專利名稱：新抗生素卡莫霉素(Chemomicin)B、C、D及其制造方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一組新的角蒽環(huán)類抗生素(Angucyclinone)卡莫霉素B、C、D及其制備方法、以卡莫霉素B、C、D為活性成分的藥物組合物以及卡莫霉素B、C、D在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術(shù)：
迄今發(fā)現(xiàn)來源于微生物的抗生素已超過萬余種，其中許多作為醫(yī)藥，農(nóng)藥已得到廣泛應用。Angucyclinone類抗生素是20世紀60年代發(fā)現(xiàn)的一類具有廣泛生物學活性的抗生素，其結(jié)構(gòu)與蒽環(huán)類抗生素比較相近，其中A環(huán)呈角的形式并于蒽環(huán)上。大部分Angucyclinone抗生素都具有抗腫瘤活性，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的活性較弱，個別此類抗生素還具有酶抑制劑活性、抗病毒活性、受體拮抗劑活性和免疫抑制活性。由于這類抗生素具有廣泛生物學活性，引起了世界上許多研究者的注意，并對這類抗生素進行了深入的研究。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Angucyclinone這類抗生素已有一百多個[Rohr，J.NatRep.9(2)103-137，1992]。
隨著新抗生素大規(guī)模篩選研究不斷向縱深發(fā)展，微生物發(fā)酵液中含量高、易分離的主組分抗生素大多已被分離出來，發(fā)現(xiàn)新抗生素的難度越來越大了。要進一步發(fā)現(xiàn)有顯著生物活性的抗生素，需要有新的研究策略，如菌種上選擇稀有放線菌、極端環(huán)境微生物等；化學上采用現(xiàn)代色譜-光譜聯(lián)用技術(shù)以實現(xiàn)微快準早期結(jié)構(gòu)判斷，分離微量組分等等。
本實驗室在從稀有放線菌篩選抗腫瘤抗生素過程中，分離得到具有抗腫瘤活性的Angucyclinone抗生素-卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)，經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜及核磁共振波普學數(shù)據(jù)分析，確定卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)為三個新結(jié)構(gòu)的抗生素。該結(jié)構(gòu)式與迄今已知結(jié)構(gòu)的所有Angucyclinone類抗生素不同，目前尚未見到與莫霉素B、C、D具有相同結(jié)構(gòu)及活性的相關報道。
迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Angucyclinone類抗生素中，也未見到有Angucyclinone類抗生素成為抗腫瘤藥物上市的。因此，卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)作為新結(jié)構(gòu)抗腫瘤抗生素具有良好的研發(fā)應用前景。
本發(fā)明的目的之一是，提供如式(1)、(2)、(3)所示卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)的結(jié)構(gòu)；
本發(fā)明的目的之二是，提供卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)的制備方法；本發(fā)明的目的之三是，提供以卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)為活性成分的藥物組合物；本發(fā)明的目的之四是，提供卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)及其組合物在制備抗腫瘤藥物中得應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了如式(1)、(2)、(3)所示結(jié)構(gòu)的卡莫霉素B、C、D(ChemomicineB、C、D) 通過一系列光譜學分析，確定了卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所說的卡莫霉素B是一種白色的粉末狀物質(zhì)，分子式為C19H18O6，其結(jié)構(gòu)特征為一種具有蒽醌環(huán)的四環(huán)結(jié)構(gòu)，其中A環(huán)的C-3上有羥甲基結(jié)構(gòu)。