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用于原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法

文檔序號:433258閱讀:703來源:國知局

專利名稱::用于原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基,尤其涉及一種用于含有l(wèi)ac啟動子、T71ac啟動子控制的原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域

背景技術(shù)
:DNA測序技術(shù)的成熟能夠準確的提供來源于不同物種的數(shù)以萬計蛋白質(zhì)的編碼序列。應(yīng)用DNA重組技術(shù)能夠把這些編碼序列克隆到表達載體上,實現(xiàn)目的蛋白的表達。最近幾年來,利用基因工程手段生產(chǎn)商業(yè)化的蛋白急劇增加,這些表達的重組蛋白已經(jīng)在工業(yè)上以及醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用。由于大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易操作、生長迅速、表達量高、以及培養(yǎng)成本低等優(yōu)點,再加上多年來外源基因表達的經(jīng)驗使其在大多數(shù)科研與應(yīng)用中成為高效表達異源蛋白最常用的原核表達系統(tǒng)。利用大腸桿菌成功表達的重組蛋白包括工業(yè)酶類(凝乳酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等)以及治療性蛋白(非格司亭、生長激素、胰島素、干擾素等)。另外據(jù)統(tǒng)計截止到2003年提交到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PBD)中的蛋白質(zhì)有80%以上是利用了大腸桿菌表達系統(tǒng)。所以說蛋白質(zhì)無論是理論上的研究還是工業(yè)化生產(chǎn),大腸桿菌表達系統(tǒng)都具有舉足輕重的地位。隨著對大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的不斷深入,現(xiàn)在已經(jīng)設(shè)計出了一系列的與大腸桿菌相匹配的表達載體,如pET系列、pGEX系列等,其中pET表達系統(tǒng)是最為廣泛使用的原核表達系統(tǒng)之一。截止到2003年提交到PBD中的蛋白質(zhì)中,pET表達系統(tǒng)的使用占整個原核表達系統(tǒng)的90%以上。pET表達系統(tǒng)采用了T71ac雜合啟動子,一方面能夠有效的啟動目的蛋白的表達,還能夠降低本底表達水平。但是這種原核表達系統(tǒng)的主流載體也存在一些不足。有研究表明,即使是使用這種表達系統(tǒng)表達外源蛋白時,當重組菌生長接近f飽和狀態(tài)時,也會發(fā)生提前誘導(dǎo)的情況。這對于表達外源蛋白特別是對宿主菌有毒性的蛋白極為不利。有文獻表明,當向處于生長期后期的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖時,會阻止這種提前表達,Novagen公司的主頁上就參考了這一研究結(jié)果,推薦向培養(yǎng)基中添加1%的葡萄糖來解決這--問題。盡管這種方法可以抑制提^表達,可是葡萄糖會使培養(yǎng)基變?yōu)樗嵝?,這就影響穩(wěn)定期的菌密度,有礙于外源蛋白的表達。所以,找到一種既能高密度培養(yǎng)細菌,又能克服表達菌的提前表達,對于提高外源蛋白的表達量具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種既能高效表達外源蛋白,又能實現(xiàn)自動誘導(dǎo)的復(fù)合培養(yǎng)基。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種用于原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的培養(yǎng)基,每升該培養(yǎng)基,主要由以下重量的各組分組成胰蛋白胨10—40g酵母提取物5—20g六水琥珀酸鈉0—8.1g二水檸檬酸鈉0—1.5g甘油15—50g葡萄糖0.5g乳糖2g磷酸氫二鈉3.55g磷酸二氫鉀3.40g氯化銨2.68g硫酸鈉0.71g七水硫酸鎂0.50g六水氯化鐵0.03g;優(yōu)選的,各組分的重量份是胰蛋白胨20.0g酵母提取物10.0g六水琥珀酸鈉5.40g二水檸檬酸鈉0.30g甘油25.0g葡萄糖0.50g乳糖2.00g磷酸氫二鈉3.55g磷酸二氫鉀3.40g氯化銨雄g硫酸鈉0.71g七水硫酸鎂0.50g六水氯化鐵0.03g;本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基的中各原料均可從生物化學(xué)試劑公司購買得到。