專利名稱：具有改善的l－賴氨酸生產(chǎn)力的棒桿菌屬微生物和利用棒桿菌微生物生產(chǎn)l－賴氨酸的方法
相關(guān)專利申請的交叉參考本申請要求2005年11月30日提交于韓國知識產(chǎn)權(quán)局的韓國專利申請10-2005-0115904的利益，其全部內(nèi)容通過參考結(jié)合與此。
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及屬于棒桿菌屬(genus Corynebacterium)的微生物，其具有增強的L-賴氨酸生產(chǎn)力，還涉及利用其生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
2.相關(guān)領域的描述棒桿菌屬菌株，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，是廣泛用于生產(chǎn)L-氨基酸的微生物。L-氨基酸，特別是L-賴氨酸用于生產(chǎn)動物飼料和用于人類的藥物，并且還用于制藥業(yè)。L-氨基酸是通過發(fā)酵棒桿菌菌株而生產(chǎn)，但由于利用棒桿菌屬生產(chǎn)L-氨基酸的方法很重要，已經(jīng)廣泛嘗試改善該方法。
一種改善利用棒桿菌屬的菌株生產(chǎn)L-氨基酸的這樣的嘗試是涉及利用重組DNA技術(shù)破壞或削弱特定基因的表達。例如，在美國專利號6,872,553中，提供了一種發(fā)酵制備L-氨基酸的方法，該方法包括a)棒桿菌的生長階段，與未削弱的棒桿菌相比，在所述棒桿菌中編碼烯醇丙酮酸磷酸(PEP)羧激酶(pck)的DNA被通過誘變的方法而削弱，所述誘變的方法選自由下述方法組成的組通過插入至少一個堿基對的插入誘變；缺失至少一個堿基對的缺失誘變；和結(jié)合無義突變的轉(zhuǎn)換或顛換誘變，從而削弱了所述多肽的活性；b)在所述細菌的培養(yǎng)基或細胞中進行需要的L-氨基酸產(chǎn)物的濃縮階段；和c)分離所述L-氨基酸產(chǎn)物的分離階段。
另外，已經(jīng)廣泛研究擴增與單個L-氨基酸的生物合成相關(guān)的基因?qū)τ谏a(chǎn)L-氨基酸的影響，并且研究了改善生產(chǎn)L-氨基酸的棒狀桿菌菌株(Eggeling，Amino Acids 6，261-272(1994))。另外，已經(jīng)嘗試了引入不同細菌來源的外源基因。例如，在日本公開的專利申請?zhí)朒ei 7-121228中，提供了一種培養(yǎng)屬于棒桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium)微生物的方法，所述微生物具有DNA片段和載體DNA的重組DNA，所述DNA片段具有與微生物的檸檬酸合酶有關(guān)的基因信息，還提供了在培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-谷氨酸和L-脯氨酸的方法。
然而，依照所述方法，需要使用具有提高的L-賴氨酸生產(chǎn)力的菌株。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了屬于棒桿菌屬、并且具有提高的L-賴氨酸生產(chǎn)力的微生物。
本發(fā)明還提供了利用棒桿菌屬微生物生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
附圖簡述通過參考附圖詳細描述其示例性的實施方案，本發(fā)明的上述和其它特征及優(yōu)勢將變得更明顯

圖1是說明用約500bp的NCgl2053基因片段克隆的pCR-2053載體的圖解。
發(fā)明詳述依照本發(fā)明的一個方面，提供了屬于棒桿菌屬的微生物，其具有失活的固有的NCgl2053脫氫酶基因，并且生產(chǎn)賴氨酸。
固有的NCgl2053脫氫酶基因具有脫氫酶活性，并且在棒桿菌屬微生物中天然存在(Nakagawa，Appl.Microbiol.Biotechnol.62(2-3)，99-109(2003))。從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的基因組的完整序列分析來評價脫氫酶的活性。脫氫酶基因可以具有SEQ IDNo1的核苷酸序列。
依照本發(fā)明的一個實施方案，屬于棒桿菌屬并且具有失活的固有(inherent)NCgl2053脫氫酶基因的微生物可以是谷氨酸棒桿菌ATCC13032，Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539，谷氨酸棒桿菌KFCC 10881或谷氨酸棒桿菌KFCC 11001，但不限于這些實例。
