專利名稱：抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的序列，所述序列為SEQ ID NO1和SEQID NO2。本發(fā)明涉及含有上述序列的質(zhì)粒，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2，及所述序列和質(zhì)粒在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1(Cyclin B1；CCNB1)有稱之為G2/mitotic specific cyclin B1 CCNB。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在裂殖酵母有三種B型周期蛋白。其中之一是Cdc13，這是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂所必需的。Booher，Beach初次報(bào)道本發(fā)明所述的基因序列[Booher，Beach(1988)EMBO J 72321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91587]。其他兩個(gè)名為Cig1[Bueno et al.(1991)Cell 65149]和Cig2[Bueno，Russell(1993)Mol Cell Biol 132286；Connolly，Beach(1994)Mol CellBiol 14768]，)它們并非有絲分裂周期所必需的。Gautier等證明，與Cdc2結(jié)合成復(fù)合物的周期蛋白B是非洲爪蟾MPF的主要成分[Gautier et al.(1990)Cell 60487]。
Pines和Hunter克隆到編碼周期蛋白B的人類基因[Pines，Hunter(1989)Cell 58833]，他們與Giordano等一道[Giordano et al.(1989)Cell 58981]也證明人周期蛋白B和Cdc2之間所形成的復(fù)合物在有絲分裂期間作為激酶其活性最高。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在細(xì)胞周期的調(diào)控中，有三類分子起著重要作用，分別為細(xì)胞周期素(Cyclins)、細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制子(CKIs)。其中Cyclins和CDKs對細(xì)胞周期起正性調(diào)控作用，CKIs起負(fù)性調(diào)控作用。當(dāng)受到生長信號的刺激時(shí)，Cyclins表達(dá)上調(diào)，激活相應(yīng)CDKs，形成Cyclins/CDKs復(fù)合物，使多種底物蛋白磷酸化，從而推動細(xì)胞沿細(xì)胞周期不斷分裂增殖。CKIs可以與Cyclins、CDKs或兩者的復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而起到負(fù)性調(diào)控的作用。
目前已經(jīng)確定的Cyclins共有11種，其中Cyclins D和Cyclins E主要調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換，CyclinsA主要調(diào)控S期的進(jìn)展，而Cyclins B主要與G2/M期轉(zhuǎn)換有關(guān)。
細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1是Cyclin B家族的成員之一[Brandeis M，Rosewell I，Carrington M，Crompton T，Jacobs MA，Kirk J，Gannon J，Hunt T.CyclinB2-null mice develop normally and are fertile whereas cyclin B1-null mice die in utero.Proc.Nat.Acad.Sci.954344-4349，1998]。其基因由九個(gè)外顯子和八個(gè)內(nèi)含子組成。基因的表達(dá)從S期后期開始，G2期達(dá)到最高峰，進(jìn)入M期后其蛋白產(chǎn)物降解失活。在Cyclin B1的誘導(dǎo)下，CDC2(又稱CDK1、P34)的激活酶CAK(主要由CDK7和Cyclin H組成)將其磷酸化，緊接著在有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的Weel/Mik1作用下，它又被再次磷酸化而失活。在G2/M期過渡時(shí)，磷酸化酶CDC25C解除這一使CDK1失活的磷酸化，使之具有蛋白激酶活性，因此，Cyclin B1/CDC2被認(rèn)為是有活性的成熟促進(jìn)因子(MPF，也稱M期促進(jìn)因子)。反過來，激活的CyclinB1/CDC2又能磷酸化CDC25C來促進(jìn)Cyclin B1/CDK1的磷酸化，如此形成了一個(gè)正反饋環(huán)路[Poon RY，Chau MS，Yamashita K，Hunter T.The role of Cdc2feedback loop control in the DNA damage checkpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)5168-78.]。CDC25C的活化需要PLK激酶的參與，有證據(jù)表明，CDC2本身就能激活PLK的活性，這又構(gòu)成了另一條正反饋途徑。在這些正反饋途徑的綜合作用下，MPF在激酶活性上完成瞬間的爆發(fā)式增加[Roshak AK，Capper EA，Imburgia C，F(xiàn)ornwald J，Scott G，Marshall LA.The human polo-like kinase，PLK，regulates cdc2/cyclin B through phosphorylation and activation of the cdc25Cphosphatase.Cell Signal.2000 Jun；12(6)405-11.