專利名稱：一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法及所使用的工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種通過(guò)生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法，還涉及該方法中所使用的工程菌。
背景技術(shù)：
近幾年，禽流感已被證明可以直接感染人類，來(lái)勢(shì)兇猛，病死率高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，禽流感已經(jīng)感染100余人，其中一半以上病人死亡。截止2005年10月，柬埔寨、中國(guó)等十余個(gè)國(guó)家和地區(qū)先后出現(xiàn)了H5N1病毒的流行，至今仍在蔓延。目前，各國(guó)政府都在積極應(yīng)對(duì)禽流感可能在人類中出現(xiàn)的大面積爆發(fā)。流感病毒專家認(rèn)為新一次流感大流行不可避免，可能為期不遠(yuǎn)。2005年7月4日由世界衛(wèi)生組織主持的討論會(huì)上，科學(xué)家們指出，禽流感依然危險(xiǎn)，要防范其在人類中發(fā)生大流行。
隨著禽流感形勢(shì)的日趨嚴(yán)峻，達(dá)菲作為預(yù)防和治療H5N1型禽流感的主要藥物受到各國(guó)的關(guān)注，僅美國(guó)政府就為此計(jì)劃儲(chǔ)備達(dá)菲約1億人份次。達(dá)菲的主要活性成分是奧塞米韋，而莽草酸(shikimic acid)是奧塞米韋的起始原料，目前莽草酸的生產(chǎn)主要通過(guò)化學(xué)萃取法從木蘭科植物八角茴香的種子中提取。由于各國(guó)都在盡可能多地儲(chǔ)備達(dá)菲這種抗禽流感藥物，導(dǎo)致莽草酸的供不應(yīng)求，由此帶來(lái)原材料八角茴香的短缺，因此化學(xué)法存在著原材料受限的嚴(yán)重弊端，尤其是在流感爆發(fā)及收成欠佳時(shí)。
此外，莽草酸還是許多生物堿、芳胺酸、吲哚衍生物和手性藥物合成的關(guān)鍵前體，其衍生藥物大部分尚處在實(shí)驗(yàn)階段，比較受到關(guān)注的發(fā)展前途有二個(gè)一是抗菌抗腫瘤作用，1987年有報(bào)道中提到日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)莽草酸的一種化合物對(duì)海拉細(xì)胞株(HeLacells)和埃希利腹水癌Ehrlichascitescarcinoma)有明顯的抑制作用，并能延長(zhǎng)接種白血病細(xì)胞L1210的小鼠的存活時(shí)間，而且毒性相對(duì)較低，并指明抑制作用主要是因?yàn)榇朔N莽草酸化合物與硫氫化物反應(yīng)；另一種化合物對(duì)須發(fā)癬菌有一定的對(duì)抗作用。并有報(bào)道(孫快麟等人)合成的莽草酸衍生物具有與二霉素類似的體外抑制白血病細(xì)胞L1210的作用(孫快麟，李潤(rùn)蓀，雷興翰.若干莽草酸衍生物的合成和生物活性研究.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1990，(1))。二是對(duì)心血管系統(tǒng)的作用，北京中醫(yī)藥大學(xué)的孫建寧等發(fā)現(xiàn)，莽草酸及其衍生物具有抗血栓形成和抑制血小板聚集的作用(孫文燕，孫建寧，劉振權(quán)，黃賤英，張文博.異亞丙基莽草酸抗大鼠腦缺血再灌注損傷的炎癥機(jī)制初探《中國(guó)藥學(xué)雜志》2005，40(9)678～680；孫文燕，孫建寧，劉振權(quán)，黃賤英，張文博.異亞丙基莽草酸對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠保護(hù)作用《北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》2005，28(3)43～47；)。
隨著禽流感形勢(shì)的日益嚴(yán)峻，保證生產(chǎn)達(dá)菲所需原材料的充足是國(guó)際形勢(shì)的需要。莽草酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且原料受自然因素影響較大，打破傳統(tǒng)的植物提取方式，采用環(huán)保、廉價(jià)、產(chǎn)量穩(wěn)定的生物工程菌生產(chǎn)莽草酸的方式是國(guó)際發(fā)展趨勢(shì)。莽草酸途徑，見(jiàn)圖1，是存在于微生物、真菌和植物中的重要的代謝途徑之一，但不存在于哺乳動(dòng)物中。從葡萄糖到莽草酸合成中間有五個(gè)重要的酶，分別是3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸合成酶(3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase，簡(jiǎn)稱DAHP合成酶)、3-脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)、3-脫氫奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinatedehydratase)、莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase)和莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme)。