其易溶于甲醇、乙酸乙酯、二甲亞砜等溶劑，微溶于水、氯仿。當氯仿∶甲醇＝9∶1時，卡莫霉素B在硅膠板上的Rf＝0.35。本發(fā)明所說的卡莫霉素C是一種紅色顆粒結(jié)晶狀物質(zhì)，分子式為C19H16O6，其結(jié)構(gòu)與卡莫霉素B很相似，是卡莫霉素B的C-6a位和C-12a位脫氫后的降解產(chǎn)物。其易溶于甲醇，乙酸乙酯，二甲亞砜等溶劑，微溶于水，氯仿。當氯仿∶甲醇＝9∶1時，卡莫霉素C在硅膠板上的Rf＝0.35。本發(fā)明所說的卡莫霉素D是一種棕褐色粉末狀物質(zhì)，分子式為C19H14O5，是卡莫霉素C在C-4a位和C-12b位之間脫水后的降解產(chǎn)物，溶解性與前兩個很相似。當氯仿∶甲醇＝9∶1時，卡莫霉素D在硅膠板上的Rf＝0.55。
本發(fā)明所說卡莫霉素B、C、D是在從稀有放線菌篩選抗腫瘤抗生素的過程中，由諾卡氏菌地中海變株1747-64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747-64)培養(yǎng)物中分離得到的。所說產(chǎn)生菌已于2005年12月8日送交位于北京的“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”進行保藏，其保藏編號為CGMCC No.1554。
為了獲得卡莫霉素B、C、D及其抗腫瘤活性，本發(fā)明采取了以下技術(shù)路線與步驟1、卡莫霉素B、C、D的發(fā)酵及培養(yǎng)首先是將生長于斜面的諾卡氏菌地中海變株1747-64菌接種于種子培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基在往復振蕩搖床上培養(yǎng)，收獲發(fā)酵液；2、卡莫霉素B的提取，分離 發(fā)酵培養(yǎng)物中，加入弱酸(如2N的鹽酸等)，抽濾除去菌絲，得到上清液，再用非極性有機溶劑(如乙酸乙酯或丙酮等)萃取，減壓濃縮得到浸膏。浸膏先經(jīng)硅膠柱層析，然后采用Sephadex LH-20對含有目標化合物的組分實施進一步分離，洗脫溶劑為甲醇。最后用聚酰胺薄膜進行制備，甲醇洗脫，低溫減壓濃縮蒸干，最后得到白色粉末目標化合物卡莫霉素B；3、卡莫霉素C、D的提取，分離將經(jīng)聚酰胺薄膜分離得到的卡莫霉素B純品用少量甲醇溶解，然后加入少量水，于50℃下加熱48小時變性降解，經(jīng)高效薄層板制備而得到；4、卡莫霉素B、C、D的結(jié)構(gòu)鑒定根據(jù)UV、IR、HR-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT數(shù)據(jù)測試和1H-1H相關譜(1H-1H COSY)、1H-13C相關譜(HSQC)以及反向檢測遠程1H-13C異核多鍵相關譜(HMBC)的分析，確定了卡莫霉素B、C、D的結(jié)構(gòu)；5、卡莫霉素B、C、D的生物學活性測定 采用MTT法進行了體外抗腫瘤活性試驗，所選用的腫瘤細胞株為人食道癌細胞KYSE150。研究結(jié)果表明，卡莫霉素B、C、D具有非常顯著的抗腫瘤活性。
本發(fā)明還提供了卡莫霉素B、C、D的藥物組合物。所說藥物組合物，是以卡莫霉素B、C、D為活性成分，與藥學上可接受的一種或多種載體所組成。
以上所說藥學上可接受的載體是指，藥學領域常規(guī)的藥物載體，如稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣等。此外，還可在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明還提供了卡莫霉素B、C、D及其組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
發(fā)明效果本發(fā)明提供的結(jié)構(gòu)式(1)、(2)、(3)所示化合物為三個新的Angucyclinone類抗生素卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)，經(jīng)生物學活性實驗證明，這三個化合物均具有十分顯著的抗腫瘤作用，可望今后研究開發(fā)成為新的臨床有效的抗腫瘤抗生素。


