專利名稱：新基因細胞周期相關(guān)腫瘤高表達基因單克隆抗體的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新基因細胞周期相關(guān)腫瘤高表達基因CREPT (cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor， XM—012930)單克隆抗體的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
P15皿"是細胞周期依賴激酶抑制因子(CKI)家族中的一員，定位于9號染色體9P21區(qū)， 此位點易發(fā)生缺失、^變和甲基化，在細胞增殖和很多腫瘤發(fā)生中起重要作用。pl5,h基因 是一種抑制細胞增殖的細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，它能使細胞停留在Gl期,從而抑制 細胞的增殖和生長。pl5RS基因?qū)毎芷谟忻黠@的調(diào)控作用；P15RS在細胞周期調(diào)控方便 也起了不可缺少的作用，它可以在Gl期充當(dāng)一個負調(diào)控子。CREPT是我們以pl5,b相關(guān)基 因pl5RS (AK001518)作為誘餌，在GenBank中用細胞信息學(xué)方法進行Blast搜尋，得到的一 個pl5相關(guān)基因的同源基因。CREPT定位于人類20號染色體上約56kb的范圍內(nèi)，具有7個 外顯子。序列相似性分析顯示CREPT基因與pl5rs的同源性達67%。既然PW和pl5RS 基因在細胞周期和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮了如此重要的作用，那么CREPT基因在細胞周期調(diào)控 和腫瘤發(fā)生中又發(fā)揮什么樣的作用呢？我們初步的研究表明CREPT基因在腎癌細胞系和腎癌 組織中的表達明顯高于非腫瘤細胞系和正常組織，表明CREPT基因的表達與腎癌發(fā)生相關(guān)， 也說明CREPT基因的表達直接或間接地促進細胞的增殖。為檢測內(nèi)源性CREPT蛋白水平，特 別是觀察在其他正?；蛘吣[瘤細胞和組織中CREPT的表達狀態(tài)，以期進一步探討CREPT基因 與腫瘤和細胞周期之間可能存在的相互關(guān)系，我們制備了特異性識別人和小鼠CREPT蛋白的 多克隆抗體和單克隆抗體，對一些常用細胞系中的CREPT蛋白水平進行了檢測，為其功能的 深入研究提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新基因細胞周期相關(guān)腫瘤高表達基因(CREPT;即cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor;以下簡稱CREPT)單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用。
新基因CREPT是'序列表中序列表中SEQ ID No.l的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No.l 的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No.l相 同活性的由SEQ ID No.l衍生的蛋白。
序列表中SEQ ID No.l的蛋白全長326個氨基酸，定位于人類20號染色體上約56kb的
范圍內(nèi)，具有7個外顯子。序列相似性分析顯示CREPT基因與pl5rs的同源性達67% ; GenBank 中檢索發(fā)現(xiàn)，在人、小鼠、斑馬魚、雞、青蛙、四膜蟲、蜜蜂、蚊子、螞蟻、果蠅、酵母、 甚至一些植物等生物體中均十分保守。
我們首先在大腸桿菌五.co/沖表達了GST-CREPT融合蛋白，然后通過還原性GST純化出該 融合蛋白，以純化得出的融合蛋白為抗原，免疫小鼠和兔子，分別得到了CREPT蛋白的多克 隆和單克隆抗體。酶聯(lián)免疫反應(yīng)驗證我們從單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中直接獲得的單克隆 抗體效價可以達到l: 25600以上；利用其中l(wèi)株雜交瘤細胞免疫小鼠，所得腹水抗體效價可達 到l: 2048000以上。進一步，我們利用得到的多克隆抗體和單克隆抗體進行了Sandwich和 Captute ELISA，實驗結(jié)果表明該抗體能夠檢測到的最低抗原量可達到20ng/ml。接下來，我 們利用免疫雜交實驗證明了該多克隆抗體和單克隆抗體均識別內(nèi)源性的CREPT蛋白，與RT-PCR 結(jié)果保持一致。這些結(jié)果為我們進一步深入研究CREPT基因的功能提供了依據(jù)。
