專利名稱：血清白蛋白與干擾素的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，特別是血清白蛋白與干擾素的融合蛋白。
背景技術(shù)：
血清白蛋白是血漿的重要成份，也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，正常情況 下不易透過腎小球。人血清白蛋白(序列l(wèi))是一種585個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì) (A. Dugaiczyk et al.,PNAS,1982 79:71-75)，其分子量約為66.5KD，血漿半衰期長達(dá)2 周以上。
人血清白蛋白(HSA)在細(xì)胞中是以一種含18個氨基酸殘基的信號肽和6個前肽的 原肽形式合成的，信號肽和前肽在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過程被切除。人血清白蛋白已成功地 在多種宿主中表達(dá)(EP330451和EP361991)。
干擾素(IFN)分為I型和II型，人I型干擾素主要包括，IFNa和IFNP，兩者共 用一種受體一IFNa/p受體，II型干擾素主要為IFNY。 IFNci分為多種亞型，如IFN a2a、 IFNa2b、 IFNalb等，有人根據(jù)這些亞型的特點設(shè)計了共有干擾素IFN a con (consensus interferon)。各型干擾素的氨基酸序列在孫衛(wèi)民等編著的《細(xì)胞因 子研究方法學(xué)》(人民衛(wèi)生出版社，1999， p541-576)和吳梧桐等編著的《基因工程藥 物一基礎(chǔ)與臨床》(人民衛(wèi)生出版社，1992， pl54-164)有詳細(xì)敘述。天然的IFN a 由白細(xì)胞產(chǎn)生，由165至166個氨基酸組成，有2對二硫鍵，(C1-C98,C29-C138或 C1-C99，C29-C139)，天然的IFN 0由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，由166個氨基酸組成，有l(wèi)對 二硫鍵，(C31-C141)，天然的IFNy由127至143個氨基酸組成，沒有二硫鍵。I型干 擾素(包括IFNci和IFNP)的生物活性基本相同，主要包括抗病毒、抗細(xì)胞增殖和 免疫調(diào)節(jié)作用，臨床上可用于治療病毒性肝炎(包括乙型肝炎、丙型肝炎等)、腫瘤、 多發(fā)性硬化癥等，II型干擾素抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)，抗病毒能力較弱。臨 床上可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性肉芽腫等疾病，現(xiàn)在用于治療的rMFN主要是由 大腸桿菌表達(dá)的。
由于IFN分子量較小，易被腎小球濾過，因而臨床應(yīng)用時，血漿半衰期較短，一 般需要大劑量頻繁用藥，如每周2-3次，而IFN治療肝炎、腫瘤、多發(fā)性硬化癥、類 風(fēng)濕等疾病時，治療周期常常長達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年，這種長期大劑量頻繁用藥不僅增加
了病人的痛苦和治療費(fèi)用，而且易產(chǎn)生毒副反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種集血清白蛋白與干擾素的特性為一體的血清白蛋白與 干擾素融合蛋白。
本發(fā)明的血清白蛋白與干擾素的融合蛋白，包括與人血清白蛋白至少85%序列同 源的第一區(qū)和與人干擾素至少85%序列同源的第二區(qū)。
其中優(yōu)選的是包括與人血清白蛋白至少95%序列同源的第一區(qū)和與人干^^素至 少95%序列同源的第二區(qū)。
最優(yōu)選的是包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人干擾素氨 基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨 基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
在本發(fā)明的融合蛋白中，可以是與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的 N-末端，與人干擾素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C-末端；也可以是與人干擾素同源 的第二區(qū)位于融合蛋白的N-末端，與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C-末端，但前一種情況的基因在酵母中的表達(dá)較高。
為了使融合蛋白兩部分間有較大的間隔，使干擾素部分最大可能地與干擾素受體 結(jié)合，所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)與人干擾素同源的第二區(qū)之間設(shè)有連接肽， 所述連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n， n為1-10的整數(shù)；其中，優(yōu)選的是n為l誦3
的整數(shù)。
本發(fā)明的干擾素可以是IFNa 、 IFNP ，也可以是IFNY，當(dāng)干擾素是IFNa時，
可以是IFNa2a， IFNalb, IFNa 2b或共有干擾素IFN a con。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。 包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人干擾素氨基酸殘基序
列相同的第二區(qū)的融合蛋白的DNA序列。其中第一區(qū)與人血清白蛋白氨基酸殘基序
列相同，第二區(qū)與人千擾素氨基酸殘基序列相同，中間設(shè)有GlyGlyGlyGlySer連接肽
的融合蛋白。
本發(fā)明的又一個目的是提供攜帶編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括pHIL-D2HSAIFN質(zhì)粒、PD3HSAIFN0質(zhì)粒、 PD3HSAIFN2質(zhì)粒、pPIC9IFN-HSA質(zhì)粒等。
