專利名稱：靜寧雞胚成纖維細胞系及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細胞系及其培養(yǎng)方法，具體地說是利用靜寧雞胚胎進行初代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)獲得高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系，屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著科技的發(fā)展和人們物質(zhì)生活需求的不斷提高，畜牧業(yè)生產(chǎn)正朝著高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病及集約化的方向快速轉(zhuǎn)變和發(fā)展。在大多數(shù)發(fā)達國家里，由于人們過于追求經(jīng)濟利益等緣故，大量繁育的畜禽只是少數(shù)經(jīng)濟價值高的品種和雜交種，因而，導(dǎo)致了而很多產(chǎn)量不高、品質(zhì)不佳、抗逆和抗病力差的地方品種的瀕臨滅絕，甚至滅絕。雖然相關(guān)的國際組織、政府部門和專家學(xué)者對畜禽遺傳資源的保存和管理工作相當(dāng)重視，但畜禽種質(zhì)資源仍在大量喪失，遺傳多樣性遭到了前所未有的破壞，并且危機程度日益加劇。
1995年，F(xiàn)AO的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明在撒哈拉沙漠以南的中部非洲地區(qū)登記在案的畜禽約有738個品種，將近15％為瀕危畜禽資源。非洲地區(qū)的形式非常嚴峻，畜禽遺傳資源已慘遭破壞，從1995年至今，處于瀕臨滅絕的家禽由20％上升到了34％。亞太地區(qū)擁有全球1/5的畜禽資源，1251個畜禽品種被登記，據(jù)估計在所被記錄的品種中，約有10％為瀕危資源。在1995年到1999年間，亞洲瀕臨滅絕的家禽由32％上升到37％。在東歐這種情況更為嚴重，在1995年到1999年的幾年時間里，處于瀕臨滅絕的家禽由65％上升到了76％。拉丁美洲現(xiàn)存20％的品種被認為處于瀕危。處于瀕危狀態(tài)的禽類由1995年的5％急劇上升到了1999年的45％。近東地區(qū)生產(chǎn)的集約化和機械化導(dǎo)致了很多畜禽品種的瀕臨滅絕。在571個被登記的品種中，有44個甚至更多被認為是處于瀕危狀態(tài)。北美持續(xù)的生產(chǎn)集約化，使得在生產(chǎn)中僅依賴少數(shù)的品種來滿足食品生產(chǎn)的需求，因此加重了畜禽遺傳資源多樣性的危機程度，在被記錄的259個品種中，有35％瀕臨滅絕。據(jù)2000年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)與聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署的報道，目前全球畜禽品種以每周減少2個品種的速度在喪失，在被FAO所記錄的2576個畜禽品種中，幾乎半數(shù)被認為是瀕危畜禽資源，約有1350個品種面臨滅絕，使世界畜禽種質(zhì)資源出現(xiàn)越來越狹窄的格局，因此挽救和保護瀕危畜禽品種已成為當(dāng)務(wù)之急。
我國畜禽生產(chǎn)力類型豐富，其遺傳資源具有物種和品種繁多，起源和分布廣泛，生態(tài)類型多樣等特點，且我國地方品種所占的比例遠遠高于其他國家。我國畜禽具有對疫病抵抗力強的特性，具有各種抗性和經(jīng)濟性狀的優(yōu)良基因。
但是，近些年來，由于生態(tài)環(huán)境的不斷惡化、國外畜禽品種的大量引進和集約化養(yǎng)殖等諸多因素的影響，導(dǎo)致我國很多優(yōu)良地方畜禽品種的滅絕或處于瀕臨滅絕狀態(tài)。近20年，41.9％的地方品種群體數(shù)量有不同程度的下降。80年代中后期雞的配套系又取代了本地雞品種和新培養(yǎng)品種，致使我國家養(yǎng)動物種質(zhì)資源受到嚴重破壞。我國的畜禽遺傳資源多樣性狀況也并不樂觀，而且有不斷惡化的趨勢。畜禽種質(zhì)資源的危機，意味著畜禽種質(zhì)所攜帶基因的危機，甚至是基因的永遠消失，意味著畜禽遺傳資源多樣性的衰退和喪失。品種的滅絕意味著細胞和分子生物學(xué)對其進行科學(xué)研究的基本材料的永遠喪失，如果這些品種的種質(zhì)資源在滅絕前未曾以任何方式保存下來，不僅永遠喪失了其基因資源，而且使科學(xué)家們對于它們諸多未知的細胞和分子生物學(xué)機理的探索及通過體細胞克隆技術(shù)使之再現(xiàn)的愿望將永遠成為謎和夢，同時也將是世界遺傳資源遺產(chǎn)和生命科學(xué)理論寶庫的巨大損失。因此，在全球性搶奪生物資源和保護生物多樣性的今天，從我國畜禽種質(zhì)資源保存的實際出發(fā)，通過構(gòu)建重要、瀕危畜禽品種群體細胞庫的方式來保存其基因資源，具有重要意義。
近年來，由于體外培養(yǎng)細胞在遺傳資源保存和生命科學(xué)研究等諸多方面具有巨大的科學(xué)價值和應(yīng)用價值，已引起各國政府高度重視。除美國外，日本大阪發(fā)酵所(IFO)、德國培養(yǎng)物保藏所(DSM)等都在逐漸擴大保藏范圍，將細胞培養(yǎng)物列入保藏對象。
目前，低溫冷凍保存技術(shù)的發(fā)展和完善，使得任何體外培養(yǎng)物都可以在保持其活力的基礎(chǔ)上無限期地得以保存，因此，對于動物細胞的大量培養(yǎng)以解決種質(zhì)資源問題無疑是現(xiàn)階段細胞生物學(xué)領(lǐng)域研究的重要問題。
靜寧雞是原產(chǎn)于我國甘肅靜寧的卵肉兼用型地方良種家禽。它的頭部高舉，尾羽高聳，胸肌發(fā)達，背寬而長。公雞多為玫瑰冠，毛色紅棕及醬紅色為主，主翼羽、主尾羽均為黑色，外觀美麗；母雞頭小清秀，黃色占大部分，麻色占的比例也不少，其肉質(zhì)鮮美細嫩，目前采用農(nóng)戶分散飼養(yǎng)，山區(qū)以放牧為主。但是，由于近幾十年來自然環(huán)境的污染和惡化，靜寧雞的種質(zhì)資源已經(jīng)嚴重匱乏，在絕大多數(shù)地區(qū)已經(jīng)滅絕，在小部分地區(qū)也只還存在有限的數(shù)目，而目前人工繁育所面臨的多方面技術(shù)問題導(dǎo)致其繁育效果不佳，我國靜寧雞面臨瀕臨滅絕的危險。更由于其種質(zhì)資源的匱乏，使生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)τ陟o寧雞的研究也成為空白。因此，為保護國家珍惜禽種，一個最優(yōu)的方法是對靜寧雞成纖維細胞的大規(guī)模培養(yǎng)并加以保藏。
目前隨著生物技術(shù)的發(fā)展，迫切需要大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，以便獲得大量有用的細胞表達產(chǎn)物。但是，由于靜寧雞成纖維細胞生長緩慢，對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，若直接從組織塊原代培養(yǎng)其所獲得的細胞數(shù)量少，細胞類型多而雜，如成纖維細胞中常混雜有上皮細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)物所含各種類型細胞間的生長期限出現(xiàn)差異，有的細胞類型經(jīng)過適應(yīng)生長階段而加速繁殖生長，而另一些細胞，或者死亡，或者經(jīng)過逐步退化而至死亡。而第一代細胞培養(yǎng)技術(shù)核心問題是難以產(chǎn)業(yè)化或者說是規(guī)?；a(chǎn)一是在工藝生產(chǎn)時不能大規(guī)模制備產(chǎn)品；二是非批量生產(chǎn)容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量的不均一性；三是難以對同批生產(chǎn)進行生產(chǎn)和質(zhì)量控制。而采用玻璃瓶靜置或旋轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方法，也已不能滿足所需細胞數(shù)量及其分泌產(chǎn)物。目前使用較多的反應(yīng)器培養(yǎng)雖可以獲得高密度細胞，但是擴大規(guī)模較難，只適合于少量、價值高的細胞培養(yǎng)。