；Yoshima-Morimoto F，Taniguchi E，Shinya N，Iwamatsu A，Nishida E.Polo-like kinase 1 phosphorylates cyclin B1 andtargets it to the nucleus during prophase.Nature.2001 Mar 8；410(6825)215-20.Erratum inNaure 2001 Apr 12；410(6830)847.；Yuan J，Eckerdt F，Bereiter-Hahn J，Kurunci-Csacsko E，Kaufmann M，Strebhardt K.Cooperative phosphorylationincluding the activity of polo-like kinase 1 regulates the subcellular localization ofcyclin B1.Oncogene.2002 Nov 28；21(54)8282-92.]。Cyclin B1/CDC2復(fù)合物從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，使相應(yīng)的底物磷酸化，推動G2/M期轉(zhuǎn)換。
Hunter等人認(rèn)為，在惡性細(xì)胞進(jìn)入S期和G2期時(shí)，Cyclin B1過表達(dá)并積累，與CDC2形成過多的成熟促進(jìn)因子，在活性和功能異常的Weel/Mik1、CAK的作用下形成不成熟激活的Cyclin B1/CDC2/CDC25C正反饋環(huán)，激活腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的成熟促進(jìn)因子，其高水平表達(dá)觸發(fā)并通過惡性細(xì)胞有缺陷的G2/M期監(jiān)測點(diǎn)而引發(fā)核內(nèi)重要蛋白結(jié)構(gòu)的改變，推動細(xì)胞進(jìn)入M期[Poon RY，Chau MS，Yamashita K，Hunter T.The role of Cdc2 feedback loop control in the DNA damagecheckpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)5168-78.；WatanabeN，Broome M，Hunter T.Regulation of the human WEE1Hu CDK tyrosine 15-kinaseduring the cell cycle.EMBO J.1995 May 1；14(9)1878-91.]。
Cyclin B1蛋白也是一種公知的蛋白序列[參見Booher，Beach(1988)EMBO J72321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91587]，在腦膠質(zhì)瘤、喉鱗癌、舌鱗癌、血管瘤、小細(xì)胞肺癌、滋養(yǎng)細(xì)胞疾病、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、非何杰金淋巴瘤、直腸癌以及肝癌等腫瘤中均有過表達(dá)。[Holtkamp N，Afanasieva A，Elstner A，Brain slice invasion model reveals genes differentially regulated in glioma invasion.Biochem Biophys Res Commun.2005 Nov 4；336(4)1227-33.；Bondi J，Husdal A，Bukholm G，Expression and gene amplification of primary(A，B1，D1，D3，and E)andsecondary(C and H)cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patientoutcome.J Clin Pathol.2005 May；58(5)509-14.；Mao Y，Wu J，Skog S，Expressionof cell proliferating genes in patients with non-small cell lung cancer byimmunohistochemistry and cDNA profiling.Oncol Rep.2005 May；13(5)837-46.；Bjorck E，Ek S，Landgren O，High expression of cyclin B1 predicts a favorable outcomein patients with follicular lymphoma.Blood.2005 Apr 1；105(7)2908-15.Epub 2004Dec 2.]?，F(xiàn)有技術(shù)中未見報(bào)道哺乳動物包括人細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1在促進(jìn)人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
本發(fā)明申請人在專利申請200610095761.5中公開了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinB1在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移藥物中的用途。在該發(fā)明的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人構(gòu)建了兩個(gè)短序列，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。同時(shí)將這兩個(gè)序列構(gòu)建到質(zhì)粒載體pGCsi/U6/neo/GFP中，形成pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2(保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號；保藏日期2006年12月12日；保藏編號CGMCCNo.1885和CGMCCNo.1886；分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli)，所述質(zhì)粒載體在脊椎動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)針對CCNB1構(gòu)建了兩個(gè)靶點(diǎn)的RNAi載體，經(jīng)測序證實(shí)了克隆的RNAi打靶序列100％正確。該載體可同時(shí)表達(dá)GFP，用于判斷轉(zhuǎn)染效率。