本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而成,這些方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通曉?,F(xiàn)有的CAI培養(yǎng)基雖然能夠?qū)崿F(xiàn)菌的高密度培養(yǎng)和蛋白的大量表達,但是這種復(fù)合培養(yǎng)基各成分之間搭配并不是非常有效,還存在一些不足。通過對現(xiàn)有的這類復(fù)合培養(yǎng)基各個成分作用特點的研究發(fā)現(xiàn),甘油濃度、酵母提取物含量以及緩沖液緩沖能力對于改進這種復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,提高蛋白表達量至關(guān)重要。通過對復(fù)合培養(yǎng)基的一系列改造,得到了一種高效的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基(改良培養(yǎng)基-4)。本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基中各成分的代謝差異促使了細胞的高密度培養(yǎng),當細胞培養(yǎng)的密度接近于飽和時,培養(yǎng)基中的成分之一一乳糖又能自動誘導(dǎo)外源蛋白的表達,而無需監(jiān)視細胞生長狀態(tài)以及手動添加誘導(dǎo)劑IPTG;培養(yǎng)基中的復(fù)合成分能夠抑制蛋白的提前表達,這對于表達對細胞有毒性的蛋白及為有利;并且這種自動誘導(dǎo)的復(fù)合培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)誘導(dǎo)方法相比,蛋白產(chǎn)量至少提高數(shù)倍以上。自動化和微型化己經(jīng)成為后基因組時代高通量研究工程的兩種關(guān)鍵因素。本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基完全符合自動化微型化的要求,為大腸桿菌表達系統(tǒng)的更廣泛應(yīng)用奠下良好的工作基礎(chǔ)。本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基既能極大方便實驗室科研人員的實際操作,又能夠擴大培養(yǎng)滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。具體來說,本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基主要具有下述優(yōu)點1)本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基使用乳糖代替了傳統(tǒng)的誘導(dǎo)劑IPTG,一方面大大節(jié)約了培養(yǎng)基成本,另一方面替換了有毒物質(zhì)IPTG的使用,更適合于醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用;2)本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基無需監(jiān)控細胞生長以及手動添加誘導(dǎo)劑,極大力便了實驗室操作;3)本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基可加速平行篩選克隆,接種培養(yǎng)簡單,容易自動化高通量地驗證蛋白的表達與可溶情況;4)本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基的復(fù)合成分能夠抑制重組蛋白的提前表達,這對于表達對細胞有毒性的蛋白極為有利;5)用本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基表達外源蛋白,其外源蛋白的表達量與普通培養(yǎng)基LB相比,產(chǎn)量提高8倍以上;與國外同類型培養(yǎng)基相比,產(chǎn)量提高2倍以上。6)能夠放大培養(yǎng)滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求;7)便于進行蛋白的結(jié)構(gòu)分析(如15NH4C1、(15NH4)2SO^nBC標記的甘油用于NMR分析等)。本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基可作為含有l(wèi)ac啟動子、T71ac啟動子控制的原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的培養(yǎng)基,其適用范圍涵蓋了原核表達系統(tǒng)的90%以上。