目前，常采用EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)、貼壁培養(yǎng)法和膠原酶消化技術(shù)進行禽類品種體外細胞的大量培養(yǎng)，但對比試驗結(jié)果表明EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)對于禽類品種的體外細胞培養(yǎng)并不適用，其培養(yǎng)的細胞活率及純度均不能達到所需標(biāo)準(zhǔn)，EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)對于人類和靈長類動物的細胞培養(yǎng)效果要優(yōu)于禽類細胞培養(yǎng)；膠原酶消化技術(shù)和貼壁培養(yǎng)法獲得的原代細胞分別經(jīng)傳代后接種，細胞群體倍增時間(PDT)分別為35.9h和48h。但前者操作步驟繁雜，不適合于體外大規(guī)?；毎呐囵B(yǎng)，后者簡單易行，適合于體外大規(guī)?；毎呐囵B(yǎng)。因此建立細胞系以采用后者為佳。對于禽類細胞保藏而言，細胞純度及活性均有較高的要求，目前，貼壁培養(yǎng)方法存在諸多弊端，如方法單一、成本過高、細胞活性及純度偏低、細胞凍存復(fù)蘇后死亡率過高等。因此，現(xiàn)在急需對其方法改進使靜寧雞成纖維細胞達到高細胞活率高純度的標(biāo)準(zhǔn)已得到很好的保藏并延續(xù)下去。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高細胞活性、高細胞純度的靜寧雞胚成纖維細胞系，其保藏號為CGMCC No.1878。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述細胞系的培養(yǎng)方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系，并在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC(地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號；郵編100080；電話010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏號CGMCC No.1878，建議的分類命名為靜寧雞胚成纖維細胞系。該靜寧雞胚成纖維細胞系具有以下特征靜寧雞的胚胎組織塊接種6h后即有細胞長出，1～2天即可貼滿瓶壁。倒置顯微鏡下可見細胞透明，胞質(zhì)突起豐滿，呈長梭形，胞核橢圓形、居中，核仁清晰。當(dāng)細胞生長成片后，細胞呈長梭形，火焰狀，細胞形態(tài)趨于一致，為單核成纖維樣。同時，細胞性質(zhì)穩(wěn)定，增殖較快。
上述高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)將除去腦、眼、四肢、內(nèi)臟的靜寧雞胚胎用PBS漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶，倒置培養(yǎng)瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基6～10ml，培養(yǎng)基成分MEM+10％胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入全培養(yǎng)液(10％FBS的MEM)6～10ml終止消化；消化后的細胞平均分裝入2個培養(yǎng)瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至凍存前24h；(3)細胞凍存A、凍存前24h棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，培養(yǎng)液成分MEM+10％胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，然后加入全培養(yǎng)液6～10ml終止反應(yīng)；C、用紅細胞計數(shù)板計算凍存前細胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心6～10min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％MEM；E、將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中封口；F、預(yù)凍將凍存管裝入降溫盒中，放于4℃20～30min，然后置于-70℃預(yù)凍4h以上；G、凍存提出凍存管放入液氮柜中，即完成細胞凍存。
上述高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其中，步驟(1)中所述的靜寧雞胚胎6日齡為最佳。
上述高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其中，步驟(2)及步驟(3)中所述的胰酶消化具體步驟是向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后后翻轉(zhuǎn)消化30～60s。
上述高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其中，根據(jù)實際需要可以將步驟(3)凍存的細胞進行細胞復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，連續(xù)晃動1min后，將細胞移入加有培養(yǎng)液(MEM+10％胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放置含37.5℃5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點與效益本發(fā)明對于貼壁培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基培養(yǎng)液成分的改進調(diào)整，可以使培養(yǎng)出的成纖維細胞無上皮細胞等雜質(zhì)細胞，細胞純度于現(xiàn)有技術(shù)相比有大幅提高；對于凍存條件的改進使復(fù)蘇的細胞與凍存前相比，細胞類型仍為成纖維細胞，細胞形態(tài)和生長速度沒有發(fā)生變化，凍存細胞質(zhì)量穩(wěn)定，且細胞凍存后細胞的活率可達到并維持在93.2％～96.7％之間，且細胞傳代生長穩(wěn)定，與現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細胞相比有顯著提高，適合大規(guī)模培養(yǎng)。
與酶消化法比貼壁培養(yǎng)法的靜寧雞胚成纖維細胞培養(yǎng)效率和質(zhì)量有很大的提高，利用酶消化法培養(yǎng)靜寧雞胚成纖維細胞的對比實驗中發(fā)現(xiàn)，原代細胞生長狀態(tài)與貼壁培養(yǎng)發(fā)的區(qū)別很小，但是傳代2d左右即發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)空泡，而且隨培養(yǎng)時間的增加細胞空泡化日益嚴重，無法得到健康狀態(tài)的靜寧雞胚成纖維細胞。因此，利用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)靜寧雞胚成纖維細胞具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明培養(yǎng)的細胞生長速度快、成活率高、外源基因表達率高、細胞融合率和凋亡率低，應(yīng)用范圍廣。
對于培養(yǎng)基的調(diào)整及培養(yǎng)方法的改進，還可以使成本大幅降低。本發(fā)明在方法等各方面彌補了現(xiàn)有禽體細胞保存狀況不理想的情況，靜寧雞胚成纖維細胞系的活率及純度的提升也使重要、瀕危靜寧雞品種的基因資源以體外培養(yǎng)細胞的形式得以長期保存。