它們?cè)诖竽c桿菌中分別由aroF，aroB，aroD，aroE，aroK和aroL編碼，其中aroK和aroL都編碼莽草酸激酶同工酶，它將莽草酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate)(1.Dansette，P.and R.Azerad，The shikimate pathway.I. Preparation of 3-3H，4-3H and 2，4-3H2D-shikimic acid.Biochimie，1973.55(5)p.5 83-9；2.Dansette，P. and R.Azerad，The shikimate pathwayII. Stereospecificity of hydrogen transfercatalyzed by NADPH-dehydroshikimate reductase of E.coli.Biochimie，1974.56(5)p.751-5)。在莽草酸途徑中，莽草酸只是中間產(chǎn)物，因此，要利用莽草酸途徑合成莽草酸就必須破壞莽草酸激酶同工酶的作用，使莽草酸能在微生物體內(nèi)大量聚集。
目前，國(guó)外已有兩項(xiàng)通過(guò)大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(bacillus subtilis)生產(chǎn)莽草酸的專利。羅氏公司已經(jīng)率先和德國(guó)一家生物技術(shù)公司合作采用大腸桿菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化成莽草酸。羅氏公司透露他們生產(chǎn)達(dá)菲的主要原料莽草酸2/3從八角茴香中的提取，1/3利用生物工程技術(shù)從大腸桿菌中獲得。美國(guó)另一項(xiàng)專利是利用枯草桿菌生產(chǎn)莽草酸，這兩種方法異曲同工，轉(zhuǎn)化率也較為相似。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到利用生物工程技術(shù)合成莽草酸的報(bào)道。從葡萄糖到莽草酸的五步反應(yīng)中，其相關(guān)的催化酶并不能有效地催化各自底物轉(zhuǎn)化，從而使其降低了莽草酸的產(chǎn)量，同時(shí)，也影響了產(chǎn)物的純度。莽草酸途徑的限速酶為DHQ合成酶(aroB)，在美國(guó)的兩項(xiàng)專利中，都是利用帶有編碼限速酶的質(zhì)粒載體導(dǎo)入受體菌來(lái)提高莽草酸的碳流。然而，多拷貝質(zhì)粒載體上的基因可能會(huì)導(dǎo)致酶的表達(dá)超出最初改善限速酶影響的要求，造成細(xì)胞代謝上的負(fù)擔(dān)，從而降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和莽草酸的合成速率及產(chǎn)量。在以后的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)上勢(shì)必將帶來(lái)許多問(wèn)題。另外，以往研究表明，整體調(diào)控基因shiA突變株可以比野生株在細(xì)胞內(nèi)多聚集20倍的糖原濃度(Yang H，Liu M Y，Romeo T.Coordinate genetic regulation of glycogen catabolism andbiosynthesis in Escherichia coli via the ShiA gene product.J Bacteriol，1996，1781012～1017)。因此，本發(fā)明敲除shiA基因?qū)⒂行У靥岣呒?xì)菌內(nèi)合成莽草酸的前體物，同時(shí)在大腸桿菌的染色體中增加限速酶的拷貝，從而大大提高莽草酸的轉(zhuǎn)化率。
通過(guò)生物技術(shù)合成莽草酸具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)(1)不受植物原材料生產(chǎn)周期及產(chǎn)量的限制八角茴香為木蘭植物八角茴香的果實(shí)，每年果期為秋季至翌年春季，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量有限，尤其是遇到流感爆發(fā)流行和果實(shí)欠收時(shí)；生物技術(shù)合成所需的原料是細(xì)菌、葡萄糖等，這些材料可隨時(shí)獲得，不受季節(jié)限制。(2)保護(hù)環(huán)境；(3)成本低廉相對(duì)從八角茴香萃取而言，通過(guò)生物技術(shù)合成莽草酸能降低生產(chǎn)成本約2/3。因此通過(guò)基因工程技術(shù)合成莽草酸是時(shí)勢(shì)所趨。