本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基的使用方法如下-將含有目的基因的大腸桿菌接種于本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基中,37°C,振蕩培養(yǎng)12-24小時,收集所表達的外源蛋白。優(yōu)選的,本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基的使用方法(1)挑取單菌落接種于裝有10ml細菌高密度增值培養(yǎng)基的250ml三角瓶中,培養(yǎng)(37°C,250rpm)12h;按l:1000的接種比例加入到裝有本發(fā)明復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中,繼續(xù)培養(yǎng)12h,收集所表達的外源蛋白。(注利用細菌高密度培養(yǎng)基增值培養(yǎng)細菌后,放入-8(TC冰箱保存數(shù)周很少發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象);(2)或者直接挑取單菌落,放入裝有本發(fā)明復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中,過夜培養(yǎng),收集所表達的外源蛋白。(3)或者直接挑取單菌落,放入裝有本發(fā)明復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中在37"C,250rpm培養(yǎng)3-4h,略見混濁后放入低溫(15-30°C)搖床振蕩培養(yǎng)(這樣能夠極大提高可溶性外源蛋白的表達量)。圖17種重組蛋白的SDS-PAGE分析;M:為蛋白質(zhì)分子量Marker(Fermentas);la,2a,3a,4a,5a,6aand7a分別為P-l、P-2、P-3、P-4、P-5、P-6、P-7表達的可溶性蛋白,lb,2b,3b,4b,5b,6band7b為對應(yīng)的非可溶性蛋白。圖2分別使用LB和CAI為培養(yǎng)基表達外源蛋白,可溶性融合蛋fi表達鼂的比較結(jié)果。圖3改良的不同復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基對可溶性融合蛋白表達量的影響。圖4兩種培養(yǎng)基與CAI相比對可溶性融合蛋白表達量的影響。具體實施方式以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明,應(yīng)該理解的是,這些實施例僅用于例證的目的,決不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例l本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基的制備1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2XZY):20g胰蛋白胨10g酵母提取物tolLwithH20;2)50X復(fù)合磷酸鹽緩沖溶液17.75g磷酸氫二鈉n.og磷酸二氫鉀13.4g氯化銨3.55g硫酸鈉to100mlwithH20;3)100X有機酸緩沖溶液54g六水琥珀酸鈉3g二水檸檬酸鈉to100mlwithH20;4)500X硫酸鎂儲存溶液25g七水硫酸鎂to100mlwithH20;以上儲存液0.1Mpa,121.5。C滅菌20min。5)1000X氯化鐵儲存溶液3g六水氯化鐵lml濃鹽酸(pH12M)99ml滅菌水;6)50X復(fù)合碳源儲存液125g甘油2.5g葡萄糖10g乳糖to100mlw池H20(過濾除菌)。實施例2重組質(zhì)粒p-l、p-2、p-3、p-4、p-5、p-6和p-7的構(gòu)建和表達1.p-l、p-2、p-3這三種重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程如F:分別根據(jù)抗菌肽CAP和IB的編碼序列,人工合成了兩條寡核苷酸鏈,PCR后分別得到了CAP、CAP改造和IB的基因片段,這三條基因片段兩端都帶有和Eo)/I識別位點;連接到用同樣兩個酶處理的載體pET-32a上,經(jīng)酶切與PCR鑒定后得到重組質(zhì)粒p-l、p-2、p-3。2.p-4、p-5、p-6、p-7的構(gòu)建過程如下:用DNASIS和GENERUNNER軟件分別分析了傳染性喉氣管炎病毒gC、gD、gE、gJ蛋白的抗原性,選擇抗原性強的的區(qū)域,分別設(shè)計了四對不同的特異性引物,從提取的傳染性喉氣管炎病毒基岡組中分別擴出了gC、gD、gE、gJ的基因片段,這二條基因片段兩端都帶有£>W1和X/w/I識別位點;連接到用同樣兩個酶處理的載體pET-32a上,經(jīng)酶切與PCR鑒定后得到重組質(zhì)粒p-4、p-5、p-6、p-7。