由于靜寧雞種質(zhì)資源的匱乏，使得對于靜寧雞在各領(lǐng)域內(nèi)的研究成為空白。而本發(fā)明所述的高細胞活率及高純度的靜寧雞胚成纖維細胞系可以為醫(yī)學(xué)、細胞和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量的高品質(zhì)材料；并可以作為禽體細胞克隆育種的供體細胞；在農(nóng)業(yè)上可以豐富地方禽品種改良以及地方優(yōu)良禽品種保種的手段；還可以作為是疫苗生產(chǎn)的主要原材料及肝細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層；同時可用于細胞凋亡及細胞融合研究之用。
下面結(jié)合附圖及最佳實施方式對本發(fā)明做進一步說明，以使公眾對發(fā)明內(nèi)容有整體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以實施的保護范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對本發(fā)明的侵犯。


圖1為靜寧雞胚原代細胞顯微鏡下圖；圖2為靜寧雞傳代前細胞顯微鏡下圖；圖3為靜寧雞繼代I細胞顯微鏡下圖；圖4為靜寧雞胚繼代II細胞顯微鏡下圖；
圖5為被支原體污染的成纖維細胞對照圖；圖6為靜寧雞胚成纖維細胞支原體檢測陰性結(jié)果圖示；圖7為靜寧雞胚成纖維細胞生長曲線圖；圖8為靜寧雞胚成纖維細胞核型圖示；圖9為靜寧雞胚成纖維細胞乳酸脫氫同功酶電泳圖示(左側(cè)兩個泳道為白耳雞、右側(cè)兩個泳道為靜寧雞的乳酸脫氫同功酶)；圖10為靜寧雞胚成纖維細胞蘋果酸脫氫酶電泳圖示(右側(cè)兩個泳道為白耳雞的、左側(cè)兩個泳道為靜寧雞的蘋果酸酸同功酶)；圖11為外源基因在靜寧雞胚成纖維細胞中表達24h圖示(pEGFP-N3熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；圖12為外源基因在靜寧雞胚成纖維細胞中表達48h圖示(pEGFP-N3熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；圖13為外源基因在靜寧雞胚成纖維細胞中表達48h圖示(pDsRed1-N1熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；圖14為外源基因在靜寧雞胚成纖維細胞中表達48h圖示(pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)；圖15伊紅染色的靜寧雞細胞(400×)；圖16DAPI染色的天祝白牦牛細胞(400×)；圖17天祝白牦牛和靜寧雞細胞融合(1000×)；圖18天祝白牦牛和靜寧雞融合細胞某一位點放大圖(400×)；圖19靜寧雞細胞自身融合(400×)；圖20靜寧雞復(fù)蘇后凋亡檢測(200×)。
具體實施例方式
實施例中所用的主要儀器及試劑來源靜寧雞胚來源靜寧雞蛋胚采自甘肅省靜寧縣。
(一)主要儀器設(shè)備1、CO2培養(yǎng)箱Heraeus BB16UV；2、DL-CJ-2N高性能無菌實驗臺哈爾濱；3、IX-71倒置相差顯微鏡，CX31生物顯微鏡，IX-71倒置相差熒光顯微鏡Olympus；4、TDL-4OB低速離心機CENTERIGUGE；
5、頗爾超純水器Pall-pruelab_plus；6、電動移液器德國Accu-jet；7、-70℃低溫冰箱美國kelvinator；8、激光掃描共聚焦顯微鏡尼康TE-2000-E；9、液氮貯存器四川東亞YES-50B-125F；10、電泳儀DYY-6C及電泳槽DYC-24A北京六一廠；(二)主要試劑1、MEM(含Earle’s鹽、L-谷胺酰氨、非必需氨基酸，不含重碳酸鹽)Gibco公司；2、脂質(zhì)體LipofectinGibco公司；3、載體pEGEP-N3Clontech；4、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆薩(Giemsa)Amresco；5、胎牛血清(Defined FBS)特級胎牛血清(Defined FBS)，Hyclone；6、臺盼藍(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉雙丙烯酰胺)98％，過硫酸銨(AmmoniumPersulfate)，PMS，NAD，噻唑藍(Thiazolyl Blue)Sigma；7、甘油分析純?nèi)A綠淵；8、TrisPromega；9、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)NOVON；10、PEGMylab；成纖維細胞培養(yǎng)所用試劑11、MEM培養(yǎng)液超純?nèi)羲芙?.6g的MEM，2.2g的NaHCO3，加水定容至1L，pH為7.2～7.4，0.22μm濾膜過濾除菌后，500ml/瓶分裝，4℃貯存；12、全培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液中加入終濃度為10％(體積比)的FBS，0.22μm濾膜過濾除菌后，500ml/瓶分裝，4℃貯存。
13、雙抗貯存液100萬IU的鏈霉素4支，80萬IU的青霉素5支溶于400ml滅菌去離子水中。
14、1×PBS緩沖液NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO40.10g，加三蒸水定容至500ml，pH為7.2，高壓滅菌密封后4℃貯存。
15、0.25％(質(zhì)量體積比)胰蛋白酶溶液1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH為7.2～7.4，0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝，-20℃貯存。
16、0.9％(質(zhì)量比)生理鹽水0.45g NaCl溶于500ml三蒸水，高壓滅菌30min。
17、細胞凍存液將50ml DMSO加入450ml全培養(yǎng)液(含體積比15％FBS的全培養(yǎng)液)中，用0.22μm濾膜過濾除菌，以100ml/瓶分裝，貯存于-20℃冰箱。
微生物檢測所用試劑18、大豆胰蛋白胨3g大豆胰蛋白胨，加100ml三蒸水，調(diào)pH至7.3，高壓滅菌15～20min，分裝到15mm×150mm的玻璃管中。
19、麥芽汁2g麥芽汁加100ml三蒸水，調(diào)pH至3～4，高壓滅菌15～20min，分裝到15mm×150mm的玻璃管中。
20、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
21、封片液22.2ml 0.1M的檸檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH調(diào)節(jié)pH至5.5，貯存于4℃。
22、固定液冰醋酸與甲醇以體積比1∶3的比例(現(xiàn)用現(xiàn)配)。
染色體標(biāo)本制備所用試劑23、秋水仙素貯存液10mg秋水仙素溶于10ml三蒸水中。
24、稀釋液三蒸水將貯存液稀釋10倍至終濃度為100μg/ml。
25、低滲KCl溶液0.5g的KCl溶于100ml三蒸水。
26、固定液冰醋酸與甲醇按體積比1∶3的比例配制。
27、Giemsa染色液原液將1g Giemsa染粉倒入研缽，加幾滴甘油，在研缽內(nèi)研磨至無顆粒為止，然后加甘油至33ml，放在56℃保溫箱2h后，加入45ml甲醇攪拌均勻，棕色瓶中貯存?zhèn)溆谩?br> 工作液磷酸緩沖液將Giemsa原液稀釋10倍至終濃度為10ml。
28、磷酸緩沖液的配制KH2PO40.34g加入100ml去離子水(用NaOH調(diào)pH 6.8)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞所用試劑29、質(zhì)粒DNA(DsRed、pEYFP-N1和pEGFP-N3)，脂質(zhì)體Lipofectamine，不含血清的MEM培養(yǎng)液，含血清的MEM培養(yǎng)液，pH7.4的PBS。
同工酶分析所用試劑30、0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液分別稱取0.9g NaCl和0.0223gEDTA溶于100ml三蒸水中即可。
31、蛋白提取液將5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmolEDTA溶液中即得蛋白提取液，將其貯于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(質(zhì)量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。
