專利名稱：穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的領(lǐng)域是在生物樣品中測(cè)量酶活性。更具體地說，本發(fā)明涉及用于使膽堿酯酶底物溶液穩(wěn)定化的極性有機(jī)溶劑的用途，以及用于在樣品中確定膽堿酯酶活性的所述溶液的用途。此外，提供了用于確定膽堿酯酶活性的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
膽堿酯酶是酶活性的通用名稱，其催化酰酯水解為醇和羧酸根。膽堿酯酶作用于多種具有醇部分(如苯酚(phenyl-alcohol)、吲哚醇(indoxyl-alcohol)并且優(yōu)選膽堿)和羧酸根部分的底物(如碳酸、重碳酸(dicarbonic acid)、苯甲酸)(Brown等，Adv.Clin.Chem.，221-123(1981))。基于其對(duì)羧酸根部分的專一性，膽堿酯酶被細(xì)分為兩類?！罢婺憠A酯酶”或乙酰膽堿酯酶(乙酰膽堿乙酰基水解酶，EC 3.1.1.7)顯示了對(duì)乙?；糠?moiety)的顯著選擇性，而“偽膽堿酯酶”或?；憠A酯酶(?；憠A酰基水解酶，EC 3.1.1.8)優(yōu)選水解具有更大羧酸根部分(如丁酰基或苯甲?；?的底物。
乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)系統(tǒng)中和在神經(jīng)與肌肉之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著很重要的作用。其還存在于紅血球中。該酶由于神經(jīng)毒氣如沙林的作用以及殺蟲劑中毒而不可逆地失去活性。
?；憠A酯酶的生物學(xué)功能是未知的。酰基膽堿酯酶可存在于胰腺、心臟、腸粘膜、血清、腦白質(zhì)和肝臟中。
膽堿酯酶和其活性的確定尤其在臨床上引起了關(guān)注。由于其明顯源于肝臟，這種關(guān)注主要在于?；憠A酯酶。其作為肝功能指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，該酶還用作疑似殺蟲劑中毒的臨床指標(biāo)。通過手術(shù)前篩選?；憠A酯酶，可以識(shí)別出具有非典型形式的酶的病人，旨在預(yù)防長時(shí)間的呼吸暫停(其由于肌肉遲緩(muscle relaxans)的遲發(fā)型退化所造成)。?；憠A酯酶的水平下降可能發(fā)現(xiàn)與有機(jī)磷化合物引起的中毒、肝炎、肝硬化、心機(jī)梗塞、急性感染和酶的非典型表型有關(guān)。
用于在生物樣品中檢測(cè)膽堿酯酶活性的方法在現(xiàn)有技術(shù)(Burtis和Ashwood(編輯)，Tietz fundamentals of clinical chemistry，第四版，ISBN0-7216-3763-9)中進(jìn)行了描述。共同的試驗(yàn)原則是基于使用硫代膽堿酯如乙?；虼憠A、丙?；虼憠A、丁?；虼憠A和琥珀酰基二硫代膽堿。在這些當(dāng)中，只有乙酰基和丙?；虼憠A可用于確定乙酰膽堿酯酶。雖然血清?；憠A酯酶對(duì)于所有這些底物具有活性，但優(yōu)選使用琥珀?；虼憠A并且尤其是丁酰基硫代膽堿來確定血清?；憠A酯酶。因?yàn)榱蝓ユI的水解，使得所有這些硫酯在水溶液中是不穩(wěn)定的。被冷藏的試劑溶液的低穩(wěn)定性已經(jīng)被數(shù)位作者證實(shí)，例如乙酰基硫代膽堿，7天(Whittaker M.Cholinesterases.InBergmeyer HU，ed；Methods of Enzymatic Analyses，第三版，WeinheimVerlag Chemie，198452-74)；丙?；虼憠A，1天(Dietz等Colorimetric Determination of Serum Cholinesterase and Its GeneticVariance by the Propionylthiocholine-Dithiobis(nitrobenzoic Acid)Procedure.Clinical Chemistry 1973；191309-1313)；丁酰基硫代膽堿，30天(Schmidt E.等Proposal of Standard Methods for theDetermination of Enzyme Catalytic Concentrations in Serum andPlasma at 37℃。Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1992；30163-170)。雖然酰基膽堿酯酶的上述底物中的一些還被乙酰膽堿酯酶、芳基酯酶(芳基酯水解酶，EC 3.1.1.2)、甚至白蛋白分解，但是丁?；虼憠A(BTC；Knedel and B_ttger，Klin Wschr 45325-327(1967))不受這些缺陷的影響。因而BTC通常被認(rèn)為是最特異底物之一并且被選作國家推薦的膽堿酯酶分析法(Association of Clinical Biochemists，News Sheet Assoc.Clin.Biochemists，Suppl.20231s-36s(1980)；Cholinesterase，InKommentare zum Arzneibuch der Deutschen Demokratischen Republik，Heft 2Enzym-Aktivit_tsbestimmung in der Laboratoriumsdiagnostik，Akademie-Verlag，Berlin，56-65(1988))。取決于酰基膽堿酯酶活性，BTC被水解為硫代膽堿和丁酸根。硫代膽堿與5，5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸酯(DTNB)反應(yīng)，形成黃色染料5-巰基-2-硝基苯甲酸酯。