可以利用任何本領域已知的方法引入失活。在本發(fā)明的微生物中，術(shù)語“失活”是意圖表示NCgl2053脫氫酶基因的表達低于野生菌株的表達或者根本不表達，或者即使NCgl2053脫氫酶基因表達成NCgl2053脫氫酶，但NCgl2053脫氫酶根本不具有活性或具有減弱的活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可以利用誘變方法引入失活，所述誘變選自由下述誘變組成的組通過將至少一個堿基對插入到NCgl2053脫氫酶基因中的插入誘變，在NCgl2053脫氫酶基因中缺失至少一個堿基對的缺失誘變，和結(jié)合無義密碼子的轉(zhuǎn)換或顛換誘變。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可以通過用具有抗生素標記和部分NCgl2053脫氫酶基因區(qū)域的載體轉(zhuǎn)化屬于棒桿菌屬的細菌，并在抗生素條件下培養(yǎng)所述細菌來引入失活。例如，所述載體可以是pCR-2053，其包括部分NCgl2053基因，如SEQ ID No2所示。將具有部分所述基因的載體轉(zhuǎn)化到微生物中并在選擇標記存在的條件下培養(yǎng)導致部分所述基因序列和微生物固有基因的同源重組。通過同源重組，微生物的固有基因被重組，并且在具有重組基因的微生物中，僅具有上述標記的重組微生物被選擇。結(jié)果，可以獲得屬于棒桿菌屬、并且具有失活的固有的NCgl2053脫氫酶基因的微生物。然而，獲得本發(fā)明微生物的方法并不限于該這種同源重組方法，可以使用本領域已知的任何方法。
所述微生物可以是谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102(保藏號是KCCM-10709P)。
依照本發(fā)明的另一個方面，提供了一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的微生物以在培養(yǎng)基或細胞中生產(chǎn)L-賴氨酸，從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸。
在本發(fā)明的方法中，可以使用本領域已知的任何培養(yǎng)條件和方法來培養(yǎng)棒桿菌屬的微生物。用于培養(yǎng)棒桿菌屬菌株的培養(yǎng)基的實例是是美國細菌學會的普通細菌學方法手冊(Manual of Methods for General Bacteriologyby the American Society for Bacteriology)(Washington D.C.，USA，1981)中公開的培養(yǎng)基?？梢杂糜谂囵B(yǎng)基中的碳源包括下述碳源糖和碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，淀粉和纖維素；油和脂肪如大豆油，葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞麻酸；醇如乙醇；和有機酸如乙酸。上述提及的糖源的實例可以單獨使用或組合使用。氮源實例包括下述物質(zhì)蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麥芽提取物，玉米漿，大豆粉和尿素或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。上述提及的氮源可以單獨使用或組合使用。磷源的實例包括下述物質(zhì)磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，或其相應的鈉鹽。另外，培養(yǎng)基可以包括金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵，它們對于生長是必需的。另外，除了上述成分外，可以使用生長的必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。而且，可以在培養(yǎng)基中使用適當?shù)那绑w。在分批或連續(xù)方式培養(yǎng)過程中可以向培養(yǎng)基中添加上述成分。
利用堿性化合物如氫氧化鈉，氫氧化鉀或氨，或利用酸性化合物如磷酸或硫酸可以控制培養(yǎng)基的pH。另外，使用抗泡沫劑如脂肪酸聚乙二醇酯可以抑制泡沫的產(chǎn)生。為了維持有氧條件，可以將氧或含氧的氣體如空氣注入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的溫度是20-45℃，優(yōu)選25-40℃?？梢赃M行培養(yǎng)直至產(chǎn)生所需量的L-賴氨酸，但進行培養(yǎng)10-160小時是理想的。
可以以各種方式包括分批、補料分批、重復補料分批和連續(xù)方式進行培養(yǎng)。這些方法在本領域是眾所周知的，并且本發(fā)明并不局限于此。