32、40％(質(zhì)量體積比)蔗糖溶液將40g蔗糖溶于100ml水中。
33、膠溶液的配制A液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用濃鹽酸調(diào)至pH8.9B液Acr 40.0g，Bis 2gC液過硫酸銨0.14g(現(xiàn)配現(xiàn)用)D液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用濃鹽酸調(diào)至pH6.7E液Acr 10.0g，Bis 2.5gF液核黃素4.0mgG液蔗糖40.0g34、聚丙稀酰胺凝膠溶液濃度，見表1表1


35、電極緩沖液的配置6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸餾水，pH調(diào)至8.736、電泳指示劑分別秤稱取0.25g溴酚藍和40g蔗糖溶于100ml水中。
37、LDH染色液配制(染色前1h配制)乳酸鈣100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml噻唑藍5mg+三蒸水1.0mlPMS 2.5mg+三蒸水1.0ml輔酶I(NAD)10mg染色前，將以上保溫試劑混合后，倒入20ml 2％(體積比)瓊脂溶液中，混勻。
38、MDH染色液配制(染色前1h配制)DL-蘋果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中噻唑藍15mg+三蒸水1.5mlPMS 5mg+三蒸水1.0ml輔酶I(NAD)10mg將以上混合后，倒入25ml 2％(體積比)瓊脂溶液中。
39、固定液的配制乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。
40、溴酚藍溶液得配制分別稱取0.25g溴酚藍和40g蔗糖溶于100ml水中。
細胞融合所用試劑41、GKN溶液NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，NaH2PO40.68g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000ml蒸餾水中。
42、50％(質(zhì)量體積比)PEG溶液稱取50g的PEG(WM＝4000)放入燒杯中，沸水浴加熱，使之熔化，待冷卻至50℃時，加入預(yù)熱至50℃的GKN溶液100ml，混勻，置37℃?zhèn)溆谩?br> 43、0.5mol/L CaCl2溶液5.5495g無水CaCl2溶于100ml三蒸水中，終濃度為0.5mol/L。
44、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
45、伊紅染液(試劑盒)細胞凋亡檢測所用試劑46、固定液冰醋酸與無水甲醇以體積比1∶3的比例混合，4℃貯存?zhèn)溆?現(xiàn)用現(xiàn)配)。
47、DAPI染液三蒸水配制1mg/ml DAPI儲存液，PBS稀釋為0.5～1mg/ml。
48、封片液的配制將22.2ml 0.1mol/L檸檬酸與27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH調(diào)pH至5.5，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 實施例1高細胞活率高純度靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)(1)初代培養(yǎng)無菌條件下，將靜寧雞6日齡胚胎破蛋殼大端，用眼科鑷小心取出胚胎，置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，除去胚胎的腦、眼、四肢、內(nèi)臟，放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中漂洗3～4次，以去除表面血污；將組織剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；用移樣器將組織塊分別移入培養(yǎng)瓶中分散均勻，倒置培養(yǎng)瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基8ml，培養(yǎng)基成分MEM+10％特級胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留物2次后，以除去殘余的血清和脫落的組織塊及死細胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化50s，在倒置顯微鏡下觀察細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大時，加入全培養(yǎng)液(10％FBS的MEM)8ml終止消化；消化后的細胞平均分裝入2個培養(yǎng)瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至凍存前24h；(3)細胞凍存A、至凍存前24h棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液8ml，培養(yǎng)液成分MEM+10％特級胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶2ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化50s，加入全培養(yǎng)液8ml終止反應(yīng)；C、用紅細胞計數(shù)板計算凍存前細胞總數(shù)；
D、收集1000rpm離心8min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管輕輕吹打使細胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％MEM；E、將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中嚴密封口，標(biāo)明日期、品種、細胞名稱、培養(yǎng)代數(shù)；F、預(yù)凍將凍存管裝入降溫盒中，放于4℃20～30min，然后在-70℃冰箱中預(yù)凍10～12h(4h以上)；G、凍存提出凍存管放入液氮柜中，即完成細胞凍存。
(4)細胞復(fù)蘇將凍存管從液氮中取出，迅速置入42℃水浴中，連續(xù)晃動1分種后，見余有小冰團成黃豆粒大h放入超凈工作臺內(nèi)；將細胞移入加有培養(yǎng)液(MEM+10％特級胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中輕輕吹打均勻，放置含37.5℃5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
(5)純化細胞利用胰酶消化進行純化成纖維細胞。從建成的細胞系形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果看，在原代培養(yǎng)及早期傳代培養(yǎng)時，上皮細胞和成纖維細胞同時出現(xiàn)，混雜生長，混雜生長細胞分區(qū)成片。上皮細胞為多邊形，形態(tài)上與成纖維細胞有很大不同。由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶耐受性不同，在消化培養(yǎng)細胞時，常是成纖維細胞先脫壁，而且傳代后貼壁快，附著快。而另外大部分上皮細胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍振動即浮起，需要生長基質(zhì)如膠原或其它細胞外基質(zhì)成分等的支持，因此，利用這個差別，經(jīng)酶消化法和反復(fù)貼壁法處理2～3代后，能夠完全純化成纖維細胞。細胞呈典型的梭形，中央有卵圓形核，細胞在生長時呈放射狀、火焰狀或旋渦狀走行。細胞純度達到99％以上。
實施例2靜寧雞胚成纖維細胞系生物學(xué)特性的檢測對實施例1培養(yǎng)的靜寧雞胚成纖維細胞系進行生物學(xué)特性檢查，方法及結(jié)論如下。
