專利名稱：利用微生物生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法和檢測(cè)具有抗菌或除草活性的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用由原核生物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法；并涉及篩選具有抗生或除草活性的、與非甲羥戊酸途徑有關(guān)的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
類異戊二烯是具有由5個(gè)碳原子作為主鏈結(jié)構(gòu)組成的異戊二烯單元的化合物的通用術(shù)語(yǔ)。通過(guò)異戊烯焦磷酸(IPP)聚合生物合成類異戊二烯。在自然界中存在著各種各樣的類異戊二烯化合物，其中許多對(duì)人類有用。
例如，泛醌作為電子傳遞體系的必需組分在體內(nèi)起重要作用。泛醌不僅僅作為有效對(duì)抗心臟病的藥物的需求正在增加，而且其在西方國(guó)家作為健康食品的需求也正在增加。
維生素K是一種參與血液凝固體系的重要的維生素，利用其作為止血?jiǎng)?。近?lái)已經(jīng)表明維生素K參與骨代謝，并預(yù)期其可用于治療骨質(zhì)疏松癥。維生素K1和甲基萘醌類(menaquinone)已經(jīng)被批準(zhǔn)作為藥物。
另外，泛醌和維生素K有效抑制附著物(barnacle)依附于物體，因此可制成極好的油漆產(chǎn)品添加劑，防止附著物的依附。
而且，具有由40個(gè)碳原子組成的異戊二烯主鏈的稱為類胡蘿卜素的化合物具有抗氧化劑作用。預(yù)計(jì)類胡蘿卜素(諸如β-胡蘿卜素、蝦青素和隱黃素)具有癌癥預(yù)防和免疫強(qiáng)化活性。
如上所述，類異戊二烯化合物包括許多有用的物質(zhì)。建立一種生產(chǎn)這些物質(zhì)的經(jīng)濟(jì)的方法將對(duì)醫(yī)學(xué)界和社會(huì)極為有益。
已經(jīng)研究了通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，并已經(jīng)對(duì)培養(yǎng)條件的檢驗(yàn)、通過(guò)誘變進(jìn)行菌株育種和通過(guò)基因工程技術(shù)提高產(chǎn)量進(jìn)行了試驗(yàn)。然而，實(shí)際的結(jié)果限于個(gè)別類型的化合物，還不知道對(duì)類異戊二烯化合物普遍有效的方法。
在諸如動(dòng)物和酵母的真核生物中，已經(jīng)證明類異戊二烯化合物主鏈單元-異戊烯焦磷酸(IPP)是由乙酰輔酶A通過(guò)甲羥戊酸(甲羥戊酸途徑)生物合成。
據(jù)認(rèn)為，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶在甲羥戊酸途徑中是限速酶[Mol.Biol.Cell，5，655(1994)]。已經(jīng)在酵母中進(jìn)行了通過(guò)過(guò)量表達(dá)HMG-CoA還原酶提高類胡蘿卜素產(chǎn)量的試驗(yàn)[Misawa等，Summaries of Lectures on Carotenoids，1997]。
沒(méi)有資料證明在原核生物中存在甲羥戊酸途徑。在許多原核生物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了另一條途徑-非甲羥戊酸途徑，其中通過(guò)由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合產(chǎn)生的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸生物合成IPP[Biochem.J.，295，517(1993)]。在一個(gè)使用13C標(biāo)記的底物的試驗(yàn)中表明，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸通過(guò)2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸轉(zhuǎn)化成IPP[Tetrahedron Lett.38，4769(1997)]。
在大腸桿菌(Escherichia coli)中，鑒定了一種編碼1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)的基因，它使得丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合而生物合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12857(1997)]。所述基因包含在由四個(gè)ORF組成的操縱子中，所述ORF包括編碼法尼焦磷酸合酶的ispA。
而且在大腸桿菌中已知存在將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化為2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸的活性[Tetrahedron Lett.39，4509(1998)]。
目前，還沒(méi)有關(guān)于通過(guò)這些包含在所述操縱子中的基因的工程基因提高類異戊二烯化合物產(chǎn)量的已知描述和提示。
盡管對(duì)原核生物中非甲羥戊酸途徑的了解越來(lái)越多，但其中涉及的大多數(shù)酶和編碼這些酶的基因仍處于未知狀態(tài)。
在光合作用細(xì)菌中，已知一種通過(guò)引入ubiC酶基因(uviC基因，它將分支酸鹽轉(zhuǎn)變成4-羥基苯甲酸)和對(duì)-羥基苯甲酸轉(zhuǎn)移酶(ubiA)基因，有效生產(chǎn)泛醌-10的方法(日本未審查專利申請(qǐng)107789/96)。然而，其中沒(méi)有通過(guò)對(duì)參與非甲羥戊酸途徑的酶的基因進(jìn)行基因工程提高類異戊二烯化合物產(chǎn)量的實(shí)施例。
而且，其中沒(méi)有關(guān)于當(dāng)通過(guò)誘變或用藥物處理抑制在非甲羥戊酸途徑上的反應(yīng)時(shí)，將怎樣影響原核生物的論述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，該方法包括將包含一個(gè)或多個(gè)參與類異戊二烯化合物(可用于針對(duì)心臟病、骨質(zhì)疏松癥、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、預(yù)防癌癥和免疫強(qiáng)化的藥物、健康食品和抗依附者的防污漆產(chǎn)品)生物合成的DNA的DNA整合到載體中，將產(chǎn)生的重組DNA引入到得自原核生物的宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體，使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積類異戊二烯化合物，并從所述培養(yǎng)物中回收類異戊二烯化合物；一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括將包含一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白(所述蛋白具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率的活性)的DNA的DNA整合到載體中，將產(chǎn)生的重組DNA引入到宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體，使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積所述蛋白，并從培養(yǎng)物中回收所述蛋白；所述蛋白；和編碼該蛋白的DNA。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種篩選具有抗生活性和/或除草活性的物質(zhì)的方法，包括篩選抑制非甲羥戊酸途徑上的酶反應(yīng)的物質(zhì)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)篩選能夠在原核生物中提高類異戊二烯產(chǎn)量的DNA，并將獲得的DNA引入到原核生物中，可以提高類異戊二烯的產(chǎn)量，本發(fā)明人據(jù)此完成本發(fā)明。
即，本申請(qǐng)的第一個(gè)發(fā)明是生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，該方法包括將包含一個(gè)或多個(gè)選自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的DNA的DNA整合到載體中(a) 編碼具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA，(b) 編碼法尼焦磷酸合酶的DNA，(c) 編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白的DNA，或編碼具有其中在SEQ ID NO3的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA，(d) 編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白的DNA，或編碼具有其中在SEQ ID NO4的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA、(e) 編碼具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA，(f) 編碼能夠在嚴(yán)格條件下與選自(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的DNA雜交、并且其活性與所選擇的DNA編碼的蛋白的活性基本相同的蛋白的DNA；將產(chǎn)生的重組DNA引入到得自原核生物的宿主細(xì)胞中；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體；使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積類異戊二烯化合物；并從所述培養(yǎng)物中回收所述類異戊二烯化合物。
可以通過(guò)定點(diǎn)誘變(在本申請(qǐng)?zhí)峤恢?，它是一種廣為人知的技術(shù))進(jìn)行在本說(shuō)明書(shū)中的氨基酸殘基的缺失、置換或添加。此外，詞組“一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基”是指通過(guò)定點(diǎn)誘變可以缺失、置換或添加的氨基酸殘基的數(shù)目，例如1-5個(gè)氨基酸殘基。
可以按照在Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989(下文稱為Molecular Cloning，第二版)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997)，Nucleic AcidsResearch，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，Nucleic Acids Research，13，4431(1985)和Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，488(1985)等中描述的方法，制備由具有一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基缺失、置換或添加的氨基酸序列組成的蛋白。
上述的編碼催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)的蛋白的DNA，是例如編碼具有SEQ ID NO1、26或28的氨基酸序列的蛋白的DNA，或者是編碼具有其中在SEQ ID NO1、26或28的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA。
此DNA的實(shí)例包括具有SEQ ID NO6的核苷酸序列的DNA或具有SEQ ID NO27或29的核苷酸序列的DNA。
編碼法尼焦磷酸合酶的DNA的實(shí)例包括編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白的DNA，或編碼具有其中在SEQ ID NO2的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有產(chǎn)生法尼焦磷酸的酶活性的蛋白的DNA。具體實(shí)例是具有SEQID NO7的核苷酸序列的DNA。
編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白的DNA的具體實(shí)例是具有SEQ ID NO8的核苷酸序列的DNA。
此外，編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白的DNA的具體實(shí)例是具有SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA。
編碼具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA的實(shí)例，包括編碼具有SEQ IDNO5或30的氨基酸序列的蛋白的DNA，或者是編碼具有其中在SEQID NO5或30的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA。
具體而言，這種DNA是具有SEQ ID NO10或31的核苷酸序列的DNA。
