專利名稱：一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種攜帶人wwox基因的重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，特別是用于制備化療藥 增敏劑。
背景技術(shù)：
肺癌是死亡率極高的惡性腫瘤，高發(fā)病率、低手術(shù)治愈可能性和化療療效反應(yīng)差是最主要的原因。肺癌中80%的患者為非小細(xì)胞肺癌， 大約40%的非小細(xì)胞肺癌被確診時(shí)已經(jīng)晚期，全身化療成為主要的治 療方法。但是我們不得不面對(duì)這樣的事實(shí)，那就是絕大多數(shù)非小細(xì)胞 肺癌(NSCLC)在體內(nèi)和體外都被證實(shí)對(duì)化療不敏感。腫瘤化學(xué)治療最大障礙之一是腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性。有些腫 瘤，如大腸癌細(xì)胞對(duì)藥物存在固有的抗藥性(Intrinsicresistance;consti tutiveresistance)亦稱原發(fā)性耐藥，在治療開(kāi)始時(shí)就表現(xiàn)出對(duì)藥物的高 度耐受；另一些腫瘤，如乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、淋巴瘤等，化療開(kāi)始時(shí) 有效，久用則產(chǎn)生抗藥，出現(xiàn)獲得性抗藥性(Acquiredresis Tance)亦稱 繼發(fā)性耐藥。原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥區(qū)別是:原發(fā)性耐藥是未接觸 藥物就已存在的，繼發(fā)性耐藥是接觸藥物后才產(chǎn)生的。多藥耐藥性 (multidrugresistance，MDR)是腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸某一化療藥物，不僅對(duì) 此種化療藥物產(chǎn)生耐藥,而且對(duì)其它結(jié)構(gòu)和功能不同的多種藥物產(chǎn)生 交叉耐藥性。腫瘤的多藥耐藥特性，其產(chǎn)生機(jī)制可歸納為四種類型 一般包括 一，細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度不足(一)藥物攝入不足；(二)藥物泵 出被細(xì)胞攝入的化療藥物在起效前，若被重新泵出，則使得藥效無(wú) 法發(fā)揮，這是導(dǎo)致胞內(nèi)有效藥物濃度不足的另一原因。①經(jīng)典多藥耐 藥(MDR, multidrug resistance);②非P-糖蛋白型多藥耐藥(也稱
MRP, multidrug resistance protein );③乳腺癌耐藥蛋白(BRCP， breast cancer resistance); ④月市耐藥相關(guān)蛋白(LRP， lung resistance-protein)。 (三)細(xì)胞內(nèi)藥物被"封閉"從而不能到達(dá)作用靶點(diǎn)，引起藥物相對(duì) 不足。二、通過(guò)干擾藥物作用機(jī)制、降低藥物活性產(chǎn)生耐藥。三、通 過(guò)DNA修復(fù)途徑產(chǎn)生耐藥腫瘤細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能可與化療藥 物的DNA毒性發(fā)生拮抗，導(dǎo)致耐藥。四、可以通過(guò)細(xì)胞凋亡相關(guān)改變 產(chǎn)生耐藥凋亡相關(guān)因子的異?？梢鹉[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物(如紫杉 醇)的促凋亡作用不敏感。目前了解較清楚的凋亡相關(guān)因子包括p53、 Bcl-2、 NF-kB、 Rb等。研究已證實(shí)突變型p53加強(qiáng)腫瘤對(duì)化療的耐 受性，檢測(cè)p53的表達(dá)水平有助于對(duì)化療效果的評(píng)估。針對(duì)上述的臨床耐藥問(wèn)題，有必要找出合適的方法克服化療的耐 藥性。多藥耐藥的克服途徑逆轉(zhuǎn)MD R的藥物稱為多藥耐藥修飾劑 (RM,resistancemodifer)或M D R逆轉(zhuǎn)劑。如l丐通道阻滯劑異博定 Ver(Vpl)、Psc833、托瑞米芬、三氟拉嗪、丁硫氨酸亞砜胺(B S O)等。理想的MD R逆轉(zhuǎn)劑最好具備:①對(duì)正常組織毒性小，安全性大； ②在體內(nèi)能達(dá)到體外有效藥物濃度；③本身具有一定的抗腫瘤作用； ④穩(wěn)定性好，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)；⑤代謝產(chǎn)物亦能有效。目前所發(fā)現(xiàn)的M D R逆轉(zhuǎn)劑遠(yuǎn)沒(méi)達(dá)到上述要求，并且目前所用RM大多毒性較大，在 體內(nèi)難達(dá)到體外有效濃度，因而臨床效果不理想。