本發(fā)明的再一個目的是提供表達(dá)本發(fā)明融合蛋白編碼基因的宿主。 本發(fā)明的宿主可以是被重組表達(dá)載體或重組表達(dá)載體的一部分轉(zhuǎn)化，含有本發(fā)明 融合蛋白編碼基因的細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞；其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選
的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是畢赤酵母GS115。
本發(fā)明將白蛋白分子，或其至少85%序列同源的類似物與干擾素，或其至少85% 序列同源的類似物融合，所形成的融合蛋白既保留了與干擾素受體結(jié)合的活性，同時 與干擾素相比，其血漿半衰期又得到了延長。本發(fā)明的融合蛋白既可以保留激活干擾 素受體的活性，作為該受體的激動劑，制造成干擾素類藥物，也可以僅保留與該受體 結(jié)合的活性，作為該受體的抑制劑，制造成用于治療某些與干擾素或其受體過量表達(dá) 有關(guān)疾病的藥物。
人血清白蛋白天然存在多態(tài)性，本發(fā)明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括這 些多態(tài)型。
編碼HSA的多聚核苷酸和編碼MFN的多聚核苷酸可以用本領(lǐng)域周知的方法，如 PCR (Saiki等Science. 239:487-491， 1988)、 RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩 選cDNA文庫的方法等獲得，用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫的mRNA或cDNA 可以來源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞、及文庫等，如從人肝胎cDNA 文庫(購自Clontech Laboratories Inc. USA)獲得。也可以用人工合成的方法獲得，人工 合成時可選用宿主偏愛的密碼子，這樣往往可以提高產(chǎn)物的表達(dá)。編碼IFNa(包括IFN a lb、 IFNa 2b、 IFNa 2a等)的多聚核苷酸可以用RT-PCR的方法從用新城雞瘟病毒 誘導(dǎo)的人外周血白細(xì)胞的RNA制品中獲得，編碼IFNa con的多聚核苷酸可以用人工 合成的方法獲得，編碼IFNe的多聚核苷酸可以用RT-PCR的方法從用干擾素、聚肌 胞、放線菌酮和放線菌素誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞的RNA制品 中獲得。若需要可用本領(lǐng)域公知的方法對多聚核苷酸進(jìn)行突變、缺失、插入、和與其 它多聚核苷酸連接等。編碼HSA和編碼hIFN的多聚核苷酸的融合，在保持各自閱讀 框架不變的前提下，可以用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過PCR的方法，在編碼序 列的兩側(cè)引入限制性內(nèi)切酶識別位點，通過酶切產(chǎn)生粘性末端，編碼HSA和編碼hIFN 的多聚核苷酸的粘性末端用DNA連接酶連接，從而獲得編碼融合蛋白的基因。如果 需要可在本發(fā)明的編碼融合蛋白基因的兩側(cè)引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有 限制性內(nèi)切酶識別位點?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到 各種表達(dá)載體中去。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過程見J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分 子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)的敘述。
許多表達(dá)載體和其對應(yīng)的宿主可以從公司購得，如酵母表達(dá)載體PHIL-D2 ，
pPIC9， pHIL-S, (Invitrogen Corp. San Diego. California. USA),動物細(xì)胞表達(dá)載體 pSVK3、 pMSG (Amersham Pharmacia Biotech Inc.US A)等。優(yōu)選的方法是將編碼本 發(fā)明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表達(dá)載體pHIL-D2 ， pPIC9等，這些質(zhì)粒 為酵母整合型質(zhì)粒，帶有His4選擇性標(biāo)記。醇氧化酶操縱子(AOX1) 5'序列和3'序 列，用于方便編碼基因整合至酵母染色體，和控制編碼基因的表達(dá)。這些質(zhì)粒及對應(yīng) 的宿主菌等可以從Invitrogen Co卬.San Diego. California. USA構(gòu)得，優(yōu)選的啟動子為 AOXl。
表達(dá)融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌、動物、植物等。融合蛋 白或多肽可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來，優(yōu)選的，是從宿主中 分泌出來。分泌所用的信號肽，優(yōu)選的是天然的人血清白蛋白的信號肽，或酵母MF ci信號肽，或這兩種信號肽的類似物。更優(yōu)選的用天然的人血清白蛋白的信號肽，用 該信號肽時融合蛋白表達(dá)水平較高。融合蛋白或多肽也可以不用信號肽，而在酵母中 以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒 形式存在。
轉(zhuǎn)化所需核酸至宿主細(xì)胞中去可用通常的方法，如電穿孔，制備感受態(tài)的原生
質(zhì)球等。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可通過人們熟知的技 術(shù)加以鑒定，如細(xì)胞經(jīng)收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鑒定?；蛘?，細(xì)胞培 養(yǎng)上清中或細(xì)胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗IFN的抗體檢測。