上述詞組“可以在嚴(yán)格條件下雜交...DNA”是指使用上述的DNA或DNA片段作為探針，通過(guò)菌落雜交、噬菌斑雜交、DNA印跡或類似的方法可以獲得的DNA?？梢酝ㄟ^(guò)使用其上固定有來(lái)自菌落或噬菌斑的DNA或其片段的濾膜，在0.7-1.0mol/l NaCl存在下于65℃進(jìn)行雜交，接著用約0.1-2倍SSC溶液(1倍濃度的SSC溶液的組成為150mol/l氯化鈉、15mol/l檸檬酸鈉)于65℃洗滌該濾膜來(lái)鑒定這種DNA。
可以按照在Molecular Cloning，第二版中描述的方法進(jìn)行雜交。能夠雜交的DNA的實(shí)例包括與選自SEQ ID NO1、2、3、4和5的核苷酸序列具有至少70％或更高同源性，優(yōu)選90％或更高同源性的DNA。
類異戊二烯化合物的實(shí)例包括泛醌、維生素K2和類胡蘿卜素。
本申請(qǐng)的第二個(gè)發(fā)明是具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率的活性、并選自以下(a)、(b)和(c)的蛋白(a) 具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO3的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白，(b) 具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO4的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白，和(c) 具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO5的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白。
本申請(qǐng)的第三個(gè)發(fā)明是生產(chǎn)具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的方法，該方法包括將編碼在上述第二個(gè)發(fā)明中描述的蛋白的DNA整合到載體中；將產(chǎn)生的重組DNA引入到宿主細(xì)胞中；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體；使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積所述蛋白；并從所述培養(yǎng)物中回收所述蛋白。
上述轉(zhuǎn)化體包括屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)或歐文氏菌屬(Erwinia)的微生物。
本申請(qǐng)的第四個(gè)發(fā)明是編碼具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白、并選自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)和(g)的DNA(a) 編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白的DNA，(b) 編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白的DNA，(c) 編碼具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的蛋白的DNA，(d) 具有SEQ ID NO8的核苷酸序列的DNA，(e) 具有SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA，(f) 具有SEQ ID NO10的核苷酸序列的DNA，和(g) 可以在嚴(yán)格條件下與在(a)至(f)描述的任何一個(gè)DNA雜交的DNA。
本申請(qǐng)的第五個(gè)發(fā)明是篩選具有抗生活性的物質(zhì)的方法，該方法包括篩選抑制蛋白反應(yīng)的物質(zhì)，所述蛋白具有選自那些存在于非甲羥戊酸途徑上的酶的酶活性，在所述途徑中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，而由2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸生物合成異戊烯焦磷酸。
本發(fā)明的第六個(gè)發(fā)明是篩選具有除草活性的物質(zhì)的方法，該方法包括篩選抑制蛋白反應(yīng)的物質(zhì)，所述蛋白具有選自那些存在于非甲羥戊酸途徑上的酶的酶活性，在所述途徑中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，而由2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸生物合成異戊烯焦磷酸。
在上述的第五個(gè)和第六個(gè)發(fā)明中的蛋白的實(shí)例包括以下(a)或(b)中的蛋白(a) 具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白，或(b) 具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白。
催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)的蛋白的實(shí)例，包括具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白。
催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的實(shí)例，包括具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO5的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白。
本發(fā)明的第七個(gè)發(fā)明是一種具有抗生活性的物質(zhì)，并利用在上述第五個(gè)發(fā)明中的篩選方法獲得。由上述篩選方法獲得的已知物質(zhì)不包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明人著重于膦胺霉素[3-(N-甲酰-N-羥基氨基)丙膦酸]與2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸的結(jié)構(gòu)相似性，所述2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(reductoisomerase)反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，或是假定在此酶反應(yīng)中產(chǎn)生的反應(yīng)中間體。
根據(jù)膦胺霉素具有抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的活性和抗生活性的假定，本發(fā)明人已經(jīng)對(duì)第五個(gè)發(fā)明的篩選方法進(jìn)行了試驗(yàn)，并還在以下的實(shí)施例10中進(jìn)行了描述。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)膦胺霉素是具有抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性和抗生活性的物質(zhì)，另外，驗(yàn)證了上述第五個(gè)發(fā)明的篩選方法的合理性。然而，已知化合物膦胺霉素排除在本發(fā)明之外。
本發(fā)明的第八個(gè)發(fā)明是具有除草活性的物質(zhì)，并通過(guò)上述第六個(gè)發(fā)明的篩選方法獲得。如上所述，由該篩選方法獲得并已知的任何物質(zhì)都排除在本發(fā)明之外。
下文將給出對(duì)本發(fā)明的更詳細(xì)的解釋。
I.克隆編碼參與類異戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA(1)使用編碼DXS的DNA(DXS基因)的核苷酸序列克隆編碼參與類異戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA使用在預(yù)先確定的大腸桿菌染色體的核苷酸序列和DXS基因上的信息[Proc.Ntal.Acad.Sci.USA.，94，12857(1997)]，通過(guò)用PCR方法克隆，由大腸桿菌獲得包含DXS基因或DXS基因相鄰基因的DNA區(qū)[Science，230，1350(1985)]。
在包含DXS基因的核苷酸序列上的信息的實(shí)例是SEQ ID NO11的核苷酸序列。
克隆包含DXS基因的DNA區(qū)的方法的具體例子如下。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在適于大腸桿菌的培養(yǎng)基，例如LB液體培養(yǎng)基[每升水包含10g細(xì)菌用胰蛋白胨(由Difco Laboratories生產(chǎn))、5g酵母提取物(由Difco Laboratories生產(chǎn))、5g NaCl，并調(diào)節(jié)至pH 7.2]中培養(yǎng)大腸桿菌，諸如大腸桿菌XL1-Blue株系(得自TOYOBO CO.，LTD.)。
培養(yǎng)后，通過(guò)離心從培養(yǎng)物中回收細(xì)胞。
按照在例如Molecular Cloning，第二版中描述的已知方法，由獲得的細(xì)胞中分離染色體DNA。
使用在SEQ ID NO11的核苷酸序列上的信息，用DNA合成儀合成包含DXS基因或?qū)?yīng)于DXS基因相鄰基因的DNA區(qū)的核苷酸序列的有義引物和反義引物。
在PCR擴(kuò)增后，為將擴(kuò)增的DNA片段引入到質(zhì)粒中，優(yōu)選將合乎限制酶(例如BamHI和EcoRI)的識(shí)別位點(diǎn)加入到有義和反義引物的5′末端。
有義和反義引物組合的實(shí)例包括具有核苷酸序列SEQ ID NO12和13、SEQ ID NO14和15、SEQ ID NO12和16、SEQ ID NO17和18、SEQ ID NO19和13或SEQ ID NO22和23組合的DNA。
使用所述染色體DNA作為模板，使用所述引物；TaKaRaLA-PCRTM試劑盒2型(由TAKARA SHUZO CO.，LTD.生產(chǎn))或ExpandTM高保真性PCR系統(tǒng)(由Boehringer Manheim K.K.生產(chǎn))，用DNA熱循環(huán)儀(由Perkin Elmer Instruments，Inc.日本生產(chǎn))進(jìn)行PCR。
在PCR反應(yīng)條件下，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，在擴(kuò)增的DNA片段為2kb或更少的情況下，一個(gè)循環(huán)包括在94℃反應(yīng)30秒、55℃反應(yīng)30秒至1分鐘和在72℃反應(yīng)2分鐘；在擴(kuò)增的DNA片段超過(guò)2kb的情況下，一個(gè)循環(huán)包括在98℃反應(yīng)20秒和68℃反應(yīng)3分鐘；然后在72℃接著反應(yīng)7分鐘。
在與加入到上述引物中的限制酶切位點(diǎn)相同的位點(diǎn)切斷擴(kuò)增的DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、蔗糖密度梯度離心以及諸如此類的方法分離和收集。
使用收集的DNA片段，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，諸如在MolecularCloning，第二版，Current Protocols in Molecular Biology，附錄1-38，John Wiley & Sons(1987-1997)，DNA Cloning 1Core Techniques，APractical Approach，第二版，Oxford University Press(1995)中描述的那些方法，或者通過(guò)使用可從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的試劑盒，諸如用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟uperScript Plasmid System(由Life Technologies生產(chǎn))或ZAP-cDNA合成試劑盒(由Stratagene生產(chǎn))，構(gòu)建克隆載體。然后使用上述的克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，例如大腸桿菌DH5α(得自TOYOBO CO.，LTD)。
為轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以使用可在大腸桿菌K12中自主復(fù)制的任何克隆載體，包括噬菌體載體和質(zhì)粒載體。用于大腸桿菌的表達(dá)載體可用作克隆載體。所述克隆載體的具體例子包括ZAP Express[由Stratagene生產(chǎn)，Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[NucleicAcids Research，17，9494(1989)]、λZAP II(由Stratagene生產(chǎn))、λgt10、λgt11(DNA Cloning，A Practical Approach，1，49(1985))、λTriplEx(由Clonetec生產(chǎn))、λExCell(由Pharmacia生產(chǎn))、pT7T3 18U(由Pharmacia生產(chǎn))、pcD2[H.Okayama and P.Berg；Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pMW218(由WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES.，LTD生產(chǎn))、pUC118(由TAKARA SHUZO CO.，LTD.生產(chǎn))、pEG400[J.Bac.，172，2392(1990)]和pQE-30(由Qiagen.Inc生產(chǎn))。