附圖1-Chemomicin B在MeOH中的紫外光譜；附圖2-Chemomicm B的紅外光譜(KBr壓片)；附圖3-Chemomicin B的HR-ESI-MS譜；附圖4-Chemomicin B在DMSO-d6中的1H-NMR譜；附圖5-Chemomicin B在DMSO-d6+D2O中的1H-NMR譜；附圖6-Chemomicin B在DMSO-d6中的13C-NMR譜；附圖7-Chemomicin B在DMSO-d6中的DEPT譜；附圖8-Chemomicin B在DMSO-d6中的1H-1H COSY譜；附圖9-Chemomicin B在DMSO-d6中的HSQC譜；附圖10-Chemomicin B在DMSO-d6中的HMBC譜；附圖11-Chemomicin C在MeOH中的紫外光譜；附圖12-Chemomicin C的紅外光譜(KBr壓片)；附圖13-Chemomicin C的HR-ESI-MS譜；附圖14-Chemomicin C在DMSO-d6中的1H-NMR譜；附圖15-Chemomicin C在CD3OD中的1H-NMR譜；附圖16-Chemomicin C在CD3OD中的13C-NMR譜；附圖17-Chemomicin C在CD3OD中的DEPT譜；附圖18-Chemomicin C在CD3OD中的1H-1H COSY譜；附圖19-Chemomicin C在CD3OD中的HSQC譜；附圖20-Chemomicin C在CD3OD中的HMBC譜；附圖21-Chemomicin D在MeOH中的紫外光譜；附圖22-Chemomicin D的紅外光譜(KBr壓片)；附圖23-Chemomicin D的HR-ESI-MS譜；附圖24-Chemomicin D在CD3OD中的1H-NMR譜；附圖25-Chemomicin D在CD3OD中的13C-NMR譜；
附圖26-Chemomicin D在CD3OD中的DEPT譜；附圖27-Chemomicin D在CD3OD中的1H-1H COSY譜；附圖28-Chemomicin D在CD3OD中的HSQC譜；附圖29-Chemomicin D在CD3OD中的HMBC譜。
具體實施方案以下實施例可以使本領域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
<實施例1>卡莫霉素B、C、D的發(fā)酵將生長于斜面的(2％可溶性淀粉、1％KNO3、0.05％NaCl、0.05％K2HPO4，、0.001％FeSO4·7H2O，、0.05％MgSO4·7H2O，、2％瓊脂、pH7.0)Nocardia MediterraneiVar.Kanglensis 1747-64菌接種于種子培養(yǎng)基(2％葡萄糖，1％黃豆粉，0.5％酵母粉，0.5％CaCO3，pH6.5)50ml/250ml的搖瓶，在28℃于旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48小時，然后以5％的接種量，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基(3％葡萄糖、1％花生餅粉、1％酵母粉、0.5％蛋白胨、0.1％CaCO3，、pH6.5)100ml/500ml的三角瓶中，在28℃下于往復振蕩搖床上培養(yǎng)72小時，收獲發(fā)酵液共20L。
<實施例2>卡莫霉素B、C、D的提取以上所得發(fā)酵液用2N的HCl調(diào)pH至3～4，布氏漏斗里墊上濾紙抽濾，除去菌絲等，得到上清發(fā)酵液。用發(fā)酵液1/3體積的乙酸乙酯萃取三次，將三次萃取得到的乙酸乙酯合并后，加入無水硫酸鈉干燥脫水，靜置3～4小時，減壓濃縮得到浸膏。
<實施例3>卡莫霉素B、C、D的分離以上所得浸膏先經(jīng)硅膠柱層析以氯仿∶甲醇梯度洗脫進行初步分離，洗脫梯度分別為氯仿∶甲醇＝100∶1(共202mL)，氯仿∶甲醇＝20∶1(共300mL)，氯仿∶甲醇＝9∶1(共200mL)，收集各個餾分，將含有目標化合物-卡莫霉素B的組分合并濃縮；然后采用SephadexLH-20對含有目標化合物的組分進行進一步分離，洗脫溶劑為甲醇，流速為1mL/3分鐘，共用甲醇350mL，收集洗脫液中的各個組分，并將含有目標化合物(卡莫霉素B)的組分合并濃縮；然后再采用聚酰胺薄膜制備(20×20cm，氯仿∶甲醇∶水＝9∶1∶0.5)，收集Rf＝0.65的綠色熒光帶(卡莫霉素B)，甲醇洗脫后濃縮，再用Sephadex LH-20進行柱層析以除去聚酰胺薄膜中的雜質(zhì)，低溫旋轉(zhuǎn)蒸干后真空干燥，得到卡莫霉素B的純品，純度為97.5％，共30mg。
將卡莫霉素B的純品，于50℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，至卡莫霉素B變性降解。將降解后的樣品用少量甲醇溶解，經(jīng)高效TLC板制備(氯仿∶甲醇＝9∶1)，收集Rf＝0.35黃色帶(卡莫霉素C)和Rf＝0.55的暗褐色帶(卡莫霉素D)，用氯仿∶甲醇＝19∶1的溶劑洗脫，室溫旋轉(zhuǎn)蒸干，真空干燥后得到卡莫霉素C的純品，純度為95.3％，共12mg；卡莫霉素D的純品，純度為92.6％，共8mg。