可以通過培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主，如重組酵母、重組哺乳動物細(xì)胞、 重組細(xì)菌、轉(zhuǎn)基因動植物等，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法，可以用搖瓶 或生物反應(yīng)器等，生產(chǎn)時優(yōu)選的為生物反應(yīng)器。培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體(或細(xì)胞)生長 和產(chǎn)物表達(dá)所需的物質(zhì)，應(yīng)包含氮源、碳源、pH緩沖成分等，培養(yǎng)基配方一般應(yīng)根 據(jù)不同培養(yǎng)對象，通過試驗獲得。培養(yǎng)可分兩個階段，第一階段主要用于菌體(或細(xì) 胞)的生長，第二階段主要用于合成產(chǎn)物。
可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離、純 化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層 析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。
本發(fā)明中的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形 式的鹽、修飾產(chǎn)物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進(jìn)行修飾。所用修飾 劑可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本發(fā)明中的融合蛋白及其衍生物可單獨(dú)使用，優(yōu)選的為與一個或多個藥學(xué)上可接 受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應(yīng)與融合蛋白相容且不能對受體自身有 害，典型的載體為水、鹽水、糖類、醇類或氨基酸，它們需無菌且無致熱原。藥物制 劑可以單位劑量的形式存在，并可通過任何本領(lǐng)域已知的方法制備。這些方法包括將
融合蛋白與具有一種或多種輔助成分混合的步驟。優(yōu)選的藥物制劑包括含水的液體制 劑和含水量低于10%或不含水的凍干制劑。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類，小分子 糖類等，使藥物的滲透性與受體血液中的滲透性相等或相似。藥物制劑可存在于單元 劑量或多劑量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。凍干制劑是將液體制劑冷 凍干燥制備的，使用前加入無菌、無熱原的液態(tài)載體，如注射用水。
優(yōu)選的單元劑量包括有融合蛋白的日用劑量或單元日用劑量或其適當(dāng)?shù)膩喎帧?br> 本發(fā)明中的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物可以通過任何已知的方法，包括 注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入、口服等方法給藥。優(yōu)選的方法為靜 脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。
本發(fā)明的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物，作為干擾素類藥物可用于治療可 用干擾素或其類似物治療的疾病，如病毒性肝炎(包括乙型、丙型肝炎等)、腫瘤(包 括白血病、 一些實體瘤等)、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕等。作為干擾素抑制劑可用于治 療與干擾素或其受體過量表達(dá)有關(guān)的疾病，如變態(tài)反應(yīng)等。
使用劑量可通過融合蛋白相對于IFN的效價計算出，同時考慮融合蛋白相對于天 然IFN延長的半衰期。典型用量為1X103—1 X106 U/kg。在由全長HSA和全長IFN 融合蛋白中，按照摩爾數(shù)相當(dāng)即意味著使用較大重量的融合蛋白，但使用頻率可降低， 如一周一次或更少。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為pHIL-D2HSAIFN質(zhì)粒的構(gòu)建，
圖2為pD3HSAIFN0質(zhì)粒的構(gòu)建
圖3為pD3HSAIFN2質(zhì)粒的構(gòu)建
圖4為pPIC9IFN-HSA質(zhì)粒構(gòu)建
圖5為純化的融合蛋白的SDS-PAGE分析
圖6為融合蛋白的抗病毒活性
圖7為融合蛋白酶聯(lián)免疫分析
圖8為HSA/IFN和rhIFN在小鼠血漿中的代謝，
其中l(wèi):HSA/IFNa2b 2: HSA/IFN卩3:IFNa2b 4: IFN卩
具體實施例方式
實施例l: HSAcDNA的克隆
用PCR方法從人肝胎cDNA文庫(購自Clontech Laboratories Inc. USA)獲得帶有 信號肽和前肽編碼序列的HSAcDNA，所用的引物HSA1和HSA2用寡聚核苷酸合成 儀合成，其中引物HSA2除包括HSA基因的3，末端序列外，還在其3，末端后加入了 編碼GlyGlyGlyGlySer接頭肽的序列。
HSA1: 5， GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3， HSA2: 5， TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3， PCR條件為100|al反應(yīng)體系中，加入lpl人肝胎cDNA文庫，20^imol/L的HSA1 和HSA2引物各3nl， 2mmol/L的dNTP, 10(il ， 10X反應(yīng)緩沖液lOpl， TaqplusIDNA 聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為94。C變性1分鐘，52°C 退火1分鐘，72'C延伸3分鐘，35個循環(huán)后，再72'C延伸10分鐘。通過凝膠電泳分 析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(1.8KD)的條帶，PCR產(chǎn)物電泳純化，用DNA片段回收 試劑盒回收純化約1.8KD的目標(biāo)帶(實驗中的TaqplusI DNA聚合酶、內(nèi)切酶、連接 酶、試劑盒等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù) 有限公司)。取純化的HSA cDNA 6^1 ，加入1 ^ pGEM-T載化，8pl 2X緩沖液，1 |il T4DNA連接酶(pGEM-T載體、緩沖液和酶為Promega Corp.USA產(chǎn)品)，15'C反應(yīng) 過夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司〉。轉(zhuǎn) 化菌輔于含x-gal和IPTG和氨芐青霉素(50jig/ml)的LB瓊脂平皿上，37。C培養(yǎng)過 夜。挑取白色菌落，接種至3ml含氨芐青霉素(50pg/ni1)的LB培養(yǎng)基，37匸培養(yǎng)過 夜，用常規(guī)方法抽提質(zhì)粒，用PstI酶切，(在載體上和HSAcDNA上各有PstI酶切位 點)，電泳分析鑒定陽性克隆。從pGEM-T載體的多克隆位點兩端分別測序，并合成 兩個測序引物