近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤發(fā)病分子機(jī)制及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理研究的深 入，腫瘤的基因治療研究取得了巨大的進(jìn)展。研究人員根據(jù)腫瘤的類 型和分布，采用了多種技術(shù)來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，現(xiàn)在有許多己經(jīng)應(yīng)用到 了臨床試驗(yàn)。如"今又生"(Gendicine，重組腺病毒-p53基因注 射液)已經(jīng)在臨床上使用，其主要通過(guò)以下機(jī)理特異性殺傷腫瘤細(xì)胞: 1)啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)通路；2)抑制腫瘤細(xì)胞生存信號(hào)傳遞；3) 抑制腫瘤組織血管生成及腫瘤細(xì)胞物質(zhì)及能量代謝；4)抑制腫瘤細(xì) 胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移；5)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞放/化療抗性；6)阻滯腫瘤細(xì)胞周期 的運(yùn)轉(zhuǎn)，使腫瘤細(xì)胞處于嚴(yán)重冬眠狀態(tài)；7)啟動(dòng)"旁殺傷效應(yīng)"，調(diào) 節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，殺傷腫瘤細(xì)胞。因此p53己經(jīng)作為化療藥物抗性的 逆轉(zhuǎn)劑。
臨床逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)的根本性突破有待于多藥耐藥機(jī)理的進(jìn)一步明確， 隨著高效低毒逆轉(zhuǎn)劑的不斷發(fā)現(xiàn)并逐步用于臨床，基因治療的探索， 傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物治療向分子靶向藥物治療過(guò)渡，應(yīng)用循證醫(yī)學(xué)指導(dǎo) 臨床實(shí)踐，最終解決惡性腫瘤的耐藥問(wèn)題有待時(shí)日，并且有理由相信 基因治療對(duì)抗癌藥物的耐受性將在不久的將來(lái)逐漸占重要地位。目前研究表明，WWOX基因(genebank號(hào)NMJ)16373;網(wǎng)址 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=nucleotide&val=770 6522)是跨越了整個(gè)常見(jiàn)染色體脆性部位FRA16D的一個(gè)新的抑癌基 因。WWOX蛋白含有414個(gè)氨基酸，在它的氨基末端有兩個(gè)麗結(jié)構(gòu)域， 麗結(jié)構(gòu)域主要與蛋白之間相互作用有關(guān)，其中WWOX的鼎l區(qū)域特異 性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)含有PPXY配體的蛋白；蛋白之間的這種相互作用是機(jī)體 抑癌基因通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)所必需。在WWOX蛋白的 中心部位有一短鏈氧化還原酶功能域(SRD)，結(jié)合WWOX基因在激素 調(diào)節(jié)組織如前列腺、卵巢癌高表達(dá)，WWOX基因被推測(cè)為一參與性 激素調(diào)節(jié)的酶，在前列腺癌、卵巢癌中WWOX基因的頻發(fā)異常更加 支持上述推測(cè)。WWOX和甾體激素、乳腺癌致癌作用有重要的作用 和復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。有研究報(bào)道，通過(guò)重組腺病毒(Ad-WW0X)和藥物誘 導(dǎo)系統(tǒng)(松甾酮A、 ponA)，在肺癌細(xì)胞株中恢復(fù)WWOX的表達(dá)，內(nèi) 源性鼎0X蛋白陰性的細(xì)胞株(A549， H460, and H1299)通過(guò)激活內(nèi)源 性凋亡caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)過(guò)重組腺病毒(Ad-WW0X) 和藥物(松甾酮A、 ponA)誘導(dǎo)系統(tǒng)兩種方法，異位表達(dá)WWOX導(dǎo)致 A549、 H460和H1299細(xì)胞株在裸鼠致腫瘤性受到顯著抑制。實(shí)驗(yàn)證實(shí) WWOX是一種抑癌基因，并且高效率抑制肺癌異種移植物的生長(zhǎng)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用，特別是在制備化療藥增敏劑(Chemosensitizer)中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是構(gòu)建攜帶人WWOX基因的重組腺 病毒(Ad-WWOX)，并進(jìn)行WWOX逆轉(zhuǎn)A549/紫杉醇耐藥細(xì)胞 (A549/T)對(duì)化療藥物(紫杉醇和順鉑)耐藥的研究。