有報道發(fā)現(xiàn)，pl5,b基因是一種抑制細胞增殖的細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，它能使 細胞停留在G1期,從而抑制細胞的增殖和生長。pl5RS基因?qū)毎芷谟忻黠@的調(diào)控作用； P15RS在細胞周期調(diào)控方便也起了不可缺少的作用，它可以在G1期充當(dāng)一個負調(diào)控子。CREPT 是我們以Pl5,b相關(guān)基因pl5RS (AK001518)作為誘餌，在GenBank中用細胞信息學(xué)方法進行 Blast搜尋，得到的一個p15相關(guān)基因的同源基因。序列相似性分析顯示CREPT基因與pl5rs 的同源性達67%。我們初步的研究表明CREPT基因在腎癌細胞系和腎癌組織中的表達明顯高 于非腫瘤細胞系和正常組織，表明CREPT基因的表達與腎癌發(fā)生相關(guān)，也說明CREPT基因的表 達直接或間接地促進細胞的增殖。本發(fā)明顯示，我們制備的單克隆抗體效價較高，該抗體靈 f度高、特異性強，測定CREPT蛋白最高靈敏度為20ng/ml,且與別的無關(guān)抗原不存在交叉反 應(yīng)性；進一步的免疫印跡和RT-PCR顯示該蛋白在許多腫瘤細胞系中均有表達，也說明該基因 在細胞周期和腫瘤發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要的作用。
總之，CREPT蛋白單克隆抗體的制備為檢測內(nèi)源性CREPT蛋白水平，特別是觀察在其他 正常或者腫瘤細胞和組織中CREPT的表達狀態(tài)，以期進一步探討CREPT基因與腫瘤和細胞周 期之間可能存在的相互關(guān)系及其功能的深入研究提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。


圖l誘導(dǎo)后以及純化的GST-CREPT的SDS-PAGE分析。Marker:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； Sypernate:超聲裂解、離心沉淀后的上清樣品；Flow-through:純化時過完柱子后的流出 液；Elution 1-7:純化之后的GST-CREPT融合蛋白。
圖2多克隆抗體檢測293T細胞中CREPT蛋白及其兩個缺失體的表達。在293T細胞內(nèi)
分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag、 pcDNA3.1-Flag/crept及其兩個缺失體pcDNA3.1-Flag/crept-RPR和 pcDNA3.1-Flag/crept-CCT，轉(zhuǎn)染24hr后，裂解細胞進行western blot，用CREPT多克隆抗體 為一抗。結(jié)果表明該多抗不但識別全長的CREPT蛋白，而且識別其氨基端和羧基端兩個不同 的缺失體。圖2上圖曝光時間較短，看不到氨基端的表達(CREPT-RPR)，當(dāng)曝光時間稍長時， 就可以看到其表達。
圖3和圖4單克隆抗體的酶聯(lián)效價及CREPT抗原的敏感度檢測。圖3. l檢測3株雜交瘤細胞 的培養(yǎng)上清，實驗結(jié)果表明3株細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體4H1、 5F4和3G4的效價較好，三種抗 體均達到l: 25600以上(3G4圖未顯示)。圖3.2檢測所得腹水，實驗結(jié)果表明4H1所產(chǎn)生的腹 水效價較高，均達到h 2048000以上，并且不同個體之間所產(chǎn)生的抗體效價差異較小(4H1-1 和2分別代表不同的小鼠所產(chǎn)生的腹水)。圖4. l利用sandwich ELISA方法，用不同稀釋倍數(shù) 的多抗(l: 50; 1: 100; 1: 200; 1: 400)包被檢測不同稀釋倍數(shù)的抗原;圖4. 2利用capture ELISA方法，用不同稀釋倍數(shù)的單抗(1: 1; 1: 2; 5F4上清)包被檢測不同稀釋倍數(shù)的抗原； 函4均表明該抗體檢測抗原的靈敏度可達到20ng/ml。
圖5檢測293T細胞中CREPT蛋白及其兩個缺失體的表達。用與圖2相同的細胞裂解液，以 Flag抗體作為陽性對照，用單抗5F4、 4Hl和3G4分別進行western blot。實驗結(jié)果表明5F4、 4H1和3G4單抗都識別全長的CREPT蛋白和羧基端缺失體而不識別CREPT蛋白氨基端的缺失體。 4H1和3G4均識別內(nèi)源性CREPT蛋白。
圖6內(nèi)源性CREPT的檢測。圖6上用免疫雜交實驗檢測了CREPT蛋白在一些細胞系中的表 達；圖6中下分別是用RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平上的表達，圖6中是全長，圖6下是其氨基端的RPR結(jié) 構(gòu)域。
具體實施例方式
實施例1、 CREPT蛋白相關(guān)表達載體的構(gòu)建。