硫代膽堿+ 5-巰基-2-硝基苯甲酸鹽DTNB ————→ +2-硝基苯甲酸-巰基硫代膽堿5-巰基-2-硝基苯甲酸酯的形成速率與?；憠A酯酶的催化活性成正比，這根據(jù)在波長480nm下的消光增加而確定。由于底物的專一性，用血清進(jìn)行的試驗(yàn)未受乙酰膽堿酯酶的干擾，乙酰膽堿酯酶是由于邊際溶血(marginal hemolysis)而從紅血球中釋放的。
在另一個(gè)?；憠A酯酶分析中，對(duì)試驗(yàn)原則(Knedel和B_ttger，Klin.Wschr.45325-327(1967))進(jìn)行了改進(jìn)，作為反應(yīng)(由?；憠A酯酶驅(qū)動(dòng))產(chǎn)物的硫代膽堿將黃色的六氰基高鐵酸鹽(III)迅速還原成幾乎無色的六氰基高鐵酸鹽(II)，因此可以直接進(jìn)行反應(yīng)的光譜測(cè)定監(jiān)控。
對(duì)于測(cè)量人血清中的酰基膽堿酯酶的催化活性的最優(yōu)化反應(yīng)條件已經(jīng)被研究并確定[Schmidt等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30(3)163-170(1992)]。這些條件考慮了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和人工與機(jī)械性能的技術(shù)方面。雖然它們不必提供最大可能的轉(zhuǎn)化率，但要保證該方法最大程度的耐用性(robustness)。
然而，一個(gè)重要的然而未解決的問題是BTC的低穩(wěn)定性，因?yàn)樽鳛榱蝓セ衔锏亩□；虼憠A易于自動(dòng)水解。因此，在分析條件下，總要從BTC的轉(zhuǎn)化數(shù)(turnover)中除去BTC的自發(fā)解離以得到真實(shí)的?；憠A酯酶活性。眾所周知，通過最優(yōu)化底物濃度和緩沖條件，可以將該試劑空白反應(yīng)最小化至一定程度。因?yàn)殡S著存儲(chǔ)時(shí)間的增加，溶液中BTC的穩(wěn)定性顯著地降低，由此，重要的前提是提供新鮮制備的BTC溶液。目前，這僅可以通過重構(gòu)(reconstitution)BTC顆粒來實(shí)現(xiàn)，該方法復(fù)雜且耗時(shí)。
在現(xiàn)有技術(shù)中不能獲得這樣的試劑，其使得不存在任何酶的情況下，在沒有增加自動(dòng)水解活性的條件下，在更長的時(shí)間內(nèi)存儲(chǔ)被溶解的膽堿酯酶底物如BTC。由于需要提供新鮮溶解的底物以在膽堿酯酶試驗(yàn)中最小化試劑空白反應(yīng)，在平行的更大套數(shù)樣品中檢測(cè)膽堿酯酶活性將是復(fù)雜和低效的。在眾多樣品中簡單和有效的檢測(cè)膽堿酯酶活性，例如通過在自動(dòng)分析器中進(jìn)行高處理量的方法，在此時(shí)是不可能的。
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種穩(wěn)定化的膽堿酯酶底物溶液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
本發(fā)明還涉及穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的用途，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明還涉及極性有機(jī)溶劑用于使膽堿酯酶底物溶液穩(wěn)定化的用途，其中在緩沖溶液中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。此外，本發(fā)明還包括用于確定樣品中膽堿酯酶活性的穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
此外，本發(fā)明涉及一種用于確定樣品中膽堿酯酶的活性的方法，所述方法包括以下步驟在適于酶活性的條件下將懷疑含有該酶的樣品和含穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的試劑組合，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定，和監(jiān)控該酶的活性。
本發(fā)明還包括用于確定樣品中膽堿酯酶的活性的試劑盒，其包括在封裝的組合中的第一試劑，其包括適于膽堿酯酶活性的緩沖溶液，和第二試劑，其包括穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。此外，本發(fā)明還涉及一種進(jìn)行確定樣品中膽堿酯酶的活性的方法的試劑盒，該方法包括以下步驟在適于酶活性的條件下將懷疑含有該酶的樣品和含穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的試劑組合，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定，和監(jiān)控該酶的活性。


