專利名稱：Knsl4的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能和預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物用途及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)目屬于已知基因的新功能、新用途和應(yīng)用方法的發(fā)明。具體講是發(fā)現(xiàn)了已知基因KNSL4的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能，并可作為乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的基因標(biāo)志；發(fā)明了基于KNSL4基因mRNA表達(dá)量預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在歐美國(guó)家發(fā)病率高達(dá)10％，而低發(fā)的亞洲國(guó)家近年來(lái)發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈顯著的上升趨勢(shì)，我國(guó)大城市中乳腺癌發(fā)病率已居女性惡性腫瘤的首位，成為婦女健康的重大威脅。乳腺癌是全身性疾病，腫瘤細(xì)胞的淋巴道和血道播散導(dǎo)致的全身轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的關(guān)鍵所在。乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)將為轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供線索，為轉(zhuǎn)移的早期診斷提供分子標(biāo)志，為患者的預(yù)后評(píng)估提供客觀指征，為抗轉(zhuǎn)移治療提供基因靶點(diǎn)。
目前，關(guān)于驅(qū)動(dòng)蛋白樣DNA結(jié)合蛋白基因(kinesin-like DNA bindingprotein，KNSL4，kinesin-like 4，KIF22，Accession No.NM_007317)及其蛋白產(chǎn)物Kid的研究報(bào)道都是關(guān)于分子結(jié)構(gòu)和基于分子結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能的研究，已知該基因編碼的Kid蛋白與微管結(jié)合驅(qū)動(dòng)染色體的運(yùn)動(dòng)，在細(xì)胞有絲分裂中起關(guān)鍵作用。但KNSL4基因的改變對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)行為的影響、與組織病理學(xué)改變的關(guān)系、基因表達(dá)量檢測(cè)方法和應(yīng)用的研究還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
為了篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，采用Differential display RT-PCR(DDRT-PCR)方法，通過(guò)比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性乳腺癌患者的原發(fā)癌和配對(duì)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織基因表達(dá)的差異和實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了KNSL4的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的新功能。
建立了定量RT-PCR檢測(cè)KNSL4 mRNA表達(dá)量的方法；經(jīng)大樣本量的臨床病例檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)KNSL4 mRNA水平與乳腺癌的多種臨床病理因素及轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)，與患者無(wú)轉(zhuǎn)移生存期呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，因此，KNSL4mRNA可作為乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物；確定了基于KNSL4mRNA表達(dá)量可以區(qū)分預(yù)后好和預(yù)后差的患者群的臨界值，高于臨界值的患者判斷判斷為預(yù)后好，低于臨界值的患者為預(yù)后差。
主要發(fā)明如下
驅(qū)動(dòng)蛋白樣DNA結(jié)合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能。
KNSL4基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物用途，基于KNSL4基因表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后，KNSL4表達(dá)水平高的患者預(yù)后好，表達(dá)水平低的患者預(yù)后差。
基于KNSL4基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的檢測(cè)及應(yīng)用方法，a.提取腫瘤患者原發(fā)癌組織標(biāo)本的細(xì)胞總RNA；以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，用KNSL4基因和管家基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算KNSL4基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtKNSL4-CtGAPDH(CT為實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù))；b.根據(jù)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4 mRNA表達(dá)量，確定預(yù)后判斷的臨界值。KNSL4 mRNA表達(dá)量高于臨界值的患者預(yù)后好，而低于臨界值的患者預(yù)后差。
所述的檢測(cè)方法，以原發(fā)癌組織中KNSL4 mRNA表達(dá)量為1.40×10-3作為對(duì)腫瘤患者預(yù)后判斷的臨界值，高于該臨界值的患者則判斷為預(yù)后好，低于該臨界值則判斷為預(yù)后差。
所述的檢測(cè)方法，KNSL4基因?qū)崟r(shí)定量RT-PCR的引物和探針序列是上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特異性熒光標(biāo)記探針序列5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。
所述的檢測(cè)方法，其熒光報(bào)告基團(tuán)還可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等熒光染料。


附圖是KNSL4 mRNA表達(dá)與患者生存期分析圖。
具體實(shí)施例方式