HSA3: 5'GCCAGAAGACATCCTTAC3' HSA4: 5'AGTTGGAGTAGACACTTG3，
從兩端中部接著測序，完成HSAcDNA全長測序。獲得了含有序列正確的HSA cDNA的克隆，JM109 (pGEMT-HSA)，這里克隆的HSAcDNA含有其天然的信號肽 和前肽部分的編碼序列，以便于在表達(dá)時，直接利用其信號肽和前肽用于作為分泌信 號，同時在HSA cDNA的c末端添加了接頭肽GlyGlyGlyGlySer的編碼序列。
實施例2: IFNa的cDNA克隆
取正常人外周血加分離淋巴細(xì)胞分層液，分離人白細(xì)胞，用含5 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，加新城雞瘟病毒后37'C培養(yǎng)1小時，離心棄上清，重新加入培養(yǎng)基，37'C， 5%0)2培養(yǎng)18小時。用RNA提取試劑盒分離總RNA，用通用RT-PCR試劑盒(這 兩個試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，具體操作按說明書進(jìn)行)獲 得逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，通過PCR方法獲得IFNa的cDNA。所用的引物隨所需克隆的IFNa 亞型的不同略有不同，如克隆IFNa2b、 IFNa2a,其引物可用
工FNa2b-l: 5，-一 ATGGATCC TGT GAT CTC CCT CAA ACC CAC AG—-3，
IFN a 2b-2: 5，--- ATGAATTC TTA TTC CTT ACT CCT TM TCT TTC TTG---3，
克隆IFNa lb,其引物可用
工FNa lb-1: 5，-一 ATGGATCC TGT GAT CTC CCT GAG ACC CAC AG -—3,
IFN a lb-2: 5，--- ATGMTTC TTA TTC CTT CCT CCT TAA TCT TTC TTG ---3'
PCR方法為
lOOpl反應(yīng)體系中加入1^1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，20^raol/L的IFNa2b-1、 IFNa2b -2 (或IFNalb-1、 I.FNalb -2)引物各3|il , 2mmol/L的dNTP， 10^1 ， 10X反應(yīng)緩 沖液lOjal， pfuDNA聚合酶5U， ( dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海生物 工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR儀，PCR條件為94°C 變性1分鐘，52。C退火30秒，72'C延伸1.5分鐘，循環(huán)35次。通過凝膠電泳分析反 應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(約0.5kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化 回收。用BamH I和EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶 解的pUC19質(zhì)粒上(實驗中的pfu酶、內(nèi)切酶、連接酶、pUC19質(zhì)粒、試劑盒等購自 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌JM109,每種PCR產(chǎn)物挑選若千克隆，純化質(zhì)粒，BamHI—EcoRI區(qū)DNA測序， 挑選其編碼的氨基酸序列分別含有IFNoclb、 IFNa2b、 IFNa2a序列的克隆，分別命名 為pUC-IFNcdb、 pUC-IFNot2b、 pUC-IFNcc2a等。其它亞型的IFNa的cD隱可用相似的 方法克隆，共有千擾素的基因可用人工合成的方法獲得。 實施例3: IFNP的cDNA克隆
人羊膜細(xì)胞(Wish細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供)用含10%小牛血清的1640培 養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿瓶底，棄培養(yǎng)基，加含100U/ml IFN，和10%小牛血清的1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16小時，棄培養(yǎng)基。加入含50iig/ml聚肌胞苷酸，和10ug/ml放線 菌酮的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4小時，再加放線菌素D 1 y g/ml，培養(yǎng)5小時。棄上清， 用胰酶消化后，收集細(xì)胞，用RNA提取試劑盒分離總RNA，用通用RT-PCR試劑盒(這 兩個試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，具體操作按說明書進(jìn)行)獲 得逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，通過PCR的方法獲得IFN P的cDNA，其引物可用
IFN 3 -l: 5 'ATGGATCC ATG AGC TAC AAC TTG CTT GGA3' IFN 5 -2: 5 ，ATGAATTC TTA GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG TC3' PCR和克隆方法同實施例2，獲得的克隆BamHI—EcoRI區(qū)DNA測序，挑選其 編碼的氨基酸序列與IFNe序列的克隆，命名為pUC-IFNp。