<實施例4>卡莫霉素B、C、D的結(jié)構(gòu)鑒定卡莫霉素B的理化特性見表1。根據(jù)UV(圖1)、IR(圖2)、HR-ESI-MS(圖3)、1H-NMRDMSO-d6為溶劑(圖4)、DMSO-d6+D2O為溶劑(圖5)、13C-NMR DMSO-d6為溶劑(圖6)、DEPT DMSO-d6為溶劑(圖7)數(shù)據(jù)和1H-1H COSY相關譜DMSO-d6為溶劑(圖8)、1H-13C相關譜HSQC DMSO-d6為溶劑(圖9)以及反向檢測遠程1H-13C異核多鍵相關譜HMBCDMSO-d6為溶劑(圖10)的分析結(jié)果，確定了卡莫霉素B的結(jié)構(gòu)。
表1.卡莫霉素B的理化特性

本發(fā)明根據(jù)高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS(圖3)，同時結(jié)合1H-NMR(圖4)、13C-NMR(圖6)和DEPT(圖7)譜，確定了Chemomicin B的分子式為C19H18O6，不飽和度N＝11。通過對1H-NMR(圖4)、13C-NMR(圖6)，DEPT譜(圖7)及HSQC(圖9)譜的綜合分析，ChemomicinB的19個碳信號中有3個羰基信號，8個芳香碳或烯碳信號(其中包括4個次甲基碳，2個季碳，2個含有羥基或羥甲基取代的季碳)，1個含羥基取代的季碳信號，另外還有3個次甲基信號，4個亞甲基信號(其中1個有羥基取代)。3個羥基質(zhì)子信號，化學位移分別為δ11.83(形成氫鍵的酚羥基質(zhì)子)，5.26(2個羥基質(zhì)子)，當加入D2O交換以后這3個質(zhì)子信號消失。
根據(jù)IR譜(圖2)，在3436cm-1有羥基信號，在1646cm-1附近有羰基信號，這與13C-NMR譜(圖6)中的低場羰基信號δ204.1(C-1)，197.0(C-7)，195.1(C-12)相吻合。根據(jù)1H-NMR譜(圖4)中化學位移在7.0～8.0ppm之間的ABX偶合體系，同時結(jié)合HSQC譜(圖9)和1H-1HCOSY譜(圖8)可以確定，C-9，C-10，C-11位上的質(zhì)子化學位移分別為δ7.29，7.74，7.55，碳化學位移分別為δ122.7，136.5，117.6。根據(jù)HMBC譜(圖10)的遠程偶合關系，可以確定C-7a，C-8，C-11a，C-12的位置及化學位移值，由于8-OH質(zhì)子與7-羰基形成分子內(nèi)氫鍵，從而導致7-羰基碳的化學位移向低場位移至δ197.0，可以確定C-7的位置。由于C-8位有-OH取代，化學位移向低場位移至159.8。
根據(jù)1H-NMR譜(圖4)、1H-1HCOSY譜(圖8)和HSQC譜(圖9)的分析，可以確定另外兩大結(jié)構(gòu)片段(如下圖片段I和II)。根據(jù)HMBC譜(圖10)的遠程偶合關系，次甲基質(zhì)子δ3.37(H-12a)與化學位移δ197.0(C-7)、δ195.1(C-12)、δ44.9(C-6a)、δ55.8(C-12b)存在遠程偶合，次甲基質(zhì)子δ3.55(H-12b)與δ71.2(C-4a)，δ55.8(C-12a)，δ44.9(C-6a)存在遠程偶合，可以確定C-12a和C-12b位置，這樣可以把結(jié)構(gòu)片段I跟C環(huán)連接起來。根據(jù)UV譜(圖1)，230nm附近的強吸收峰符合α、β不飽和酮的計算值，推測結(jié)構(gòu)片段II與羰基相連接，這樣確定C-1為羰基。質(zhì)子δ1.45(H-5)與δ20.4(C-6)，δ44.9(C-6a)，δ55.8(C-12b)，δ71.2(C-4a)存在遠程偶合，δ2.28(4-H)與δ120.1(C-2)，δ164.2(C-3)，δ71.2(C-4a)，δ31.1(C-5)，δ55.8(C-12b)，δ63.1(C-13)有遠程偶合，可以推導出結(jié)構(gòu)片段I和II是通過C-4a和C-12b這兩個碳連接起來的，確定了C-4a的位置，這樣把A環(huán)和B環(huán)連接起來。經(jīng)過與Kanglemycin C的文獻資料比較，同時結(jié)合如下圖所示HMBC的研究，確定卡莫霉素B的結(jié)構(gòu)如式(1)所示。
卡莫霉素B在DMSO-d6中的NMR數(shù)據(jù)如表2所示。
表2.卡莫霉素B在DMSO-d6I中的NMR數(shù)據(jù)