可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如在Molecular Cloning，第二版，CurrentProtocols in Molecular Biology，附錄1-38，John Wiley&Sons(1987-1997)，DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach，第二版，Oxford University Press(1995)中描述的那些技術(shù)，由產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中獲得包含目的DNA的質(zhì)粒DNA。
通過(guò)上述方法，可以獲得包含編碼具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA、編碼法尼焦磷酸合酶的DNA、編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白的DNA、編碼具有SEQ ID NO4或其它的氨基酸序列的蛋白的DNA的質(zhì)粒DNA；以及包含上述一個(gè)或幾個(gè)DNA的質(zhì)粒DNA。
這些質(zhì)粒包括含有以上所有DNA的質(zhì)粒pADO-1、含有具有SEQID NO6的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒pDXS-1或pQEDXS-1、含有具有SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒pISP-1、含有具有SEQ ID NO8的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒pXSE-1和含有具有SEQID NO9的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒pTFE-1。
可以使用已經(jīng)插入到這些質(zhì)粒中的、得自大腸桿菌的DNA片段的核苷酸序列，以如上所述的相同的方式，由其它原核生物，諸如屬于紅細(xì)菌屬的微生物，獲得所述DNA的同源物。
(2)克隆編碼具有互補(bǔ)大腸桿菌甲基赤蘚糖醇需要型突變體活性的蛋白的DNA(互補(bǔ)甲基赤蘚糖醇需要型突變體的基因)①構(gòu)建大腸桿菌甲基赤蘚糖醇需要型突變體按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)大腸桿菌，諸如大腸桿菌W3110(ATCC14948)。
培養(yǎng)后，通過(guò)離心由獲得的培養(yǎng)物中回收細(xì)胞。
用合適的緩沖劑如0.05mol/l Tris-馬來(lái)酸鹽緩沖液(pH 6.0)洗滌獲得的細(xì)胞。然后在相同緩沖液中懸浮所述細(xì)胞，以使細(xì)胞密度為104至1010細(xì)胞/ml。
使用該懸浮液通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行誘變。在此標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中，例如向所述懸浮液中加入NTG至終濃度為600mg/l，然后將該混合物在室溫下保持20分鐘。
將此誘變后的懸浮液涂布在補(bǔ)加0.05至0.5％甲基赤蘚糖醇的基本瓊脂培養(yǎng)基上并培養(yǎng)。
基本瓊脂培養(yǎng)基的實(shí)例是補(bǔ)加瓊脂的M9培養(yǎng)基(MolecularCloning，第二版)。
可以使用按照在Tetrahedron Letters，3835，6184(1997)中描述的方法化學(xué)合成的甲基赤蘚糖醇。
將培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落復(fù)制到基本瓊脂培養(yǎng)基和每個(gè)含有0.05至0.5％甲基赤蘚糖醇的基本瓊脂培養(yǎng)基上。選擇需要甲基赤蘚糖醇生長(zhǎng)的目的突變體。即選擇能夠在包含甲基赤蘚糖醇的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、但不能在沒(méi)有甲基赤蘚糖醇的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。
菌株ME7是通過(guò)如上操作獲得的生成物甲基赤蘚糖醇需要型突變體的實(shí)例。
②克隆互補(bǔ)甲基赤蘚糖醇需要型特性的基因?qū)⒋竽c桿菌，諸如大腸桿菌W3110(ATCC14948)，接種到例如LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
通過(guò)離心由產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如在Molecular Cloning，第二版中描述的那些技術(shù)，由獲得的細(xì)胞中分離和純化染色體DNA。由以上(1)中描述的方法獲得的染色體DNA可以用作分離和純化的染色體DNA。
用合適的限制酶，諸如Sau3AI，部分消化適量的所述染色體DNA。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如蔗糖密度梯度離心(26,000rpm，20℃，20小時(shí))，分離消化的DNA片段。
將通過(guò)以上分離獲得的每個(gè)4至6kb的DNA片段連接至例如pMW118(Nippon Gene)的載體，該載體已經(jīng)用合適的限制酶消化，以構(gòu)建染色體DNA文庫(kù)。
使用所述連接的DNA，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如在MolecularCloning，第二版中描述的那些技術(shù)，轉(zhuǎn)化在以上①中分離的甲基赤蘚糖醇需要型突變體，諸如菌株ME 7。
將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體涂布在補(bǔ)加藥物的基本培養(yǎng)基上，該藥物對(duì)應(yīng)于所述載體具有的藥物抗性基因，諸如包含100μg/l氨芐青霉素的M9瓊脂培養(yǎng)基，然后在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
從而可以通過(guò)以上方法選擇互補(bǔ)其甲基赤蘚糖醇需要的轉(zhuǎn)化體。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒。可以使所述轉(zhuǎn)化體互補(bǔ)其甲基赤蘚糖醇需要的質(zhì)粒的實(shí)例是pMEW73和pQEDXR。
對(duì)整合到該質(zhì)粒中的DNA的核苷酸序列測(cè)序。
這種核苷酸序列的實(shí)例是包含SEQ ID NO10的yaeM基因的核苷酸序列的序列。使用在yaeM基因的核苷酸序列上的信息，以如上所述的相同的方式，可以由其它原核生物或植物獲得yaeM基因的同源物。
II.生產(chǎn)具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白。
為在宿主細(xì)胞中表達(dá)所產(chǎn)生的DNA，用限制酶或脫氧核糖核酸酶將目的DNA片段消化成包含所述基因的適當(dāng)長(zhǎng)度的片段。接下來(lái)將該片段插入到在表達(dá)載體中的啟動(dòng)子區(qū)下游。然后將該表達(dá)載體引入到適于其的宿主細(xì)胞中。
可以使用任何可表達(dá)目的基因的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞的實(shí)例包括屬于埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)等的細(xì)菌、屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)等的酵母、動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞。
本文使用的表達(dá)載體可以在上述的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或整合到染色體DNA中，并在可以轉(zhuǎn)錄如上所述的目的DNA的位置包含啟動(dòng)子。
當(dāng)使用細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)上述DNA的優(yōu)選表達(dá)載體可以在該細(xì)菌中自主復(fù)制，是包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、上述DNA和轉(zhuǎn)錄終止序列的重組載體。該表達(dá)載體可以含有調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的基因。
表達(dá)載體的實(shí)例包括pBTrp2、pBTac1、pBTac2(它們都可由Boehringer Manheim K.K.獲得)、pKK233-2(Pharmacia)、pSE280(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(Qiagen.Inc)、pQE-30(Qiagen.Inc)、pKYP10(日本專利公開(kāi)公告第58-110600號(hào))、pKYP200(Agricultural Biological Chemistry，48，669，1984)、pLSA1(Agric.Biol.Chem.，53，277，1989)、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306，1985)、pBluescriptII SK+、pBluescriptII SK(-)(Stratagene)、pTrS30(FERM BP-5407)、pTrS32(FERM BP-5408)、pGEX(Pharmacia)、pET-3(Novagen)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18(gene，33，103，1985)、pUC19(gene，33，103，1985)、pSTV28(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)、pSTV29(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)、pUC118(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)、pPA1(日本專利公開(kāi)公告第63-233798號(hào))、pEG400(J.Bacteriol.，172，2392，1990)和pQE-30(Qiagen.Inc)。
可以使用任何可在宿主細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括得自大腸桿菌或噬菌體的啟動(dòng)子，諸如trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子(Plac)、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、PSE啟動(dòng)子、SP01啟動(dòng)子、SP02啟動(dòng)子和penP啟動(dòng)子。而且，可以使用那些人工設(shè)計(jì)和修飾的啟動(dòng)子，如通過(guò)順序連接兩個(gè)Ptrp形成的Ptrpx 2啟動(dòng)子以及tac啟動(dòng)子、letI啟動(dòng)子和lacT7啟動(dòng)子。
可以使用任何可在宿主細(xì)胞中起作用的核糖體結(jié)合序列。優(yōu)選的質(zhì)粒在Shine-Dalgarno序列和起始密碼子之間具有適當(dāng)調(diào)節(jié)的間隔，例如6至18個(gè)堿基長(zhǎng)。
對(duì)于表達(dá)目的DNA來(lái)說(shuō)，不總是需要轉(zhuǎn)錄終止序列。最好在結(jié)構(gòu)基因后立即排列轉(zhuǎn)錄終止序列。
本文使用的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞桿菌屬、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)、組囊藍(lán)細(xì)菌屬(Anacystis)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、Azobacter、著色菌屬(Chromatium)、歐文氏菌屬(Erwinia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、席藍(lán)細(xì)菌屬(Phormidium)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、Scenedesmun、鏈霉菌屬(Streptomyces)、Synnecoccus和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的微生物。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括屬于埃希氏菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬、土壤桿菌屬、脂環(huán)酸桿菌屬、魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌屬、組囊藍(lán)細(xì)菌屬、節(jié)桿菌屬、Azobacter、著色菌屬、歐文氏菌屬、甲基桿菌屬、席藍(lán)細(xì)菌屬、紅細(xì)菌屬、紅假單胞菌屬、紅螺菌屬、Scenedesmun、鏈霉菌屬、Synnecoccus和發(fā)酵單胞菌屬的微生物。