注這七種重組質(zhì)粒表達的重組蛋白分別是抗菌肽IB、抗菌肽CAP、改良的CAP、ILTV的gC蛋白、gD蛋白、gE蛋白和gJ蛋白。將7種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入£.co//BL21中,誘導(dǎo)之后均可從SDS-PAGE電泳結(jié)果中觀察到外源蛋白的表達(圖1),分子量大小分別為18.6kD,21kD,21.5kD,35kD,41.7kD,53kD,58kD。試驗例分別使用LB和CAI(CAI是Complexauto-inducingmedia的縮寫,是參照閨外學(xué)者Studier的研究配方,自動誘導(dǎo)技術(shù)所應(yīng)用的培養(yǎng)基;其具體配方見表l)表達實施例2所構(gòu)建的7種重組表達質(zhì)粒,核酸蛋白分析儀和薄層色譜掃描儀測定的結(jié)果如表2所示,從中可以看出,在CAI中這七種融合蛋白(抗菌肽IB、抗菌肽CAP、改良的CAP、ILTV的gC蛋白、gD蛋白、gE蛋白和gJ蛋白)的可溶性蛋白在總可溶性蛋白中所占比例與在LB中的相比(除了P-5之外)都有稍微的提咼,但是它們總的可溶性蛋白產(chǎn)量與LB相比有大幅度增加,致使這七種融合蛋白在CAI中的可溶蛋白產(chǎn)量都明顯高于在LB中的產(chǎn)量。為了更直觀地看出外源蛋白在這兩種培養(yǎng)基表達量的差距,根據(jù)表2的數(shù)據(jù)繪制成了圖2。表l細菌高密度增值培養(yǎng)基和復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2在LB和CAI培養(yǎng)基中相比可溶性融合蛋白的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從圖2可以看出,當使用復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基表達外源蛋白時,其可溶性融合蛋白的表達產(chǎn)量與普通的LB培養(yǎng)基相比,產(chǎn)量提高了4倍左右。Studier的CAI培養(yǎng)基雖然能夠?qū)崿F(xiàn)菌的高密度培養(yǎng)和蛋白的高效表達,但是這種復(fù)合培養(yǎng)基各成分之間的搭配并不是非常有效,還存在一些不足。通過對復(fù)合培養(yǎng)基各個成分作用特點的研究發(fā)現(xiàn),甘油濃度、酵母提取物含量以及緩沖液緩沖能力對于改進這種復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,提高蛋白表達量爭:關(guān)重要。當在這種復(fù)合培養(yǎng)基中添加某些物質(zhì)或者改變某些成分的含鼂時,三種蛋白(P-l、P-2、P-3)產(chǎn)量得到了進一步提高(表3、表4、表5、表6)。表3在改良培養(yǎng)基-1中可溶性融合蛋白的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4在改良培養(yǎng)基-2中可溶性融合蛋白的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5在改良培養(yǎng)基-3中可溶性融合蛋白的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6在改良培養(yǎng)基-4中可溶性融合蛋白的數(shù)值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>根據(jù)以上幾個表格,把可溶性融合蛋白的數(shù)值繪制成從圖3,結(jié)果可以看出,復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)過改良后均能提高目的蛋白的產(chǎn)量,其中以4號改良培養(yǎng)基對目的蛋白產(chǎn)量的提高最為明顯。甘油可以作為誘導(dǎo)后期良好的碳源,從而促進菌的生長,提高蛋白的表達量;并且伴隨著最近幾年來甘油價格的大幅度下降,甘油作為大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的碳源而備受親睞。添加甘油使其濃度由原來的0.5%增加為2.5%,形成改良培養(yǎng)基-1(具體配方見表7),結(jié)果蛋白表達量得到了提高;可是誘導(dǎo)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)3種菌的培養(yǎng)基pH值都降到4.8以下,這樣酸性的條件下質(zhì)粒的穩(wěn)定性較差,并且對蛋白的表達非常不利(蛋白的表達的最適pH值在6.07.5左右)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),共有2種方法可以解決這種問題一是添加某些能夠增強培養(yǎng)基緩沖能力的物質(zhì);二是增加原來培養(yǎng)基中緩沖液的磷酸鹽濃度(由原來的50mmol/L增加到100mmol/L)。