利用生物技術(shù)從大腸桿菌合成莽草酸具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，在全球面臨禽流感威脅的今天，其研究意義更顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
為了改善目前利用基因工程技術(shù)合成莽草酸的方法中莽草酸合成速率及產(chǎn)量低，純度低的缺陷，本發(fā)明公開(kāi)了一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法。
本發(fā)明的制備方法包括如下步驟
1.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建莽草酸代謝途徑限速酶的aroEaroFaroBkan多基因盒。構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒策略如圖2所示。包括如下步驟(1)PCR擴(kuò)增基因aroF、aroB、aroE、shiA、kan，前三個(gè)基因中每個(gè)基因的5’端加入Ptac強(qiáng)啟動(dòng)子；(2)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-shiA，pET32a-aroF，pET32a-aroE，pET32a-aroB，pET32a-kan；(3)構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒將三個(gè)基因aroF、aroB、aroE通過(guò)酶切順序連接，并加入kan抗性基因。
Ptac強(qiáng)啟動(dòng)子是DeBoer等構(gòu)建的來(lái)自trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的一個(gè)雜合啟動(dòng)子，由于其-35序列和Pribnow盒的一致性，故在控制大腸桿菌中外源基因的表達(dá)是高效的。據(jù)報(bào)道，其啟動(dòng)效率比lacUV5啟動(dòng)子高出11倍之多。基因盒中的kan抗性基因一方面是為了便于基因敲除和基因替換后菌株的篩選，另一方面也給了基因敲除和基因替換后的菌株一個(gè)選擇壓力，使其不易于發(fā)生回復(fù)突變。另外，kan基因可以利用能識(shí)別FRT位點(diǎn)的FLP重組酶系統(tǒng)而消除。
2.利用Red重組系統(tǒng)敲除細(xì)菌中的莽草酸激酶同工酶aroK和aroL。Red重組系統(tǒng)是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，可以直接利用含有同源臂的PCR線性片段，替換出同源臂內(nèi)的目的基因。Red是一種λ噬菌體主管同源重組的重組酶，由exo、beta和gam基因組成，Gam抑制宿主菌的RecBCD核酸外切酶，使外源線性DNA不至于立即被降解，Exo和Bet引導(dǎo)線性片段與同源區(qū)發(fā)生重組置換，而且效率較傳統(tǒng)的同源重組方法高幾十倍。aroK和aroL都編碼莽草酸激酶同工酶，它們的缺失將促使莽草酸在細(xì)胞內(nèi)的聚集。因此，通過(guò)構(gòu)建包含Red重組系統(tǒng)的質(zhì)粒來(lái)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行aroK和aroL基因的缺失突變，改造后的大腸桿菌備用。
3.敲除aroK和aroL缺失菌中的shiA基因，并敲入aroEaroFaroBkan多基因盒。采用脈沖電轉(zhuǎn)化多基因盒線性片段，利用Red重組系統(tǒng)敲入aroEaroFaroBkan多基因盒，同時(shí)敲除shiA基因，然后進(jìn)行基因替換菌株的篩選。由于基因盒的插入，shiA基因被破壞的同時(shí)，保存了基因盒的完整性。本發(fā)明通過(guò)PCR鑒定基因敲除和基因替換菌株。
4.利用基因工程技術(shù)發(fā)酵該重組工程菌獲得莽草酸。通過(guò)搖瓶發(fā)酵莽草酸并進(jìn)行轉(zhuǎn)化率的鑒定，探索最佳的發(fā)酵條件和轉(zhuǎn)化率。在本發(fā)明中，所用的工程菌為大腸桿菌、枯草桿菌等細(xì)菌，其中大腸桿菌為優(yōu)選。轉(zhuǎn)化率達(dá)到40％以上。
5.分離、純化莽草酸。本發(fā)明所使用的分離純化莽草酸方法為離子交換色譜法及重結(jié)晶法。
本發(fā)明還公開(kāi)了在制備莽草酸方法中的重組工程菌，該工程菌敲除了aroK，aroL基因和shiA基因，包含aroEaroFaroBkan多基因盒。其中aroEaroFaroBkan多基因盒由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac、莽草酸合成途徑的限速酶aroF、aroB、aroE及抗性基因kan組成。
本發(fā)明所公開(kāi)的重組工程菌為大腸桿菌、枯草桿菌等細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌。