所述宿主細(xì)胞的更具體的實(shí)例包括大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacines)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳發(fā)酸短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、無(wú)花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、種名待定的假單胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110、放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)、懸鉤子土壤桿菌(Agrobacterium rubi)、柱孢魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena cylindrica)、桶形魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena doliolum)、水華魚(yú)腥藍(lán)細(xì)菌(Anbaena flos-aquqe)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobactercitreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globformis)、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、邁索爾節(jié)桿菌(Arthrobacter mysorens)、煙草節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotianae)、石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus)、原玻璃繩節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺節(jié)桿菌(Arthrobactersulfureus)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)、巴氏著色菌(Chromatium buderi)、微溫著色菌(Chromatium tepidum)、酒色著色菌(Chromatium vinosum)、沃氏著色菌(Chromatium warmingii)、Chromatium fluviatile、噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、菠蘿歐文氏菌(Erwinia ananas)、草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)、Erwinia punctata、Erwinia terreus、羅得西亞甲基桿菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens)、種名未定的席藍(lán)細(xì)菌(Phomidium sp.)ATCC29409、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、生芽紅假單胞菌(Rhodopseudomonasblastica)、海紅假單孢菌(Rhodopseudomonas marina)、血色紅假單胞菌(Ehodopseudomonas palustris)、深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)、需鹽紅螺菌(Rhodospirillum salexigens)、鹽場(chǎng)紅螺菌(Rhodospirillum salinarum)、產(chǎn)二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)、金霉素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)、殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)、橄欖灰鏈霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝鏈霉菌(Streptomyces rameus)、田無(wú)鏈霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒紅鏈霉菌(Streptomycesvinaceus)和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。
可以使用任何將重組載體引入到如上所述的宿主細(xì)胞中的方法。這種方法的實(shí)例包括使用鈣離子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110，1972)、原生質(zhì)體方法(日本專利公開(kāi)公告第63-2483942號(hào))或在Gene，17，107(1982)或Molecular&Genetics，168，111(1979)中描述的方法。
當(dāng)使用酵母作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體是例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19和pHS15。
可以使用任何可在酵母中起作用的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、gal 1啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子、熱激蛋白啟動(dòng)子、MFα1啟動(dòng)子和CUP1啟動(dòng)子。
在此使用的宿主細(xì)胞包括啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)和河岸許旺酵母(Schwanniomyces alluvius)。
可以使用任何引入重組載體，即將DNA引入到酵母中的方法。這種方法的實(shí)例包括電穿孔(Methods.Enzymol.，194，182，1990)，原生質(zhì)球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929，(1978))、乙酸鋰法(J.Bacteriol.，153，163(1983))和在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中描述的方法。
當(dāng)使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體是例如pcDNAI、pcDM8(Funakoshi Co.，Ltd)、pAGE107[日本專利公開(kāi)公告第3-22979號(hào)；Cytotechnology，3，133(1990)]、pAS3-3[日本專利公開(kāi)公告第2-227075號(hào)]；pCDM8(Nature，329，840(1987))、pcDNAI/Amp(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]和pAGE210。
可以使用任何在動(dòng)物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括巨細(xì)胞病毒(人CMV)的IE(立即早期)基因的啟動(dòng)子、SV40初始(initial)啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱激啟動(dòng)子和SRα啟動(dòng)子。而且，人CMV IE基因的增強(qiáng)子可以和啟動(dòng)子一起使用。
本文使用的宿主細(xì)胞是例如Namalwa細(xì)胞、HBT5637(日本專利公開(kāi)公告第63-299號(hào))、COS1細(xì)胞、COS7細(xì)胞和CHO細(xì)胞。
可以使用任何將重組載體引入到動(dòng)物細(xì)胞，即把DNA引入到動(dòng)物細(xì)胞中的方法。這種方法的實(shí)例包括電穿孔(Cytotechnology，3，133(1990))，磷酸鈣法(日本專利公開(kāi)公告第2-227075號(hào))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]和在Virology，52，456(1973)中描述的方法?？梢园凑赵谌毡緦＠_(kāi)公告第2-227075號(hào)和日本專利公開(kāi)公告第2-257891號(hào)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的回收和培養(yǎng)。
當(dāng)使用昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，可以按照在諸如桿狀病毒表達(dá)載體(Baculovirus Expression Vectors)，A Laboratory Manual，CurrentProtocols in Molecular Biology附錄1-38(1987-1997)和Bio/Technology，6，47(1988)中描述的方法表達(dá)蛋白。
亦即將引入重組基因的載體和桿狀病毒共轉(zhuǎn)導(dǎo)到昆蟲(chóng)細(xì)胞中，以在所述昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中獲得重組病毒。然后用該重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，從而表達(dá)目的蛋白。
轉(zhuǎn)移基因的載體的實(shí)例包括pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(所有這些都由Invitrogen生產(chǎn))。
本文使用的桿狀病毒是例如感染甘藍(lán)夜蛾屬(Barathra)昆蟲(chóng)的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
昆蟲(chóng)細(xì)胞的實(shí)例包括秋粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)的卵巢細(xì)胞Sf9和Sf21(桿狀病毒表達(dá)載體，A Laboratory Manual(W.H.Freemanand company，紐約，1992))以及粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢細(xì)胞High5(Invitrogen)。
將用于轉(zhuǎn)移重組基因的載體和桿狀病毒共轉(zhuǎn)導(dǎo)到昆蟲(chóng)細(xì)胞中以制備重組病毒的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染法(日本專利公開(kāi)公告第2-227075號(hào))和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]。
表達(dá)基因的方法除直接表達(dá)之外，還包括分泌生產(chǎn)和根據(jù)在Molecular Cloning，第二版中列出的技術(shù)的融合蛋白表達(dá)。
當(dāng)在酵母、動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)所述基因時(shí)，可以獲得其中加入糖或糖鏈的蛋白。
可以通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含已經(jīng)將上述DNA引入到其中的重組DNA的轉(zhuǎn)化體、使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白，然后由所述培養(yǎng)物中收集所述蛋白，生產(chǎn)具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白。
可以通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，培養(yǎng)本發(fā)明的用于生產(chǎn)具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的轉(zhuǎn)化體。
當(dāng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是諸如大腸桿菌的原核生物或諸如酵母的真核生物時(shí)，培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基包含所述微生物可吸收的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，并使得所述轉(zhuǎn)化體有效生長(zhǎng)?？梢允褂萌我环N滿足以上條件的天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基。
可以使用所述微生物可吸收的任何碳源。這種碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖和含有它們的糖蜜，例如淀粉或淀粉水解產(chǎn)物的碳水化合物，例如乙酸和丙酸的有機(jī)酸以及例如乙醇和丙醇的醇類。
氮源的實(shí)例包括氨、無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的鹽，例如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨和磷酸銨，其它的含氮化合物，蛋白胨，肉羹，酵母提取物，玉米漿，酪蛋白水解產(chǎn)物，豆粉和豆粉水解產(chǎn)物，各種發(fā)酵微生物細(xì)胞或其消化液。