本發(fā)明提供一種攜帶人wwox基因的重組腺病毒在制備抗腫瘤 上述應(yīng)用是指用于制備化療藥增敏劑，特別是肺癌化療藥增敏劑。所述的化療藥增敏劑也稱為多藥耐藥修飾劑或MD R逆轉(zhuǎn)劑。本發(fā)明的技術(shù)方案1. 構(gòu)建攜帶人WWOX基因的重組腺病毒通過(guò)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒同源重組人全長(zhǎng)wwox基因整合到腺病毒載體上，獲得重組腺病毒， 并制備和純化一定量的病毒顆粒；具體步驟首先構(gòu)建pDC316-IRES-EGFP質(zhì)粒；其次構(gòu)建攜帶人 WWOX基因的穿梭質(zhì)粒，命名為pDC316-WWOX-IRES-EGFP(如圖2所示)。 將pDC316-麗0X-IRES-EGFP與攜帶腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒 pBHGloxAEl， 3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，兩者在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組， 形成攜帶人全長(zhǎng)WWOX的重組腺病毒，命名為Ad-麗OX (如圖3所示)。2. 建立耐藥模型A549紫杉醇耐藥株和基因轉(zhuǎn)移方法，觀察腺 病毒在A549/T細(xì)胞的表達(dá)；3. 通過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)(CCK-8法)，證明WWOX能顯著逆轉(zhuǎn)紫 杉醇和順鉑的耐藥性，尤其是對(duì)紫杉醇的耐藥性。本發(fā)明可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥，為最終解決惡性腫瘤的耐藥問(wèn)題提 供新的方法。本發(fā)明將使腫瘤對(duì)抗癌藥物的耐受性在不久的將來(lái)被逐 漸克服。


圖1是AdMax腺病毒包裝試劑盒中穿梭質(zhì)粒^pDC316質(zhì)粒的圖 譜圖2是pDC316- WWOX-IRES-EGFP的圖譜 圖3是Ad-WWOX的結(jié)構(gòu)示意4是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP的A549/T細(xì)胞形態(tài) 其中A是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP前A549/T細(xì)胞形態(tài) 相差倒置顯微鏡X100 B是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP 48小時(shí)A549/T細(xì)胞形態(tài)相差倒置顯微鏡X100 C是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP 48小時(shí)A549/T細(xì)胞形態(tài)
熒光顯微鏡xioo圖5是westblot檢測(cè)腺病毒感染A549/T后WWOX的表達(dá)
其中1泳道是感染Ad-IRES-EGFP的A549細(xì)胞 2泳道是感染Ad-IRES-EGFP的A549/T細(xì)胞 3泳道是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP的A549/T細(xì)胞 4泳道是陽(yáng)性對(duì)照MCF-7細(xì)胞
圖6是A549/T感染含目的基因腺病毒組和對(duì)照組的TAX生存曲線圖7是A549/T感染含目的基因腺病毒組和對(duì)照組的DDP生存曲線
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的實(shí)施 并不僅限于此。
實(shí)施例l:重組腺病毒(Ad-WWOX)的構(gòu)建和制備
(一)重組腺病毒的構(gòu)建復(fù)制缺陷性腺病毒AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)(加拿大MicrobixBiosystems公司產(chǎn)品，穿梭質(zhì)粒-pDC316質(zhì)粒的圖譜如圖l所示，骨架質(zhì)?！猵BHGlox_El， 3Cre。)
293細(xì)胞為加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司產(chǎn)品。 1. pDC316-IRES-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建 1. 1從質(zhì)粒pIRES-EGFP上擴(kuò)增序列IRES-EGFP設(shè)計(jì)引物(引物設(shè)計(jì)軟件oligo6.0)，從質(zhì)粒pIRES-EGFP(購(gòu) 自clontech公司)上擴(kuò)增序列IRES-EGFP ， 構(gòu)建質(zhì)粒 pDC316-IRES-EGFP。引物序列為