圖1顯示了由用DMSO(25體積％)穩(wěn)定的新鮮制備的CHE底物溶液得到的和由同樣的穩(wěn)定化溶液(在35℃控溫18天)得到的膽堿酯酶(CHE)的催化濃度的比較。
圖2顯示了根據(jù)DGKC[Deutsche Gesellschaft für KlinischeChemie，見Schmidt等人，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30(3)163-170(1992)]的建議由新鮮制備的CHE底物溶液得到的和由同樣的溶液(35℃控溫21天)得到的膽堿酯酶(CHE)的催化濃度的比較。
具體實(shí)施例方式
令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少一種膽堿酯酶底物和至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)的組合得到了一種穩(wěn)定化的膽堿酯酶底物溶液。因此，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
術(shù)語“穩(wěn)定化”是指可以在不存在任何酶活性的情況下儲(chǔ)藏根據(jù)本發(fā)明的膽堿酯酶底物溶液，而沒有明顯的底物失活。
“沒有明顯的底物失活”是指例如在35℃在至少18天的時(shí)間內(nèi)存儲(chǔ)穩(wěn)定化溶液后或者在典型實(shí)驗(yàn)室條件(即在4-8℃冷藏)下存儲(chǔ)達(dá)至少15個(gè)月后，沒有BTC損失發(fā)生，結(jié)果在使用新鮮制備和培養(yǎng)的底物溶液獲得的CHE催化濃度的圖中，直線的截距為約小于+/-300U/l和斜率小于+/-3％。
術(shù)語“膽堿酯酶”包括酶活性，其催化酰酯水解為醇和羧酸根。在本發(fā)明中，包括任何膽堿酯酶，優(yōu)選EC 3.1.1.7定義的乙酰膽堿酯酶和EC 3.1.1.8定義的?；憠A酯酶。還應(yīng)理解的是“膽堿酯酶”是指覆蓋了膽堿酯酶以及其生物學(xué)活性的亞型、片段和亞基，其在生物學(xué)意義上如同膽堿酯酶那樣行為，即水解酰酯成為醇和羧酸根。
同至今已知的膽堿酯酶底物溶液(其必須在使用前由顆粒重構(gòu))相比，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。作為一種液體試劑，對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定化底物溶液，不再需要由顆粒重構(gòu)。這對(duì)于檢測(cè)膽堿酯酶活性的恒定準(zhǔn)確度來說是重要的前提。重構(gòu)，即將顆粒放入溶液中，通常耗時(shí)且易于出錯(cuò)。在每次重構(gòu)后，必須進(jìn)行附加的校準(zhǔn)分析以檢驗(yàn)由獨(dú)立重構(gòu)的底物溶液得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。相反，提供穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液使得試劑批次中所有瓶的組成是均一的，由此保證準(zhǔn)確度的提高和減少校準(zhǔn)分析的次數(shù)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液是穩(wěn)定化?；憠A酯酶底物溶液。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液是穩(wěn)定化乙酰膽堿酯酶底物溶液。
術(shù)語“膽堿酯酶底物”包括所有被膽堿酯酶水解的底物，其包括屬于酰酯類型的底物。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，至少一種穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的底物是膽堿酯。在另一種實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的至少一種底物是硫酯，優(yōu)選丁?；虼憠A(BTC)或者乙酰基硫代膽堿(ATC)。
術(shù)語“極性有機(jī)溶劑”是指由有機(jī)化合物組成的溶劑，所述有機(jī)化合物包含碳原子并且具有親水的性能，這是由于在該有機(jī)化合物中電荷分布不平均，使得各個(gè)分子的一端比另一端正電性更強(qiáng)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)是極性質(zhì)子有機(jī)溶劑。術(shù)語“極性質(zhì)子有機(jī)溶劑”是指這樣的有機(jī)溶劑，該有機(jī)溶劑中的有機(jī)化合物包含一個(gè)或多個(gè)酸性氫原子，與″極性無質(zhì)子有機(jī)溶劑″相反。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少一種極性質(zhì)子有機(jī)溶劑物質(zhì)是醇。