需要通過一系列的措施,找到解決這一問題的最適合辦法。本發(fā)明人首先把改良培養(yǎng)基-1中磷酸鹽的濃度由50mmol/L增加到100mmol/L,形成改良培養(yǎng)基-2(具體配方見表8),誘導(dǎo)以后發(fā)現(xiàn),pH值由原來的低于4.8升到了6.4左右,蛋白的表達量得到了大幅度提高;然后,往改良培養(yǎng)基-1中添加了適當濃度的2種物質(zhì)一六水琥珀酸鈉(5.40g/l)和二水檸檬酸鈉(0.30g/l),形成改良培養(yǎng)基-3(具體配方見表9),誘導(dǎo)以后發(fā)現(xiàn)改良培養(yǎng)基-2的蛋白表達量略高于改良培養(yǎng)基-3。不過經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),高磷酸鹽濃度能夠提高重組質(zhì)粒的卡那抗性,在100mmol/L磷酸鹽濃度的培養(yǎng)基中,,那霉素的有效濃度必須提高到300Mg/ml,這樣就給我們表達卡那抗性的重組質(zhì)粒帶來困難,所以這種培養(yǎng)基只適合表達含有氨卞抗性的重組質(zhì)粒,不具有通用性。故采用折衷的方法,使用改良培養(yǎng)基-3作為進一步的研究對象。葡萄糖在這種自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的作用是非常重要的。ir先葡萄糖是大腸桿菌最偏愛的碳源,另外它還與其他碳源存在競爭關(guān)系,也就是說當葡萄糖存在時,大腸桿菌優(yōu)先利用,直到其被耗盡時,才代謝其他碳源,這也就是所謂"自動誘導(dǎo)"培養(yǎng)基形成的理論基礎(chǔ)。不過葡萄糖的存在還會帶來-些負面影響。葡萄糖在代謝過程中會產(chǎn)生乙酸這樣的短鏈酸類物質(zhì),短鏈酸能夠降低RNA、DNA、蛋白質(zhì)以及酯類的合成速率。并且乙酸濃度在0.5g/L的情況下就能嚴重影響菌的生長。在査閱文獻的過程中,我們發(fā)現(xiàn)酵母提取物除了能夠減少乙酸形成之外,還能夠增加菌密度、阻止耙蛋白的降解、增強發(fā)酵培養(yǎng)基的緩沖能力等多種作用。借鑒于2xYT(含有10g酵母提取物、16g胰蛋白胨)、TRB(含有24g酵母提取物、12g胰蛋白胨)以及MBL培養(yǎng)基(含有30g酵母提取物、20g胰蛋白胨)中酵母提取物和胰蛋白胨的組成特點,我們往改良培養(yǎng)基-3中補加了適當濃度的酵母提取物和胰蛋白胨,形成了改良培養(yǎng)基-4(具體配方見表10),經(jīng)誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn),其蛋白表達產(chǎn)量與改良培養(yǎng)基-3相比又有較大幅度的提高。本發(fā)明在改良培養(yǎng)基-4的基礎(chǔ)上,又經(jīng)過大量的試驗發(fā)現(xiàn),將改良培養(yǎng)基-4的下述一些組分在以下上下限范圍內(nèi)浮動,所得到的培養(yǎng)基表達外源蛋白時,其表達量與CAI相比,都有所提高胰蛋白胨10—40g,酵母提取物5—20g,六水琥珀酸鈉0—8.1g,二水檸檬酸鈉0—1.5g,甘油15—50g(以每升培養(yǎng)基計)。作為一種例證,本發(fā)明配制了以下兩種濃度的培養(yǎng)基(1)胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,甘油15g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,磷酸氫二鈉3.55g,磷酸二氫鉀3.4g,氯化銨2.68g,硫酸鈉0.71g,七水硫酸鎂0.5g,六水氯化鐵0.03g(以每升培養(yǎng)基計)。(2)胰蛋白胨40g,酵母提取物20g,六水琥珀酸鈉8.1g,二水檸檬酸鈉1.5g,甘油50g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,磷酸氫二鈉3.55g,磷酸二氫鉀3.4g,氯化銨2.68g,硫酸鈉0.71g,七水硫酸鎂0.5g,六水氯化鐵0.03g(以每升培養(yǎng)基計)。上述兩種培養(yǎng)基表達外源蛋白時,其表達量與CAI相比,其表達量都有所提高,具體結(jié)果參照圖4。本發(fā)明培養(yǎng)基與國外的同類型培養(yǎng)基相比,優(yōu)化了胰蛋白胨,酵母提取物以及甘油的濃度,添加了兩種合適濃度的能夠增加緩沖液緩沖能力的物質(zhì)一六水琥珀酸鈉和二水檸檬酸鈉,在此保護范圍內(nèi),其外源蛋臺的表達量都要優(yōu)于stucher的CAI培養(yǎng)基。(雖然本發(fā)明中沒有確定其它物質(zhì)的濃度范圍,但是作為一種自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,只要關(guān)鍵物質(zhì)確定后,其它物質(zhì)是可以在一定范圍內(nèi)浮動的,比如Na10-200mM、K+10-200mM、NH/20-100mM、Mg2+1-1OmM、Fe3+l-100uM、P04310-lOOmM等)。