申請人研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2可以干擾人類食管癌細(xì)胞內(nèi)源性Cyclin B1在RNA水平、蛋白水平的表達(dá)，可以特異性的阻遏人類食管癌的肺轉(zhuǎn)移。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的序列，所述序列為SEQ ID NO1(基因名稱CCNB1-1)和SEQ ID NO2(基因名稱CCNB1-3)。
另一方面，本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO1的pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1質(zhì)粒和含有SEQ ID NO2的pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明序列和含有所述序列的質(zhì)粒在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
本發(fā)明的序列可以通過本領(lǐng)域已知的方法得到，包括化學(xué)合成、固相合成等。


圖1是質(zhì)粒(載體)特征圖，其中shRNA代表本發(fā)明序列SEQ ID NO1或SEQ IDNO2。
圖2，3顯示了質(zhì)粒的測序結(jié)果，其中劃線部分為所需要的片段序列和其反義核苷酸序列，其與設(shè)計(jì)得到的序列完全一致。
圖4是Western blot檢測12株食管癌細(xì)胞Cyclin B1蛋白的表達(dá)圖，其中現(xiàn)有技術(shù)的方法提取KYSE2，KYSE30，KYSE140，KYSE150，KYSE180，KYSE410，KYSE450，KYSE510，COLO-680，EC9706，T12，KYSE70等12株食管癌細(xì)胞的總蛋白，采用Western blot方法檢測Cyclin B1蛋白的表達(dá)水平，圖中條帶深淺代表蛋白表達(dá)水平的高低。EC9706作為Cyclin B1高表達(dá)的研究對象。
圖5是單克隆的篩選與鑒定(Western Blot)圖，其中提取不同單克隆細(xì)胞的總蛋白，采用Western blot方法檢測Cyclin B1蛋白的表達(dá)水平，圖中條帶深淺代表蛋白表達(dá)水平的高低。挑選編號為17、42的單克隆細(xì)胞作為低表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞。
圖6是單克隆的篩選與鑒定(RT-PCR)圖，其中提取不同單克隆細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR方法檢測Cyclin B1 RNA水平的表達(dá)情況，圖中條帶亮度的深淺代表RNA表達(dá)水平的高低。挑選編號為17、42的單克隆細(xì)胞作為低表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞。
圖7是RT-PCR、Western Blot檢測克隆Cyclin B1表達(dá)情況說明圖，檢測轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyelin B1質(zhì)粒低表達(dá)Cyclin B1蛋白的食管癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞之間Cyclin B1表達(dá)的差異。
圖8是高表達(dá)Cyclin B1的穩(wěn)定細(xì)胞株細(xì)胞生長曲線圖，其中消化細(xì)胞后，進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后接種在六孔板中，每孔30000個(gè)細(xì)胞。每隔24小時(shí)取出一板，消化細(xì)胞后，再分別計(jì)數(shù)。最后計(jì)算均值，繪制曲線。
圖9是克隆形成試驗(yàn)結(jié)果圖，其中消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種在100mm的培養(yǎng)皿中，每皿1000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2周，固定、染色，分別計(jì)數(shù)。
圖10是穿透試驗(yàn)結(jié)果圖，其中帶有8μm小孔的聚碳酸脂膜置于兩層小室之間，在上層小室的50μl培養(yǎng)基中包含1×104個(gè)細(xì)胞，下層小室的30μl基質(zhì)中含有5μg/mlfibronectin，37℃5％CO2的孵箱孵育6小時(shí)。小心刮下沒有遷移的上層細(xì)胞后，聚碳酸脂膜在甲醇中固定10分鐘，Giemsa染色1小時(shí)。顯微鏡下觀察，照相計(jì)數(shù)。隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)數(shù)值，繪制柱形圖。
圖11是裸鼠腫瘤體積曲線，其中于BALB/C裸鼠右側(cè)背部(近尾側(cè))接種人類食管癌細(xì)胞，200萬細(xì)胞/只，每7天觀察一次，測量腫瘤大小，依據(jù)公式v＝4/3πr12r2(r1為短徑，r2為長徑)，計(jì)算腫瘤大小，繪制曲線。
圖12是取接種人類食管癌細(xì)胞的裸鼠連續(xù)觀察3個(gè)月，之后處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，作病理H&E染色，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP-cyclin B1質(zhì)粒低表達(dá)Cyclin B1蛋白的食管癌細(xì)胞顯著抑制裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移。其中，a圖為正常肺組織，即接種低表達(dá)cyclin B1的單克隆食管癌細(xì)胞的裸鼠的肺組織；b圖為有轉(zhuǎn)移的肺組織，即接種EC9706食管癌細(xì)胞的裸鼠的肺組織；c，d為b的高倍圖象。