術(shù)語“醇”是指一無醇，即只具有一個(gè)羥基的醇，以及含一個(gè)以上羥基的多元醇。優(yōu)選地，所述至少一種極性質(zhì)子有機(jī)溶劑物質(zhì)是選自鏈長為1-7個(gè)碳原子的醇。在本發(fā)明中，鏈長為1-7個(gè)碳原子的醇包括具有分支碳鏈的醇如3-甲基己-3-醇以及具有直碳鏈的醇如乙醇。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的特征在于至少一種底物被選自甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇的醇穩(wěn)定。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液被甘油穩(wěn)定。
根據(jù)本發(fā)明，所述至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)還可以包括羧酸。術(shù)語“羧酸”是指有機(jī)酸，其特征為存在羧基?！棒人帷边€包括羧酸的鹽和陰離子，其也稱為“羧酸根(鹽)”(carboxylates)，以及每分子具有兩個(gè)或更多羧酸基團(tuán)的羧酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)是極性無質(zhì)子有機(jī)溶劑(polar aprotic organic solvent)，其優(yōu)選地選自羰基化合物或者雜羰基化合物。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述羰基化合物或者雜羰基化合物選自含1-12個(gè)碳原子的羰基化合物或者雜羰基化合物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液特征在于至少一種底物被羰基化合物或者雜羰基化合物穩(wěn)定，所述羰基化合物或者雜羰基化合物選自二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙酰丙酮、乙腈和六甲基磷酰三胺(HMPT)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種極性無質(zhì)子有機(jī)溶劑物質(zhì)是醚。術(shù)語“醚”是指這類化合物，其包含醚基團(tuán)，即連接到兩個(gè)取代烷基的氧原子。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液特征在于至少一種底物被選自含1-12個(gè)碳原子的醚的醚穩(wěn)定。在本發(fā)明中，包括任何含1-12個(gè)碳原子的醚，例如環(huán)醚、以及具有支化或線性碳鏈的醚。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液特征在于至少一種底物被環(huán)醚，優(yōu)選四氫呋喃(THF)或者二氧雜環(huán)己烷(dioxan)穩(wěn)定。
本發(fā)明還包括穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中在該反應(yīng)混合物中至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)的濃度至少為0.25vol％和最大100vol％。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液中的至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)的濃度是對(duì)DMSO至少0.25vol％和最大100vol％，優(yōu)選地至少0.25vol％和最大20vol％，對(duì)乙醇至少0.25vol％和最大100vol％，優(yōu)選地至少0.25vol％和最大20vol％，對(duì)異丙醇至少0.5vol％和最大95vol％，優(yōu)選地至少0.5vol％和最大20vol％，和/或?qū)HF至少0.5vol％和最大100vol％，優(yōu)選地至少0.5vol％和最大20vol％。
本發(fā)明的另一種方面是穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的用途，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明的其它方面是極性有機(jī)溶劑在使膽堿酯酶底物溶液穩(wěn)定中的用途，其中在緩沖溶液中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。此外，本發(fā)明還包括用于確定樣品中膽堿酯酶活性的穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
術(shù)語“樣品”是指任何懷疑含膽堿酯酶的樣品。樣品典型地是水溶液。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，樣品是生物樣品，如來自宿主的體液，例如，尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、腦脊液、淚液、粘液等，但是優(yōu)選地是血漿或者血清。如果期望的話，樣品可以進(jìn)行預(yù)先處理，并且可以在任何不妨礙分析的合適介質(zhì)中制備。水介質(zhì)是優(yōu)選的。