IRES up 5'-GCCAGTCGACACCGCATCGAGCTGA-3' IRES down 5'-CTGCCAAGTTGCTCGAAGTCGACT-3'利用引物IRES叩和IRES down從pIRES-EGFP質(zhì)粒上擴(kuò)增片斷 IRES-EGFPPCR體系為名稱 ul IRES up 2 IRES down 2 dNTP 0.510Xprobest buffer 5 Probest 0.5H20 39 Template 1 Total 50 95度5min， 94度30sec， 60度30sec， 72度lmin30sec， 25cycles; 72度7min。1%瓊脂糖電泳，用PCR產(chǎn)物膠純化柱純化PCR產(chǎn)物。從 pIRES-EGFP擴(kuò)增IRES-EGFP基因，條帶大小為723bp。1. 2載體和PCR產(chǎn)物均用酶Sal I酶切，用Sal I單酶切載體pDC316 的電泳條帶大小為3913bp;回收載體和PCR產(chǎn)物。1.3連接 體系名稱 體積(ul)Vector (Sal I) 4IRES-EGFP (Sal I) 4Ligase 0.510 X buffer 1.5H20 5Total 15 16度過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化，挑菌。 1.4篩選構(gòu)建好的載體用Hind lll單酶切鑒定，正確的載體能夠切 出大小為243bp的條帶，該質(zhì)粒的圖譜見(jiàn)圖2。 1.5經(jīng)英駿(Invitrogen)生物科技有限公司測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。2. 構(gòu)建pDC316- WW0X-IRES-EGFP2. 1以pINCY-WWOX質(zhì)粒(美國(guó)open biosystens公司，CATALOG IHS1380-97652595)為模板，根據(jù)而0X的CDS序列合成上、下游引物
引物序列如下WW0X-EcoR I-UP: 5'-GGAATTCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGAC-3' WWOX-BamH I-DW: 5'-GGGATCCTTAGCCGGACTGGCTGCCAAGCCGTTC-3' PCR反應(yīng)參數(shù)如下94度30秒 58度30秒 72C 1分鐘 30個(gè)循環(huán)，最后72度延伸5分鐘 結(jié)果從plNVY-WWOX質(zhì)粒上擴(kuò)增WWOX基因，條帶大小為1259bp2.2酶切體系2. 2. 1 PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒純化后，用EcoRI/BamHI雙酶切 酶切反應(yīng)體系如下■ 5ul (0.4 ug/ul)H Buffer(Roch) 3 ulEcoRI 1 ul (20u/ul)BamHI 1 ul (20u/ul)DD Water 20 ul37。C 3h酶切產(chǎn)物電泳后用膠回收試劑盒純化 2.2.2載體酶切體系同上，將BamHI換成BglII并將DNA量減半 2. 3連接與轉(zhuǎn)化按《分子克隆》操作手冊(cè)常規(guī)方法進(jìn)行2.3. l連接反應(yīng)體系DNA (質(zhì)粒DNA+PCR酶切產(chǎn)物) 5ulLigation buffer (10x) lulddH20 3ulligase lulTotal 10ul 160C overnight 2. 3. 2構(gòu)建好的載體用EcoR I和Hind III雙酶切鑒定，正確的質(zhì)粒 應(yīng)該切出大小為1.3k的條帶；用PCR鑒定陽(yáng)性克?。凰徒粶y(cè)序證實(shí) 與，測(cè)序由英駿(Invitrogen)生物科技有限公司完成。3. Ad5-WW0XLIRES-EGFP重組腺病毒毒種制備3. 1293細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代將凍存的一管293細(xì)胞在37'C水浴輕輕晃動(dòng)融化，融化后在超 凈臺(tái)無(wú)菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿檫拭干凈，加入 10mll0。/。DMEM重懸，600Xg離心5分鐘，棄上清后用10mllO。/。DMEM重 懸，輕輕打勻，轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在5。/。C02孵箱中37。C培養(yǎng)， 將生長(zhǎng)至90%左右的細(xì)胞用PBS洗三次，室溫下胰酶消化30-120秒 使細(xì)胞脫落，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓、脫落，加入少許培養(yǎng) 基中止消化，吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞，離心，稀釋細(xì)胞懸液，1: 3-5 轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。