莽草酸是一種單體化合物，分子式為C7H10O5，結(jié)構(gòu)式如圖1中所示，相對(duì)分子質(zhì)量為174.15，學(xué)名是3，4，5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸，為白色精細(xì)粉末，氣微，味辛酸，易溶于水，難溶于氯仿、苯和石油醚，熔點(diǎn)為185℃～187℃，旋光度為-180°。
本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建基因盒aroEaroFaroBkan，并在基因盒前、后分別加入強(qiáng)啟動(dòng)子和抗性篩選基因，利用依賴于λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)敲除代謝調(diào)控基因shiA，并代替以基因盒aroEaroFaroBkan，增加了細(xì)胞內(nèi)的有效糖濃度，解除對(duì)PEP合成酶的負(fù)調(diào)控，從而使莽草酸合成途徑達(dá)到最優(yōu)化，另外，我們還要敲除莽草酸激酶同工酶aroK和aroL，使得大腸桿菌內(nèi)的莽草酸得以在細(xì)胞內(nèi)聚集。
在莽草酸代謝途徑中，碳貯存調(diào)控因子(carbon storage regulatorA，ShiA)的缺失可增加糖異生和糖原的合成，降低糖酵解。另外，ShiA也調(diào)控直接參與磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)代謝的3個(gè)酶的活性水平丙酮酸激酶(PykF)正調(diào)控，而PEP羧化酶(PckA)和PEP合成酶則被負(fù)調(diào)控。另外，一些非直接影響PEP的酶也被ShiA所調(diào)控，因而shiA基因的敲除可使細(xì)胞內(nèi)的PEP大大增加，為莽草酸的生物合成提供大量的前體物。
本發(fā)明使用依賴噬菌體的Red重組系統(tǒng)來(lái)敲除大腸桿菌中的碳貯存調(diào)控因子shiA，并代替以莽草酸途徑限速酶基因盒——強(qiáng)啟動(dòng)子+aroFaroBaroE基因+篩選基因來(lái)優(yōu)化大腸桿菌莽草酸合成系統(tǒng)，操作方法簡(jiǎn)單精確，從設(shè)計(jì)上明顯優(yōu)于美國(guó)兩個(gè)分別利用大腸桿菌和枯草桿菌生長(zhǎng)莽草酸的研究。
本發(fā)明相對(duì)于國(guó)外兩項(xiàng)專利的創(chuàng)新點(diǎn)如下(1)通過(guò)敲除大腸桿菌的碳貯存調(diào)控因子，并代替以基因盒aroEaroFaroBkan，使莽草酸途徑達(dá)到最優(yōu)化；(2)使用了近幾年發(fā)展迅速的依賴于λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)，對(duì)大腸桿菌染色體DNA進(jìn)行基因敲除、敲入和替換。該方法能有效利用線性DNA片段作為打靶分子，不需要限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，操作過(guò)程簡(jiǎn)單、精確、快速、經(jīng)濟(jì)，大大縮短了構(gòu)建打靶載體的時(shí)間；
(3)基因盒替換的方法，避免了利用載體導(dǎo)入多拷貝限速酶基因方法的局限性，減輕了細(xì)菌代謝的負(fù)擔(dān)，提高了細(xì)菌的生長(zhǎng)速率和莽草酸的合成速率及產(chǎn)量，同時(shí)提高了工程菌株的穩(wěn)定性，不存在質(zhì)粒丟失的情況。
大腸桿菌是現(xiàn)在生物實(shí)驗(yàn)室常用工程菌。依賴λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)是新近發(fā)展起來(lái)的基因敲除方法。本發(fā)明在國(guó)內(nèi)首次成功地在大腸桿菌中高度表達(dá)莽草酸，以大腸桿菌為宿主菌，進(jìn)行溫度誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)化率在40％以上。
本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒并替換掉整體調(diào)控基因shiA，提高了莽草酸合成限速酶在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)，有效地催化各自底物的轉(zhuǎn)化，盡可能地減少了染色體外的DNA，避免了細(xì)胞代謝上的負(fù)擔(dān)，同時(shí)shiA的缺失可增加糖異生和糖原的合成，降低糖酵解，可使細(xì)胞內(nèi)的PEP大大增加，為莽草酸的生物合成提供大量的前體物。莽草酸激酶同工酶aroK和aroL的缺失，促進(jìn)了莽草酸在大腸桿菌胞質(zhì)內(nèi)的聚集。
本發(fā)明基于提高莽草酸生物合成產(chǎn)量和降低市場(chǎng)價(jià)格的目的，設(shè)計(jì)構(gòu)建了由莽草酸合成代謝限速酶組成的多基因盒，并替換掉整體調(diào)控基因shiA，同時(shí)缺失掉莽草酸激酶同工酶，使重組后的大腸桿菌能在體內(nèi)高效表達(dá)莽草酸，轉(zhuǎn)化率可達(dá)40-50％，為大規(guī)模制備莽草酸創(chuàng)造了條件。