膽堿酯酶的活性可以通過定量、半定量和定性方法以及全部其它用于確定膽堿酯酶的方法來確定。例如，僅在疑似含膽堿酯酶的樣品中檢測(cè)膽堿酯酶的存在或不存在的方法被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語“檢測(cè)”、“監(jiān)控”和“測(cè)量”以及用于“確定”意思的其它常見同義詞預(yù)計(jì)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明確定膽堿酯酶活性可以通過速率分析法(其中測(cè)量每單位時(shí)間膽堿酯酶活性的產(chǎn)物的吸光率變化)或終點(diǎn)法(其中在一定時(shí)間以后，使反應(yīng)淬滅)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，確定膽堿酯酶活性還可以通過測(cè)量產(chǎn)物吸光率變化來進(jìn)行，所述產(chǎn)物是由實(shí)際酶促反應(yīng)的產(chǎn)物中的一種開始的二次反應(yīng)獲得的。本發(fā)明方法可容易地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室或者臨床分析所用的自動(dòng)分析儀。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，監(jiān)控膽堿酯酶活性是通過確定硫代膽堿的形成，優(yōu)選地通過分光光度測(cè)定法來測(cè)量六氰基高鐵酸鹽(III)還原為六氰基高鐵酸鹽(II)而進(jìn)行的。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，硫代膽堿的膽堿酯酶依賴性形成是通過分光光度測(cè)定法測(cè)量作為硫代膽堿與5，5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸酯的反應(yīng)產(chǎn)物的5-巰基-2-硝基苯甲酸酯的形成而確定的。根據(jù)本發(fā)明，監(jiān)控膽堿酯酶的活性可以通過使用自動(dòng)分析儀來進(jìn)行。
此外，本發(fā)明還涉及一種確定樣品中膽堿酯酶的活性的方法，該方法包括以下步驟在適于酶活性的條件下將疑似含有該酶的樣品和含穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的試劑組合，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定，和監(jiān)控該酶的活性。
為了強(qiáng)化本發(fā)明的通用性，用于本發(fā)明方法的試劑可以在封裝的組合中、在相同或單獨(dú)的容器中、以液體或凍干形式提供，以便各試劑的比值提供了方法和分析的顯著優(yōu)化。試劑可以各自位于單獨(dú)容器中，或者各種試劑可以在一個(gè)或多個(gè)容器中組合，這取決于各試劑的交叉反應(yīng)性和穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于方便地進(jìn)行用于確定膽堿酯酶活性的本發(fā)明分析方法的試劑盒。
本發(fā)明包括用于確定樣品中膽堿酯酶的活性的試劑盒，在封裝的組合中包括第一試劑，其包括適于膽堿酯酶活性的緩沖溶液，和第二試劑，其包括穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。此外，本發(fā)明還涉及一種進(jìn)行確定樣品中膽堿酯酶的活性的方法的試劑盒，該方法包括以下步驟在適于酶活性的條件下將疑似含有該酶的樣品和含穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的試劑組合，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定，和監(jiān)控該酶的活性。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，用于進(jìn)行確定樣品中膽堿酯酶的活性的所述方法的所述試劑盒在封裝的組合中包括第一試劑，其包括適于膽堿酯酶活性的緩沖溶液，和第二試劑，其包括穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
試劑可以保持液態(tài)或者凍干狀態(tài)。試劑盒還可以包括其它的封裝的校準(zhǔn)材料，如含已知量膽堿酯酶的校準(zhǔn)試劑。校準(zhǔn)材料是指任何含有已知量的待測(cè)分析物的標(biāo)準(zhǔn)或者參比材料。在相似條件下，分析疑似含分析物的樣品和校準(zhǔn)材料。然后通過比較由未知樣品獲得的結(jié)果和由標(biāo)準(zhǔn)獲得的結(jié)果來計(jì)算分析物濃度。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包括為膽堿酯酶活性所優(yōu)化的緩沖溶液和由至少0.25vol％和最大100vol％的DMSO、至少0.25vol％和最大100vol％的乙醇、至少0.5vol％和最大95vol％的異丙醇和/或至少0.5vol％和最大100vol％的THF穩(wěn)定的膽堿酯酶底物溶液。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括為膽堿酯酶活性所優(yōu)化的緩沖溶液和由至少0.25vol％和最大20vol％的DMSO、至少0.25vol％和最大20vol％的乙醇、至少0.5vol％和最大20vol％的異丙醇和/或至少0.5vol％和最大20vol％的THF穩(wěn)定的膽堿酯酶底物溶液。
