專利名稱：一種高產(chǎn)核苷磷酸化酶的菌種及阿糖核苷的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化工程領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)核苷磷酸化酶的菌種及應用 該菌種酶法合成阿糖嘌呤類核苷的方法。
技術(shù)背景阿糖嘌呤類核苷有阿糖腺苷，二氨基阿糖腺苷，阿糖肌苷等，其化學結(jié)構(gòu) 式如下。阿糖腺苷 二氨基阿糖腺苷 阿糖肌苷其中阿糖腺苷具有廣譜抗病毒的作用，對單純皰疹病毒i、 n型、帶狀皰疹病毒的作用明顯，對腺病毒、EB病毒、牛痘病毒、巨細胞病毒及乙型肝炎病毒(HBV) 等亦有抑制作用，對核糖核酸(RNA)病毒也有一定的抑制作用。臨床上可靜脈注 射或外用。阿糖腺苷還是阿糖腺苷單磷酸重要中間體，而后者作為注射劑使用 優(yōu)勢明顯。二氨基阿糖腺苷和阿糖肌苷也有一定的抗病毒作用，更是昂貴的生 化試劑，用于生化研究。目前，阿糖嘌呤類核苷的制備可有下列方法1)發(fā)酵法 從^^ptow;;c^ a加'W加'cw發(fā)酵液中分離得到阿糖腺苷(Juichi Awaya， Journal of antibiotics. 1979,10:1050-1054)。此方法發(fā)酵單位低(幾十毫克每升發(fā)酵 液)，提取困難，發(fā)酵周期長，且發(fā)酵液中混有其它化合物，不適合于大規(guī)模工 業(yè)化生產(chǎn)。2) 化學合成法化學合成方法有三類(l)鹵代糖與嘌呤經(jīng)保護、縮合、水解等反應制備。 (2)半合成法由木糖腺苷或核糖腺苷經(jīng)一些反應使2'-羥基轉(zhuǎn)位。(3)全合成法 由D-阿拉伯糖經(jīng)噁唑烷合成嘌呤糖苷。(l)法得到的是a和P構(gòu)型的混合物， 步驟長，收率低。(2)法反應步驟也長，且須經(jīng)層分離。(3)法原料來源方便，步 驟較短，特別是合成的產(chǎn)物具有立體專一的特點，而且從噁唑烷開始，反應的 中間體不需分離。目前我國主要采用化學合成法生產(chǎn)阿糖腺苷。但是化學合成 過程均需基團保護、脫保護反應、手性試劑和其它特殊防護，其工藝復雜、成 本高、收率低(《20%)、易造成環(huán)境污染。3) 酶化學合成法先用化學法合成阿糖尿苷(Ara-U)或阿糖5-甲基尿苷(Am-5MU)，再與嘌呤 在嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)和尿苷磷酸化酶(UPase)的作用下，進行堿基和核 糖基的交換反應。酶法合成阿糖嘌呤類核苷可用分離提純的酶或完整細胞進行 催化。有許多文獻報道了酶法合成阿糖嘌呤類核苷，如文獻(TakashiUtagawa， Agric.Biol.Chem.. 1985,49 (4) :1053-1058; Takashi Utagawa， Agric.Biol.Chem.. 1985, 49(8): 2425-2430 ; Tskashi Utagawa ， Agric.Biol.Chem.. 1985， 49(7):2167-2171; 鄭一敏，生物學雜志，2002， 19 (6): 20-21; 郭勇莉，生 物技術(shù)，2006， 16 (1): 32-35)。這些酶化學法雖然有些可以獲得較高的收率，如90%以上，但是使用阿糖
尿苷的量是嘌呤的三倍，浪費嚴重，且酶轉(zhuǎn)化時間長達24小時以上，酶反應難以控制等缺點。發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人為克服上述酶化學法合成阿糖嘌呤類核苷存在的酶轉(zhuǎn)化時間長達24 小時以上，酶反應難以控制等技術(shù)缺陷，進行了廣泛的研究。最終提供一種產(chǎn) 氣腸桿菌(5"^ra^"W^rage"M)新菌種，該菌種具有高活力的嘌呤核苷磷酸 化酶和尿苷磷酸化酶，應用該菌種為酶源制備嘌呤類阿糖核苷的方法。該方法應用阿糖尿苷或阿糖5-甲基尿苷為阿糖供體，摩爾轉(zhuǎn)化率最高可達90%以上，且酶反應時間大為縮短。大大增強了反應效率，降低了生產(chǎn)成本，適合于工業(yè) 化生產(chǎn)。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的，以產(chǎn)氣腸桿菌完整細胞為酶源，主要利用嘌呤核 苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，在微生物非增殖的情況下進行酶轉(zhuǎn)化生成阿糖嘌 呤類核苷。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58，以提高 嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力與產(chǎn)量。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法。 用于本發(fā)明所使用的微生物是屬于腸桿菌屬的產(chǎn)氣腸桿菌。產(chǎn)氣腸桿菌 DWOQ-58即為本發(fā)明所述的具有高活力核苷磷酸化酶的菌種，以下簡稱 DWOQ-58。該菌種與產(chǎn)氣腸桿菌模式菌種ATCC 13048為同一種。經(jīng)對 ATCC13048長期深凍，紫外線照射，Y射線輻射，化學試劑處理(如硫酸二乙 酯，亞硝酸，N-甲基-硝基-N-亞硝基胍等)，超聲波等誘變處理，即可獲得所說 的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58。