表7改良培養(yǎng)基-1的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表8改良培養(yǎng)基-2的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表9改良培養(yǎng)基-3的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表10改良培養(yǎng)基-4的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,以每升培養(yǎng)基計,含有以下重量的各組分胰蛋白胨10-40g酵母提取物5-20g六水琥珀酸鈉0-8.1g二水檸檬酸鈉0-1.5g甘油15-50g葡萄糖0.5g乳糖2g磷酸氫二鈉3.55g磷酸二氫鉀3.40g氯化銨2.68g硫酸鈉0.71g七水硫酸鎂0.50g六水氯化鐵0.03g。2、按照權(quán)利要求l的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,其特征在于含有以下重量的各組分胰蛋白胨酵母提取物六水琥珀酸鈉二水檸檬酸鈉甘油乳糖磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀氯化銨硫酸鈉20.0g歸g5.40g0.30g25.0g0.50g2.00g3.55g3.40g168g0.71g七水硫酸鎂0.50g六水氯化鐵0.03g。3、權(quán)利要求1或2的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基在表達外源蛋白中的應(yīng)用,包括將含有目的基因的大腸桿菌接種于本發(fā)明復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,37°C,振蕩培養(yǎng)12-24小時,收集所表達的外源蛋白。4、按照權(quán)利要求3的應(yīng)用,其特征在于挑取含有目的基因的大腸桿菌單菌落接種于裝有10ml細菌高密度增值培養(yǎng)基的250ml三角瓶中,37°C,250rpm培養(yǎng)12h;按l:1000的接種比例加入到裝有權(quán)利要求1所述復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中,繼續(xù)培養(yǎng)12h,收集所表達的外源蛋白。5、按照權(quán)利要求3的應(yīng)用,其特征在于直接挑取含有目的基因的大腸桿菌單菌落,放入裝有權(quán)利要求1所述復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中在37i:,250rpm過夜培養(yǎng),收集所表達的外源蛋白。6、按照權(quán)利要求3的應(yīng)用,其特征在于直接挑取含有目的基因的大腸桿菌單菌落,放入裝有權(quán)利要求1所述復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中在37T:,250rpm培養(yǎng)3-4h,略見混濁后放入低溫搖床振蕩培養(yǎng),收集所表達的外源蛋白。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白的復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每升培養(yǎng)基中含有以下重量的各組分胰蛋白胨10-40g,酵母提取物5-20g,六水琥珀酸鈉0-8.1g,二水檸檬酸鈉0-1.5g,甘油15-50g,葡萄糖0.5g,乳糖2g,磷酸氫二鈉3.55g,磷酸二氫鉀3.40g,氯化銨2.68g,硫酸鈉0.71g,七水硫酸鎂0.50g,六水氯化鐵0.03g。用本發(fā)明復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基表達外源蛋白,其外源蛋白的表達量與普通培養(yǎng)基LB相比,產(chǎn)量提高8倍以上;與同類型復(fù)合自動誘導(dǎo)培養(yǎng)基相比,產(chǎn)量提高達2倍以上。文檔編號C12N1/21GK101235362SQ200710003048公開日2008年8月6日申請日期2007年2月1日優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日發(fā)明者徐靈龍,玫王,王云峰,石星明,童光志申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
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