根據(jù)本發(fā)明，各種輔助材料將常用于底物溶液或者分析中。例如，緩沖液將通常存在于分析介質(zhì)中，以及用于分析介質(zhì)的穩(wěn)定劑和分析組分。通常，除這些添加劑以外，可以包括附加的蛋白質(zhì)如白蛋白，或者表面活性劑，特別是非離子表面活性劑等。
現(xiàn)通過以下實(shí)施例或附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明，其當(dāng)然不起限制作用。
實(shí)施例實(shí)施例1確定膽堿酯酶活性根據(jù)以下反應(yīng)流程基于硫代膽堿的形成和檢測(cè)而確定膽堿酯酶(CHE)活性
2硫代膽堿 二硫代雙(膽堿)+2OH-+[Fe(CN)6]3-——→+H2O+2[Fe(CN)6]4-取決于膽堿酯酶活性，從丁?；虼憠A特異地釋放硫代膽堿。硫代膽堿迅速地將黃色的六氰基高鐵酸鹽III還原為幾乎無色的六氰基高鐵酸鹽II。消光降低可以在波長405納米和溫度37℃下以分光光度法測(cè)量。由六氰基高鐵酸鉀III的摩爾吸收系數(shù)(92.7+/-0.4m2/mol)計(jì)算膽堿酯酶濃度。
特別地，按如下過程來確定膽堿酯酶活性兩個(gè)試劑溶液，R1和R2，新鮮制備R191.5mM焦磷酸鹽2.44mM六氰基高鐵酸鉀用檸檬酸將pH調(diào)節(jié)至7.7R210mM HEPPS45.7mM碘化丁?；虼憠A用磷酸將pH調(diào)節(jié)至4.0極性有機(jī)溶劑，例如10％(體積)DMSO血清、肝素或者EDTA血漿作為樣品材料或者0.9％(w/v)NaCl，R1和R2，根據(jù)以下方案移液至小管中，所得最終濃度為75.2mM焦磷酸鹽、2.0mM六氰基高鐵酸鹽(III)、7.5mM丁?；虼憠A和1.6mMHEPPS。
表1試劑空白和樣品的移液方案

所述全部試劑和溶液用作37℃控溫(tempered)的工作液。因此，再次控制小管中混合物的溫度以保證移液后溫度為37±0.05℃。
然后，添加180μl R2并且通過徹底混合樣品來開始反應(yīng)。
根據(jù)以下條件，使用手動(dòng)光度計(jì)，恰在添加R2后90、120、150和180秒進(jìn)行分光光度測(cè)量溫度 37+0.05℃波長405nm帶寬2nm光路10mm延遲時(shí)間90秒測(cè)量時(shí)間90秒此外，考慮以下的樣品材料的稀釋極限ΔE/分鐘＝0.380(測(cè)量時(shí)間60秒)對(duì)于更高活性100μl樣品與100μl 0.9％(w/v)NaCl溶液混合，重復(fù)測(cè)量，結(jié)果放大到2倍。
對(duì)于活性ΔE/分鐘＜0.007，樣品體積加倍(30μl)，減去試劑空白，結(jié)果放大至33914倍。
相對(duì)于空氣進(jìn)行測(cè)量以確定消光的降低。對(duì)于各個(gè)系列的測(cè)量，確定5次空白反應(yīng)值，并且在任何一次，空白反應(yīng)值被從真實(shí)酶促反應(yīng)值中減去。
因而，樣品中的膽堿酯酶的轉(zhuǎn)換速率等于樣品反應(yīng)和空白反應(yīng)之差(ΔE/分鐘)CHE＝(ΔE/分鐘)樣品-(ΔE/分鐘)試劑空白通過將轉(zhuǎn)換速率(ΔE/分鐘)CHE乘以因子78749來計(jì)算膽堿酯酶的催化濃度(U/L)

其中1000U/L＝16.67μkat/L；1μkat/L＝60U/L，具有因子78749的公式是基于以下計(jì)算在波長405nm和測(cè)量溫度37℃下，催化濃度是
b=A·Vϵ·l·v]]>-在405nm六氰基高鐵酸鉀的摩爾吸收系數(shù)ε＝92.7m2·mol-1(見DGKC建議)-光程長，l0.01m-反應(yīng)體積，V 1.095·10-3L(R10.900·10-3·L+R20.180·10-3L+樣品)-樣品體積，v 0.015·10-3L-A60秒的消光降低擬合b=A·1.095·10-392.7·0.01·0.015·10-3·L·mol·m2·m·L·min]]>b=A·78.7487·molm3·min]]>b=A·78749·UL]]>或b=A·1312.5·μkatL(1μkat=60U)]]>在波長415nm下，移液體積為R1180μl、樣品3μl和R236μl，使用自動(dòng)Roche/Hitachi 917分析儀根據(jù)類似的程序進(jìn)行以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2用不同的極性有機(jī)溶劑評(píng)定丁?；虼憠A(BTC)的穩(wěn)定性在試劑老化結(jié)果的變化中能夠看出BTC的穩(wěn)定化不足。為了評(píng)定BTC穩(wěn)定性，用由控溫的底物溶液(在35℃控溫18-21天)得到的膽堿酯酶的催化濃度與由新鮮制備的底物溶液得到的膽堿酯酶的催化濃度進(jìn)行比較。
類似于實(shí)施例1中所述的程序在Roche/Hitachi 917分析儀上進(jìn)行測(cè)量。
