專利名稱：一株產(chǎn)乙烯的綠色木霉及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌領(lǐng)域，具體地涉及一種產(chǎn)乙烯的綠色木霉及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
乙烯是用途最廣泛的有機(jī)原料，被用來(lái)生產(chǎn)塑料、纖維、橡膠等有機(jī)化工產(chǎn)品，這些產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于國(guó)民經(jīng)濟(jì)的各個(gè)部門。因此，乙烯在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位。2004年世界乙烯生產(chǎn)能力為11,000萬(wàn)噸，我國(guó)乙烯消費(fèi)量為1500萬(wàn)噸，而國(guó)內(nèi)乙烯產(chǎn)量為600萬(wàn)噸，自給率僅為43％。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)快速發(fā)展，我國(guó)對(duì)乙烯的需求量持續(xù)增加，預(yù)計(jì)到2010年乙烯需求量將達(dá)到2000萬(wàn)噸以上，其中的60％以上需要進(jìn)口。而且，乙烯是從石油中提煉和加工制得的，而石油是一種不能再生的資源，地球上蘊(yùn)藏的可開采石油將在40年內(nèi)耗盡。我國(guó)是一個(gè)石油資源短缺的國(guó)家，同時(shí)，我國(guó)又是石油消費(fèi)大國(guó)，目前對(duì)進(jìn)口石油的依存度已超過(guò)50％。因此，隨著石油資源的日益枯竭，用生物法生產(chǎn)乙烯以替代石油產(chǎn)品的研究已經(jīng)迫在眉睫。
事實(shí)上，人們很早就知道，乙烯可以由植物合成并排出體外，而且乙烯是植物產(chǎn)生的五大類植物激素之一，在促進(jìn)瓜果成熟、性別分化和促進(jìn)次生物質(zhì)的形成等方面都發(fā)揮著重要作用。雖然乙烯廣泛地存在于多種植物組織中，但在植物組織中的正常含量是非常小的，通常小于0.1ppm。植物體內(nèi)乙烯合成的起始底物是蛋氨酸，中間產(chǎn)物是1-氨基-環(huán)丙烷基-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，它在ACC合成酶的催化下合成。微生物合成乙烯有兩條途徑，但都不同于植物合成第一條途徑是以蛋氨酸為底物，中間產(chǎn)物是4-甲硫基-2-丁酮酸(2-Keto-4-methylthiobutyric acid，KMBA)；第二條途徑是以α-酮戊二酸為底物合成，這種途徑中的關(guān)鍵酶是乙烯形成酶EFE，由efe基因編碼，它可以直接將TCA循環(huán)中的α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為乙烯，該途徑可以高效地產(chǎn)生乙烯，可達(dá)10-7nl/細(xì)胞/小時(shí)，是KMBA途徑的500-1000倍。
目前，世界各國(guó)都在大力開發(fā)生物能源，即利用生物質(zhì)(所謂生物質(zhì)可理解為由光合作用產(chǎn)生的所有生物有機(jī)體的總稱，包括植物、農(nóng)作物、林產(chǎn)物、農(nóng)林產(chǎn)廢棄物如秸稈等可再生的原料)為原料生產(chǎn)的能源，包括燃料乙醇、生物柴油、生物氫氣、生物沼氣及生物質(zhì)氣化或液化等產(chǎn)生的能源產(chǎn)品，而且在燃料乙醇、生物氫氣、生物沼氣等方面已見成效。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，生物質(zhì)資源非常豐富，每年產(chǎn)秸稈7億噸，尚未得到充分利用，絕大多數(shù)在田間地頭被燒毀。植物纖維原料一般含半纖維素(32％)、纖維素(38％)、木質(zhì)素(17％)等。絲狀真菌特別是木霉如瑞氏木霉具有很強(qiáng)的分解纖維素和半纖維素的能力，國(guó)內(nèi)外一直致力于利用木霉及其它一些微生物來(lái)轉(zhuǎn)化植物纖維為乙醇的研究工作，但是用木霉生產(chǎn)乙烯在國(guó)內(nèi)外都沒見報(bào)道。
本發(fā)明是從丁香假單胞菌大豆致病變種中克隆乙烯形成酶基因efe，將該基因?qū)氲椒纸饫w維素的木霉中，獲得產(chǎn)乙烯的木霉。利用該菌株在含纖維素或植物秸桿的培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙烯，為乙烯的生產(chǎn)提供一條新途徑。本發(fā)明利用秸稈類生物質(zhì)生產(chǎn)乙烯，既能減少乙烯進(jìn)口為國(guó)家節(jié)省外匯，同時(shí)又能保護(hù)環(huán)境，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中應(yīng)用前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)乙烯的綠色木霉，本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的培養(yǎng)方法，為利用秸稈類生物質(zhì)生產(chǎn)乙烯以替代石油產(chǎn)品提供有效的解決途徑。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明所述的綠色木霉(Trichoderma viride)，該菌株已于2007年1月16日被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No.1918。
綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的染色體DNA中含有乙烯形成酶基因efe，該菌株的構(gòu)建過(guò)程為從丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonassyringae pv.glycinea)中克隆乙烯形成酶基因(efe)，將其插入到載體pCL-9上形成重組質(zhì)粒pCL-9-efe。然后制備綠色木霉的原生質(zhì)體，將攜帶潮霉素抗性的質(zhì)粒pAN7-1和重組質(zhì)粒pCL-9-efe共轉(zhuǎn)化綠色木霉的原生質(zhì)體，在再生培養(yǎng)基上篩選帶有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。然后通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選整合有乙烯形成酶基因(efe)的轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)氣相色譜來(lái)確定乙烯產(chǎn)量，其中乙烯產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化子即為綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918。
綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的生物學(xué)特點(diǎn)是除染色體上攜帶有乙烯形成酶基因(efe)外，在形態(tài)上與其他木霉類似，在生活史中有菌絲和分生孢子，主要靠無(wú)性繁殖。該真菌依靠自身產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)分解植物纖維。木霉產(chǎn)生的纖維素酶是由葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶三個(gè)主要成分所組成。以濾紙為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量表征纖維素酶系總的糖化能力，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，通稱濾紙酶活(FPA)，在50℃、pH4.5的條件下，每小時(shí)由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。固態(tài)發(fā)酵88小時(shí)，測(cè)得本發(fā)明所述的綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的濾紙酶活力為26292U/g干曲(干曲表示發(fā)酵培養(yǎng)基的干重)。
綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培養(yǎng)方法包括以下步驟(1)將所述的綠色木霉的孢子或菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1周；(2)待孢子長(zhǎng)成綠色后，刮下孢子并懸浮于無(wú)菌水中，然后按體積比1％的接種量將孢子懸液接種于液體基本培養(yǎng)基中，試管用棉塞封口，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48h；(3)離心收集菌絲體，再將菌絲體轉(zhuǎn)接于液體纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，試管用膠塞封口，30℃振蕩培養(yǎng)36h；培養(yǎng)過(guò)程中所用到的培養(yǎng)基的組成是基本培養(yǎng)基葡萄糖2g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.06g/L，CaCl20.06g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，pH5.5，余量用水補(bǔ)足；
纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基纖維素粉0.5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.06g/L，CaCl20.06g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，pH5.5，余量用水補(bǔ)足。
綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培養(yǎng)還可采用如下方法(1)將所述的綠色木霉的孢子或菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1周；(2)待孢子長(zhǎng)成綠色后，刮下孢子并懸浮于無(wú)菌水中，然后按體積比10％的接種量將孢子懸液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，然后將試管的封口棉塞換成膠塞，繼續(xù)在30℃靜置培養(yǎng)48h；培養(yǎng)過(guò)程中所用到的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是麥秸粉72g，麩皮8g，(NH4)2SO42g，水205ml。其中，麥秸粉是通過(guò)將小麥秸稈經(jīng)F120型粉碎機(jī)(購(gòu)自上海樹立儀器儀表公司)粉碎至40目制得的，麩皮購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所。
綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)乙烯。
(三)有益效果本發(fā)明提供了一種產(chǎn)乙烯的綠色木霉及其培養(yǎng)方法，該菌株可利用纖維素生產(chǎn)乙烯，以減少乙烯的進(jìn)口，實(shí)現(xiàn)乙烯供應(yīng)的可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)拉動(dòng)農(nóng)業(yè)及其他相關(guān)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
1.經(jīng)濟(jì)效益分析地球上的生物質(zhì)資源極為豐富，據(jù)估計(jì)，地球每年經(jīng)光合作用所產(chǎn)生的干物質(zhì)有2000億噸，木質(zhì)纖維素是這些植物光合產(chǎn)物中超過(guò)一半的主成分，在木材、秸稈、農(nóng)林產(chǎn)品加工副產(chǎn)品、畜禽糞便中都含有大量的木質(zhì)纖維素。其中，秸稈是世界上產(chǎn)量最大的固體廢棄物。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)作物秸稈產(chǎn)量每年達(dá)7億噸以上，相當(dāng)于3.5億噸標(biāo)煤，占全國(guó)年商品能源消費(fèi)量的30％，按2006年標(biāo)煤市場(chǎng)價(jià)格計(jì)算，廢棄秸稈的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1200億元。然而，2004年我國(guó)60％以上的乙烯需要進(jìn)口，進(jìn)口乙烯量為900萬(wàn)噸，預(yù)計(jì)到2010年乙烯進(jìn)口量將達(dá)1200萬(wàn)噸以上。同時(shí)，目前生產(chǎn)的乙烯都是從石油中提煉和加工制得的，而石油是一種不能再生的資源，地球上蘊(yùn)藏的可開采石油將在40年內(nèi)耗盡。因此，如能利用全國(guó)每年20％的作物秸稈生產(chǎn)乙烯，則會(huì)有效降低乙烯的進(jìn)口，為乙烯的生產(chǎn)開辟一條新途徑，還可帶動(dòng)其它相關(guān)環(huán)保產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為“三農(nóng)”開辟一條新的生產(chǎn)和致富門路。