本發(fā)明為我國(guó)首次利用重組大腸桿菌高度表達(dá)莽草酸，為以莽草酸為原料的藥物例如達(dá)菲等的生產(chǎn)成本提供了可能的經(jīng)濟(jì)環(huán)保途徑，中國(guó)作為世界人口最多的國(guó)家，在應(yīng)對(duì)禽流感爆發(fā)時(shí)需要達(dá)菲儲(chǔ)備數(shù)量巨大，因此達(dá)菲生產(chǎn)原材料-莽草酸的生產(chǎn)迫在眉睫。本發(fā)明具有巨大的市場(chǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并會(huì)極大地提高我國(guó)對(duì)防治禽流感及其他流感的應(yīng)對(duì)能力。


圖1為莽草酸代謝途徑。A是DAHP合成酶；B是3-脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase)；C是3-脫氫奎尼酸脫水酶(3-dehydroquinatedehydratase，)D是莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase)；E是莽草酸激酶同工酶(shikimate kinase isozyme)。
圖2為aroEaroFaroBkan多基因盒的構(gòu)建示意圖。其中pUC-pUC19載體及目的基因；pET-pET32a載體及目的基因；kan抗性篩選基因；XXba I；NNspV；MMsc I；Kkpn I；BaBamH I；BgBglII圖3鑒定aroL::CMr陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
圖4鑒定aroK::CMr陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子圖5為aroF，aroB，aroE的PCR擴(kuò)增。其中MDL2000 marke；1，2aroE；3，4aroB；5，6aroF圖6為Kan的PCR擴(kuò)增。其中MDL2000 marke；1，2kan圖7為shiA的PCR擴(kuò)增。其中MDL2000 marke；1，2shiA圖8為PCR鑒定pUC-aroEaroFaroBkan，其中MDL2000 marker；1，5，9aroB；2，6，10Kan；3，7，11aroF；4，8，12aroE具體實(shí)施方式
實(shí)施例一莽草酸表達(dá)菌株的構(gòu)建材料與方法(1)菌株與質(zhì)粒。E.coli DH5α購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒pKD46(oriR101repA101ts ParaB-gam-bet-exo Amp)是溫度敏感型，在阿拉伯糖誘導(dǎo)后表達(dá)同源重組需要的三個(gè)γ噬菌體重組酶Gam，Bet和Exo。質(zhì)粒pKD3為兩邊含有FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因，質(zhì)粒pCP20也是溫度敏感型，熱誘導(dǎo)后表達(dá)FLP重組酶，能識(shí)別FRT位點(diǎn)并促進(jìn)重組的發(fā)生(1.Datsenko KA，Wanner BL. One step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K 12 usingPCR products.Proc Natl Acad Sci USA，2000，976640～6645；2.Red重組技術(shù)研究進(jìn)展，中國(guó)生物工程雜志，2006，26(1)81～86)，以上三種質(zhì)粒由王恒梁博士惠贈(zèng)。pUC19購(gòu)自Takara公司，pET32a購(gòu)自Novagen公司。
(2)培養(yǎng)基LB1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl。
LBS含瓊脂為1.5％的LB固體培養(yǎng)基。
M9培養(yǎng)基20％5×M9鹽溶液，0.4％葡萄糖，另含Vit PP 4 ug/ml，Vit B1 4ug/ml；檢測(cè)芳香族氨基酸基因缺陷用M9加對(duì)氨基苯甲酸(PABA)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)各40ug/ml；固體平板加1.5％瓊脂。
5×M9鹽溶液(1L)Na2HPO4·12H2O 75g，KH2PO415g，NaCl 2.5g，NH4Cl 5.0g，去離子水定容至1L，調(diào)節(jié)PH值至7.4，高壓滅菌20min備用。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖2％，硫酸胺2％，檸檬酸鈉0.05％，反丁烯二酸0.05％，硫酸鎂0.08％，磷酸二氫鉀/磷酸氫二鉀0.34mg/0.16mg，碳酸鈣0.04％，0.5％酵母提取物；100倍微量元素5ml，pH7.2。100倍微量元素含CoCl20.1mg/L，ZnSO41mg/L，CaCl25mg/L，VB110mg/L，尼克酸鹽酸10mg/L，MnCl22mg/L.