1H-NMR(500 M HZ，δin ppm，J in HZ)，13C-NMR(125MHZ，δin ppm)卡莫霉素C的理化特性見3。本發(fā)明根據(jù)UV(圖11)、IR(圖12)、高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS(圖13)，同時結(jié)合1H-NMR(圖15和圖14)、13C-NMR(圖16)和DEPT(圖17)譜，確定了Chemomicin C的分子式為C19H16O6，不飽和度N＝12。通過對1H-NMR(圖14和圖15)、13C-NMR(圖16)，DEPT譜(圖17)及HSQC(圖19)譜的綜合分析，ChemomicinC的19個碳信號中有3個羰基信號，10個芳香碳或烯碳信號(其中包括4個次甲基碳，4個季碳，2個含有羥基或羥甲基取代的季碳)，1個有羥基取代的季碳信號，另外還有1個次甲基信號，4個亞甲基信號(其中1個有羥基取代)。根據(jù)1H-NMR譜，溶劑為DMSO-d6(圖14)，可以觀察到3個羥基質(zhì)子信號，化學位移分別為δ11.91(形成氫鍵的酚羥基質(zhì)子)，5.24(2個羥基質(zhì)子)，在溶劑為CD3OD時(圖15)，這3個質(zhì)子信號消失。
表3.卡莫霉素C的理化特性

由于Chemomicin C是Chemomicin B在50℃加熱后變性降解而來，Chemomicin B脫2個H后變成Chemomicin C。通過與Chemomicin B的DEPT譜(圖7)比較，發(fā)現(xiàn)在化學位移為40.0～50.0ppm之間少了2個次甲基碳信號，而在140.0～150.0ppm之間多了2個芳香季碳信號，由此提示，所脫的2個H位于2個次甲基碳上，脫H后形成雙鍵。根據(jù)1H-1HCOSY譜(圖18)，推測出所脫的2個H位于C-6a和C-12a上，結(jié)合下圖所示。HMBC譜(圖20)的研究，綜合比較Chemomicin B與Chemomicin C的光譜學數(shù)據(jù)，確定卡莫霉素C的結(jié)構(gòu)如式(2)所示。

卡莫霉素C在CD3ODI和DMSO-d6II中的NMR數(shù)據(jù)如表4所示。
表4.卡莫霉素C在CD3OD(I)和DMSO-d6(II)中的NMR數(shù)據(jù)

1H-NMR(500MHz，δin ppm，J in Hz)，13C-NMR(125MHz，δin ppm)卡莫霉素D的理化特性見表5。本發(fā)明根據(jù)UV(圖21)、IR(圖22)、高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS(圖23)，同時結(jié)合1H-NMR(圖24)、13C-NMR(圖25)及DEPT(圖26)譜，確定了Chemomicin D的分子式為C19H14O5，計算得到其不飽和度N＝13。通過對1H-NMR(圖24)、13C-NMR(圖25)、DEPT譜(圖26)及HSQC(圖28)譜的綜合分析，ChemomicinD的19個碳信號中有2個低場的羰基信號，14個芳香碳信號(其中包括5個次甲基碳，6個季碳，3個含有羥基或羥甲基的季碳)，3個亞甲基信號(其中1個有羥基取代)。
表5.卡莫霉素D的理化特性

由于Chemomicin D是Chemomicin C在50℃加熱后變性降解而來，Chemomicin C脫水后變成Chemomicin D。根據(jù)13C-NMR譜(圖25)和DEPT譜(圖26)，同時與ChemomicinC的光譜學數(shù)據(jù)進行比較，發(fā)現(xiàn)少了1個位于低場δ190.0～200.0ppm的羰基碳信號，1個位于δ40.0～50.0ppm的亞甲基信號，1個位于δ50.0～60.0ppm的次甲基信和1個位于δ60.0～80.0ppm的有羥基取代的季碳信號，而在δ110.0～160.0ppm多增加了4個芳香碳信號。在1H-NMR譜(圖24)中，δ6.74(H-2，H-4)出現(xiàn)了2個芳香質(zhì)子信號，δ6.0附近的烯碳質(zhì)子信號消失。由此可以確定，4a-與12b-之間脫水后，A環(huán)形成一個芳香環(huán)。與ChemomicinC的化學結(jié)構(gòu)比較，C-1的羰基變成-OH取代，C-4亞甲基變成芳香次甲基，結(jié)合下圖所示1H-1HCOSY譜(圖27)和HMBC譜(圖29)和，確定卡莫霉素D的結(jié)構(gòu)如式(3)所示。

卡莫霉素D在CD3OD中的NMR數(shù)據(jù)如表6所示。
表6.卡莫霉素D在CD3OD中的NMR數(shù)據(jù)