2.社會(huì)效益分析本發(fā)明直扣“三農(nóng)”、能源和環(huán)境三大主題，消除作物秸稈就地焚燒的污染，將秸稈類廢棄物轉(zhuǎn)變成生物乙烯，變廢為寶，可以大幅度提高生態(tài)指標(biāo)及生活環(huán)境質(zhì)量，極大地緩解能源危機(jī)壓力，實(shí)現(xiàn)我國(guó)可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略。
本發(fā)明所述的綠色木霉(T.viride)，該菌株已于2007年1月16日被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)為CGMCC No.1918。


圖1是重組質(zhì)粒pCL-9-efe的質(zhì)粒酶切圖譜；圖2是PCR驗(yàn)證整合有乙烯形成酶基因的轉(zhuǎn)化子的電泳圖，圖中，M表示λDNA/Hind III+EcoR I mark，1表示整合有乙烯形成酶基因的轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物，2表示作為正對(duì)照的質(zhì)粒pCL-9-efe的PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的構(gòu)建用PCR法從丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.glycinea)(該菌株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)中克隆乙烯形成酶基因efe(該基因序列見報(bào)道Fukuda H，Ogawa T，Ishihara K，et al.Molecμlarcloning in Escherichia coli，expression，and nucleotide sequence for the gene forthe ethylene-forming enzyme of Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2.Biochemical and Biophysical Research Communications，1992，188826-832.)。
PCR所用引物的序列為上游引物P15’-cccccgcggatgaccaacctacagactttc-3’(劃線處為Sac II位點(diǎn))，下游引物P25’-tatcccgggaactcatgagcctgtcgcg-3’(劃線處為Sma I位點(diǎn))。
PCR條件是94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。所用PCR儀型號(hào)是PTC200(MJ公司生產(chǎn))。
然后將PCR產(chǎn)物插入到用Sac II和Sma I(均購(gòu)自TaKaRa公司)消化的載體pCL-9(購(gòu)自華美公司)上形成重組質(zhì)粒pCL-9-efe，重組質(zhì)粒pCL-9-efe的質(zhì)粒酶切圖譜見附圖1。
接著制備綠色木霉(該菌株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所)的原生質(zhì)體(制備原生質(zhì)體的方法具體參見Penttila M，et al.A versatiletransformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene，1987，61155-164.)，然后將攜帶潮霉素抗性的質(zhì)粒pAN7-1(購(gòu)自華美公司)和重組質(zhì)粒pCL-9-efe共轉(zhuǎn)化綠色木霉的原生質(zhì)體(共轉(zhuǎn)化的方法具體參見Penttila M，et al.A versatile transformation system for the cellμlolyticfilamentous fungus Trichoderma reesei.Gene，1987，61155-164.)。
然后在再生培養(yǎng)基上篩選帶有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，再生培養(yǎng)基的配方為葡萄糖2g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.06g/L，CaCl20.06g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，瓊脂2g/L，pH5.5，添加1mol/L的山梨醇0.8mol作滲透壓穩(wěn)定劑，余量用水補(bǔ)足，臨用時(shí)加入潮霉素B至終濃度為250μg/ml。
再通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選整合有乙烯形成酶基因(efe)的轉(zhuǎn)化子，鑒定的結(jié)果見附圖2。并通過(guò)氣相色譜來(lái)確定乙烯產(chǎn)量(氣相色譜測(cè)定乙烯產(chǎn)量的方法見實(shí)施例2)，其中乙烯產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化子即為綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918。
實(shí)施例2綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培養(yǎng)及乙烯產(chǎn)量測(cè)定一、培養(yǎng)