實施例4:連接肽為GlyGlyGlyGlySer時本發(fā)明融合蛋白的表達(dá) 如圖1所示，為了將HSA與IFN以融合蛋白形式從畢赤酵母分泌表達(dá)，選擇 pHIL-D2質(zhì)粒作為載體(Invitrogen Corp. USA)。在該載體AOX啟動子下游NspV與 EcoRI位點間插入HSA/IFN基因，因pHIL-D2載體上有兩個NspV位點，為了方便操 作，首先pHIL-D2載體用Clal/Sal酶切成3段，回收4kb片段，自身連接后命名為pD3 載體。pD3載體用NspV/EcoRI切，回收線性化載體，將實施例2、 3構(gòu)建的pUC19-IFN a lb、 pUC19-IFN a 2b、 pUC19-IFN a 2a和pUC19-IFN e分別用BamHI/EcoRI切，回 收約0.5kb的含IFN的cDNA的片段，將實施例1構(gòu)建的pGEMT -HSA用 NspV/BamHI切，回收約1.8kb的含HSA cDNA的片段，將線性化pD3載體與含HSA cDNA和各含IFN cDNA的片段分別用T4連接酶催化連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109， 挑選陽性克隆，用NspV/EcoRI和NspV/ BamHI酶切鑒定，獲得陽性克隆大腸桿菌 JM109 (pD3HSAIFNa lb)、大腸桿菌JM109 (pD3HSAIFN a 2b)、大腸桿菌JM109 (pD3HSA IFNa2a)和大腸桿菌JM109 (pD3HSA IFNP )。上述克隆分別培養(yǎng)擴(kuò)增 后，純化質(zhì)粒，用Clal/Scal切，電泳回收線性化的約6.3kb片段，pHIL-D2空載體用 Clal/Scal切,回收約4.2kb的片段。將pHIL-D2的4.2kb片段分別與上述含HSA和各 種IFN基因的6.3kb片段用T4連接酶催化連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后， 輔于含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB瓊脂平皿，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定， 獲得克隆大腸桿菌JM109(pHIL-D2HSAIFN a lb)，大腸桿菌JM109(pHIL-D2HSAIFN a 2b)、大腸桿菌JM109 (pHIL-D2HSAIFN a 2a)和大腸桿菌JM109 (pHIL-D2HSAIFN 3 )。這些質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖1所示(其中IFN表示IFNa lb、 IFNa 2b、 IFNP等 各型和各亞型干擾素)。這些克隆分別培養(yǎng)擴(kuò)增后，各純化質(zhì)粒約10pg,用NotI醇切。 線性化后分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 (酵母表達(dá)試劑盒由Invitrogen Corp. USA提供)， 轉(zhuǎn)化后的GS115，分別輔于含山梨醇的RDB瓊脂1.5%瓊脂，lmol/L山梨醇，1%葡 萄糖，4X10^/。生物素，1.34%無氨基酸酵母氮源(YNB， DifcoCorp.) ,0.005%氨基 酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸各0.005%)平皿，37°。培 養(yǎng)1-2周，挑取His+克隆。接種至裝有25m舊MGY培養(yǎng)基(100mmol/L磷酸鉀，pH6.0， 4Xl(T"/。生物素，1.34%無氨基酸酵母氮源，1%甘油)300ml三角瓶，250轉(zhuǎn)/分鐘30 。C培養(yǎng)48小時，加甲醇0.5。/。/24h，誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，離心取上清，過濾除菌。用細(xì)胞 病變抑制法測定培養(yǎng)上清中干擾素的活性(方法見《中國生物制品規(guī)程》2000版，中
國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會編，化學(xué)工業(yè)出版社2000.6， p373-375)。人羊膜細(xì)胞(Wish 細(xì)胞)培養(yǎng)于含10。/。小牛血清的MEM培養(yǎng)基中、每周傳代2次(用前用胰酶消化， 用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基配成，2.5-3.5Xl()S個細(xì)胞/ml)。接種于96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，每孔100ul， 37°C， 5%0)2培養(yǎng)4-6小時。在另一 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每 孔加入150 y 1測定培養(yǎng)液(含7%小牛血清的MEM培養(yǎng)基)，樣品作2倍梯度稀釋， 每孔100yl樣品稀釋液轉(zhuǎn)移至加有細(xì)胞的培養(yǎng)板中，37°C， 5%0)2培養(yǎng)18-24小時,棄 上清，加入用含3 %小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋至100TCID5Q的VSV病毒(水泡口 炎病毒)，每孔100 lU， 37°C， 5°化02培養(yǎng)24小時，棄上清，每孔加入50 lU染色液(50mg 結(jié)晶紫溶于20%乙醇)，室溫放置30分鐘，流水小心沖去染色液，吸干殘留水分，每 孔加入100ul脫色液(0.1%乙酸、50%乙醇)，室溫放置5分鐘，測定其在570nm的 吸光度值。在同一稀釋度，吸光度高的克隆即是高表達(dá)克隆。得到的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 分析，分子量正確，酶聯(lián)免疫分析證明其具有血清白蛋白和干擾素的特性，活性分析 證明具有干擾素抗病毒的活性。
實施例5: IFN/HSA融合蛋白的表達(dá)
用實施例2制備的人外周血白細(xì)胞cDNA，通過PCR方法獲得IFN ct的cDNA。 所用的引物隨所需克隆的IFNa的亞型的不同略有不同，如克隆IFNa2b, IFNa2a， 其引物可用
IFN a 2b陽3: 5，ATGTCGAC CTCGAG AAA AGA TGT GAT CTC CCT CAA ACC CAC AG3，
IFNa 2b-4: 5，ATGGATCCACC ACC GCC TTC C TT ACT CCT TAA TCT TTC TTG3，
克隆IFNdlb,其引物可用