(3)酶和試劑。dNTP，Taq DNA多聚酶，限制性內(nèi)切酶EcoR I，BamH I，Kpn I，Bgl II，Nsp V，Not I，Msc I和Xba I，T4 DNA連接酶，DNA marker和DNA Ligation Kit購(gòu)自Takara公司；DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit I購(gòu)自Roche公司。小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天為時(shí)代公司。L-阿拉伯糖、氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素購(gòu)自Sigma公司。
(4)引物設(shè)計(jì)由Primer Premier 5.0分析軟件完成，引物由上海生工公司合成。
(5)質(zhì)粒DNA制備，DNA序列分析，DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性內(nèi)切酶水解、電轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法均參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)v3。
(6)用Red重組系統(tǒng)快速敲除E.coli DH5α的aroL基因和aroK基因，獲得aroK-/aroL-菌株。
(7)如圖2所示構(gòu)建多基因盒，然后用限制性內(nèi)切酶把基因盒從載體上切下，從而制備好線性化的多基因盒替換片段；利用Red重組系統(tǒng)將多基因盒片段敲入aroK-/aroL-菌株的基因組中，并替換掉shiA基因；(8)利用菌株抗性的變化及菌液PCR進(jìn)行基因破壞和基因替換菌株的篩選。
(9)工程菌發(fā)酵。挑單個(gè)工程菌接種于3ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培育過(guò)夜，用生理鹽水洗滌1次，用發(fā)酵培養(yǎng)基洗滌1次，按3～5％接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃搖床培育過(guò)夜至OD600為0.5～0.6時(shí)，將溫度升高至37℃，再培養(yǎng)48h，讓莽草酸充分表達(dá)累積。
(10)莽草酸純化。采用離子交換色譜法對(duì)表達(dá)的莽草酸進(jìn)行分離，然后進(jìn)一步通過(guò)重結(jié)晶法純化莽草酸。
實(shí)施的具體步驟分別敘述如下1.用Red重組系統(tǒng)快速敲除E.coli DH5α的aroL基因和aroK基因，獲得aroK-/aroL-菌株。
1.1 PCR引物的設(shè)計(jì)用于同源重組引物設(shè)計(jì)的原則是5’端的基因同源區(qū)和3’端的氯霉素抗性基因同源區(qū)組成，用于擴(kuò)增氯霉素抗性基因。鑒定引物分別從目的基因的上下游設(shè)計(jì)。
1)L基因的同源重組引物分別為L(zhǎng)1見(jiàn)序列表中序列1；L2見(jiàn)序列表中序列2；2)K基因的同源重組引物分別為P1見(jiàn)序列表中序列3；P2見(jiàn)序列表中序列4；1.2 Red重組系統(tǒng)的誘導(dǎo)和感受態(tài)細(xì)胞的制備將轉(zhuǎn)化有pKD46的DH5α菌株接種，30℃培養(yǎng)過(guò)夜；次日150接種至100ml LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度為50mg/ml)，30℃培養(yǎng)至A600≈0.25時(shí)，加入L-阿拉伯糖至30mmol/L，誘導(dǎo)1h(A600不能超過(guò)0.6)，使pKD46上的Exo、Bet和Gam三個(gè)蛋白充分表達(dá)。冰上預(yù)冷10分鐘，4000rpm/min，4℃離心10min，棄培養(yǎng)基；用預(yù)冷10％甘油離心洗滌3次，濃縮成100倍成1ml的感受態(tài)細(xì)胞，每管100ul。
1.3電轉(zhuǎn)化將同源臂引物擴(kuò)增的氯霉素抗性基因片段約200ng加入感受態(tài)細(xì)胞，混勻，轉(zhuǎn)入0.2cm電擊杯中，用Bio-Rad電擊儀作電轉(zhuǎn)化。電擊條件200Ω，25uF，電擊電壓2.3kV，電擊時(shí)間為4-5ms，電擊后迅速加入1ml的LB，150rpm/min，37℃培養(yǎng)1h，之后涂于氯霉素平板(氯霉素濃度為34ug/ml)；12h后用PCR法鑒定長(zhǎng)出的氯霉素抗性克隆(如圖3)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)aroL同源區(qū)序列已被氯霉素抗性基因替換。
1.4 FLP位點(diǎn)專一性重組將pCP20轉(zhuǎn)入氯霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過(guò)夜，熱誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，質(zhì)粒也逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無(wú)抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到氯霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為氯霉素抗性基因已被Flp重組酶刪除。用鑒定引物作PCR對(duì)氯霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。
1.5同理繼續(xù)使用Red重組系統(tǒng)敲除aroK基因。
PCR法鑒定長(zhǎng)出的氯霉素抗性克隆(如圖4)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)aroK同源區(qū)序列已被氯霉素抗性基因替換，最后使用FLP位點(diǎn)專一性重組消除氯霉素抗性基因。
1.6營(yíng)養(yǎng)缺陷型表型鑒定挑取陽(yáng)性菌種的單克隆接種于2ml LB(Kan 50ug/ml)中，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，用0.9％的生理鹽水細(xì)菌一次，離心棄上清，所得菌體重懸生理鹽水中，然后分別接種于M9(另含Vit PP 4ug/ml，VitB 1 4ug/ml)培養(yǎng)基和M9加對(duì)氨基苯甲酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸各40ug/ml的培養(yǎng)基固體平板中，以野生型菌株為對(duì)照，37℃培養(yǎng)36hr，觀察生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示突變體在M9培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，只要在M9培養(yǎng)基中添加了芳香氨基酸和PABA才能生長(zhǎng)，但與野生型DH5α菌株相比，突變體生長(zhǎng)較為遲緩。提示突變體aroK和aroL基因功能的缺失。