3.2雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒腺病毒包裝系統(tǒng)AdMax (骨架質(zhì)粒pBHGlox_El， 3Cre，穿梭質(zhì)粒pDC316-WW0X-IRES-EGFP) 熒光觀察有(V )、無(wú)()，其它出毒時(shí)間轉(zhuǎn)染后第8天 收毒時(shí)間轉(zhuǎn)染后第ll天毒種名稱Ad5-WW0X-IRES-EGFP (圖3) 具體流程如下3. 2. 1轉(zhuǎn)染前一天，將293細(xì)胞接種于六孔板中，每孔5 X 105個(gè)細(xì)胞， 培養(yǎng)DMEM+1096胎牛血清，置37°(:含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。 3. 2. 2轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液，用新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的80-90%時(shí)，取骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒，用 Lipofectamine2000脂質(zhì)體(invitrogen公司產(chǎn)品)按其所附說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟為1) 每個(gè)轉(zhuǎn)染孔取骨架質(zhì)粒4ug，穿梭質(zhì)粒lPg，混和均勻。2) 質(zhì)粒用300ul的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min。 3) 取10 y 1的脂質(zhì)體用300 ul的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫 放置5min。4) 將兩者混和，室溫避光放置30min。然后將混合物加入到細(xì) 胞中。3.2.3轉(zhuǎn)染后第二天，將長(zhǎng)滿的細(xì)胞傳代于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用 含5。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底 時(shí)，再傳入75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察細(xì)胞出毒跡象。出毒現(xiàn)象 為細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開(kāi)始出現(xiàn)明顯噬斑。待細(xì)胞大部分病 變并從底部脫落進(jìn)行收毒。3.2.4收毒將出毒的細(xì)胞培養(yǎng)瓶先后置于-7(TC冰箱和37。C水浴鍋 中反復(fù)凍融三次，使病毒從病變細(xì)胞中充分釋放。將凍融液3000rpm 離心5min，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為第一代毒種(Pl)，作為隨后大量病毒擴(kuò)增的毒種。 3. 3毒種鑒定3.3.1引物上游WW0X-UP 、下游WWOX-DO麗(同實(shí)施例1 (一) 中2. 1中的引物)3.3.2擴(kuò)增片段大小1200bp左右 3.3.3具體流程如下1) 模板準(zhǔn)備在25cm2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)293細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%滿時(shí)，取上 述第一代毒種500u 1接種于細(xì)胞上，待細(xì)胞完全病變時(shí)按前述方法 凍融細(xì)胞三次，離心收集病毒上清液，此即為第二代毒種(P2)。目的基因的PCR鑒定取50ixlP2毒種上清液，力口入2ul蛋白 酶K， 56。C溫育，煮沸10分鐘，冰浴冷卻，取1 u 1作為模板，用PCR水稀釋。2) PCR體系模板 lul■X-叩 0. 5ul麗OX-down 0.5ul10XPCRBuffer 2.5ul(2. 5uM)dNTP 2ul Taq 0.25ulddH20 18.25ul25ul3) PCR條件94°C 5min ， 94°C 30s ， 56°C 30s , 72°Clmin ， 72°C 5min ， 4°C-30Cycles。3.4毒種滴度測(cè)定重組腺病毒TCID50測(cè)定(Reed和Muench兩氏法，參考文獻(xiàn)Reed U, Muench H. A simple method for estimating fifty percent end points. Am J Hyg 1938:27:493-497)。 (二)病毒擴(kuò)增與純化1) 毒種生產(chǎn)與粗純化在l個(gè)75cm2方瓶中接種4X 106 2 93細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞生長(zhǎng) 至9(Fo滿時(shí)，取2ml P2代毒種接種培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，24小時(shí)，顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)有60°/。細(xì)胞病變，44小時(shí)后細(xì)胞完全病變。收獲病變細(xì)胞混懸液 后，凍融三次，離心，取上清，按同樣方法接種于另外4個(gè)75 cri^方 瓶中，44小時(shí)完全出毒，收獲病毒，用于接種轉(zhuǎn)瓶。在每個(gè)轉(zhuǎn)瓶中接 種1.8X108個(gè)293細(xì)胞，共接種4個(gè)轉(zhuǎn)瓶，等細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)， 按10ml/轉(zhuǎn)瓶(M0I約為1)接種第2步收獲的病毒上清，染毒后70小時(shí) 收獲病變細(xì)胞混懸液。混懸液3000rpm離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用腺 病毒保存液重懸浮，反復(fù)凍融三次，6000rpm離心，取上清，即為粗 純化的重組腺病毒Ad5-麗0X病毒液，分裝保存于-70。C冰箱中(短期 內(nèi)使用可保存于4'C)。2) 病毒的純化反復(fù)擴(kuò)增腺病毒至需要病毒量，氯化銫密度梯度離心純化病毒， 預(yù)冷離心機(jī)轉(zhuǎn)頭至4'C， 50ml離心管12000g，十分鐘，取上清，棄沉淀， 每lml上清加入lml20%PEG8000/2. 5M NaCL，混勻，冰浴1小時(shí)，4 。C,12500g，30分鐘，棄上清，沉淀充分重懸于5mlCsCL l.lg/ml，4 t:，8000g，5分鐘，取上清，在超速離心管中緩慢加入2ml CsCL 1.4 g/ml，非常小心輕輕順管壁加入另一層3ml CsCL 1.3 g/ml，沿管壁小 心加滿病毒顆粒，約5ml上清l. lg/ml，平衡離心管，4°C， 60， 000g離心2
小時(shí),取出離心管，固定于離心管架上，用5ml注射器，18G針頭，在病毒 層的最低點(diǎn)刺破管壁，在CsCLl. 3g/ml和CsCL1. 4g/ml交界處吸出病毒 顆粒層，病毒層溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌的容器，4'C，透析過(guò)夜，換液三次， 病毒置于-8(TC保存。(三)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c基因轉(zhuǎn)移1) 構(gòu)建A549紫杉醇耐藥細(xì)胞株(短時(shí)間作用法)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(生長(zhǎng)密度達(dá)60-70%)的A549細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院 上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心)與泰素(紫杉醇、TAXOL，美國(guó)百時(shí)美 施寶公司產(chǎn)品)作用lh，細(xì)胞經(jīng)不含藥物的培養(yǎng)液洗滌后置入不含藥 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(生長(zhǎng)密度達(dá)80%)傳代，加大劑量重復(fù)上 訴誘導(dǎo)過(guò)程。TAX0L10—100ng/ml，從低濃度開(kāi)始，每次上升幅度為 10ng/ml，中毒征象(細(xì)胞增殖減慢、細(xì)胞漿顆粒明顯增多)時(shí)停用 藥物刺激，常規(guī)培養(yǎng)(1: 2傳代，增加胎牛血清濃度至12-15%)，中 毒征象好轉(zhuǎn)(細(xì)胞顆粒減少、增殖正常)后繼續(xù)加藥刺激。歷時(shí)6月， 獲得在100ng/ml TAXOL中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549/T細(xì)胞株。2) 基因轉(zhuǎn)移A549/T細(xì)胞撤TAX0L—周后按2-4X 107孔接種于六孔板中，每孔 補(bǔ)充DMEM培養(yǎng)液至2.5ml，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞密度達(dá) 85-90%，吸凈每孔培養(yǎng)基。選擇兩孔為T+組(即A549/T+)，加 Ad-WWOX-IRES-EGFP+1640完全培養(yǎng)基(含胎牛血清及雙抗)IOOOUL， 十字形晃動(dòng)培養(yǎng)板三次，放入孵箱5小時(shí)后，補(bǔ)足1640完全培養(yǎng)基至 每孔兩毫升，繼續(xù)放入孵箱，48小時(shí)后收集細(xì)胞以備后續(xù)的檢測(cè)。