IFN a lb-3: 5， ATGTCGAC CTCGAG AAA AGA TGT GAT CTC CCT GAG ACC CAC AG 3"
IFN cc lb -4: 5， AT—GGATCCACC ACC GCC TTC CTT CCT CCT TAA TCT TTC TTG3
其它亞型的IFNa的cDNA可用相似的方法克隆，共有干擾素的基因可用人工合 成的方法獲得。
用實施例3逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過PCR方法獲得IFN 0的cDNA。 其引物可用
IFN P -3: 5，-- ATGTCGAC CTCGAG AAA AGA ATG AGC TAC AAC TTG CTT GGA3，
,3 -4: 5，—- ATGGATCCACC ACC GCC GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG
TC3'
引物用寡聚核苷酸合成儀合成。PCR方法同實施例1 ， PCR擴(kuò)增后，在cDNA 的5'-端引入一個Sal I位點和一個Xho I位點，同時在Xho I位點下游引人了 KEX2 酶切位點，用以切除表達(dá)的融合蛋白的信號肽，3'-端引入BamHI位點。PCR產(chǎn)物電
泳純化后，克隆到用SalI/Bamffl酶解的pUC19 (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公 司)質(zhì)粒上，形成pUC-IFNa2b2、 pUC-IFNalb2、 pUC-IFNP2等。DNA測序結(jié)果 表明這些克隆分別含有編碼IFN a 2b、 IFNa lb和IFNP的序列，只是在其5'-端加入 了SalI位點、Xhol位點、KEX2酶切位點，和3'—端去除了終止密碼子，加入了編 碼柔性接頭的寡聚核苷酸，及BamHI位點。
用PCR的方法從人肝胎cDNA文庫(購自Clontech Laboratories Inc. USA)獲得 HSAcDNA，所用的引物HSA5和HSA6用寡聚核苷酸合成儀合成 HSA5: 5 ，一 TAGGATCC GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT—3' HSA6: 5，一 ATGAATTC TTAAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC—3 ， PCR方法同實施例1 ， PCR產(chǎn)物電泳純化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pUC19 (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)質(zhì)粒上，形成pUCHSA2。 DNA測序結(jié)果表 明此克隆序列和HSA成熟肽的編碼序列相同，只是在其5'-端加入了 BamHI位點， 和3'—端終止密碼子后加入EcoRI位點。
選擇pPIC9質(zhì)粒作為酵母表達(dá)載體(Invitrogen Corp. USA)。在該載體AOX啟動 子下游Xhol與EcoRI位點間插入IFN/HSA基因。將上面構(gòu)建的pUC-IFNa 2b2、 pUC-IFN ct lb2、pUC-IFN P 2等質(zhì)粒用XhoI/BamHI切，分別回收0.5kb的含IFN cDNA 的片段；將pUCHSA2用BamHI/EcoR I切，回收約1.8kb的含HSA cDNA的片段； 將pPIC9質(zhì)粒用XhoI/EcoRI酶切，回收線性化片段,將各種IFN eDNA分別與含HSA cDNA的片段和線性化的pPIC9載體用T4DNA連接酶催化連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109， 挑選陽性克隆，分別用XhoI/BamHI和BamH工/EcoK I酶切鑒定，獲得陽性克隆大腸桿 菌J1109 (pPIC9 IFNa2b HSA)、大腸桿菌J1109 (pPIC9 IFNa lb HSA)、大腸桿菌 JM109 (pPIC9 IFNPHSA)。各克隆擴(kuò)增后，純化質(zhì)粒，用BglII酶切線性化后，轉(zhuǎn)化 畢赤酵母GS115 (Invitrogen Corp. USA公司酵母表達(dá)試劑盒提供的方法)，轉(zhuǎn)化后 的GS115，輔于含山梨醇的RDB瓊脂平皿(配方同實施例3)， 37"C培養(yǎng)l-2周，挑取 His+克隆。搖瓶培養(yǎng)和表達(dá)菌株篩選方法同實施例3，工程酵母的培養(yǎng)、產(chǎn)物純化、 IFN活性測定、HSA抗原性測定方法同實施例7 。結(jié)果表明表達(dá)的IFN/HSA融合蛋白 有刺激IFN活性和HSA的抗原性。
實施例6:不同接頭HSA/IFN融合蛋白的表達(dá)
將實施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pD3HSAIFN a lb、 pD3HSAIFN a 2b、 pD3HSAIFN a 2a、 pD3HSAIFN0等分別用BamH I/Stu I雙酶切，回收大片段，用綠豆芽核酸酶處理，切 除突出末端，T4D息連結(jié)酶平端連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌，挑選陽性克隆，酶切 鑒定，獲得帶有在HSAcDNA末端缺失CTT (亮氨酸)后與各IFN cDNA直接融合基因的質(zhì)
粒pD3HSAIFN a lb0、 pD3HSAIFN a 2b0、 pD3HSAIFN a 2a0、 pD3HSAIF駒等
同樣，在HSA和IFN可以加入多種柔性接頭，如[Gly Gly Gly Gly Ser]n， n可以 是I-IO。
如用[Gly Gly Gly Gly Ser]2作為接頭時，可用合成寡聚核苷酸 L2a:5， CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTG 3， L2b:5， GATCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG 3， 如用[Gly Gly Gly Gly SerL作為接頭時，可用合成寡聚核苷酸 L3a:5， CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGCG 3， L3b: 5， GATCCGCCGCCACCGGAGCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCMGG3， 將實施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pD3HSAIFNa lb、 pD3HSAIFNa 2b、 pD3HSAIFN0 ，分別 用BamH I/Stu I雙酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L2a與L2b退火后與回收的大片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆，酶切鑒定，獲得帶有在HSAcDNA末端與 各IFN cDNA間插入編碼[Gly Gly Gly Gly Ser]2柔性接頭的寡聚核苷酸的質(zhì)粒 pD3HSAIFNa lb2、 pD3HSAIFNa 2b2、 pD3HSAIFNa 2a2、 pD3HSAIFNP 2等(其步驟如圖 2所示)。