(1)將所述的綠色木霉的孢子接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1周；(2)待孢子長(zhǎng)成綠色后，刮下孢子并懸浮于無(wú)菌水中，然后按體積比1％的接種量將孢子懸液接種于液體基本培養(yǎng)基中，試管用棉塞封口，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48h；(3)離心收集菌絲體(離心機(jī)型號(hào)TGL-16H，購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，離心參數(shù)為10000rpm 1min)，再將菌絲體轉(zhuǎn)接于液體纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，試管用膠塞封口，30℃振蕩培養(yǎng)36h。
二、乙烯產(chǎn)量測(cè)定取試管內(nèi)頂端氣體100μl進(jìn)行氣相色譜分析所用氣相色譜儀型號(hào)為HP6890(美國(guó)HP公司生產(chǎn))，色譜柱為HP-PLOT/Al2O3，規(guī)格15m×0.53mm×15μm(內(nèi)膜厚度)，柱內(nèi)溫度70℃，載氣為N2(28.5ml/min)，氫焰離子檢測(cè)器。
測(cè)定結(jié)果為測(cè)得峰面積的平均值為145.9，經(jīng)搖床發(fā)酵36h綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918轉(zhuǎn)化纖維素粉生成乙烯的量為2.075μl/h/g干菌體。實(shí)施例3綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培養(yǎng)及乙烯產(chǎn)量測(cè)定一、培養(yǎng)(1)將所述的綠色木霉的菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1周；(2)待孢子長(zhǎng)成綠色后，刮下孢子并懸浮于無(wú)菌水中，然后按體積比10％的接種量將孢子懸液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，然后將試管的封口棉塞換成膠塞，繼續(xù)在30℃靜置培養(yǎng)48h。
二、乙烯產(chǎn)量測(cè)定測(cè)定方法及所用儀器、儀器參數(shù)設(shè)定同實(shí)施例2，測(cè)定結(jié)果為測(cè)得峰面積的平均值為176.7，經(jīng)固體發(fā)酵48h綠色木霉(T.viride)CGMCC No.1918直接轉(zhuǎn)化麥秸生成乙烯的量為0.059μl/h/g濕曲(濕曲表示發(fā)酵培養(yǎng)基的濕重)。
權(quán)利要求
1.一株綠色木霉(Trichoderma viride)CGMCC No.1918，其特征在于該菌株的染色體DNA中含有乙烯形成酶基因efe。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色木霉在工業(yè)生產(chǎn)乙烯中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色木霉的培養(yǎng)方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將所述的綠色木霉的孢子或菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1周；(2)待孢子長(zhǎng)成綠色后，刮下孢子并懸浮于無(wú)菌水中，然后按體積比1％的接種量將孢子懸液接種于液體基本培養(yǎng)基中，試管用棉塞封口，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48h；(3)離心收集菌絲體，再將菌絲體轉(zhuǎn)接于液體纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，試管用膠塞封口，30℃振蕩培養(yǎng)36h；培養(yǎng)過(guò)程中所用到的培養(yǎng)基的組成是基本培養(yǎng)基葡萄糖2g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.06g/L，CaCl20.06g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，pH5.5，余量用水補(bǔ)足；纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基纖維素粉0.5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.06g/L，CaCl20.06g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，pH5.5，余量用水補(bǔ)足。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色木霉的培養(yǎng)方法，其特征在于它包括以下步驟(1)將所述的綠色木霉的孢子或菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1周；(2)待孢子長(zhǎng)成綠色后，刮下孢子并懸浮于無(wú)菌水中，然后按體積比10％的接種量將孢子懸液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，然后將試管的封口棉塞換成膠塞，繼續(xù)在30℃靜置培養(yǎng)48h；培養(yǎng)過(guò)程中所用到的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是麥秸粉72g，麩皮8g，(NH4)2SO42g，水205ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株產(chǎn)乙烯的綠色木霉CGMCC No.1918，該菌株的染色體DNA中含有乙烯形成酶基因efe。本發(fā)明還提供了該菌株的培養(yǎng)方法。本發(fā)明利用秸稈類生物質(zhì)生產(chǎn)乙烯，既能減少乙烯進(jìn)口為國(guó)家節(jié)省外匯，同時(shí)又能保護(hù)環(huán)境，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12P5/02GK101024815SQ20071000285
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日
發(fā)明者陳三鳳, 陶麗, 董紅軍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)