一、細胞形態(tài)學(xué)觀察方法細胞在體外培養(yǎng)過程中，對細胞進行常規(guī)檢查，觀察細胞生長狀態(tài)、培養(yǎng)液顏色變化情況以及細胞是否發(fā)生污染。
結(jié)論如圖1(靜寧雞原代細胞)、圖2(靜寧雞傳代前細胞)、圖3(靜寧雞繼代I細胞)、圖4(靜寧雞繼代II細胞)所示，當(dāng)細胞生長狀態(tài)良好時，其形態(tài)為典型的成纖維狀，呈現(xiàn)梭形或不規(guī)則三角形。對細胞群體的全貌觀察，所培養(yǎng)的細胞均呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走勢，證明細胞生長健康旺盛。
二、微生物檢測
1、細菌、真菌檢測方法(1)取總凍存細胞安瓿0.5％的凍存細胞，分別溶解于8ml無抗培養(yǎng)基中，混勻后將細胞懸液以2000g離心20min，并重復(fù)兩次，以消除抗生素的影響。再重懸于2ml無抗生素的培養(yǎng)液中。
(2)將細胞以0.5ml接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
(3)設(shè)對照為A.陽性對照枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到胰蛋白豆胨和麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
B.陰性對照胰蛋白豆胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，分別置于37℃和26℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周。
結(jié)論檢測細胞肉眼觀察接種有靜寧雞成纖維細胞的大豆胰蛋白胨培養(yǎng)液和麥芽汁培養(yǎng)液，均呈現(xiàn)清亮透明狀，將試管置于顯微鏡下觀察，除動物細胞呈圓形的透明狀亮點漂浮在培養(yǎng)液中，無其它異物。證明在細胞培養(yǎng)凍存及細胞復(fù)蘇的整個過程中，細胞未被細菌、真菌污染。
2、病毒檢測方法(1)接種待檢測細胞培養(yǎng)物，用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)至致密單層。
(2)采集新鮮的肝素抗凝全血(雞血、豚鼠血)，1000rpm離心10min，棄上清。沉積的紅細胞用PBS洗滌3次，用0.9％NaCl溶液懸浮，制成0.5％(V/V)的紅細胞懸液。
(3)待檢細胞棄除培養(yǎng)液，用0.9％NaCl溶液沖洗單層細胞2～3次。
(4)分別加0.5ml新鮮配制的雞、豚鼠紅細胞懸液于待檢細胞瓶中，于4℃放置20min。
(5)觀察紅細胞凝集和吸附現(xiàn)象，不呈現(xiàn)紅細胞吸附的細胞，需重復(fù)進行(2)～(4)的操作。
結(jié)論
由于有些病毒表面有血凝素，能結(jié)合某些物種的紅細胞，出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。被這些病毒感染的細胞能夠?qū)㈦u、豚鼠的紅細胞吸附在其表面上。檢測結(jié)果在無抗生素的條件下常規(guī)培養(yǎng)靜寧雞胚成纖維細胞，相差顯微鏡觀察，雞的紅細胞呈橢圓狀懸浮在成纖維細胞上方，未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象；豚鼠的紅細胞呈圓形懸浮在上方，也未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。檢測結(jié)果為陰性，證明該培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中沒有因為病毒而造成細胞損傷。
3、支原體檢測方法(1)標(biāo)本將成纖維細胞制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml。
(2)培養(yǎng)被檢細胞在不含抗生素的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)3次以上(不低于3次)，在最后一次傳代培養(yǎng)增殖期中換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d。
(3)接種陰性對照皿加細胞培養(yǎng)液MEM 2ml；待檢皿內(nèi)加入待檢樣品2ml，待蓋片培養(yǎng)細胞匯合前從瓶中取出(如細胞完全匯合，影響對支原體的觀察)。
(4)漂洗將細胞蓋片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷風(fēng)吹干。
(5)固定用固定液浸泡蓋玻片，固定細胞10min后，重復(fù)步驟(4)。
(6)染色將配制好Hoechst 33258染液滴加到固定好的細胞上，室溫下染色30min。
(7)漂洗用PBS浸洗染色后的蓋玻片3次，每次3～5min，冷風(fēng)吹干。
(8)制片將一滴含1％甘油的PBS加到染色后的細胞表面，將有細胞的蓋玻片面朝下覆蓋在載玻片上。
(9)觀察以100×至400×熒光顯微鏡觀察，打開光源10min后，以330～380nm紫色熒光激發(fā)，觀察細胞核外是否有藍色熒光小點或絲狀點的熒光物產(chǎn)生。
結(jié)論Hoechst 33258熒光染料能透過細胞胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA中，使之發(fā)出明亮的藍色熒光。支原體內(nèi)也含有DNA，亦能著色，在熒光顯微電鏡下觀察可看到藍色熒光。因此，在陽性對照中，除細胞核部位有藍色熒光外，在細胞表面及周圍也能看到藍色點狀或絲狀熒光。而且在細胞表面同時有支原體DNA熒光染色顆粒和絲狀小點，如圖5所示。檢測結(jié)果顯示如圖6所示，體外培養(yǎng)靜寧雞胚成纖維細胞制片后，在倒置熒光顯微鏡下，用380nm的紫色熒光激發(fā)，可以發(fā)現(xiàn)整個視野內(nèi)可見的細胞核表面均為光滑樣，細胞核呈圓狀或橢圓狀，細胞核中的DNA發(fā)出藍色熒光，且細胞周圍無絲狀或顆粒狀小點。
三、細胞生長曲線繪制方法(1)懸液制備取待測生長狀態(tài)良好的細胞，增至接近匯合時，用常規(guī)方法消化細胞制成細胞懸液，并計數(shù)。
(2)接種向培養(yǎng)板的24個孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細胞，一般為(1～2)×104個細胞/ml，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(3)計數(shù)檢測從接種時間算起，每隔24h計數(shù)3孔內(nèi)的細胞密度，用血球計數(shù)板計算細胞總數(shù)，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8組結(jié)束。
(4)繪圖以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標(biāo)、細胞密度為縱坐標(biāo)，將結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得培養(yǎng)細胞的生長曲線。
結(jié)論通過對所培養(yǎng)的靜寧雞體外培養(yǎng)細胞用常規(guī)方法制備細胞懸液，計數(shù)，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1ml細胞懸液，對接種于24孔培養(yǎng)板的細胞進行連續(xù)7天定時記數(shù)，記錄各次細胞密度，繪制而成培養(yǎng)細胞生長曲線如圖7所示，接種后從第2天細胞數(shù)開始增加，第3天進入對數(shù)生長期，第6天細胞生長緩慢，細胞生長期總體趨勢均呈S型，細胞接種后均有24h的潛伏期，此期為細胞的適應(yīng)階段，是細胞由于接種時胰酶消化而致的損傷后的修復(fù)時期，此后細胞呈指數(shù)增殖，即指數(shù)生長期，最后進入停滯期，細胞生長緩慢，幾乎停止，可見有細胞漂浮。而細胞分裂指數(shù)(MI)最高值(培養(yǎng)第2天)在進入對數(shù)生長期前出現(xiàn)，并在培養(yǎng)第2～4天時維持于一個較高的水平，隨后下降到初始水平。本發(fā)明方法培養(yǎng)的靜寧雞胚成纖維細胞系的純度為99％以上，與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)細胞平均純度85％～90％比具有顯著提高；且群體倍增時間為24h，與現(xiàn)有技術(shù)膠原酶消化技術(shù)和現(xiàn)有貼壁培養(yǎng)法獲得的細胞群體倍增時間(PDT)35.9h和48h相比具有顯著的提高，證明細胞純度高、生命力旺盛。