同樣將實施例4中構(gòu)建的質(zhì)粒pD3HSAIFN ct lb、 pD3HSAIFN a 2b、 pD3HSAIFN a 2a、 pD3HSAIFNP，分別用BamH I/Stu I雙酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L3a與L3b 退火后與回收的大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆，酶切鑒定， 獲得帶有在HSAcDNA末端與IFN cDNA間插入編碼[Gly Gly Gly Gly Ser]3柔性接頭 的寡聚核苷酸的質(zhì)粒pD3HSAIFN a lb3、 pD3HSAIFN a 2b3、 pD3HSAIFN a 2a3、 pD3HSAIFN 0 3等。可用相似的方法改造實施例5構(gòu)建的pPIC9 IFNa lb HSA、pPIC9 IFNa 2b HSA 、 pPIC9 IFNPHSA等質(zhì)粒，以在IFN與HSA間插入不同的接頭。
將以上構(gòu)建的質(zhì)粒，如pD3HSAIFNa lbO、 pD3HSAIFN a 2b0、 pD3HSAIFN a 2a0、 pD3HSAIFN3 0 pD3HSAIFNa lb2、 pD3HSAIFN a 2b2、 pD3HSAIFN a 2a2、 pD3HSAIFN3 2、 pD3HSAIFNa lb3、 pD3HSAIFNa 2b3、 pD3HSAIFN a 2a3、 pD3HSAIFNP 3等分別用與實施 例4相同的方法構(gòu)建對應(yīng)的質(zhì)粒pHIL-D2HSAIFNct lbO、 pHIL-D2HSAIFN a 2b0、 pHIL-D2HSAIFN a 2a0、 pHIL-D2HSAIFN P 0、 pHIL-D2HSAIFN a lb2、 pHIL-D2HSAIFN a 2b2、 pHIL-D2HSAIFNa 2a2、 pHIL-D2HSAIFN 0 2、 pHIL-D2HSAIFN a lb3、 pHIL-D2HSAIFN a2a3、 pHIL-D2HSAIFN a 2b3、 pHIL-D2HSAIFN P 3,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得分別表 達(dá)HSA末端缺失亮氨酸后與各IFN直接融合的HSAIFNa lbO、 HSAIFNa 2b0、 HSAIFN a 2aO、 HSAIFN e 0等融合蛋白、HSA與IFN間插入[Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser]柔性接頭的HSAIFNa lb2、 HSAIFNa 2b2、 HSAIFNa 2a2、 HSAIFN3 2等融合
蛋白及HSA與IFN插入[Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser]柔性接頭的融合蛋白HSAIFNa lb3、 HSAIFN。2b3、 HSAIFNa2a3、 HSAIFNP3等。 實施例7:工程酵母的發(fā)酵和融合蛋白的純化
以實施例5構(gòu)建的表達(dá)HSA/IFN a 2b融合蛋白的工程酵母發(fā)酵和融合蛋白的純化 為例，其它工程酵母的發(fā)酵和融合蛋白的純化可用相同或相似的方法。
工程酵母接種lOOmlYPD培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖 10g/L)，搖床30'C， 280轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24h。接種至裝有2. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的5L發(fā)酵 罐(B.Braun Corp. Germany),其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制方法為濃磷酸3.5ml/L， CaSa,.2H20 0. 15g/L， K2S04 2. 4g/L， MgS04. 7H20 1, 95g/L， KOH 0. 65g/L， 121。C高壓 滅菌30分鐘，再加入30ml/L甘油(單獨(dú)12rC高壓滅菌30分鐘)，lml/L PTM(配方 為CuS04. 5H20 6. Og/L, CoCl2. 6H20， MnS04. H20 3. Og/L,跳O. 02g/L， FeSO" 7H20 65. Og/L NaMo04. 2H20 0. 2g/L, ZnS04. 7H20 20. Og/L, KI 0. lg/L,濃H2S04 5ml/L， 121。C高壓滅菌 30分鐘)，0. 5ml/L0. 02%生物素(過濾除菌)。接種前用氨水將培養(yǎng)基pH調(diào)至5. 8。 發(fā)酵過程控制溫度為30°C，溶氧始終大于20%飽和度，pH值不高于6.0，培養(yǎng)至甘油 耗盡后，開始流加甘油(50%甘油，加12ml/LPTM， 2ml/L0.02%生物素)，繼續(xù)培養(yǎng)， 至密度0仏。。值約為150時，開始補(bǔ)加甲醇(分析純甲醇，加12ml/LPTM， 2ml/L。. 02% 生物素)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)60小時。取50ml培養(yǎng)液離心取上清，加入硫酸銨至20X飽 和度，混勻后4。C放置過夜，離心取沉淀，用3ml25mmol/LTris-HC1 (pH7.0)溶解， 用Supdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech UK) 01.6X100cm柱層析分離，流 動相為25mmol/LTris-HC1 (pH7.0) , 150mmol/LNaCl，流速為lml/L，紫外檢測，收集 第一峰(保留時間為70-85分鐘)，即為純化的融合蛋白，分子量為85KD(如圖5所示， 如圖5所示，其中，l是分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下分別為94， 67， 43， 30KD; 2是純化 的HSAIFNa2b)。