以上“老化模型”適于快速評(píng)價(jià)不同的膽堿酯酶底物溶液，因?yàn)樵?5℃控溫18-21天的試劑相當(dāng)于在冷藏的常規(guī)條件下儲(chǔ)藏15-18個(gè)月的試劑。
使用這種“老化模型”，不同的膽堿酯酶底物溶液-/+某些極性有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性根據(jù)使用新鮮制備的和控溫的底物溶液獲得的CHE催化濃度圖(見例如圖1、2)中的直線的截距和斜率來確定。這些參數(shù)(截距和斜率)與未穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的參數(shù)比較，例如按照DGKC[Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie，見Schmidt et al.，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30(3)163-170(1992)]建議而制備的(見圖2)或者根據(jù)實(shí)施例1(即R2沒有極性有機(jī)溶劑)制備的。
因此，截距約小于+/-300U/l和斜率小于+/-3％是穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的標(biāo)準(zhǔn)，其指出實(shí)際上在35℃培養(yǎng)21天內(nèi)沒有BTC損失。
相反，類似地用DGKC建議的或根據(jù)實(shí)施例1制備的(即R2沒有極性有機(jī)溶劑)未穩(wěn)定化的原始制劑(formulation)確定的這些參數(shù)值與指出BTC穩(wěn)定化的參數(shù)值有很大的差別DGKC制劑y＝-1464+0.8105*x(見圖2)新鮮試劑用Roche校準(zhǔn)器CFAS校準(zhǔn)，并且從新鮮試劑的校準(zhǔn)曲線讀取控溫的試劑。
對(duì)用以下極性有機(jī)溶劑穩(wěn)定的膽堿酯酶底物溶液進(jìn)行測(cè)試并且該膽堿酯酶底物溶液滿足BTC穩(wěn)定化的要求(各體積百分比濃度在括號(hào)內(nèi)指出)；極性有機(jī)溶劑(體積％)直線函數(shù)乙醇(20％) y＝-178+1.016*xDMSO(20％) y＝14+0.985*x(見圖1)異丙醇(20％)y＝180+0.976*xTHF(5％)y＝252+0.982*x乙腈(20％) y＝187+0.995*x硫醇(sulfanol)(20％)y＝58+1.020*x甘油(20％) y＝302+0.976*x實(shí)施例3為丁?；虼憠A(BTC)的穩(wěn)定性而確定不同的極性有機(jī)溶劑的極限濃度基于實(shí)施例2中所述的“老化模型”，根據(jù)使用新鮮制備的和控溫的底物溶液獲得的CHE催化濃度圖中的直線的截距和斜率來確定極性有機(jī)溶劑的最小濃度(以體積百分?jǐn)?shù)計(jì))。
表2為丁?；虼憠A(BTC)的穩(wěn)定性而確定不同的極性有機(jī)溶劑的極限濃度。

考慮穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的標(biāo)準(zhǔn)，即截距約小于+/-300U/l和斜率小于+/-3％，具有穩(wěn)定效果的最低濃度是對(duì)于乙醇和DMSO分別為1％(vol％)，對(duì)于THF和異丙醇分別為2％(vol％)。
實(shí)施例4不同的極性有機(jī)溶劑的組合來評(píng)定丁?；虼憠A(BTC)的穩(wěn)定性由表2中所概括的數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為BTC的穩(wěn)定化溶液可以使用0.25％DMSO、0.25％乙醇、0.5％異丙醇和0.5％THF來制備。
根據(jù)實(shí)施例1制備試劑R1。根據(jù)實(shí)施例1制備試劑R2，包括極性有機(jī)溶劑DMSO，0.25％；ETOH，0.25％；異丙醇，0.5％；THF，0.5％。
一等分新鮮制備的R2在35℃儲(chǔ)藏21天。另一等分在4-8℃冷藏儲(chǔ)藏。在此老化階段之后，對(duì)于至少30個(gè)CHE活性為3000-15000U/l的樣品，將兩等分與R1一起使用來根據(jù)實(shí)施例1確定膽堿酯酶活性。
老化的R2相對(duì)于冷藏儲(chǔ)藏的R2的結(jié)果圖預(yù)計(jì)給出這樣的結(jié)果，其指出根據(jù)如上所定義的穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)際上沒有BTC損失。
權(quán)利要求
1.極性有機(jī)溶劑用于使膽堿酯酶底物溶液穩(wěn)定化的用途，其中在緩沖溶液中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述底物是膽堿酯。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述底物是硫酯。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述硫酯是丁?；虼憠A(BTC)或者乙?；虼憠A(ATC)。
5.權(quán)利要求1的用途，其中所述膽堿酯酶底物溶液是酰基膽堿酯酶底物溶液或者乙酰膽堿酯酶底物溶液。