四、細胞活率測定方法檢測凍存細胞的存活率可采用臺盼藍拒染試驗，將待檢細胞復(fù)蘇后制成細胞懸液，取10μl細胞懸液加人10μl 1％臺盼藍染液，混勻。血球計數(shù)板計數(shù)，健康活細胞胞體完整，細胞透明，不著色，凡著色呈藍色者均為死細胞。計數(shù)1000個細胞，計算細胞存活率。數(shù)二種細胞總數(shù)，以活細胞占細胞總數(shù)的百分比反映細胞活力。
結(jié)論細胞凍存前后對靜寧雞胚細胞進行細胞活率測定。結(jié)果表明凍存前細胞活率在95.8％～98.7％之間，凍存后細胞活率降到93.2％～96.7％之間，與現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)細胞活率80％～85％左右相比有顯著的提高。且復(fù)蘇的細胞與凍存前相比，細胞類型仍為成纖維細胞，細胞形態(tài)和生長速度沒有發(fā)生變化，凍存細胞質(zhì)量穩(wěn)定。
五、核型的制備方法1、加秋水仙素取對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，加秋水仙素到培養(yǎng)液內(nèi)，終濃度為0.1～0.4μg/ml。
2、在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，使大部分細胞處于分裂中期。
3、采集分裂相細胞加0.25％胰蛋白酶溶液用常規(guī)方法消化，然后加全培養(yǎng)液，終止胰蛋白酶溶液對細胞的作用。轉(zhuǎn)入15ml離心管，以1000rpm離心8min，收集細胞。
4、低滲吸除上清液，加入預(yù)熱至37℃、0.075M(或0.4％)KCl溶液2ml，打勻，繼續(xù)加至10ml，37℃溫箱中溫育15min。
5、預(yù)固定懸液中加入新鮮固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，打勻(打勻時要輕輕吹打防止細胞破裂)。
6、固定將懸液以1000rpm離心8min，去掉上清夜，加入新鮮固定液5ml，打勻，室溫靜置20min。
7、重固定重復(fù)2次，離心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混勻。
8、滴片將載玻片成45°傾斜，甩掉冰水后用吸管迅速滴上2～3滴細胞懸液，立即用嘴在片子上吹氣使細胞分散均勻，將載玻片掠過酒精燈幾次，以助染色體分散和展開，室溫下干燥。
9、染色用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)稀釋10倍的Giemsa液染色10min，自來水沖洗，空氣干燥。
10、鏡檢先用低倍物鏡找出分散好的分裂相視野，再換高倍物鏡和油鏡觀察，應(yīng)看到很多中期分裂相細胞和鋪展的染色體，細胞質(zhì)被染成藍色，細胞核被染成淡紫色。
11、染色體照片及數(shù)據(jù)處理選擇染色體形態(tài)及分散良好的分裂相進行顯微照相，每個品種統(tǒng)計100個分裂相以確定染色體數(shù)目，按Denver(1960)會議和Leven標(biāo)準(zhǔn)(1964)測量并計算染色體的三個參數(shù)即相對長度、臂比值和著絲點指數(shù)，并確定染色體著絲點類型。三個參數(shù)的計算公式如下 12、如標(biāo)本需要保存或作長時間觀察，可過二甲苯兩次后，用中性樹膠蓋玻片封片，(或先迅速過丙酮兩次，每次30s，再過二甲苯，然后封片亦可)。
結(jié)論細胞系質(zhì)量的國際標(biāo)準(zhǔn)是二倍體細胞的出現(xiàn)率達到85％以上，在本試驗中，對100個靜寧雞胚成纖維細胞的染色體數(shù)目計數(shù)，只對其是否為整二倍體進行計算，分別以第1～3代的細胞為研究對象。統(tǒng)計結(jié)果為細胞染色體中二倍體占主體，為95％以上，說明所建靜寧雞胚成纖維細胞系達到優(yōu)質(zhì)細胞的標(biāo)準(zhǔn)，細胞遺傳性能穩(wěn)定，該細胞系為穩(wěn)定二倍體細胞系。
具體數(shù)據(jù)見表2，M代表中部著絲點染色體，SM代表亞中部著絲點染色體，ST代表亞端部著絲點染色體，T代表端部著絲點染色體。
靜寧雞二倍體染色體數(shù)目為2n＝78±，包括9對大染色體和30對微小染色體，性染色體為Z、W，雄性為同配ZZ，雌性為異配ZW。如圖8所示，根據(jù)染色體大小順序每對特征如下
1號亞中央著絲粒染色體，為最大的一對；2號亞中央著絲粒染色體，在大小上僅次于第一號；3號亞中央著絲粒染色體；4號端著絲粒染色體，大小同第三號染色體差不多；5號中央著絲粒Z染色體，另一條為亞中央著絲粒W染色體；6號亞中著絲粒染色體；7號亞中著絲粒染色體；8號端著絲粒染色體；9號端著絲粒染色體；10～39號近端或端著絲粒染色體；表2 靜寧雞染色體參數(shù)(♀)

六、同工酶分離方法采用不連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳法。
1、收集細胞用PBS重新懸浮，記數(shù)；2、清洗用PBS洗細胞3次，離心棄去上清夜；3、用蛋白提取液重新懸浮細胞，密度達5×107個/ml，輕輕吹打均勻；4、將細胞懸液移到1.5ml離心管中，4℃下以8.733g離心2min收取上懸液，分裝后將上懸液置-70℃貯存?zhèn)溆茫?、上懸液加入等量40％蔗糖溶液，混勻即為樣品液；
6、用微量加液器向每個樣品槽加樣20～50μl，再用稀釋10倍的電極緩沖液把每個樣品槽補充滿，然后向上下槽緩緩加入電極緩沖液。在上槽中加入1～2滴溴酚藍，放入4℃冰箱；7、接通電源，上槽為負極，下槽為正極，調(diào)節(jié)電壓為120V維持1h，再調(diào)至220V，待溴酚藍遷移至下端0.5～1cm處停止電泳，約5h；8、電泳完畢，分別收集上下槽緩沖液用10ml注射器吸滿水，裝上10cm長的細穿刺針頭，沿玻璃內(nèi)側(cè)插入，邊注水邊前進，借助水的潤滑作用和針頭的刮切作用，使膠與玻璃板分離，然后輕輕拿起上層玻璃板，切去濃縮膠，再用蒸餾水漂洗兩次后，浸入染色液中置37℃溫箱中保溫染色30～60min，膠條染色后用凝膠固定液固定后照相；9、用相對遷移率(Rf)表示，即區(qū)帶泳動距離(d)與指示染料泳動距離(D)之比，計算公式為Rf＝d/D×100％。區(qū)帶泳動距離一律按區(qū)帶后緣的距離測量。
結(jié)論如圖9所示，靜寧雞胚成纖維細胞的乳酸脫氫同工酶酶譜從“陽極”到“陰極”分別為LDH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5，酶活性強弱依次為LDH5＞LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH1，而且LDH1活性很弱。與白耳雞的乳酸脫氫同工酶進行對比，結(jié)果顯示兩個雞種的各自具有特征譜系，且相對遷移率完全不同，見表3。
表3 LDH同工酶的相對遷移率

如圖10所示，靜寧雞的蘋果酸脫氫酶譜各呈現(xiàn)2條區(qū)帶，即sMDH(細胞質(zhì)型)區(qū)帶組和mMDH(線粒體型)區(qū)帶組，且后者比前者泳動速度慢。兩個帶組的相對遷移率見表4。
表4 蘋果酸脫氫酶的相對遷移率

同一種酶在不同的物種中、同一物種不同組織中表現(xiàn)不同的譜帶。上述兩種同工酶電泳結(jié)果表明所培養(yǎng)的體細胞遺傳性能穩(wěn)定，純度高，細胞之間未發(fā)生交叉污染。