可以通過陰離子交換層析和水合茚三酮衍生物產(chǎn)生來分離和分析L-氨基酸。
為了開發(fā)本發(fā)明的微生物和方法，本發(fā)明的發(fā)明人首先在存在L-賴氨酸的條件下培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌ATCC 13032，利用雙向電泳分析從谷氨酸棒桿菌ATCC 13032表達的蛋白水平，并將其于那些在無L-賴氨酸的條件下進行培養(yǎng)所表達的蛋白水平相比較。結(jié)果，我們鑒定了在存在L-賴氨酸的條件下過量表達的蛋白質(zhì)，即可能由L-賴氨酸的存在而誘導的蛋白質(zhì)?；诒昏b定蛋白質(zhì)的信息，利用美國國家健康協(xié)會GenBank(NIHGenBank)確定上述蛋白質(zhì)的基因信息，該蛋白質(zhì)被證實是NCgl1835和NCgl2053。
另外，證實了是否上述基因是由于存在賴氨酸而實際誘導的。首先，通過PCR擴增認為是上述基因的啟動子的核酸區(qū)域，然后將擴增的啟動子核酸與去除啟動子的LacZ基因融合，以獲得上述鑒定基因的啟動子-LacZ編碼序列的融合基因。將獲得的融合基因插入到載體中，并將載體引入到微生物中。在存在賴氨酸的條件下培養(yǎng)獲得的微生物，通過測量β-半乳糖苷酶的活性證實是否表達了LacZ蛋白。結(jié)果，證實了賴氨酸誘導了上述基因的表達。
然而，不了解在產(chǎn)生賴氨酸的微生物中上述基因是如何與賴氨酸的生物合成相關(guān)聯(lián)的。除了鑒定在存在賴氨酸的條件下基因過表達以外，本發(fā)明的發(fā)明人測量了通過滅活棒桿菌屬微生物的固有NCgl2053基因而產(chǎn)生的賴氨酸的量，證實了所產(chǎn)生的賴氨酸的量實際上增加了。
實施例通過參考下述實施例將更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例僅是用于舉例說明的目的，其不是意圖限制本發(fā)明的范圍。
在下述實施例中，通過滅活谷氨酸棒桿菌KFCC10881的固有NCgl2053基因來制備重組微生物，培養(yǎng)重組微生物以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生賴氨酸，并測量所產(chǎn)生的賴氨酸的量。
實施例1產(chǎn)生載體以滅活棒桿菌屬微生物的固有NCgl2053基因在本實施例中，為了產(chǎn)生具有抗生素標記和NCgl2053的部分DNA序列的載體，利用SEQ ID.NOS.3和4的寡核苷酸作為引物和谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的染色體作為模板，通過PCR擴增約500bp的NCgl2053基因片段(SEQ.ID.No.2；SEQ.ID.No.1的170-650核苷酸)。通過在96℃的溫度下變性30秒，在52℃的溫度下退火30秒，在72℃的溫度下聚合30秒，重復30次來進行PCR。通過使用TOPO克隆試劑盒(Invitrogen，US)將擴增的NCgl2053基因片段插入到大腸桿菌(E.coli)質(zhì)粒pCF2.1中，以產(chǎn)生pCR-2053質(zhì)粒。圖1顯示了pCR-2053載體，其中克隆了約500bp的NCgl2053基因片段。
實施例2產(chǎn)生具有滅活的谷氨酸棒桿菌KFCC10881固有NCgl2053基因的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株利用在Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52541-545中舉例說明的轉(zhuǎn)化方法，通過電脈沖方法用在實施例1中產(chǎn)生的pCR-2053轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌KFCC10881，然后在含25mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物。在培養(yǎng)的第二天利用轉(zhuǎn)化菌株的染色體DNA作為模板進行PCR以證實是否NCgl2053基因被破壞。通過利用SEQ ID.NO.5和6的寡核苷酸作為引物和轉(zhuǎn)化菌株的染色體DNA作為模板進行PCR以擴增含有pCR-2053質(zhì)粒，且具有約5150bp長度的NCgl2053的基因片段(SEQ ID.NO.1的118-775核苷酸)。結(jié)果，獲得破壞了上述基因的谷氨酸棒桿菌KFCC10881菌株，然后命名為谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102。認為通過同源重組將pCR-2053質(zhì)粒結(jié)合到染色體DNA的固有NCgl2053基因當中破壞了上述基因。
將谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102菌株于2005年11月16日保藏在韓國微生物保藏中心，其為布達佩斯條約承認的國際保藏機構(gòu)(保藏號KCCM-10709P)。
實施例3利用谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102生產(chǎn)L-賴氨酸通過培養(yǎng)在實施例2中產(chǎn)生的谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102菌株生產(chǎn)L-賴氨酸。
首先，將谷氨酸棒桿菌親本菌株KFCC10881接種到具有25ml的下述接種培養(yǎng)基(seed culture medium)的250ml彎頭-擋板燒瓶(corner-baffledflask)，將得到的物質(zhì)于30℃下200rpm攪拌培養(yǎng)20小時。將1ml得到的培養(yǎng)溶液接種到含24ml下述生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml彎頭-擋板燒瓶(corner-baffled flask)中，將得到的物質(zhì)于30℃下200rpm攪拌培養(yǎng)120小時。培養(yǎng)完成后，利用HPLC(Waters 2457)測量產(chǎn)生的L-賴氨酸的量。結(jié)果，確定谷氨酸棒桿菌KFCC10881和KFCC10881-CJP5102分別在培養(yǎng)物中產(chǎn)生鹽酸鹽形式的45g/l和49g/l的L-賴氨酸。
接種培養(yǎng)基(pH7.0)(每升的蒸餾水)原糖(raw sugar)20g蛋白胨 10g酵母提取物 5g
尿素1.5gKH2PO44gK2HPO48gMgSO47H2O0.5g生物素 100μg硫胺HCl1000μg鈣-泛酸 2000μg煙堿2000μg生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.0)(每升的蒸餾水)原糖100g(NH4)2SO440g大豆蛋白2.5g玉米漿 5g尿素3gKH2PO41gMgSO47H2O0.5g生物素 100μg鹽酸硫胺素 1000μg鈣-泛酸 2000μg煙堿3000μgCaCO330g實施例4谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102菌株的培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸通過將鹽酸加入到1L賴氨酸發(fā)酵肉湯中將發(fā)酵肉湯的pH調(diào)節(jié)到pH2.0，所述賴氨酸發(fā)酵肉湯通過在含糖蜜和原糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌KFCC10881-CJP5102而獲得，鈣離子轉(zhuǎn)化為CaSO4和CaCl2。然后，將培養(yǎng)物質(zhì)向上方流入陽離子交換樹脂(Diaion SK-L10)，該樹脂以銨離子的形式再生，將賴氨酸吸附到樹脂上。通過用軟化水洗滌去除陽離子交換樹脂中殘留的細菌，通過用2N-氫氧化銨洗脫樹脂收集高度濃縮的賴氨酸。將pH調(diào)整至5.0，濃縮收集的溶液，并通過冷卻至20℃結(jié)晶。通過離心分離結(jié)晶完全的淤漿獲得第一批濕產(chǎn)物，通過分批濃縮和結(jié)晶母液獲得第二批濕產(chǎn)物。通過合并第一批和第二批濕產(chǎn)物并干燥合并的產(chǎn)物獲得46.5g干燥的賴氨酸產(chǎn)物，其賴氨酸含量是98.5％。
盡管參考本發(fā)明的示例性實施方案已經(jīng)具體顯示和描述了本發(fā)明，本領域的普通技術(shù)人員可以理解可以對本發(fā)明進行各種形式和細節(jié)變化而不背離如后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
序列表<110>CJ株式會社<120>具有改善的L-賴氨酸生產(chǎn)力的棒桿菌屬微生物和利用其生產(chǎn)L-賴氨酸的方法<160>6<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>888<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032<220>