6.權(quán)利要求1的用途，其中所述至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)是極性質(zhì)子有機(jī)溶劑。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述極性質(zhì)子有機(jī)溶劑是醇。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述醇選自鏈長為1-7個(gè)碳原子的醇。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述醇選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和甘油。
10.權(quán)利要求1的用途，其中所述至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)是極性無質(zhì)子有機(jī)溶劑。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述極性無質(zhì)子有機(jī)溶劑選自羰基化合物和雜羰基化合物。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述羰基化合物或者雜羰基化合物選自含1-12個(gè)碳原子的羰基化合物或者雜羰基化合物。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述羰基化合物或者雜羰基化合物選自二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙酰丙酮、乙腈和六甲基磷酰三胺(HMPT)。
14.權(quán)利要求10的用途，其中所述極性無質(zhì)子有機(jī)溶劑是醚。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述醚選自含1-12個(gè)碳原子的醚。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述醚是環(huán)醚。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述環(huán)醚選自四氫呋喃(THF)和二氧雜環(huán)己烷。
18.權(quán)利要求1的用途，其中所述至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)的濃度是二甲亞砜至少0.25vol％和最大20vol％，乙醇至少0.25vol％和最大20vol％，異丙醇至少0.5vol％和最大20vol％，和/或THF至少0.5vol％和最大20vol％。
19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用途，其中所述底物在存儲(chǔ)于35℃至少18天后不明顯失活。
20.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的用途，其中所述底物存儲(chǔ)于4-8℃至少15個(gè)月后不明顯失活。
21.一種用于確定樣品中膽堿酯酶的活性的試劑盒，包括在封裝的組合中的a.第一試劑，其包括適于所述酶的活性的緩沖溶液，b.第二試劑，其包含穩(wěn)定化的膽堿酯酶底物溶液，其中在緩沖溶液中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，所述試劑盒還包括含已知量所述酶的校準(zhǔn)試劑。
23.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述樣品是全血、血漿或者血清。
24.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述膽堿酯酶是?；憠A酯酶或者乙酰膽堿酯酶。
25.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述底物在存儲(chǔ)于35℃至少18天后不明顯失活。
26.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述底物存儲(chǔ)于4-8℃至少15個(gè)月后不明顯失活。
全文摘要
本發(fā)明涉及極性有機(jī)溶劑在使膽堿酯酶底物溶液穩(wěn)定化中的用途，其中在緩沖溶液中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定，還涉及所述溶液用于確定樣品中膽堿酯酶活性的用途。此外，本發(fā)明還包括用于確定樣品中膽堿酯酶活性的穩(wěn)定化膽堿酯酶底物溶液，其中至少一種底物被至少一種極性有機(jī)溶劑物質(zhì)穩(wěn)定。此外，本發(fā)明涉及用于確定樣品中膽堿酯酶的活性的方法，以及用于確定樣品中膽堿酯酶的活性的試劑盒和用于進(jìn)行確定樣品中膽堿酯酶的活性的方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/46GK1978660SQ20061016425
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者N·戈特沙爾克, H·-J·凱特茲亞, M·穆克克, R·納格爾, F·韋伯 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司