實(shí)施例發(fā)明人是通過以下的實(shí)驗(yàn)得到并進(jìn)一步證實(shí)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的1.質(zhì)粒的構(gòu)建pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi載體構(gòu)建報(bào)告描述該載體在脊椎動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)針對CCNB1共構(gòu)建了三個(gè)靶點(diǎn)的RNAi載體，經(jīng)測序證實(shí)了克隆的RNAi打靶序列100％正確。該載體可同時(shí)表達(dá)GFP，用于判斷轉(zhuǎn)染效率。
包裝產(chǎn)品形式雙鏈閉環(huán)DNA。
運(yùn)輸貯存常溫運(yùn)輸(不會影響DNA質(zhì)量)?？少A存于-20℃。避免反復(fù)凍融。
供貨量20ug凍干粉質(zhì)粒純度超純抽提，可直接用于轉(zhuǎn)染。
基因信息CCNB1Target信息

構(gòu)建框架序列

測序結(jié)果與樣品編號對應(yīng)關(guān)系


1.1.質(zhì)粒(載體)特征見圖1，其中shRNA代表本發(fā)明序列SEQ ID NO1或SEQ IDNO2。
1.2.質(zhì)粒的測序結(jié)果見圖2和3，其中劃線部分為所需要的片段序列和其反義核苷酸序列，其與設(shè)計(jì)得到的序列完全一致。質(zhì)粒pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1的序列為SEQ ID NO3，質(zhì)粒pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2的序列為SEQ IDNO4。
2.藥理實(shí)驗(yàn)1.利用Western blot檢測12種食管癌細(xì)胞系，篩選出Cyclin B1蛋白高表達(dá)的細(xì)胞系，分別將pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(參照LipofectamineTM2000說明)，通過RT-PCR、Western blot檢測手段挑選Cyclin B1蛋白低表達(dá)的單克隆，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。再采用生長曲線、Transwell等細(xì)胞生物學(xué)方法觀察高表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照在細(xì)胞生物學(xué)方面的差異。
RT-PCR所采用的引物Cyclin B1上游5-TCC AAG CCC AAT GGA AAC AT-3下游5-ATG CTC TCC GAA GGA AGT GC-3產(chǎn)物大小551kbpGAPDH上游5-GCT GAG AAC GGG AAG CTT GT-3下游5-GCC AGG GGT GCT AAG CAG TT-3產(chǎn)物大小299kbpWestern Blot采用的抗體


生長曲線的繪制(1).消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種在六孔板中，每孔30000個(gè)。
(2).每隔24小時(shí)取出一板，消化細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)。
(3).七天后統(tǒng)計(jì)數(shù)值，繪制生長曲線。
克隆形成消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種在100mm的培養(yǎng)皿中，每皿1000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2周，固定、染色，分別計(jì)數(shù)。
穿透試驗(yàn)(Trans-well)使用Chemotaxis Chamber(Neuro Probe，USA)檢測細(xì)胞的侵襲能力。在上層小室的50μl培養(yǎng)基中包含1×104個(gè)細(xì)胞，下層小室的30μl基質(zhì)中含有5μg/mlfibronectin(Sigma，USA)。帶有8μm小孔的聚碳酸脂膜置于兩層小室之間，37℃5％CO2的孵箱孵育6小時(shí)。小心刮下沒有遷移的上層細(xì)胞后，聚碳酸脂膜在甲醇中固定10分鐘，Giemsa染色1小時(shí)。顯微鏡下觀察，照相計(jì)數(shù)。隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)數(shù)值，繪制柱形圖。
試驗(yàn)結(jié)果在上述12種食管癌細(xì)胞系中，EC9706細(xì)胞系Cyclin B1的蛋白表達(dá)量高(見圖7)。通過轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞系，并利用細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測方法獲得穩(wěn)定低表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞株(見圖5、6、7)。低表達(dá)Cyclin B1的穩(wěn)定細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP-NON的陰性對照組細(xì)胞株相比，細(xì)胞生長速度明顯減慢，生長曲線呈顯著減慢上升趨勢(見圖8)?？寺⌒纬稍囼?yàn)表明分別轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒的細(xì)胞株的克隆形成能力明顯低于轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP-NON的陰性對照組細(xì)胞株。穿透檢測表明上述低表達(dá)Cyclin B1的細(xì)胞株穿透能力明顯低于轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP-NON的陰性對照組細(xì)胞株(見圖10)。說明Cyclin B1可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性度增加、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。