無(wú)機(jī)鹽的實(shí)例包括磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣。
通過(guò)振搖培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)或在有氧條件下進(jìn)行浸沒(méi)通氣攪拌培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)溫度范圍為15至40℃。優(yōu)選的培養(yǎng)周期范圍為16小時(shí)至7天。在培養(yǎng)時(shí)pH保持在3.0至9.0的范圍內(nèi)。用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等調(diào)節(jié)pH。
如果必要，在培養(yǎng)時(shí)可以向所述培養(yǎng)基中加入抗生素，例如氨芐青霉素或四環(huán)素。
在培養(yǎng)用表達(dá)載體(使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，如果必要可向所述培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，在培養(yǎng)用包含lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，可以向所述培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等；在培養(yǎng)用包含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，可以加入吲哚丙烯酸(IAA)等。
用于培養(yǎng)使用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，包括通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基[The Journal of the AmericanMedical Association，199，519(1967)]、Eagle’s MEM培養(yǎng)基[Science，122，501(1952)]、DMEM培養(yǎng)基[Virology，8，396(1959)]、199培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]或那些其中加入胎牛血清等的培養(yǎng)基。
一般來(lái)說(shuō)，所述轉(zhuǎn)化體在5％CO2存在下，于pH 6-8和30-40℃培養(yǎng)1至7天。
如果必要，在培養(yǎng)時(shí)可以向所述培養(yǎng)基中加入抗生素，例如卡那霉素或青霉素。
培養(yǎng)使用昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基的實(shí)例包括通常使用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen)，Sf-900 II SFM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)、ExCell400、ExCell405(都由JRH Biosciences生產(chǎn))、Grace昆蟲(chóng)培養(yǎng)基(Grace，T.C.C.，Nature，195，788(1962))。
所述轉(zhuǎn)化體一般于pH 6-7和25℃-30℃培養(yǎng)1-5天。
如果必要，在培養(yǎng)時(shí)可以向所述培養(yǎng)基中加入抗生素，例如慶大霉素。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的酶分離和純化技術(shù)，由本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中分離和純化具有提高類異戊二烯化合物的生物合成效率活性的本發(fā)明的蛋白。
例如，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)以可溶形式表達(dá)本發(fā)明蛋白時(shí)，在培養(yǎng)完成后通過(guò)離心回收細(xì)胞，將其在水性緩沖液中懸浮，然后使用超聲發(fā)生器、弗氏壓碎器(french press)、Manton Gaulin勻漿器、Dyno-Mill等破碎，從而獲得無(wú)細(xì)胞提取物。通過(guò)離心分離所述無(wú)細(xì)胞提取物，獲得上清液?？梢岳靡环N或幾種并用的標(biāo)準(zhǔn)酶分離和純化技術(shù)，由所述上清液中獲得純化的樣品。這些技術(shù)包括溶劑提取技術(shù)、使用硫酸銨的鹽析技術(shù)、脫鹽技術(shù)、使用有機(jī)溶劑的沉淀技術(shù)、使用諸如二乙氨乙基(DEAE)瓊脂糖凝膠和DIAION HPA-75(MitsubishiChemical Corp.)的樹(shù)脂的陰離子交換層析、使用例如S-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia)樹(shù)脂的陽(yáng)離子交換層析、使用例如丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠的樹(shù)脂的疏水層析、使用分子篩的凝膠過(guò)濾、親和層析、層析聚焦和如等電聚焦的電泳。
當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)形成內(nèi)含體的蛋白時(shí)，回收、破碎所述細(xì)胞，并通過(guò)離心分離，從而獲得沉淀部分。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由產(chǎn)生的沉淀部分中回收所述蛋白，然后使用蛋白變性劑使不溶蛋白溶解。將所述溶解的溶液稀釋或透析至該溶液不合蛋白變性劑或蛋白變性劑的濃度不使蛋白變性的程度，從而使所述蛋白形成正常的三維結(jié)構(gòu)。然后通過(guò)如上所述的相同的分離和純化技術(shù)，獲得純化的樣品。
當(dāng)本發(fā)明的蛋白或其衍生物(諸如糖修飾蛋白)分泌到細(xì)胞外時(shí)，可以由培養(yǎng)物上清液回收所述蛋白或其衍生物(諸如糖鏈加合物)。即通過(guò)如上所述的離心等處理培養(yǎng)物，以便獲得可溶性部分。使用如上所述的分離和純化技術(shù)由所述可溶性部分中可獲得純化的樣品。
如上所述產(chǎn)生的蛋白是例如其氨基酸序列選自SEQ ID NO1至5的氨基酸序列的蛋白。
而且，通過(guò)以上方法表達(dá)的蛋白可以通過(guò)包括Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)的技術(shù)化學(xué)合成。此外，可以使用Souwa Boeki K.K.(Advanced ChemTech，美國(guó))、Perkin-Elmer Japan(Perkin-Elmer，美國(guó))、Pharmacia BioTech(Pharmacia BioTech，瑞典)、ALOKA CO.，LTD.(Protein Technology Instrument)、KURABOINDUSTRIES LTD.(Synthecell-Vega，美國(guó))、PerSeptive Limited.，Japan(PerSeptive，美國(guó))或SHIMADZU CORP的肽合成儀合成所述蛋白。
III.生產(chǎn)類異戊二烯化合物按照以上II的方法，通過(guò)培養(yǎng)如在以上II中所述獲得的轉(zhuǎn)化體，使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和累積類異戊二烯化合物，然后由所述培養(yǎng)物中回收所述類異戊二烯化合物，可以生產(chǎn)類異戊二烯化合物。
上述的培養(yǎng)可以產(chǎn)生類異戊二烯化合物，諸如泛醌、維生素K2和類胡蘿卜素。類異戊二烯化合物的具體實(shí)例包括使用屬于埃希氏菌屬的微生物作為轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的泛醌-8和甲基萘醌-8、使用屬于紅細(xì)菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)的泛醌-10、使用屬于節(jié)桿菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的維生素K2、使用屬于土壤桿菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的蝦青素，以及使用屬于歐文氏菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素。
在所述培養(yǎng)完成后，為了分離和純化類異戊二烯化合物，通過(guò)加入合適的溶劑到培養(yǎng)物中，提取類異戊二烯化合物，通過(guò)例如離心去除沉淀，然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行各種層析。
IV.篩選抑制非甲羥戊酸途徑上的酶活性的物質(zhì)(1)測(cè)定非甲羥戊酸途徑上的酶活性按照測(cè)定酶活性的一般方法，可以測(cè)定非甲羥戊酸途徑上的酶活性。
用作測(cè)定活性的反應(yīng)溶液的緩沖液的pH應(yīng)當(dāng)在不抑制目的酶活性的范圍內(nèi)。優(yōu)選的pH范圍包括最適pH。
例如，pH 5至10、優(yōu)選6至9的緩沖液用于1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶。
本文可以使用任何緩沖液，只要其不抑制酶活性并可以調(diào)節(jié)至以上的pH。這種緩沖液的實(shí)例包括Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液。例如，Tris-HCl緩沖液可優(yōu)選用于1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶。
可以使用任何濃度的緩沖液，只要其不抑制酶活性。優(yōu)選的濃度范圍為1mol/l至1mol/l。
當(dāng)目的酶需要輔酶時(shí)，向所述反應(yīng)溶液中加入輔酶。例如，NADPH、NADH或其它電子供體可以用作1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的輔酶。優(yōu)選的輔酶是NADPH。
準(zhǔn)備加入的輔酶的濃度可以使用任何濃度，只要其不抑制反應(yīng)。該濃度的優(yōu)選范圍為0.01mol/l至100mol/l，更優(yōu)選為0.1mol/l至10mol/l。
如果必要，可以向反應(yīng)溶液中加入金屬離子?？梢约尤肴魏谓饘匐x子，只要其不抑制反應(yīng)。優(yōu)選的金屬離子包括Co2+、Mg2+和Mn2+。
金屬離子可以以金屬鹽加入。例如，可以加入氯化物、硫酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。
準(zhǔn)備加入的金屬離子的濃度可以使用任何濃度，只要其不抑制反應(yīng)。優(yōu)選的濃度范圍為0mol/l至100mol/l，更優(yōu)選為0.1mol/l至10mol/l。
將目的酶的底物加入到所述反應(yīng)溶液中。例如加入1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的底物1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。
所述底物的濃度可以使用任何濃度，只要其不抑制反應(yīng)。在所述反應(yīng)溶液中優(yōu)選的濃度范圍為0.01mol/l至0.2mol/l在反應(yīng)中使用的酶濃度沒(méi)有明確限制。通常濃度范圍為0.01mg/ml至100mg/ml。
本文使用的酶不必純化成單一物質(zhì)。它可以含有雜質(zhì)蛋白。在如下文(2)中描述的研究中，可以使用包含1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性的細(xì)胞提取物或具有相同活性的細(xì)胞。
可以使用任何反應(yīng)溫度，只要其不抑制酶活性。優(yōu)選的溫度范圍包括最適溫度。即反應(yīng)溫度范圍為10℃至60℃，更優(yōu)選為30℃至40℃。
利用檢測(cè)底物隨反應(yīng)減少或反應(yīng)產(chǎn)物隨反應(yīng)進(jìn)行增加的方法，可以檢測(cè)活性。
這種方法是一種通過(guò)例如高效液相層析(HPLC)(如果必要)分離目的物質(zhì)并定量測(cè)定的方法。當(dāng)NADH或NADPH隨著所述反應(yīng)進(jìn)行增加或減少時(shí)，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)溶液在340nm的吸光度，可以直接測(cè)定活性。例如，通過(guò)使用分光光度計(jì)檢測(cè)在340nm的吸光度的減少，以測(cè)定隨著反應(yīng)進(jìn)行NADPH量的減少，可以檢測(cè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的活性。
(2)篩選抑制非甲羥戊酸途徑上的酶活性的物質(zhì)通過(guò)將待篩選的物質(zhì)加入到如在以上(1)中描述的酶活性檢測(cè)系統(tǒng)中，使混合物同樣反應(yīng)，然后篩選抑制所述底物的量(與不加入該物質(zhì)的情況相比)減少的物質(zhì)或抑制反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量的物質(zhì)，可以篩選抑制非甲羥戊酸途徑上的酶活性的物質(zhì)。