1H-NMR(500MHz，δinppm，J in Hz)，13C-NMR(125MHz，δin ppm)實施例5卡莫霉素B、C、D的生物學活性實驗采用MTT法進行體外抗腫瘤活性試驗，選用的細胞株為人食道癌細胞KYSE150。具體操作步驟是，將以上實施例所得卡莫霉素B、C、D分別溶解在DMSO中，濃度范圍為0.08ug/ml-10.0ug/ml，將處于對數(shù)生長期的人食道癌細胞KYSE150經(jīng)0.125％的胰酶消化，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋細胞至5000個/孔。腫瘤細胞中加入待測樣品，37℃，5％的CO2培養(yǎng)3天，每孔加入MTT 20ul，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時，吸出孔內(nèi)100ul培養(yǎng)液后，加入10％酸化SDS液(100ul/孔)，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。在酶標儀檢測各孔吸光度值(OD值，檢測波長570納米)。實驗結(jié)果表明，卡莫霉素B、C、D對人食道癌細胞KYSE150的IC50分別為0.49ug/ml、0.76ug/ml、0.33ug/ml，均顯示出很強的抑瘤活性，不同藥物濃度對人食道癌細胞KYSE150的抑制率如表7所示。
表7.不同濃度卡莫霉素B、C、D對人食道癌細胞KYSE150的抑制率

權(quán)利要求
1.一組新抗生素卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)，其結(jié)構(gòu)如式(1)、(2)、(3)所示
2.制備如權(quán)利要求1所述卡莫霉素B、C、D的方法，其特征是所說方法包括以下步驟1)卡莫霉素B、C、D的發(fā)酵培養(yǎng)；2)卡莫霉素B、C、D的提取分離；3)卡莫霉素B、C、D的結(jié)構(gòu)鑒定。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)系將生長于斜面的諾卡氏菌地中?？禈纷冎?747-64菌(保藏編號為CGMCC No.1554)接種于種子培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在往復振蕩搖床上培養(yǎng)，收獲發(fā)酵液。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是提取分離系在發(fā)酵培養(yǎng)液中，加入弱酸如2N的鹽酸，抽濾除去菌絲，得到上清液，再用非極性有機溶劑如乙酸乙酯或丙酮萃取，減壓濃縮得到浸膏；浸膏先經(jīng)硅膠柱層析，然后用Sephadex LH-20對含有目標化合物的組分進一步分離，洗脫溶劑采用甲醇；最后用聚酰胺薄膜進行制備，甲醇洗脫，4度下減壓濃縮蒸干，得到白色粉末目標化合物卡莫霉素B；將經(jīng)聚酰胺薄膜分離得到的卡莫霉素B純品用少量甲醇溶解，然后加入少量水，于50C下加熱48小時變性降解，經(jīng)高效薄層板制備，得到目標化合物卡莫霉素C和D。
5.如權(quán)利要求2或4所述的制備方法，其特征是結(jié)構(gòu)鑒定系根據(jù)UV、IR、HR-MS、分子式、1H-NMR、13C-NMR、DEPT數(shù)據(jù)測試和1H-1H相關譜、1H-13C相關譜以及反向檢測遠程1H-13C異核多鍵相關譜的分析，確定目標化合物卡莫霉素B、C、D的結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求1所述卡莫霉素B、C、D的藥物組合物，其特征是所說組合物系以卡莫霉素B、C、D為有效成分，分別與一種或多種藥學上可接受的載體所組成。
7.權(quán)利要求1所述卡莫霉素B、C、D在制備抗腫瘤藥物中的應用。
8.權(quán)利要求6所述組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組新化合物卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)及其制備方法、以卡莫霉素B、C、D為活性成分的藥物組合物以及卡莫霉素B、C、D在制備抗腫瘤藥物中的應用，所說卡莫霉素B、C、D是由諾卡氏菌地中?？禈纷冎?747－64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747－64)培養(yǎng)物中分離得到的新角蒽環(huán)類抗生素(Angucyclinone)，體外活性實驗結(jié)果證明，卡莫霉素B、C、D對人食道癌細胞KYSE150有很強的抑制活性，作為一種新的抗腫瘤藥物，具有良好的開發(fā)前景。
文檔編號C12R1/365GK101054403SQ200710111280
公開日2007年10月17日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者孫承航, 汪月, 周建琴, 金文藻, 何琪楊, 韓寧寧, 高紅, 趙立勛 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所