七、外源基因在培養(yǎng)細胞中的表達方法1、熒光蛋白報告質(zhì)粒(pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1)的制備及鑒定按照Plasmid Midi Kit質(zhì)粒提取盒說明書，提取、純化pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1熒光蛋白基因質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒溶于TE(PH8.0)低鹽溶解液中，用紫外分光光度計測定其質(zhì)粒濃度(質(zhì)粒濃度[μg/ml]＝0D260×50μg/ml×稀釋倍數(shù))，得到的pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒濃度為0.31μg/ml質(zhì)粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之間，實驗結(jié)果表明所提取質(zhì)粒較純，無RNA、無水乙醇和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。再用Nhe I和Xba I雙酶切后，用1％瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果，可以得到約750bp和4kb兩條譜帶。根據(jù)熒光蛋白質(zhì)粒酶切圖譜分析所獲質(zhì)粒確為所需pEGFP-N3、pDsRed1-N1、pEYFP-N1熒光蛋白質(zhì)粒。
2、脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染成纖維細胞(1)、于轉(zhuǎn)染前一天，用胰蛋白酶溶液消化細胞培養(yǎng)物，將細胞接種到6孔(或35mm)的培養(yǎng)板內(nèi)，每孔(1～2)×105細胞，加2ml含血清培養(yǎng)液；(2)、置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞達到70％～80％的匯合程度；(3)、轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察，挑取生長旺盛、形態(tài)好的細胞用于轉(zhuǎn)染；(4)、將待轉(zhuǎn)染的細胞不含血清的培養(yǎng)液漂洗細胞兩次；(5)、合并溶液A和B，輕輕混合后于室溫下靜置45min，然后加入0.8ml不含血清的培養(yǎng)液；(6)、將DNA、脂質(zhì)體和不含血清的培養(yǎng)液的混合物滴加在培養(yǎng)版中待轉(zhuǎn)染的細胞表面，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～24h；(7)、倒掉轉(zhuǎn)染夜，加入含血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細胞；(8)、在相應(yīng)顏色熒光激發(fā)下觀察三種熒光蛋白的表達結(jié)果，計算轉(zhuǎn)染效率。
結(jié)論如圖11、12所示，靜寧雞胚成纖維細胞的轉(zhuǎn)染峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染24h后，綠色熒光蛋白的熒光強度達在轉(zhuǎn)然后48h最強，轉(zhuǎn)染率為55.5％；紅色熒光蛋白pDsRed1-N1在轉(zhuǎn)染后48h轉(zhuǎn)染率達到60.2％，如圖13所示；黃色熒光蛋白pEYFP-N1在轉(zhuǎn)染后48h轉(zhuǎn)染率也分別達到了60.2％，如圖14所示；轉(zhuǎn)染48h后陽性細胞和熒光強度均逐漸減少、減弱。
將外源基因轉(zhuǎn)入細胞的方法很多，主要有脂質(zhì)體包裹、多聚賴氨酸介導(dǎo)、受體介高壓電擊、基因槍及顯微注射等。脂質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染是目前最為有效的轉(zhuǎn)染方法，脂質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染所用的DNA量與磷酸鈣法相比大為減少，而轉(zhuǎn)染效率卻比磷酸鈣法高出5～100倍。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA對靜寧雞的成纖維細胞進行抽樣轉(zhuǎn)染，通過觀測熒光蛋白基因的表達效果來反向證實所培養(yǎng)細胞的遺傳性能，結(jié)果顯示綠色熒光蛋白pEGFP-N3的轉(zhuǎn)染率為55.5％；黃色熒光蛋白pEYFP-N1的轉(zhuǎn)染率也分別達到了60.2％，如圖14所示；紅色熒光蛋白pDsRed1-N1的轉(zhuǎn)染率達到60.2％，遠遠高于普通培養(yǎng)細胞的15％～30％的轉(zhuǎn)染率。這些結(jié)果說明了所培養(yǎng)的靜寧雞成纖維細胞能夠很好地表達外源基因，進一步證明了所培養(yǎng)細胞系的高表達率的特性。
八、細胞凋亡方法1、將細胞以4.0×105個/ml密度接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁。
2、DAPI染色倒掉細胞的培養(yǎng)基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液沖洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆蓋細胞，37℃溫育15min，再倒掉染色液，用甲醇沖洗一次。
3.激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。
結(jié)論細胞凋亡是完成新舊細胞的生死交替的自然過程，若其規(guī)律失常則個體即不能正常發(fā)育，或發(fā)生畸形，或不能存活。
細胞凋亡時，核染色質(zhì)濃縮成塊并凝聚在核膜周圍，胞膜內(nèi)陷將細胞自行分割為多個有外膜包裹、內(nèi)涵物不外溢的凋亡小體。其原因是由于真核細胞染色質(zhì)是由許多核小體以一定的方式包裝而成，核小體是由核心顆粒和連接區(qū)兩部分組成，前者是由組蛋白八聚體與140bp的DNA片段組成，后者是合成RNA引物的起始點，由組蛋白H1與60bp左右的DNA片段組成，H1磷酸化與細胞分裂關(guān)系密切，易受核酸內(nèi)切酶攻擊。每個核小體DNA全長為150～241bp。細胞凋亡時，激活了核酸內(nèi)切酶，切割連接區(qū)DNA，從而產(chǎn)生長度為180～200bp左右的寡核苷酸碎片，形成凋亡小體。
因此常用DNA的特異性熒光染料DAPI，以非嵌入式與DNA的A-T堿基區(qū)結(jié)合，從而對細胞核染色。染色后，激光掃描共聚焦顯微鏡下活細胞核呈彌散均勻的藍色熒光，出現(xiàn)細胞凋亡時，細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的藍色顆粒塊狀熒光，圖20為靜寧雞復(fù)蘇時凋亡細胞。
共聚焦顯微鏡下，觀察統(tǒng)計100～200個細胞，計算凋亡率凋亡率＝凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％計算得出所培養(yǎng)的靜寧雞胚成纖維細胞系凋亡率低于5％。
實施例3利用靜寧雞配成纖維細胞進行細胞融合實驗1、細胞染色(1)靜寧雞伊紅染色95％(體積比)乙醇5s，伊紅染色液染色30s～120s(可以根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整時間)。70％(體積比)乙醇洗滌2次后即可直接觀察。
(2)天祝白牦牛DAPI染色倒掉細胞的培養(yǎng)基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液沖洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆蓋細胞，37℃溫育15min，再倒掉染色液，用甲醇沖洗一次。
2、混合細胞取4ml復(fù)蘇后培養(yǎng)的106～107個/ml細胞懸液注入10ml具塞尖底離心管中，取出0.4ml的懸液，用生理鹽水稀釋5倍，作為對照組。
3、細胞融合(1)將上述剩余的細胞懸液以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，去掉大部分上清液，留下0.2ml液體將沉降的細胞分散于其中，制成細胞懸液；(2)輕輕搖動試管，并逐滴加入37℃下預(yù)熱的50％(質(zhì)量體積比)PEG溶液0.4ml；(3)將此懸液置于37℃水浴中，溫育90s；(4)緩慢地加入無血清培養(yǎng)液5ml，以中止PEG的作用；(5)蓋塞，并慢慢的傾轉(zhuǎn)離心管4～5次；(6)以1500r/min離心5min。去除大部分上清液，留下約0.1ml液體懸浮細胞；(7)在懸浮液中加入5ml的全培養(yǎng)液，混勻后，取出0.4ml懸液滴片作觀察用。