<221>基因<222>(1)..(879)<223>NCgl2053基因<400>1atgatttcat tgctaaatga tccacgtacg ctattcccga aagtcgatcc cccaaagcaa60agccagccgg aaccaggcct agatataaaa ctttcccccc aagccgatat tggtctctcc120agctatcaag gaagtggaag gcttaagggc cgcaaggctc ttattactgg tggcgattct180gggattggag ctgccgtagc aatcgcttat gctcgcgagg gggcagatgt tgcgatcgct240tacttgcccg aagaacaagc cgatgctgac agagtgctcc aagcaatcga ggaaacaggt300caaaaagctt tttctttccc tggtgatctc cgtgatccag aatactgtcg ctcgctggtc360
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<223>谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032NCgl2053基因的片段<400>2gtggcgattc tgggattgga gctgccgtag caatcgctta tgctcgcgag ggggcagatg60ttgcgatcgc ttacttgccc gaagaacaag ccgatgctga cagagtgctc caagcaatcg120aggaaacagg tcaaaaagct ttttctttcc ctggtgatct ccgtgatcca gaatactgtc180
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<223>擴增NCgl2053基因的部分區(qū)域(170-650nt)的引物1<400>3gtggcgattc tgggattgga20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增NCgl2053基因的部分區(qū)域(170-650nt)的引物2<400>4aatgccatcg cctatcagac20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增NCgl2053基因的部分區(qū)域(118-775nt)的引物3<400>5tccagctatc aaggaagtgg20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴增NCgl2053基因的部分區(qū)域(118-775nt)的引物4<400>6
ttccaatcgg agcgtgctgg20
權(quán)利要求
1.微生物，其屬于棒桿菌屬，具有滅活的固有的NCgl2053脫氫酶，并且產(chǎn)生賴氨酸。
2.權(quán)利要求1的微生物，其通過誘變的方法獲得，所述誘變選自由下述誘變組成的組通過將至少一個堿基對插入到NCgl2053脫氫酶基因中的插入誘變，在NCgl2053脫氫酶基因中缺失至少一個堿基對的缺失誘變，和結(jié)合無義密碼子的轉(zhuǎn)換或顛換誘變。
3.權(quán)利要求1的微生物，其是通過轉(zhuǎn)化具有抗生素標記和部分NCgl2053脫氫酶基因的載體并在抗生素條件下培養(yǎng)而選擇的。
4.權(quán)利要求1的微生物，其中NCgl2053脫氫酶基因具有SEQ ID No1的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1的微生物，其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881-CJP5102(保藏號KCCM-10709P)。
6.一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)依照權(quán)利要求1-5任一項的微生物以在培養(yǎng)基或細胞中產(chǎn)生L-賴氨酸；和從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了屬于棒桿菌屬、具有滅活的固有的NCgl2053脫氫酶基因的微生物，和一種利用該微生物生產(chǎn)L－賴氨酸的方法。通過使用該微生物，L－賴氨酸的產(chǎn)率提高，原因在于固有的NCgl2053脫氫酶基因被滅活。依照該方法，可以高產(chǎn)率地生產(chǎn)L－賴氨酸。
文檔編號C12N15/09GK1974761SQ20061016370
公開日2007年6月6日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者樸英薰, 具賢敏, 林相曹, 文準玉, 梁榮烈 申請人:Cj株式會社