篩選方法包括監(jiān)測(cè)底物量隨時(shí)間減少或反應(yīng)產(chǎn)物量隨時(shí)間增加的方法；或在反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，檢測(cè)底物量減少或反應(yīng)產(chǎn)物量增加的方法。
在監(jiān)測(cè)底物量隨時(shí)間減少或反應(yīng)產(chǎn)物量隨時(shí)間增加的方法中，在反應(yīng)過(guò)程中優(yōu)選以15秒至20分鐘的間隔，更優(yōu)選以1至3分鐘的間隔，檢測(cè)所述量。
為檢測(cè)在反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行一定時(shí)間后的底物量減少或反應(yīng)產(chǎn)物量增加，所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至1天，更優(yōu)選為30分鐘至2小時(shí)。
抑制非甲羥戊酸途徑上的酶活性的物質(zhì)抑制具有非甲羥戊酸途徑的微生物和植物的生長(zhǎng)。本發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)抑制所述微生物和植物生長(zhǎng)的事實(shí)。
所述非甲羥戊酸途徑存在于微生物和植物中，但不存在于動(dòng)物和人中。因此，通過(guò)上述的篩選方法可以獲得抑制非甲羥戊酸途徑上的酶活性但不影響人和動(dòng)物的物質(zhì)。
該物質(zhì)可以是有效的抗生素或除草劑。
本說(shuō)明書(shū)包括了部分或全部在本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文件的日本專利申請(qǐng)第10-103101、10-221910和11-035739號(hào)的說(shuō)明書(shū)和/或附圖中公開(kāi)的內(nèi)容。


圖1顯示了反應(yīng)溫度對(duì)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性的影響。
圖2顯示了反應(yīng)溶液的pH對(duì)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性的影響。顯示了在不同pH、于100mol/l Tris-HCl緩沖液中檢測(cè)的酶活性。以pH 8.0的活性為100％的相對(duì)活性表示活性。
圖3顯示了使用同源重組破壞染色體上yaeM基因的方法。
圖4顯示了膦胺霉素對(duì)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的影響。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在將利用實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不應(yīng)限于其中。除非另有說(shuō)明，否則按照在Melecular Cloning，第二版中描述的技術(shù)(后文稱為標(biāo)準(zhǔn)技術(shù))進(jìn)行在實(shí)施例中提出的基因重組。
實(shí)施例1克隆編碼參與類異戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA(1)使用大腸桿菌DXS基因的核苷酸序列克隆編碼參與類異戊二烯化合物生物合成的蛋白的DNA將一接種環(huán)的大腸桿菌XL1-Blue(購(gòu)自TOYOBO)接種到10mlLB液體培養(yǎng)基中，然后于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
培養(yǎng)后，通過(guò)離心由產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由所述細(xì)胞中分離和純化染色體DNA。
用DNA合成儀，合成在其5′末端都具有BamH I和EcoR I限制酶切位點(diǎn)、分別由SEQ ID NO12和13、14和15、12和16、17和18以及19和13的核苷酸序列對(duì)組成的有義和反義引物；合成在其5′末端都具有BamH I限制酶切位點(diǎn)、由SEQ ID NO22和23的核苷酸序列對(duì)組成的有義和反義引物。
使用這些引物、作為模板的染色體DNA以及TaKaRa La-PCRTM試劑盒2型(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)、ExpandTM高保真性PCR系統(tǒng)(Boehringer Manheim K.K.)或Taq DNA聚合酶(Boehringer)，用DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Instruments，Inc.日本)進(jìn)行PCR。
進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。在擴(kuò)增的DNA片段為2kb或更少的情況下，一個(gè)循環(huán)包括在94℃反應(yīng)30秒、55℃反應(yīng)30秒至1分鐘和在72℃反應(yīng)2分鐘；在擴(kuò)增的DNA片段超過(guò)2kb的情況下，一個(gè)循環(huán)包括在98℃反應(yīng)20秒和68℃反應(yīng)3分鐘；然后在72℃接著反應(yīng)7分鐘。
在通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA片段中，用在5′末端都具有BamH I和EcoR I限制酶切位點(diǎn)的有義和反義引物擴(kuò)增的DNA片段用限制酶BamH I和EcoR I消化；用在5′末端都具有BamH I限制酶切位點(diǎn)的有義和反義引物擴(kuò)增的DNA片段用限制酶BamH I消化。
在消化后，這些用所述限制酶處理的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收BamH I和EcoR I處理的DNA片段和BamH I處理DNA片段。
用限制酶BamH I和EcoR I消化含有l(wèi)ac啟動(dòng)子的廣泛宿主范圍的載體pEG 400[J.Bac.，172，2392(1990)]，對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收BamH I和EcoR I處理的pEG 400片段。
用限制酶BamH I消化pUC 118(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收BamH I處理的pUC 118片段。
將每種產(chǎn)生的BamH I和EcoR I處理的DNA片段和BamH I和EcoR I處理的pEG 400片段混合，然后用乙醇使所述混合物沉淀。將獲得的DNA沉淀溶解在5μl蒸餾水中，發(fā)生連接反應(yīng)，從而獲得每種重組DNA。
使用產(chǎn)生的重組DNA，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購(gòu)自TOYOBO)。然后將該轉(zhuǎn)化體涂布在含有100μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，接著于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
將所述轉(zhuǎn)化體的一些抗壯觀霉素的菌落在10ml含有100μg/ml壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃振搖培養(yǎng)16小時(shí)。
對(duì)獲得的培養(yǎng)物離心，以便收集細(xì)胞。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由所述細(xì)胞中分離質(zhì)粒。
為證實(shí)所分離的質(zhì)粒含有目的DNA片段，用各種限制酶切割所述質(zhì)粒，以檢驗(yàn)其結(jié)構(gòu)，并對(duì)其核苷酸序列測(cè)序。
包含具有SEQ ID NO6的核苷酸序列的DNA、具有SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA、具有SEQ ID NO8的核苷酸序列的DNA和具有SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒稱為pADO-1。包含具有SEQ ID NO6的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒稱為pDXS-1。包含具有SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒稱為pISP-1。包含具有SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA的質(zhì)粒稱為pTFE-1。
混合以上的BamH I處理的DNA片段和BamH I處理的pUC118片段，然后用乙醇使所述混合物沉淀。將獲得的DNA沉淀溶解在5μl蒸餾水中，發(fā)生連接反應(yīng)，以獲得重組DNA。使用所述重組DNA，以如上所述的相同的方式轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后由該轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒。
為證實(shí)所分離的質(zhì)粒含有目的DNA片段，用各種限制酶切割所述質(zhì)粒，以檢驗(yàn)其結(jié)構(gòu)，并以如上所述的相同的方式對(duì)其核苷酸序列測(cè)序。
用BamH I消化這些質(zhì)粒。以如上所述的相同的方式回收目的DNA片段，然后將其亞克隆到表達(dá)載體pQE30(Qiagen.Inc)中。
由以上亞克隆獲得的并具有SEQ ID NO6的核苷酸序列的質(zhì)粒稱為pQEDXS-1。
(2)克隆互補(bǔ)甲基赤蘚糖醇需要型特性的基因①選擇大腸桿菌的甲基赤蘚糖醇需要型突變體將大腸桿菌W3110(ATCC14948)接種到LB液體培養(yǎng)基中，并將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
培養(yǎng)后，通過(guò)離心由獲得的培養(yǎng)物中回收細(xì)胞。
用0.05mol/l Tris-馬來(lái)酸鹽緩沖液(pH 6.0)洗滌所述細(xì)胞，然后將其在相同緩沖液中懸浮至細(xì)胞密度為109細(xì)胞/ml。
通過(guò)向所述懸浮液中加入NTG至終濃度為600mg/l誘導(dǎo)突變，然后將該混合物在室溫下保持20分鐘。
將這些NTG處理的細(xì)胞涂布在包含0.1％甲基赤蘚糖醇的M9基本瓊脂培養(yǎng)基(Molecular Cloning，第二版)平板上并培養(yǎng)。
按照在Tetrahedron Letters，38，35，6184(1997)中描述的方法化學(xué)合成甲基赤蘚糖醇。
將在包含0.1％甲基赤蘚糖醇的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落復(fù)制在M9基本瓊脂培養(yǎng)基和包含0.1％甲基赤蘚糖醇的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上。選擇需要甲基赤蘚糖醇生長(zhǎng)的目的突變體菌株。即選擇能夠在包含0.1％甲基赤蘚糖醇的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、但不能在沒(méi)有甲基赤蘚糖醇的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。
在以下的實(shí)驗(yàn)中使用由此獲得的甲基赤蘚糖醇需要型突變體ME7。
②克隆互補(bǔ)甲基赤蘚糖醇需要型特性的基因?qū)⒋竽c桿菌W3110(ATCC14948)接種到LB液體培養(yǎng)基中，然后將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后通過(guò)離心由產(chǎn)生的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由獲得的細(xì)胞中分離和純化染色體DNA。
用限制酶Sau3AI部分消化200μg染色體DNA。通過(guò)蔗糖密度梯度離心(26,000rpm，20℃，20小時(shí))分離產(chǎn)生的DNA片段。
將通過(guò)以上分離獲得的每個(gè)4至6kb的DNA片段連接至已經(jīng)用限制酶BamH I消化的pMW118載體(Nippon Gene)，構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。
使用此基因組DNA文庫(kù)，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化在以上①中分離的菌株ME7。
將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體涂布在補(bǔ)加100μg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
由每個(gè)在所述瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落中提取質(zhì)粒，然后測(cè)定核苷酸序列。
被測(cè)定核苷酸序列的質(zhì)粒含有SEQ ID NO10的核苷酸序列。這些質(zhì)粒稱為pMEW41和pMEW73。
由具有所述序列的克隆的一個(gè)菌株中提取的質(zhì)粒稱為pMEW73。
用Hind III和SacI雙重消化pMEW73。將產(chǎn)生的具有SEQ ID NO10的核苷酸序列的Hind III和SacI處理的DNA片段連接至廣泛宿主范圍的載體pEG400[J.Bac.，172，2392(1990)]的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pEGYM1。