根據(jù)GenBank中基因序列及表達載體的閱讀框設(shè)計特異性引物進行PCR反應(yīng)，分別克 隆得到了原核表達載體pGEX-5X-2/CREPT,真核表達載體Flag-pcDNA3.1/CREPT (全長)， Flag-pcDNA3.1/CREPT/CCT(CREPT羧基端)，F(xiàn)lag-pcDNA3.1/CREPT7RPR(CREPT氨基端)， 克隆CREPT表達載體及其缺失體以質(zhì)粒pcDNA6/CREPT為模板。反應(yīng)條件為首先95'C變 性5min;然后PCR循環(huán)94。C變性30s, 60'C退火30s, 72'C延伸60s，進行30個循環(huán)；最后 72'C延伸10min。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，克隆完成后測序鑒定融合蛋白閱讀框 正確。
P'CR反應(yīng)的引物如下
F/CREPT/pcDNA3.1 (pGEX-5X-2) : 5'-TATGAATTCAGGATGTTGTGTCCACGTATG-3' R/CREPT/pcDNA3.1 (pGEX-5X-2) : 5，-TATGAATTCTAGGATGTTGTGTCCACGTATG-3' R/ CREPT-RPR/ pcDNA3.1: 5，-TATAGTCGACTCAGGAGGAGTCTGTACAGG- 3' F/CREPT-CCT/ pcDN乂3.1: 5'-TATGAATTCGAAT(3CCGCTGCACAGGTAT-3' 實施例2、 GST-CREPT融合蛋白的原核表達和純化及其檢測。
為了深入研究CREPT的功能，利用在大腸桿菌Eco/!'中表達了 GST-CREPT融合蛋白， 然后通過還原性GST純化出該融合蛋白(圖l)，以純化得出的融合蛋白為抗原，免疫小鼠， 免疫小鼠是使用5周齡雌性BALB/C小鼠,每只小鼠免疫30u g抗原,在四肢的淋巴結(jié)附件皮 下多點注射，0. 3ml/只。每間隔3天免疫1次，共3次。第1次與完全福氏佐劑混合免疫，后 兩次與不完全福氏佐劑混合免疫。免疫3次后,眼眶采血測抗體效價,選擇血清抗體效價達1 X 105的小鼠,于融合前3天加強免疫1次。
取對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤Sp2/0細胞和免疫小鼠的脾細胞按常規(guī)PEG方法融合,有限 稀釋法克隆細胞，間接'ELISA篩選特異性抗體,克隆化后的細胞株經(jīng)傳代確定為穩(wěn)定的細胞株 后,液氮保存,共克隆出4株細胞。即得到了 CREPT蛋白單克隆抗體。
酶聯(lián)免疫反應(yīng)驗證我們從單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中直接獲得的單克隆抗體效價可 以達到l: 25600以上(圖3上)；利用其中l(wèi)株雜交瘤細胞免疫小鼠，所得腹水抗體效價 可達到l: 2048000以上(圖3下)。進一步，我們利用得到的多克隆抗體和單克隆抗體進 行了 Sandwich和Captute ELISA (圖4)，以純化后倍比稀釋的GST-CREPT融合蛋白為標(biāo)準(zhǔn) 檢測品，以牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照(圖4上是sandwich ELISA和圖4下是capture ELISA)試驗。以檢測孔與陰性對照孔0D值的比值大于2. 1 (P/N》2. 1)為陽性結(jié)果。實驗結(jié) 果表明該抗體檢測抗原的靈敏度可達到20ng/ml。 實施例3、 CREPT抗體特異性檢測。
. 將構(gòu)建好的表達載體pcDNA3. 1-Flag/cr印t及其兩個缺失體pcDNA3. 1-Flag/cr印t-RPR和 pcDNA3.1-Flag/cr印t-CCT，以pcDNA3.1-Flag為對照分別轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染24hr后，用細 胞裂解液裂解細胞進行western blot檢測。以Flag抗體作為陽性對照，可以檢測到帶Flag的 CREPT融合蛋白以及兩個缺失體，對照組沒有條帶(圖5上)。用我們所得到的多克隆抗體和 單克隆抗體分別檢測，多克隆抗體的western blot結(jié)果表明該多抗不但識別全長的CREPT蛋 白，而且識別其氨基端和羧基端兩個不同的缺失體，同時還識別內(nèi)源性CREPT的表達(圖2)。 圖2上圖曝光時間較短，看不到氨基端的表達(CREPT-RPR)，當(dāng)曝光時間稍長時，就可以看 到其表達。當(dāng)分別以5F4、 4H1、 2G4和3G4為一抗檢測CREPT全長以及兩個缺失體時，除了2G4 不識別CREPT全長以及兩個缺失體外，而其余3株單克隆抗體都識別CREPT全長及其羧基端，卻
不識別其氨基端(圖5)。與此同時，4H1和3G4能夠識別內(nèi)源性CREPT蛋白的表達(圖5下)。 同我們ELISA檢測的結(jié)果一致。
實施例4、內(nèi)源性CREPT的檢測。