另 選兩孔加等量Ad-IRES-EGFP 50UL者(T-組，即A549/T-)及兩孔未加 腺病毒者(T組)為陰性對(duì)照，培養(yǎng)方法同T+組。同時(shí)，A549細(xì)胞按 l-2X106/孔接種于六孔板中，每孔補(bǔ)充1640培養(yǎng)液至2. 5ml，細(xì)胞貼 壁生長(zhǎng)，細(xì)胞密度達(dá)85-90y。用Ad-IRES-EGFP50UL感染接種于A549 (A-組，艮卩A549—組)。(四)攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-EGFP)在A549/T細(xì) 胞中的表達(dá)熒光纖維鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá):A-組、T-組和T+組細(xì)胞感染 腺病毒24-48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白(EGFP)的 綠色熒光(圖4)。WESTEN-BLOT法檢測(cè)麗OX的表達(dá):MCF-7、 A549/T+細(xì)胞均見(jiàn)大小為 46KDa雜交信號(hào)帶，A549-和A549/T-細(xì)胞未見(jiàn)雜交條帶，其中46KDa 位置的信號(hào)條帶與文獻(xiàn)報(bào)告一致，證實(shí)腺病毒攜帶的麗OX目的基因成 功表達(dá)(圖5)。兔抗WW0Xl+4多克隆抗體(abl4691)采用英國(guó)ABcom公司產(chǎn)品。實(shí)施例2:重組腺病毒介導(dǎo)人WWOX基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞耐藥基因 治療的實(shí)驗(yàn)研究(一)肺腺癌耐藥細(xì)胞耐藥性基因治療檢測(cè)(體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn) -CCK-8法)A549/T+組、A549/T-組和A549-組生長(zhǎng)達(dá)80%感染Ad (MOI: 50)， 48小時(shí)收集細(xì)胞；加入96孔培養(yǎng)板中(100ul完全培養(yǎng)基+8000個(gè)細(xì) 胞/孔)，培養(yǎng)12小時(shí)，加入不同濃度的CDDP (澳大利亞科鼎制藥有 限公司產(chǎn)品)或TAX (每孔設(shè)三個(gè)復(fù)孔)；37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)， 接真空泵的一次性輸液針頭吸盡所測(cè)孔培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基(預(yù) 混的5ul CCK-8+100ul含10。/o胎牛的培養(yǎng)基/ L)，培養(yǎng)3. 5小時(shí)；測(cè) 定450nm吸光度(參比波長(zhǎng)650nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率公式細(xì)胞 存活率(％) =[ (A1-A3) / (A2-A3)]，其中，Al:實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì) 胞的培養(yǎng)基、CCK-8、化療藥物)A2:對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有化療藥物)、A3:空白 孔(不含細(xì)胞和化療物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8);通過(guò)excel表計(jì)算IC50 值；計(jì)算耐藥指數(shù)(RI)^耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50，計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍 數(shù)(RF):A549/T-細(xì)胞IC50/A549/T+細(xì)胞IC50 (RK5為低度耐藥， RI5-15為中度耐藥，RI〉15為高度耐藥)；統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:兩組均數(shù)比較 采用t檢驗(yàn)，IC50計(jì)算采用加權(quán)直線回歸分析。Cell counting kit-8 (CCK-8)試劑盒采用DOJIDO株式會(huì)社同 仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。 (二)肺腺癌耐藥細(xì)胞株對(duì)紫杉醇和順鉑耐藥基因治療的效果采用CCK-8法進(jìn)行了體外藥物敏感性分析，計(jì)算出A549-、 A549/T-、 A549/T+三組細(xì)胞對(duì)不同藥物的細(xì)胞生存率(圖6和7)，按