將Hind III-SacI處理的DNA片段連接至載體pUC19(Gene，33，103(1985))的Hind III-SacI位點(diǎn)，構(gòu)建pUCYM1。
按照在基于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的大腸桿菌染色體DNA的核苷酸序列上的信息，證實(shí)已經(jīng)插入到所述載體中的DNA片段包含yaeM基因。
通過(guò)以下的使用PCR的方法[Science，230，1350(1985)]構(gòu)建可以有效表達(dá)yaeM基因的重組載體。
用DNA合成儀合成具有SEQ ID NO20的序列的有義引物和具有SEQ ID NO21的序列的反義引物。
將BamH I限制酶識(shí)別位點(diǎn)加入到每個(gè)所述有義和反義引物的5′末端。
使用作為模板的大腸桿菌染色體DNA、這些引物和Taq DNA聚合酶(Boelinnger)，用DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Instruments，Inc.日本)通過(guò)PCR擴(kuò)增yaeM基因。
進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，一個(gè)循環(huán)包括于94℃反應(yīng)30秒、于55℃反應(yīng)30秒并于72℃反應(yīng)2分鐘，接著于72℃反應(yīng)7分鐘。
在用限制酶BamH I消化擴(kuò)增的DNA片段和pUC118(TAKARASHUZO CO.，LTD.)后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化每種DNA片段。
混合這些片段，然后用乙醇使所述混合物沉淀。將獲得的DNA沉淀溶解在5μl蒸餾水中，發(fā)生連接反應(yīng)，從而獲得重組DNA。
通過(guò)測(cè)定核苷酸序列證實(shí)所述重組DNA是yaeM基因，然后將其亞克隆到表達(dá)載體pQE30(Qiagen，Inc)中。
產(chǎn)生的重組DNA稱為pQEYM1。
用pQEYM1通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化菌株ME7。將轉(zhuǎn)化體涂布在包含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
結(jié)果證實(shí)所述轉(zhuǎn)化體以與野生型菌株相同的生長(zhǎng)速率形成菌落，這表明yaeM基因互補(bǔ)在菌株ME7中的突變。
實(shí)施例2使用重組大腸桿菌生產(chǎn)泛醌-8(CoQ8)(1)分別用在以上實(shí)施例1中獲得的那些質(zhì)粒pADO-1、pDXS-1和pXSE-1以及作為對(duì)照的pEG400，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，然后獲得顯示抗100μg/ml濃度壯觀霉素的大腸桿菌DH5α/pADO-1、大腸桿菌DH5α/pDXS-1、大腸桿菌DH5α/pXSE-1和大腸桿菌DH5α/pEG400。
將這些轉(zhuǎn)化體接種到含有10ml LB培養(yǎng)基的試管中，所述LB培養(yǎng)基補(bǔ)充以每種100mg/l的維生素B1和維生素B6、50mg/l的對(duì)羥基苯甲酸和100mg/ml的壯觀霉素。然后將所述轉(zhuǎn)化體于30℃振搖培養(yǎng)72小時(shí)。
在培養(yǎng)完成后，將每種培養(yǎng)物濃縮10倍。
將300μl的2-丁醇和300μl的玻璃珠加入到每種300μl的濃縮培養(yǎng)物中。在用Multi Beads Shocker MB-200(YASUI KIKAI)破碎細(xì)胞5分鐘的同時(shí)，用所述溶劑提取類異戊二烯化合物。然后離心收集2-丁醇層。
通過(guò)使用高效液相層析(LC-10A，SHIMADZU CORP.)定量分析在丁醇層中的CoQ8，計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的CoQ8的量。
使用Develosil ODS-HG-5(NOMURA CHEMICAL K.K.)作為柱子，甲醇∶正己烷＝8∶2溶液作為流動(dòng)相，以1ml/分鐘的流速和275nm的檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)行HPLC。
表1顯示了結(jié)果。
表1大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的CoQ8產(chǎn)量

*1用10倍的CoQ8產(chǎn)量(mg/L)除以細(xì)胞量(OD660)獲得的值表示細(xì)胞內(nèi)含量。
在DH5α/pADO-1、DH5α/pDXS-1和DH5α/pXSE-1中產(chǎn)生的CoQ8的量明顯高于在對(duì)照菌株DH5α/pEG400中的產(chǎn)量。特別是，將在實(shí)施例1中獲得的所有DNA引入至其中的DH5α/pADO-1顯示產(chǎn)量最高。
(2)將在以上(1)中獲得的大腸桿菌DH5α/pDXS-1或大腸桿菌DH5α/pEG400接種到含有10ml M9培養(yǎng)基的試管中，然后于30℃振搖培養(yǎng)72小時(shí)。
在培養(yǎng)完成后，以如以上(1)中相同的方式計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的CoQ8的量。
表2顯示了結(jié)果。
表2大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的CoQ8產(chǎn)量

*1用10倍的CoQ8產(chǎn)量(mg/L)除以細(xì)胞量(OD660)獲得的值表示細(xì)胞內(nèi)含量。
在DH5α/pDXS-1中產(chǎn)生的CoQ8的量明顯高于在對(duì)照菌株DH5α/pEG400中的產(chǎn)量。
(3)使用重組大腸桿菌生產(chǎn)CoQ8將在實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pEGYM1或作為對(duì)照的pEG400引入到大腸桿菌DH5α中，獲得顯示抗100μg/ml濃度壯觀霉素的大腸桿菌DH5α/pEGYM1和大腸桿菌DH5α/pEG400。
將這些轉(zhuǎn)化體接種到含有10ml LB培養(yǎng)基的試管中，所述LB培養(yǎng)基補(bǔ)充以1％的葡萄糖、100mg/l的維生素B1、100mg/l的維生素B6、50mg/l的對(duì)羥基苯甲酸。然后將所述轉(zhuǎn)化體于30℃振搖培養(yǎng)72小時(shí)。
在培養(yǎng)完成后，以和以上(1)中相同的方式計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的CoQ8的量。
表3顯示了結(jié)果。
表3大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的CoQ8產(chǎn)量

*1用10倍的CoQ8產(chǎn)量(mg/L)除以細(xì)胞量(OD660)獲得的值表示細(xì)胞內(nèi)含量。
在DH5α/pEGYM1中產(chǎn)生的CoQ8的量明顯高于在對(duì)照菌株DH5α/pEG400中的產(chǎn)量。
實(shí)施例3由重組大腸桿菌生產(chǎn)甲基萘醌-8(MK-8)(1)將在實(shí)施例2(1)中獲得的大腸桿菌DH5α/pADO-1或大腸桿菌DH5α/pEG400接種到含有10ml補(bǔ)充以100μg/ml壯觀霉素的TB培養(yǎng)基的試管中，然后于30℃振搖培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)將12g細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco)、24g酵母提取物(Difco)和5g甘油溶解在900ml水中，接著加入100ml含有0.17mol/l KH2PO4和0.72mol/l KH2PO4的水溶液，制備所述TB培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)完成后，以和在實(shí)施例2(1)中的CoQ8定量方法相同的方法定量MK-8，然后計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的MK-8的量。
表4顯示了結(jié)果。
表4大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的MK-8產(chǎn)量

*1用10倍的CoQ8產(chǎn)量(mg/L)除以細(xì)胞量(OD660)獲得的值表示細(xì)胞內(nèi)含量。
在DH5α/pADO-1中產(chǎn)生的MK-8的量明顯高于在對(duì)照DH5α/pEG400中的產(chǎn)量。
(2)以和以上(1)中相同的方式培養(yǎng)在實(shí)施例2(1)中獲得的大腸桿菌DH5α/pDXS-1或大腸桿菌DH5α/pEG400，然后計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的MK-8的量。
表5顯示了結(jié)果。
表5大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的MK-8產(chǎn)量

*1用10倍的CoQ8產(chǎn)量(mg/L)除以細(xì)胞量(OD660)獲得的值表示細(xì)胞內(nèi)含量。
在DH5α/pDXS-1中產(chǎn)生的MK-8的量明顯高于在對(duì)照菌株DH5α/pEG400中的產(chǎn)量。
實(shí)施例4由重組胡蘿卜軟腐歐文氏菌生產(chǎn)CoQ8將在實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pDXS-1或作為對(duì)照的pEG400引入到胡蘿卜軟腐歐文氏菌IFO-3380中，從而獲得轉(zhuǎn)化體IFO-3380/pDXS-1和IFO-3380/pEG400，它們都抗100μg/ml濃度的壯觀霉素。
將這些轉(zhuǎn)化體接種到含有10ml補(bǔ)充以100μg/ml壯觀霉素的LB培養(yǎng)基的試管中，然后于30℃振搖培養(yǎng)72小時(shí)。
在培養(yǎng)完成后，以和實(shí)施例2(1)中相同的方式計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的CoQ8的量。
表6顯示了結(jié)果。
表6胡蘿卜軟腐歐文氏菌轉(zhuǎn)化體的CoQ8產(chǎn)量

*1用10倍的CoQ8產(chǎn)量(mg/L)除以細(xì)胞量(OD660)獲得的值表示細(xì)胞內(nèi)含量。
在IFO-3380/pDXS-1中產(chǎn)生的CoQ8的量明顯高于在對(duì)照菌株IFO-3380/pEG400中的產(chǎn)量。
實(shí)施例5由重組噬夏孢歐文氏菌生產(chǎn)泛醌和類胡蘿卜素通過(guò)電穿孔將在實(shí)施例1中獲得的質(zhì)粒pUCYM-1、pQEDXS-1、pQEYM-1或作為對(duì)照的pUC19和pQE30引入到噬夏孢歐文氏菌DSM-30080中，從而獲得顯示抗100μg/ml濃度氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體噬夏孢歐文氏菌DSM-30080/pUCYM-1、噬夏孢歐文氏菌DSM-30080/pQEDXS-1、噬夏孢歐文氏菌DSM-30080/pQEYM-1、噬夏孢歐文氏菌DSM-30080/pUC19和噬夏孢歐文氏菌DSM-30080/pQE30。
將這些轉(zhuǎn)化體接種到含有10ml LB培養(yǎng)基的試管中，所述LB培養(yǎng)基補(bǔ)充以100μg/l的氨芐青霉素、1％的葡萄糖、各100mg/l的維生素B1和維生素B6以及50mg/l的對(duì)羥基苯甲酸。然后將所述轉(zhuǎn)化體于30℃振搖培養(yǎng)72小時(shí)。
在培養(yǎng)完成后，以和實(shí)施例2(1)中相同的方式計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的CoQ8的量。
通過(guò)使用分光光度計(jì)檢測(cè)2-丁醇層于450nm的吸光度，以和實(shí)施例2(1)中相同的方式計(jì)算類胡蘿卜素色素的產(chǎn)量。
表7顯示了結(jié)果。
表7噬夏孢歐文氏菌轉(zhuǎn)化體的CoQ8和類胡蘿卜素產(chǎn)量

在DSM-30080/pUCYM-1中的CoQ8和類胡蘿卜素色素的產(chǎn)量都明顯高于在對(duì)照菌株DSM-30080/pUC19中的產(chǎn)量。
同樣地，在DSM-30080/pQEYM-1和DSM-30080/pQEDXS-1中的CoQ8和類胡蘿卜素色素的產(chǎn)量也都明顯高于在對(duì)照菌株DSM-30080/pQE30中的產(chǎn)量。
實(shí)施例6克隆編碼蛋白的DNA，該蛋白參與由光合作用細(xì)菌類球紅細(xì)菌類異戊二烯化合物的生物合成(1)克隆來(lái)自類球紅細(xì)菌的DXS基因使用在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的DXS核苷酸序列檢索Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中在其它物種中保守的DXS同源物。結(jié)果，在流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(P45205)、莢膜紅細(xì)菌(P26242)、枯草桿菌(P54523)、種名待定的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis sp.)PCC6803(P73067)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(007184)等中發(fā)現(xiàn)了DXS同源物。通過(guò)比較這些序列選擇高度保守的氨基酸序列?？紤]到在類球紅細(xì)菌中的密碼子選擇，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)于這種保守氨基酸序列的核苷酸序列。用DNA合成儀合成具有SEQ ID NO32和SEQID NO33的核苷酸序列的DNA片段，和具有SEQ ID NO34的核苷酸序列的DNA片段。