純化樣品用細(xì)胞病變抑制法測定IFN活性(方法見《中國生物制品 規(guī)程》2000版，中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會編，化學(xué)工業(yè)出版社2000.6， p373-375)。 Wish細(xì)胞(人羊膜細(xì)胞)培養(yǎng)于含10y。小牛血清的MEM培養(yǎng)基中、每周傳代2次(用 前用胰酶消化，用含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基配成。2.5-3.5X105個細(xì)胞/ml)。接 種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul， 37°C， 5%0)2培養(yǎng)4-6小時。在另一 96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，每孔加入150ul測定培養(yǎng)液(含7。/。小牛血清的MEM培養(yǎng)基)，樣品作2 倍梯度稀釋，每孔100y l樣品稀釋液轉(zhuǎn)移至加有細(xì)胞的培養(yǎng)板中，37'C， 5%0)2培養(yǎng) 18-24小時，棄上清，加入用含3 %小牛血清的MEM培養(yǎng)基稀釋至100TCID5。的水泡口炎 病毒(VSV病毒)，每孔100ul， 37°C， 5%0)2培養(yǎng)24小時，棄上清，每孔加入50ul 染色液(50mg結(jié)晶紫溶于20%乙醇)，室溫放置30分鐘，流水小心沖去染色液，吸干殘留水分，每孔加入100lil脫色液(0. 1%乙酸、50%乙醇)，室溫放置5分鐘，測定 其在570mn的吸光度值，如圖6所示，橫軸為2倍梯度稀釋的孔數(shù)，縱軸是吸光度值， 結(jié)果顯示樣品明顯具有干擾素活性。
用樣品包被酶聯(lián)板，分別用兔抗人血清白蛋白抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo) 記的羊抗兔IgG作為二抗，檢測樣品，如圖7所示，橫軸為2倍梯度稀釋的孔數(shù)，縱 軸是吸光度值，從圖中可以看出，樣品具有HSA的抗原性。
取相同活性劑量的HSA/IFNa2b、 HSA/IFN P融合蛋白禾口 rhlFNa2b、 rhIFNP ， 小鼠尾靜脈給藥，不同時間取血清測定其中的IFN活性。如圖8所示，融合蛋白在小 鼠血漿中的代謝速度明顯比rhIFN慢。注射后10分鐘，兩者在血漿中的IFN活性相 差不大，而8小時后，rhlFNa2b和rhIFNP的活性下降了近十倍，而融合蛋白的活 性只略微降低了； 48小時后，注射融合蛋白的小鼠仍能測到IFN的活性。
權(quán)利要求
1、一種融合蛋白，所述融合蛋白具有血清白蛋白和干擾素的特性，它包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人干擾素氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物，所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的融合蛋白，其中，所述第一區(qū)位于融合蛋白的N-末端，所 述第二區(qū)位于融合蛋白的C-末端；或者，所述第二區(qū)位于融合蛋白的N-末端，所述 第一區(qū)位于融合蛋白的C-末端。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中，所述第一區(qū)與第二區(qū)之間設(shè)有連接肽， 所述連接肽的通式是[GlyGlyGlyGly Ser]n， n為1-10的整數(shù)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3的融合蛋白，其中，n為l-3的整數(shù)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l一4任意一項的融合蛋白，其中，所述第二區(qū)為IFNa、 IFN P或IFN Y 。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5的融合蛋白，其中，所述IFNa為IFNa2a、 IFNalb、 IFN a 2b或IFNa con。
7、 編碼權(quán)利要求1一6任意一項的融合蛋白的DNA序列。
8、 含有權(quán)利要求7所述DNA序列的細(xì)胞，其為細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中，所述酵母為畢赤酵母。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中，所述畢赤酵母為畢赤酵母GSU5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血清白蛋白與干擾素的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA序列，攜帶該DNA序列的細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞；本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人干擾素至少85％序列同源的第二區(qū)，該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯?，進(jìn)行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入；本發(fā)明融合蛋白的第一區(qū)與第二區(qū)之間設(shè)有連接肽，連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n為1-10的整數(shù)；本發(fā)明的融合蛋白既有人干擾素的特性，半衰期又得到了延長，在藥學(xué)領(lǐng)域?qū)玫綇V泛應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK101200503SQ20071011146
公開日2008年6月18日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月10日
發(fā)明者軍 吳, 唱韻紅, 新 鞏, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所