一、病例資料及標(biāo)本取材1.病例資料108例乳腺原發(fā)癌組織均為2002年1月至2003年10月天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科收治的乳腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，組織學(xué)分型及臨床分期根據(jù)《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》第八分冊(cè)(乳腺癌)。年齡為29-73歲，中位年齡51歲；浸潤(rùn)性非特殊型癌101例(單純癌60例、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌24例、髓樣癌12例、腺癌5例)和浸潤(rùn)性特殊型癌7例(乳頭狀癌3例、粘液癌癌2例、大汗腺癌2例)；臨床分期I期16例，II期63，III期25例，IV期4例；組織學(xué)分級(jí)I級(jí)12例、II級(jí)73例、III級(jí)23例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性52例，陽(yáng)性56例；ER、PR采用免疫組化檢測(cè)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)30％以上為陽(yáng)性，ER陰性36例，陽(yáng)性68例，PR陰性55例，陽(yáng)性病例49例，4例ER、PR免疫組化資料缺失；雙乳癌3例；平均隨訪43個(gè)月，11例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，45例無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，62例無(wú)隨訪結(jié)果。
2.標(biāo)本取材組織標(biāo)本取材分為兩部分，用于mRNA表達(dá)檢測(cè)的新鮮標(biāo)本經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于組織病理學(xué)診斷和免疫組織化學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋，制備4μm組織切片。
二、Real-time RT-PCR方法檢測(cè)KNSL4的mRNA表達(dá)1.細(xì)胞總RNA的提取采用Trizol一步法快速提取組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。
2.cDNA的合成20μl SuperScript II(invitrogen公司)反應(yīng)體系。其中包括5μg totalRNA，0.5μg Oligo(dT)，10nmol dNTP mix，65℃變性5分鐘，冰浴后加入First-Strand Buffer，0.2μmol DTT和40U RNA酶抑制劑，42℃溫育2分鐘后加入SuperScriptII 200U，42℃反應(yīng)50分鐘。反應(yīng)完成后70℃，15分鐘終止反應(yīng)。
3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)KNSL4的mRNA表達(dá)KNSL4引物采用oligo6.0和primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)并進(jìn)行最大優(yōu)化，GAPDH引物參考文獻(xiàn)。引物和探針序列及片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG試劑盒(Invitrogen公司)。20μl反應(yīng)體系中包括由40ng total RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，10μl Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，10μM的上下游引物和TaqMan探針各0.4μl。PCR反應(yīng)條件為50℃溫育2分鐘，95℃預(yù)變性2分鐘；95℃30秒，62℃1分鐘，45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR過(guò)程中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)為CT值，計(jì)算各個(gè)樣本KNSL4的CT值與管家基因GAPDH的CT值的差值ΔCT，2-□CT即為各個(gè)樣本中KNLS4相對(duì)于同一樣本中GAPDH的表達(dá)量。FAM(6-carboxy-fluorescein)為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)為熒光淬滅基團(tuán)。熒光報(bào)告基團(tuán)還可為SYBR GreenI、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等熒光染料。
三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0軟件。兩組之間比較采用Student’st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，Kaplan-Meier法用于患者的生存期分析。
四、結(jié)果1.KNSL4 mRNA表達(dá)與臨床因素的關(guān)系乳腺原發(fā)癌中KNSL4的mRNA表達(dá)隨著腫瘤的進(jìn)展總體呈下調(diào)趨勢(shì)，臨床分期III-IV期組KNSL4的mRNA表達(dá)低于I-II期組(t＝3.842，p＜0.001)，差異有顯著性，平均相對(duì)表達(dá)量下調(diào)50.0％；KNSL4的mRNA表達(dá)在ER和PR的陰性和陽(yáng)性組之間比較，陰性組均低于陽(yáng)性組，但差異無(wú)顯著性(t＝-1.245，p＝0.216；t＝-1.871，p＝0.065)；在不同年齡組、病理類型和組織學(xué)分級(jí)之間差異均無(wú)顯著性(p＞0.05)。檢測(cè)上述病例中76例c-erbB-2的蛋白表達(dá)，27例c-erbB-2的蛋白表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為35.5％。乳腺原發(fā)癌中KNSL4 mRNA表達(dá)在c-erbB-2陽(yáng)性組低于陰性組(t＝3.215，p＜0.01)，相對(duì)表達(dá)量下調(diào)52.3％。見(jiàn)表2。
2.KNSL4 mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系乳腺原發(fā)癌中KNSL4的mRNA表達(dá)在淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)1-3個(gè)組高于陰性組1.5倍(p＜0.05)，還高于8個(gè)以上組2.6倍，差異有顯著性(p＜0.05)。將轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)分為0-3個(gè)組和大于3個(gè)組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大于3個(gè)組KNSL4的mRNA表達(dá)低于0-3個(gè)組，差異有顯著性(p＜0.01)，平均相對(duì)表達(dá)量下調(diào)37.5％。見(jiàn)表3。
3.KNSL4 mRNA表達(dá)與患者生存期的關(guān)系根據(jù)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4mRNA的相對(duì)表達(dá)量，將1.40×10-3作為預(yù)后分組的臨界值，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例KNSL4 mRNA的表達(dá)量小于1.40×10-3，與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例比較差異有顯著性(p＜0.01)。見(jiàn)表4，圖1。KNSL4 mRNA表達(dá)量高于臨界值的患者預(yù)后好，而低于臨界值的患者預(yù)后差。
五、結(jié)論1.KNSL4表達(dá)水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，具有轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能。
2.KNSL4 mRNA表達(dá)可以作為乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的基因標(biāo)志。