2.構(gòu)建多基因盒aroEaroFaroBkan2.1 PCR擴(kuò)增目的基因aroF、aroB、aroE、shiA、kan；
以E.coli DH5α全DNA為模板，用相應(yīng)的寡聚核苷酸引物擴(kuò)增目的基因；相應(yīng)的5’端寡核苷酸引物包含Ptac全序列。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3，4，5所示。
PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)序列表中序列5-17；2.2多基因盒的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，用相應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切，直接插入到pUC19或pET32a載體中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-shiA，pET32a-aroF，pET32a-aroB，pET32a-aroE，pET32a-kan。然后pET32a-aroB和pET32a-kan分別用Xba I和Msc I雙酶切，前者回收線性化pET32a-aroB，后者回收基因kan，然后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定；接著，pET32a-aroBkan和aroF用Nsp V和KpnI雙酶切，前者回收線性化的pET32a-aroBkan，后者回收基因aroF，然后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定；進(jìn)一步，pET32a-aroFaroBkan和pET32a-aroE用BamH I和Kpn I雙酶切，前者回收線性化pET32a-aroFaroBkan，后者回收基因aroE，然后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得pET32a-aroEaroFaroBkan，挑取克隆通過(guò)PCR鑒定，如圖6；測(cè)序結(jié)果顯示連接序列正確。
2.3 pUC19-shiAaroEaroFaroBkanshiA的構(gòu)建利用shiA基因內(nèi)部的BglII酶切位點(diǎn)把pUC19-shiA切開(kāi)，同時(shí)用Bgl II和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pET32a-aroEaroFaroBkan，回收基因盒aroEaroFaroBkan，利用BglII和BamH I是同尾酶的特點(diǎn)，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，然后進(jìn)行PCR鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示連接結(jié)果正確。
3.進(jìn)一步利用Red重組系統(tǒng)進(jìn)行shiA基因敲除和基因替換基因盒插入shiA的中間，因此基因盒兩端各有大約140bp的序列與宿主菌的基因組染色體同源。用shiA兩端的酶切位點(diǎn)把shiA連同基因盒一起酶切下，實(shí)現(xiàn)DNA片段的線性化。然后按照與步驟1的Red重組技術(shù)從aroK-/aroL-菌株中敲除shiA基因，敲入基因盒shiAaroEaroFaroBkanshiA，從而獲得莽草酸工程菌Escherichia coli DH5α△SE。
4.莽草酸工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)挑單個(gè)莽草酸工程菌Escherichia coli DH5α△SE接種于3ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培育過(guò)夜，用生理鹽水洗滌1次，用發(fā)酵培養(yǎng)基洗滌1次，按3～5％接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃搖床培育過(guò)夜至OD600為0.5～0.6時(shí)，將溫度升高至37℃，再培養(yǎng)48h，讓莽草酸充分表達(dá)累積。離心，上清用離子交換色譜法分離，進(jìn)一步通過(guò)重結(jié)晶純化。結(jié)果如表1所示?？梢钥吹教窍臎](méi)有明顯差異，而莽草酸酸產(chǎn)量提高了3.07倍。
表1搖瓶發(fā)酵的莽草酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率

序列表<110>汪莉<120>一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法及所使用的工程菌<130>
<160>17<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>70<212>DNA<213>
<400>1atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac agcgattgtg60taggctggag 70<210>2<211>76<212>DNA<213>
<400>2tcaacaattg atcgtctgtg ccagggcgct gcgaatttca gaaatcacct taattaacgg60ctgacatggg aattag76<210>3<211>70<212>DNA<213>
<400>3atggcagaga aacgcaatat ctttctggtt gggcctatgg gtgccggaaa agcgattgtg60taggctggag 70<210>4<211>76<212>DNA<213>
<400>4ttagttgctt tccagcatgt gaataatctg gtttgcaacc actttagcgc taattaacgg60ctgacatggg aattag76
<210>5<211>106<212>DNA<213>
<400>5cgggatcctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa60caatttcaca caggaaacag tattcatgga tgttaccgca aaatac 106<210>6<211>37<212>DNA<213>