pl5INK4b基因是一種抑制細胞增殖的細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，它能使細胞停留在 Gl期,從而抑制細胞的增殖和生長。pl5RS基因?qū)毎芷谟忻黠@的調(diào)控作用；CREPT基因在 腎癌細胞系和腎癌組織中的表達明顯高于非腫瘤細胞系和正常組織。為檢測內(nèi)源性CREPT蛋 白水平，特別是觀察在其他正?；蛘吣[瘤細胞和組織中CREPT的表達狀態(tài)，以期進一步探討 CREPT基因與腫瘤和細胞周期之間可能存在的相互關(guān)系，我們制備了特異性識別人和小鼠 CREPT的多克隆抗體和單克隆抗體。既然4H1單克隆抗體能夠識別內(nèi)源性CREPT蛋白的表達， 進一步，利用免疫雜交方法檢測了幾種常用細胞系中CREPT的表達。結(jié)果表明CREPT在大多 數(shù)細胞內(nèi)存在(圖6上)。同時利用RT-PCR檢測了 CREPT在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(圖6中)， 結(jié)果與免疫雜交結(jié)果基本一致。而CREPT蛋白的氨基端RPR結(jié)構(gòu)域在幾乎所有細胞中均存在 (圖6下)。以上結(jié)果也說明了該基因在生物體生長發(fā)育以及疾病發(fā)生過程中可能發(fā)揮了不 可缺少的作用。同時為該基因重要功能的探索奠定了基礎(chǔ)和提供了依據(jù)。 序列表
<160>1
<210>1
<211>326
<212>PRT
<213>小鼠(Homo Sapiens) <400>1
1 maftasqrwe egqarqigfr frwal叩erl amplhkypvw lwkrlqlreg icsrlpghyl 61 rsleeertpt pvhyrphgak fki叩kngqr ervedvpipi yfppesqrgl wggegwilgq 121 iyarmdklsk rlkkvwkpql ferefyseil dkkftvtvtm rtldlideay gldfyilktp .181 kedlcskfgm dlkrgmllrl arqdpqlhpe dperraaiyd kykefaipee eaewvgltle 241 eaiekqrlle ekdpvplfki yvaeliqqlq qqals印avv qkrasgq
權(quán)利要求
1、新基因CREPT單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性研究。CREPT是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白。
2、 含有權(quán)利要求l所述蛋白編碼蛋白的制備的多克隆抗體。
3、 含有權(quán)利要求l所述蛋白編碼蛋白的制備的單克隆抗體。
4、 含有權(quán)利要求l所述蛋白編碼基因的表達載體。
5、 含有權(quán)利要求1所述蛋白編碼基因的細胞系。
6、 權(quán)利要求1所述蛋白及其編碼基因在構(gòu)建抗腫瘤藥物篩選模型中的應(yīng)用。
7、 權(quán)利要求1所述蛋白及其編碼基因在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了新基因細胞周期相關(guān)腫瘤高表達基因CREPT(cell-cycle related andexpression-elevated protein in tumor)單克隆抗體的制備及應(yīng)用，它是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白。利用DNA重組技術(shù)，將編碼人CREPT蛋白全長的DNA片段構(gòu)建于融合表達質(zhì)粒pGEX/5X-2中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用純化的GST-CREPT融合蛋白，制備了特異性識別人和小鼠細胞內(nèi)CREPT蛋白的單克隆和多克隆抗體。同時采用ELISA間接法以及夾心ELISA法對所得單克隆抗體進行篩選，并對細胞的內(nèi)源性CREPT蛋白進行了檢測。發(fā)現(xiàn)該抗體靈敏度高、特異性強，測定CREPT蛋白最高靈敏度為20ng/ml，且與別的無關(guān)抗原不存在交叉反應(yīng)性；該基因在許多腫瘤細胞系中均有表達。以上結(jié)果為進一步探討CREPT基因與腫瘤和細胞周期之間可能存在的相互關(guān)系及其功能的深入研究提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/10GK101113170SQ200710079709
公開日2008年1月30日 申請日期2007年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月5日
發(fā)明者任芳麗, 常智杰, 王銀銀, 胡建祥, 斌 韓 申請人:北京賽爾泰和生物醫(yī)藥科技有限公司