本發(fā)明的產(chǎn)氣腸桿菌(E"to'o^cto' aerogem s) DWOQ-58已于2007年4月30日在中國微生物菌種保藏管理委會員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址中國科學院北京微生物研究所)保藏，保藏號為 CGMCC No. 2035。DWOQ-58具有如下特征1. 形態(tài)特征(1) 細胞的形態(tài)和大小直桿狀，0.6-1.0 umX 1.2-3.0 um;(2) 孢子形成無；(3) 革蘭氏染色陰性。2. 在各種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)(1) 牛肉浸膏瓊脂平板培養(yǎng)(30°C， 48小時)菌落形狀圓形； 菌落表面隆起扁平狀，平滑； 大小2-6mm; 色調(diào)淺灰色至灰白色。(2) 牛肉浸膏瓊脂斜面培養(yǎng)(30°C， 48小時) 生長良好；生長形態(tài)疣狀。3. 生理特性(1) 能在以檸檬酸鹽或丙二酸鹽作為唯一碳源培養(yǎng)中生長；(2) 不從硫代硫酸鹽產(chǎn)生H2S;(3) 明膠液化緩慢；(4) 不產(chǎn)生脫氧核糖核酸酶；(5) V-P試驗陽性；(6) MR試驗陰性；(7) 不產(chǎn)生fl引哚；(8) 可同化葡萄糖酸，果糖，纖維二糖，甘露醇，L-阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖，麥芽糖，龍膽二糖，蜜二糖，棉籽糖，松二糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，山梨醇，e-羥基丁酸，琥珀酸，丙二酸，肌醇等；不同化阿拉伯醇，木糖醇，衛(wèi)矛醇，a-羥基西酸等。(9) pH生長范圍:3.0-10.0;(10) 生長最適溫度25-35°C;(11) 具有5-氟胞嘧啶抗性；(12) 嘌呤核苷磷酸酶活性14.6單位/mg濕菌體；尿苷磷酸化酶活性24.4 單位/mg濕菌體。根據(jù)"伯杰系統(tǒng)細菌學手冊"提供的方法和上述試驗結(jié)果表明，DWOQ-58 屬于產(chǎn)氣腸桿菌類群，但又與原產(chǎn)氣腸桿菌有明顯不同，其主要不同之處在于 具有5-氟胞嘧啶抗性，且嘌呤和尿苷磷酸化酶活性明顯提高。通過常規(guī)的培養(yǎng)方法，可以發(fā)酵生產(chǎn)DWOQ-58。以該菌種為酶源，由常規(guī)的酶反應方法可以酶法生產(chǎn)嘌呤類阿糖核苷。本發(fā)明菌種的培養(yǎng)方法是以碳源、氮源、無機鹽以及必要的維生素等有 機營養(yǎng)素加以培養(yǎng)。所說的碳源選自葡萄糖、淀粉水解糖、糖蜜、蔗糖、乳糖、果糖、檸檬酸 鹽、丙二酸鹽中的一種或多種；所說的氮源選自氨水、酵母膏、牛肉膏、玉米 漿、蛋白胨、大豆水解液、氨基酸復合液中的一種或多種，所說的無機鹽選自 磷酸鹽、錳鹽、鉀鹽、鐵鹽中的一種或多種，所說的維生素選自VB、 VB6。產(chǎn) 氣腸桿菌的培養(yǎng)方法在對本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是已知的。收集上述方法培養(yǎng)的DWOQ-58，即可直接使用，或者進一步進行菌體處理，
如進行丙酮干燥，超聲波處理，表面活性劑，冷凍處理等，以達到提高轉(zhuǎn)化效 率、穩(wěn)定酶活和提高酶利用率的目的。優(yōu)選的本發(fā)明的菌種培養(yǎng)方法，將所得的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58置于含有 碳源、氮源、無機鹽等的無菌培養(yǎng)基中、pH=7.0、培養(yǎng)溫度25-35°。、培養(yǎng)時間 12-48小時。離心發(fā)酵液收集菌體，然后用磷酸鹽溶液洗滌三次，置于冰箱冷藏備用。用本發(fā)明的菌種生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，包括如下步驟(1) 培養(yǎng)并收集本發(fā)明的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58,禾口，(2) 用將所說的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58與阿糖供體、嘌呤堿基受體接觸， 其特征在于，緩沖液pH5.0-10.0，反應溫度為30-70°C，反應時間4-12小時， 阿糖供體和嘌呤堿基受體的濃度為5-50mmol/L，菌體加入量為1-20% (菌體濕 重g/100mL,下同)。優(yōu)選的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，pH為6.5-8。 優(yōu)選的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，反應溫度40-60°C 。 優(yōu)選的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，阿糖供體和嘌呤堿基受體的濃度為 10-30mmol/L。優(yōu)選的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，菌體加入量為5-15%。 