3.建立了實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)KNSL4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的方法，確定了用于乳腺癌預(yù)后判斷的臨界值。
六、補(bǔ)充說(shuō)明1.用于乳腺癌預(yù)后判斷的KNSL4 mRNA相對(duì)表達(dá)量的臨界值可能由于今后應(yīng)用樣本量的增加達(dá)到更優(yōu)化。
2.實(shí)時(shí)定量PCR的熒光標(biāo)記也可為非特異的SYBR green I等熒光染料雙鏈DNA內(nèi)插式非特異性標(biāo)記。
3.還可以采用絕對(duì)定量PCR擴(kuò)增、分子雜交等方法檢測(cè)KNSL4基因的mRNA表達(dá)量，及免疫化學(xué)方法檢測(cè)KNSL4基因的蛋白表達(dá)量，用于乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)。
4.采用不同的檢測(cè)方法其預(yù)后判斷的閾值不同。
表1 Real-time RT-PCR引物和Tagman探針序列及擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度

表2 KNSL4的mRNA表達(dá)與臨床各因素的關(guān)系分組例數(shù)t/F P
年齡≤48 48 2.02±1.62＞48 60 1.76±2.09 0.703 ＞0.05病理類型單純癌60 1.78±1.72浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 25 1.90±1.44髓樣癌12 2.20±3.09 0.282 ＞0.05腺癌 51.50±0.86其他 62.40±2.99臨床分期I-II 79 2.16±2.09III-IV29 1.10±0.77 3.842 ＜0.001組織學(xué)分級(jí)I 12 1.63±1.22II73 2.03±2.01 0.751 ＞0.05III 23 1.52±1.76ER陽(yáng)性 68 2.09±2.12陰性 36 1.60±1.40 -1.245 ＞0.05PR陽(yáng)性 49 2.29±2.24陰性 55 1.59±1.51 -1.871 ＞0.05c-erbB-2蛋白陰性 49 2.24±2.33陽(yáng)性 27 1.09±0.69 3.215 ＜0.01
表3 KNSL4 mRNA表達(dá)與轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系例數(shù)

t/F P
淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)(1)0 52 1.85±1.641-322 2.83±2.933.292＜0.05*4-714 1.63±1.20＞＝8 20 1.09±0.82淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)(2)0-374 2.14±2.132.727＜0.01＞329 1.10±0.77遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組 64 2.00±1.96遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組 19 1.46±1.93 1.0340.304
*淋巴結(jié)陽(yáng)性數(shù)1-3個(gè)組KNSL4的mRNA表達(dá)高于陰性組和大于8個(gè)組(p＜0.05)表4以KNSL4 mRNA量對(duì)表達(dá)1.40×10-3為臨界值對(duì)患者預(yù)后分組

權(quán)利要求
1.驅(qū)動(dòng)蛋白樣DNA結(jié)合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因功能。
2.KNSL4基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物用途，其特征在于基于KNSL4基因表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后，KNSL4表達(dá)水平高的患者預(yù)后好，表達(dá)水平低的患者預(yù)后差。
3.基于KNSL4基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的檢測(cè)及應(yīng)用方法，其特征在于a.提取腫瘤患者原發(fā)癌組織標(biāo)本的細(xì)胞總RNA；以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，用KNSL4基因和管家基因的特異性引物和熒光標(biāo)記探針進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算KNSL4基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtKNSL4-CtGAPDH(CT為實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù))；b.根據(jù)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4 mRNA表達(dá)量，確定預(yù)后判斷的臨界值，KNSL4 mRNA表達(dá)量高于臨界值的患者預(yù)后好，而低于臨界值的患者預(yù)后差。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于以原發(fā)癌組織中KNSL4 mRNA表達(dá)量為1.40×10-3作為對(duì)腫瘤患者預(yù)后判斷的臨界值，高于該臨界值的患者則判斷為預(yù)后好，低于該臨界值則判斷為預(yù)后差。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于KNSL4基因?qū)崟r(shí)定量RT-PCR的引物和探針序列是上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特異性熒光標(biāo)記探針序列5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于熒光報(bào)告基團(tuán)還可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等熒光染料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了①驅(qū)動(dòng)蛋白樣DNA結(jié)合蛋白基因KNSL4具有轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的功能；②KNSL4基因表達(dá)水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物用途；③基于KNSL4mRNA表達(dá)量用于乳腺癌患者預(yù)后判斷的應(yīng)用方法建立了實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)KNSL4的mRNA表達(dá)水平的方法，根據(jù)患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性病例和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移陰性病例的KNSL4基因mRNA表達(dá)水平確定判斷患者預(yù)后的臨界值，KNSL4mRNA表達(dá)量高于臨界值的患者預(yù)后好，而低于臨界值的患者預(yù)后差。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101089198SQ20071011163
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月4日 公開(kāi)號(hào)200710111637.8
發(fā)明者馮玉梅, 李曉青, 萬(wàn)艷芳 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院