大學(xué)董事會(huì), 魯汶卡柴列克大學(xué)