更優(yōu)選地，生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，包括如下步驟(1) 培養(yǎng)并收集本發(fā)明的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58，禾口，(2) 用將所說的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58與阿糖供體、嘌呤堿基受體接觸， 其特征在于，pH為6.5-8，反應溫度40-6(TC，阿糖供體和嘌呤堿基受體的濃度 為10-30mmol/L，菌體加入量為5-15%。所說的阿糖供體為阿糖尿苷，阿糖5-甲基尿苷，阿糖胞苷，或其相應的磷酸鹽。所說的嘌呤受體為腺嘌呤，二氨基腺嘌呤，次黃嘌呤等。所說的緩沖液可以磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉， 磷酸二氫銨，磷酸銨等。本發(fā)明的菌種具有顯著的技術(shù)進步，如一個具體實施例顯示的那樣，本發(fā) 明的菌種的嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的活力分別提高了 1倍和21倍， 并能夠抗5-氟胞嘧啶。本發(fā)明生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率， 一般均在80%以上，且反應時間縮短為K2小時以內(nèi)。本發(fā)明生產(chǎn)阿糖嘌呤 類核苷的方法的一個實施例中，反應時間6hr，阿糖腺苷摩爾轉(zhuǎn)化率為92%。本 發(fā)明無需提取酶，直接以完整菌體參與反應，大大降低了生產(chǎn)操作程序與生產(chǎn) 成本。本發(fā)明的酶活分析方法尿苷磷酸化酶活力測定參照Saunders法 (P.RSaunders， Journal of Biological Chemistry, i 969， 244(13):3691-3697),嘌呤核苷 磷酸化酶活力測參照Kalckar法(KalckarH.M，)。核苷類化合物的分析方法采用高效液相色譜法。色譜儀為島津高效液相色 譜儀；泵LC-10AT;紫外檢測器SPD-10A;色譜柱HypersilC18;流動相 水乙腈-95: 5;流速為imL/min;室溫；檢測波長254nm。本發(fā)明的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58已于2007年4月30日在中國微生物菌種 保藏管理委會員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.2035。


圖l為酶反應進程曲線。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明，但是應該理解所有這些實施例都
是說明性的，專利保護的范圍由權(quán)利要求的法律結(jié)構(gòu)確定。 實施例1將產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048從斜面上刮一環(huán)接種于無菌培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基1: 蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L) ， 30"C振蕩培養(yǎng)16 小時，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌三次，并溶解在無菌生理鹽水中，調(diào)整 菌密度為10S個/mL，經(jīng)一系列的誘變處理，均勻的涂輔在無菌培養(yǎng)皿上(培養(yǎng) 基2:培養(yǎng)基加100微克/mL的5-氟胞嘧啶和20g/L瓊脂)，3(TC培養(yǎng)三天，選 取生長較好菌落較大的菌種，接于含培養(yǎng)基l搖瓶中，振蕩培養(yǎng)24小時。收集 菌體，用磷酸鹽緩沖液洗滌三次，測定酶活，最終得到一株高活力的嘌呤和尿 苷磷酸化酶的菌種DWOQ-58。酶活力及特性如表l。表l菌種嘌呤核苷磷酸化酶 (單位/mg濕菌體)尿苷磷酸化酶 (單位/mg濕菌體)抗5-氟胞嘧啶 (100微克/mL)ATCC130481.21.1不長DWOQ-5814.624.4生長良好實施例2將產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58從斜面上刮一環(huán)接種于無菌培養(yǎng)基1中，35'C振 蕩培養(yǎng)16小時，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌三次，菌體冷藏備用。 ATCC13048也按同樣方法，獲得濕菌體。取1克DWOQ-58濕菌體，分別加入1Ommol/L腺嘌呤，30mmol/L阿糖尿 苷，pH=7.0的磷酸鉀緩沖液，總體積10mL, 6(TC振蕩反應6小時，反應結(jié)束， 高速離心，取上清液分析。阿糖腺苷摩爾轉(zhuǎn)化率為92%。