4、細胞培養(yǎng)將細胞作4倍稀釋，混勻，以每孔0.5ml分裝于24孔培養(yǎng)板或每孔0.1ml分裝于96孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5、用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察從形態(tài)上識別兩種親本細胞并觀察其中有無融合細胞，同時通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察同一細胞核質(zhì)顏色不同的即為融合細胞，如圖15。
6、細胞融合率觀察統(tǒng)計100～200個細胞(包括已融合的與未融合的)，計算融合率融合率＝融合細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％
結(jié)論PEG融合法雖沒有品種種屬科間的特異性或?qū)Ｒ恍?，動植物間的限制也被打破，但其融合率低。最佳條件下，不同科屬原生質(zhì)體間的融合率僅為30％，此外PEG法對細胞毒性大。因此，PEG誘導(dǎo)細胞融合通常選相對分子質(zhì)量在1000～6000，濃度在體積比30％～50％(質(zhì)量體積比)的PEG，并且嚴格控制促融作用時間，減少對細胞的毒性。
天祝白牦牛細胞核和靜寧雞細胞質(zhì)分別用DAPI和伊紅染色后，再用相對分子質(zhì)量為4000、濃度為50％(質(zhì)量體積比)的PEG促融90s，從而使核與質(zhì)分別染成藍、紅色的細胞融合。異源細胞或原生質(zhì)體在促融劑作用下，呈致密狀態(tài)細胞的細胞膜性質(zhì)發(fā)生變化，細胞間發(fā)生凝集現(xiàn)象，一部分凝集細胞間的膜發(fā)生粘連，融合成多核細胞，隨后多核細胞又進行核的融合而成為單核雜種細胞。
圖15為543nm波長激發(fā)光下被伊紅染色的呈現(xiàn)紅色的靜寧雞細胞質(zhì)，圖16為408nm波長激發(fā)光激發(fā)下被熒光染料DAPI染色的呈藍色的天祝白牦牛細胞核。由于一種細胞核染為藍色，另一種細胞質(zhì)染為紅色，所以同一細胞中含有藍色核和紅色質(zhì)的即為融合的細胞，如圖17所示的同一視野下細胞在兩種激發(fā)光作用下的合成圖，圖18為天祝白牦牛和靜寧雞融合細胞某一位點放大圖，圖19為靜寧雞細胞自身融合(400×)。
通過計算得出天祝白牦牛和靜寧雞的細胞融合率為97.2％，靜寧雞自身細胞融合率為92.4％。融合率較高，這是因為與融合前對細胞進行的染色處理、醇類脫脂脫水的固定，從而改變了細胞膜結(jié)構(gòu)，提高了融合率；同時也能看出，同種間和不同種間的細胞融合率基本相同。
以上結(jié)果說明了所培養(yǎng)的靜寧雞胚成纖維細胞系可以用于細胞融合等更廣范圍的細胞學(xué)實驗，為其他生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供高質(zhì)量的細胞系。
權(quán)利要求
1.一種靜寧雞胚成纖維細胞系，其特征在于，其保藏編號為CGMCC No.1878。
2.一種靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)初代培養(yǎng)將除去腦、眼、四肢、內(nèi)臟的靜寧雞胚胎用PBS漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養(yǎng)瓶，倒置培養(yǎng)瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4h；組織塊完全貼壁后加入培養(yǎng)基6～10ml，培養(yǎng)基成分MEM+10％胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)10～12h；(2)傳代培養(yǎng)棄除步驟(1)培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶內(nèi)殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入全培養(yǎng)液(10％FBS的MEM)6～10ml終止消化；消化后的細胞平均分裝入2個培養(yǎng)瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至凍存前24h；(3)細胞凍存A、凍存前24h棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液并更換新鮮培養(yǎng)液6～10ml，培養(yǎng)液成分MEM+10％胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24h；B、用胰蛋白酶消化培養(yǎng)細胞，然后加入全培養(yǎng)液6～10ml終止反應(yīng)；C、用紅細胞計數(shù)板計算凍存前細胞總數(shù)；D、收集1000rpm離心6～10min，去上清液，加入4℃預(yù)冷的凍存液1ml，混勻后用吸管吹打使細胞重懸；凍存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％MEM；E、將培養(yǎng)物分裝入滅菌的凍存管中封口；F、預(yù)凍將凍存管裝入降溫盒中，放于4℃ 20～30min，然后置于-70℃預(yù)凍4h以上；G、凍存提出凍存管放入液氮柜中，即完成細胞凍存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的靜寧雞胚胎為6日齡。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(2)及步驟(3)中所述的胰酶消化具體步驟是向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入0.25％胰蛋白酶1.5～2.5ml，倒置培養(yǎng)瓶于溫箱中預(yù)熱至37℃后翻轉(zhuǎn)消化30s～60s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種靜寧雞胚成纖維細胞系的培養(yǎng)方法，其特征在于，將步驟(3)凍存的細胞進行細胞復(fù)蘇，具體步驟為將凍存管從液氮中取出置入42℃水浴中，連續(xù)晃動1分種后，將細胞移入加有培養(yǎng)液(MEM+10％胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中吹打均勻，放置含37.5℃5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～12h后即可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系，其保藏編號為CGMCC No.1878屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明培養(yǎng)出的成纖維細胞無上皮細胞等，細胞純度高；凍存細胞質(zhì)量穩(wěn)定，且細胞凍存后的細胞活率可達到并維持在93.2％～96.7％之間，傳代生長穩(wěn)定，適合大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明涉及的靜寧雞胚成纖維細胞系可以為醫(yī)學(xué)、細胞和分子生物學(xué)等生命科學(xué)研究提供大量高品質(zhì)材料；并可以作為禽體細胞克隆育種的供體細胞；在農(nóng)業(yè)上可以改良地方禽品種及可以作為地方優(yōu)良禽品種保種的手段；還可以作為是疫苗生產(chǎn)的主要原材料及肝細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層；同時可用于細胞凋亡及細胞融合研究之用。
文檔編號C12N5/06GK1995333SQ20061016498
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者關(guān)偉軍, 馬月輝, 劉長青, 包阿東, 王有柱, 劉學(xué)東 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所