<400>6ataagaatgc ggccgcttag gcaccgaacc ccatgac37<210>7<211>45<212>DNA<213>
<400>7cggggtacct gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgc 45<210>8<211>108<212>DNA<213>
<400>8ggaattcggt acctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg60gataacaatt tcacacagga aacagtattc atgcaaaaag acgcgctg108<210>9<211>37<212>DNA<213>
<400>9ataagaatgc ggccgcttaa gccacgcgag ccgtcag37<210>10<211>45<212>DNA
<213>
<400>10cggttcgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgc45<210>11<211>107<212>DNA<213>
<400>11ggaattcgaa tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat60aacaatttca cacaggaaac agtattcatg gagaggattg tcgttac 107<210>12<211>36<212>DNA<213>
<400>12ataagaatgc ggccgcttac gctgattgac aatcgg 36<210>13<211>44<212>DNA<213>
<400>13cgtggccatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgc44<210>14<211>31<212>DNA<213>
<400>14cgtggccatc atgaacaata aaactgtctg c 31<210>15<211>35<212>DNA<213>
<400>15gctctagatc tcaggtggca cttttcgggg aaatg 35<210>16
<211>27<212>DNA<213>
<400>16cgggatccat gctgattctg actcgtc 27<210>17<211>29<212>DNA<213>
<400>17cgggatccga acgggagtaa agcgaaaag 29
權(quán)利要求
1.一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法，主要包括以下步驟(1)利用基因工程技術(shù)構(gòu)建莽草酸代謝途徑限速酶的aroEaroFaroBkan多基因盒；(2)利用Red重組系統(tǒng)敲除細(xì)菌中的莽草酸激酶同工酶aroK和aroL；(3)敲除細(xì)菌中的shiA基因，并敲入aroEaroFaroBkan多基因盒；(4)利用基因工程技術(shù)發(fā)酵該重組工程菌獲得莽草酸；(5)分離、純化莽草酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中aroEaroFaroBkan多基因盒的構(gòu)建方法包括如下步驟(1)PCR擴(kuò)增基因aroF、aroB、aroE、shiA、kan，前三個(gè)基因中每個(gè)基因的5’端加入Ptac強(qiáng)啟動(dòng)子；(2)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-shiA，pET32a-aroF，pET32a-aroB，pET32a-aroE，pET32a-kan；(3)構(gòu)建aroEaroFaroBkan多基因盒將三個(gè)基因aroF、aroB、aroE通過(guò)酶切順序連接，并加入kan抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中細(xì)菌為大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中利用Red重組系統(tǒng)敲除aroK和aroL，構(gòu)建aroK-/aroL-的工程菌株，步驟如下(1)用于同源重組的引物5’端為aroK基因兩側(cè)的同源臂，3’端為用于擴(kuò)增氯霉素抗性基因的引物，同理設(shè)計(jì)aroL氯霉素抗性基因引物；PCR擴(kuò)增帶FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因；(2)將以上的線性片段轉(zhuǎn)入表達(dá)Red重組酶的菌株中；(3)選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體；(4)FLP重組酶消除氯霉素抗性基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中敲入aroEaroFaroBkan多基因盒采用脈沖電轉(zhuǎn)化多基因盒線性片段方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中分離純化莽草酸采用離子交換色譜法及重結(jié)晶法。
7.權(quán)利要求1所述方法中的重組工程菌，其特征在于該工程菌敲除了aroK和aroL基因，包含由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptac、莽草酸合成途徑的限速酶aroF、aroB、aroE及抗性基因kan組成的aroEaroFaroBkan多基因盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述重組工程菌，其特征在于該工程菌為大腸桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述重組工程菌，其特征在于該工程菌為大腸桿菌DH5α。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用生物合成技術(shù)制備莽草酸的方法，還公開(kāi)了該方法中所用的重組大腸桿菌。本發(fā)明的方法包括構(gòu)建包含莽草酸代謝途徑限速酶多基因盒的載體；將多基因盒替代shiA基因；利用Red重組系統(tǒng)敲除細(xì)菌中的莽草酸激酶同工酶；發(fā)酵重組工程菌獲得莽草酸及莽草酸純化等步驟。通過(guò)本發(fā)明的方法，可以提高莽草酸的表達(dá)產(chǎn)量，降低生產(chǎn)莽草酸成本，為生產(chǎn)防治流感藥物達(dá)菲提供原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101085998SQ200710110469
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日 公開(kāi)號(hào)200710110469.0
發(fā)明者汪莉 申請(qǐng)人:汪莉