2.裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)選用4周齡BALB/C裸鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動物中心)，雌雄各半，于裸鼠右側(cè)背部(近尾側(cè))接種人類食管癌細(xì)胞，100萬細(xì)胞/只，每7天觀察一次，測量腫瘤大小，觀察裸鼠一般情況，連續(xù)觀察3個(gè)月，分別在28天、70天以及3個(gè)月之后處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，作病理H&E染色，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了三次。
裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)共分為四組接種，細(xì)胞分別為EC9706、轉(zhuǎn)染pGCsi-U6/neo/GFP-NON質(zhì)粒、分別轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒的細(xì)胞克隆(克隆1、克隆2)，每組10只裸鼠。重復(fù)3次。
依據(jù)公式v＝4/3πr12r2(r1為短徑，r2為長徑)，計(jì)算腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線。(見圖11)試驗(yàn)結(jié)果H&E染色結(jié)果顯示，腫瘤為上皮來源，確為接種的人類食管癌細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆(克隆1、2)接種裸鼠后，腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤體積顯著小于EC9706、pGCsi-U6/neo/GFP-NON。EC9706、pGCsi-U6/neo/GFP-NON接種裸鼠后，腫瘤侵犯肌層、橫紋肌、骨，遠(yuǎn)處可見肺轉(zhuǎn)移，特別是肺轉(zhuǎn)移比例為50-70％，而轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒的細(xì)胞克隆1、2細(xì)胞組未見有肺轉(zhuǎn)移(見圖12)。
表1顯示本實(shí)施例的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移情況統(tǒng)計(jì)情況。

注裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)，共分為四組接種，分別為EC9706、空載、低表達(dá)1為轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1質(zhì)粒的細(xì)胞克隆(克隆1)，低表達(dá)2為轉(zhuǎn)染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒的細(xì)胞克隆(克隆2)，每組10只裸鼠。重復(fù)3次。處死，取裸鼠的腫瘤、肺、腦、肝、腎等臟器，作病理H&E染色，觀察腫瘤局部侵襲、臟器轉(zhuǎn)移情況。此表為侵襲、轉(zhuǎn)移情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所<120>抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的序列<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<220>
<223>
<400>1acatgagagc catcctaat19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<220>
<223>
<400>2gaaatgtacc ctccagaaa19<210>3<211>1161
<212>DNA<213>人工構(gòu)建<220>
<223>
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1.一種抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的DNA序列，所述序列為SEQ ID NO1或SEQ IDNO2。
2.權(quán)利要求1所述的序列在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
3.含有權(quán)利要求1所述序列的質(zhì)粒，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2，所述質(zhì)粒的保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1質(zhì)粒的編號為CGMCCNo.1885，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2質(zhì)粒的編號為CGMCCNo.1886。
4.權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的序列，所述序列為SEQ ID NO1或SEQID NO2。本發(fā)明涉及含有上述序列的質(zhì)粒，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1－1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1－2，及所述序列和質(zhì)粒在制備抗人類食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
文檔編號C12N15/63GK101074254SQ20071007971
公開日2007年11月21日 申請日期2007年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月5日
發(fā)明者詹啟敏, 宋詠梅, 趙春玲, 林堅(jiān), 付明, 董立佳 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所