照所得細(xì)胞生存率的數(shù)據(jù)計(jì)據(jù)計(jì)算IC50、 RI和RF (表l， 2)。 表1 Ad-WW0X感染A549/T細(xì)胞對(duì)化療藥物的IC50值(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，ug/ml)A549-A549/T-A549/T+TAXOL 0.05 ±0.010. 97±0. 05 *0. 36±0. 01 *DDP0.02±0.010. 39±0, 01 *0. 14±0.01 ** A549/T+和A549/T-細(xì)胞IC50值相比，p<0. 01表2感染腺病毒的A549/T細(xì)胞的耐藥指數(shù)(RI)和麗OX對(duì)耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)耐藥指數(shù)— 逆轉(zhuǎn)倍數(shù)A549/T-A549/T+泰素 21.398. 012. 69順鉑 13.997. 151. 96由表1可見(jiàn)，感染含WWOX的腺病毒后A549/T(T+)細(xì)胞和感染空 腺病毒載體的A54T(T-)細(xì)胞，兩組細(xì)胞經(jīng)TAXOL或CCDP分別作用72 小時(shí)，體外藥敏實(shí)驗(yàn)(CCK-8法)測(cè)定IC50值，T+組IC50較T-組低，t 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有顯著差異(-0.01)，因此,冊(cè)0X增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)TAX和 CDDP敏感性的結(jié)論。由表2可見(jiàn)，A549/T感染空腺病毒載體組(T-)和感染麗0X腺 病毒組(T+)，經(jīng)泰素作用72小時(shí)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2. 69;耐藥指數(shù)從21. 39 下降至8. 01，即從高度耐藥降至中等度耐藥，充分說(shuō)明A549/T細(xì)胞對(duì) 泰素敏感性增強(qiáng)，耐藥性下降。A549/T感染空腺病毒載體組(T-)和 感染W(wǎng)WOX腺病毒組(T+)加順鉑作用72小時(shí)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)1.96;72 小時(shí)耐藥指數(shù)分別從13. 99下降至7. 15，說(shuō)明A549/T細(xì)胞對(duì)順鉑敏 感性增強(qiáng)，耐藥性下降。因此，從定量角度上講，可得出WW0X顯著增強(qiáng) 了耐藥細(xì)胞對(duì)TAXOL和CDDP (尤其是TAX0L)的敏感性的結(jié)論。
權(quán)利要求
1、一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中所述的重組腺病毒攜帶人WWOX基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的重組腺病毒用于制備化療藥 增敏劑。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述的重組腺病毒用于制備肺癌化 療藥增敏劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的應(yīng)用，所述的重組腺病毒是通過(guò)細(xì) 胞內(nèi)質(zhì)粒同源重組人全長(zhǎng)WWOX基因整合到腺病毒載體上獲得的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中的腺病毒載體是AdMax腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。肺癌是死亡率極高的惡性腫瘤，全身化療成為主要的治療方法，但決大多數(shù)NSCLC在體內(nèi)和體外都被證實(shí)對(duì)化療不敏感。本發(fā)明的目的是提供一種攜帶人WWOX基因的重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，特別是用于制備化療藥增敏劑。本發(fā)明首先構(gòu)建攜帶人WWOX基因的重組腺病毒，然后建立耐藥模型A549紫杉醇耐藥株和基因轉(zhuǎn)移方法，觀察腺病毒在A549/T細(xì)胞的表達(dá)；最終通過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)證明WWOX能顯著逆轉(zhuǎn)紫杉醇和順鉑的耐藥性。本發(fā)明可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥，為最終解決惡性腫瘤的耐藥問(wèn)題提供新的方法。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101130092SQ20071004384
公開(kāi)日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日
發(fā)明者吳俊杰, 強(qiáng) 李 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)