另取ATCC13048同樣操作，阿糖腺苷摩爾轉(zhuǎn)化率僅為11%。 實施例3同實施例2，但是將阿糖尿苷換為阿糖5-甲基尿苷。DWOQ-58催化合成阿 糖腺苷摩爾轉(zhuǎn)化率為87%，而ATCC13048合成阿糖腺苷的摩爾轉(zhuǎn)化僅為8%。 實施例4同實施例2，但是將阿糖尿苷換為阿糖胞苷。DWOQ-58催化的阿糖腺苷摩 爾轉(zhuǎn)化率為82%，而ATCC13048的反應中只有微量的阿糖腺苷生成。 實施例5同實施例2，但是將阿糖尿苷的濃度降低為10mmol/L， DWOQ-58催化的阿 糖腺苷摩爾轉(zhuǎn)化率為80%，而ATCC13048的反應中只有微量的阿糖腺苷生成。 實施例6同實施例2，但是將腺嘌呤換為二氨基腺嘌呤，DWOQ-58的反應中阿糖二 氨基腺苷的摩爾轉(zhuǎn)化率為87%,而ATCC13048的反應中阿糖二氨基腺苷的摩爾 轉(zhuǎn)化率為15%。實施例7同實施例2，但是將腺嘌呤換為次黃嘌，DWOQ-58的反應中阿糖肌苷的摩 爾轉(zhuǎn)化率為81%，而ATCC13048的反應中阿糖肌苷的摩爾轉(zhuǎn)化率為7%。 實施例8同實施例2，但是于3、 6、 12、 24、 36、 48小時取樣分析阿糖腺苷，得到 酶反應進程曲線。見圖1。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)DWOQ-58，保藏號為CGMCCNo.2035。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58的培養(yǎng)方法，以碳源、氮源、無機 鹽以及必要的維生素等有機營養(yǎng)素加以培養(yǎng)，所說的碳源選自葡萄糖、淀粉水 解糖、糖蜜、蔗糖、乳糖、果糖、檸檬酸鹽、丙二酸鹽中的一種或多種；所說 的氮源選自氨水、酵母膏、牛肉膏、玉米漿、蛋白胨、大豆水解液、氨基酸復 合液中的一種或多種，所說的無機鹽選自磷酸鹽、錳鹽、鉀鹽、鐵鹽中的一種 或多種，所說的維生素選自VB、 VB6。
3. 用權(quán)利要求1所述的菌種生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，包括如下步驟(1) 培養(yǎng)并收集本發(fā)明的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58，禾口，(2) 用將所說的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58與阿糖供體、嘌呤堿基受體接觸， 其特征在于，緩沖液pH5.0-10.0，反應溫度為30-70°C，反應時間4-12小時， 阿糖供體和嘌呤堿基受體的濃度為5-50mmol/L，菌體加入量為1-20% (菌體濕 重g/100mL)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，其特征在于pH為6.5-8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，其特征在于反應溫度 40畫60。C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，其特征在于阿糖供體和 嘌呤堿基受體的濃度為10-30mmol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，其特征在于菌體加入量 為5-15% (菌體濕重g/100mL)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，其特征在于pH為6.5-8， 反應溫度40-6(TC，阿糖供體和嘌呤堿基受體的濃度為10-30mmol/L，菌體加入量為5-15%。
9.根據(jù)權(quán)利要求3 8任一所述的生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，其特征在于， 阿糖供體選自阿糖尿苷、阿糖5-甲基尿苷、阿糖胞苷或其相應的磷酸鹽，嘌呤 受體選自腺嘌呤，二氨基腺嘌呤，次黃嘌呤。
全文摘要
本發(fā)明一種高產(chǎn)核苷磷酸化酶的菌種及阿糖核苷的合成方法屬于生化工程領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)核苷磷酸化酶的菌種及應用該菌種酶法合成阿糖嘌呤類核苷的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的菌種及用改菌種生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法。本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氣腸桿菌，保藏號為CGMCC No.2035，并公開了用該菌種生產(chǎn)阿糖嘌呤類核苷的方法，包括(1)培養(yǎng)并收集本發(fā)明的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58和(2)用將所說的產(chǎn)氣腸桿菌DWOQ-58與阿糖供體、嘌呤堿基受體接觸。本發(fā)明的菌種酶活力高，抗5-氟胞嘧啶，而且轉(zhuǎn)化率，一般均在80％以上，且反應時間縮短為12小時以內(nèi)。
文檔編號C12P19/00GK101113420SQ20071004325
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日
發(fā)明者丁慶豹, 伶 歐, 邱蔚然, 閻蓬勃, 魏曉琨 申請人:上海蔚平生物科技有限公司