使用作為模板的類球紅細(xì)菌KY4113(FERM-P4675)的染色體DNA、上述引物和ExpandTM高保真性PCR系統(tǒng)(Boehringer ManheimK.K.)，用DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Instruments，Inc.日本)進(jìn)行PCR。
進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，一個(gè)循環(huán)包括在94℃反應(yīng)40秒、在60℃反應(yīng)40秒、在72℃反應(yīng)1分鐘；接著在72℃反應(yīng)1分鐘，從而獲得目的DNA片段。使用DIG DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer ManheimK.K.)對(duì)所述DNA片段進(jìn)行DIG標(biāo)記。
為獲得全長(zhǎng)類球紅細(xì)菌DXS基因，構(gòu)建菌株KY4113的基因組DNA文庫(kù)。在LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)菌株KY4113，提取染色體DNA。用限制酶Sau3 AI部分消化所述染色體DNA，然后通過(guò)蔗糖密度梯度離心純化4至6kb的DNA片段。使用Ligation Pack(Nippon Gene)連接所述DNA片段和BamH I消化的載體pUC19，并使用此連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化體涂布在包含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，從而獲得約10,000個(gè)菌落。對(duì)其檢測(cè)。通過(guò)測(cè)序，從每種DNA片段中發(fā)現(xiàn)具有與已知的其它物種的DXS基因高度序列同源性的ORF。SEQ ID NO26的氨基酸序列稱為DXS1，而SEQ ID NO27的氨基酸序列稱為DXS2。
(2)使用大腸桿菌DXS基因缺失的突變體證實(shí)互補(bǔ)性①選擇大腸桿菌DXS基因缺失菌株將大腸桿菌W3110(ATCC14948)接種到LB液體培養(yǎng)基中，并將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。培養(yǎng)后，通過(guò)離心由培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。
用0.05mol/l Tris-馬來(lái)酸鹽緩沖液(pH 6.0)洗滌所述細(xì)胞，并在相同緩沖液中懸浮至細(xì)胞密度為109細(xì)胞/ml。
向所述懸浮液中加入NTG至終濃度為600mg/l，然后將該混合物在室溫下保持20分鐘，以誘導(dǎo)突變。
將產(chǎn)生的NTG處理的細(xì)胞涂布在包含0.1％1-脫氧木酮糖的M9基本瓊脂培養(yǎng)基(Molecular Cloning，第二版)平板上，然后培養(yǎng)。已經(jīng)按照在J.C.S.Perkin Trans I，2131-2137(1982)中描述的方法化學(xué)合成了1-脫氧木酮糖。
將在包含0.1％1-脫氧木酮糖的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落復(fù)制在M9基本瓊脂培養(yǎng)基和包含0.1％1-脫氧木酮糖的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上。選擇需要1-脫氧木酮糖生長(zhǎng)的目的突變體菌株。即選擇能夠在包含1-脫氧木酮糖的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、但不能在沒(méi)有1-脫氧木酮糖的基本瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。
由此選擇和獲得的突變體稱為ME1。
當(dāng)將pDXS-1引入到菌株ME1中時(shí)，互補(bǔ)了ME1菌株的1-脫氧木酮糖缺陷。因此證實(shí)所述菌株ME1是DXS基因缺失的菌株。
(3)關(guān)于DXS1和DXS2的互補(bǔ)研究編碼SEQ ID NO27的DXS1的DNA片段或編碼SEQ ID NO29的DXS2的DNA片段均得自菌株KY4113，分別將它們連接至載體pUC19的lac啟動(dòng)子的下游，以構(gòu)建重組質(zhì)粒。
當(dāng)將構(gòu)建的質(zhì)粒引入到ME1中時(shí)，DXS1和DXS2每一個(gè)都互補(bǔ)菌株ME1中的1-脫氧木酮糖缺陷。
因此表明類球紅細(xì)菌具有兩個(gè)基因-DXS1和DXS2，他們具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的反應(yīng)的活性。
(4)克隆得自類球紅細(xì)菌的互補(bǔ)甲基赤蘚糖醇需要型特性的基因?qū)⒃趯?shí)施例1(2)①中獲得的大腸桿菌甲基赤蘚糖醇需要型突變體ME7接種至包含0.1％甲基赤蘚糖醇的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后離心收集細(xì)胞。
用包含10％甘油的1mol/l HEPES水溶液洗滌所述細(xì)胞，以便盡可能去除培養(yǎng)基成分。
由在實(shí)施例6(1)中構(gòu)建的類球紅細(xì)菌KY4113基因組文庫(kù)中提取質(zhì)粒。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)電穿孔將該質(zhì)粒引入到洗滌的細(xì)胞中。
接下來(lái)，將所述細(xì)胞涂布在包含100μg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
在挑出于所述培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落后，將所述菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后由培養(yǎng)的細(xì)胞中提取質(zhì)粒。
當(dāng)將提取的質(zhì)粒再次引入到菌株ME7中時(shí)，轉(zhuǎn)化體可以在沒(méi)有甲基赤蘚糖醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因此證實(shí)，所述質(zhì)粒包含得自類球紅細(xì)菌的互補(bǔ)甲基赤蘚糖醇需要型特性的DNA片段。
通過(guò)對(duì)所述DNA片段的核苷酸序列測(cè)序，發(fā)現(xiàn)編碼氨基酸序列的SEQ ID NO31的DNA序列與大腸桿菌yaeM具有高度同源性。
實(shí)施例7由重組光合作用細(xì)菌生產(chǎn)泛醌-10(CoQ10)將得自菌株KY4113的glnB啟動(dòng)子連接至都在實(shí)施例6中獲得的SEQ ID NO27的DNA片段DXS1和SEQID NO29的DNA片段DXS2的上游。然后將產(chǎn)物插入到廣泛宿主范圍的載體pEG400中，從而構(gòu)建質(zhì)粒。這些質(zhì)粒分別稱為pRSDX-1和pRSDX-2。另外，將yaeM和DXS1串聯(lián)連接，然后將產(chǎn)物連接至glnB啟動(dòng)子的下游，從而構(gòu)建質(zhì)粒。該質(zhì)粒稱為pRSYMDX1。分別通過(guò)電穿孔(Bio-RadLaboratories)將這些質(zhì)粒引入到類球紅細(xì)菌KY4113中。
然后將細(xì)胞涂布在包含100μg/ml濃度壯觀霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后于30℃培養(yǎng)3天。
接下來(lái)，將在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種到包含100μg/ml濃度壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。然后，通過(guò)離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞。
通過(guò)由所述細(xì)胞(Qiagen，Inc)中提取質(zhì)粒，證實(shí)每種菌株的細(xì)胞都包含引入的質(zhì)粒。因此獲得的轉(zhuǎn)化體稱為KY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2、KY4113/pRSYMDX1和KY4113/pEG400。
將一接種環(huán)的每種轉(zhuǎn)化體接種到包含5ml種子培養(yǎng)基(2％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.2)的試管中，然后于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。
將0.5ml獲得的培養(yǎng)物接種到包含5ml泛醌-10生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，然后于30℃振搖培養(yǎng)5天。
所述泛醌-10生產(chǎn)培養(yǎng)基包括4％赤糖糊、2.7％葡萄糖、4％玉米漿、0.8％硫酸銨、0.05％磷酸氫二鉀、0.05％磷酸二氫鉀、0.025％七水硫酸鎂、3mg/l七水硫酸亞鐵、8mg/l維生素B1、8mg/l煙酸和1ml/l痕量元素，預(yù)先調(diào)節(jié)至pH 9，補(bǔ)加1％碳酸鈣，然后高壓滅菌。
以和在實(shí)施例2(1)中定量CoQ8相同的方式計(jì)算由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的CoQ10的量。表8顯示了結(jié)果。
表8

在KY4113/pRSDX-1、KY4113/pRSDX-2和KY4113/pRSYMDX1中產(chǎn)生的CoQ10的量明顯高于在對(duì)照菌株KY4113/pEG400中的產(chǎn)量。
實(shí)施例8測(cè)定yaeM基因編碼的酶的活性(1)過(guò)量表達(dá)yaeM基因使用PCR[Science，230，1350(1985)]如下構(gòu)建可有效表達(dá)yaeM基因的重組質(zhì)粒。
使用DNA合成儀合成具有SEQ ID NO24的核苷酸序列的有義引物和具有SEQ ID NO25的核苷酸序列的反義引物。
將限制酶BamH I位點(diǎn)加入到每種所述有義和反義引物的5′-末端。
使用作為模板的大腸桿菌染色體DNA、這些引物、Taq DNA聚合酶(Boehringer)和DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer日本)，通過(guò)PCR擴(kuò)增yaeM基因。
進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，一個(gè)循環(huán)包括于94℃反應(yīng)30秒，于55℃反應(yīng)30秒，和于72℃反應(yīng)2分鐘，接著于72℃反應(yīng)7分鐘。
用限制酶BamH I消化擴(kuò)增的DNA片段和pUC118(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化每種DNA片段。
將兩種純化的DNA片段混合在一起，然后用乙醇處理使DNA沉淀。將產(chǎn)生的DNA沉淀溶解在5μl蒸餾水中，發(fā)生連接反應(yīng)，從而獲得重組DNA。
通過(guò)測(cè)定DNA序列證實(shí)所述重組DNA是yaeM基因。
由具有所述重組DNA的微生物中提取質(zhì)粒，用限制酶BamH I消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從而獲得包含BamH I處理的yaeM基因的DNA片段。
用限制酶BamH I消化pQE30(Qiagen，Inc)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從而獲得BamH I處理的pQE30片段。
將獲得的包含BamHI處理的yaeM基因的DNA片段與BamH I處理的pQE30片段混合，并用乙醇處理以使DNA沉淀。將產(chǎn)生的DNA沉淀溶解在5μl蒸餾水中，發(fā)生連接反應(yīng)，從而獲得重組DNA。
使用所述重組DNA通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。接著將所述轉(zhuǎn)化體涂布在包含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
以如上所述的相同的方式由大腸桿菌中分離質(zhì)粒。
同樣地，用各種限制酶切割所分離的質(zhì)粒以檢查結(jié)構(gòu)，然后測(cè)定核苷酸序列，從而證實(shí)所述質(zhì)粒包含目的DNA片段。該質(zhì)粒稱為pQEDXR。
(2)測(cè)定yaeM基因產(chǎn)物活性①純化yaeM基因產(chǎn)物通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將在(1)中構(gòu)建的pQEDXR引入到具有pREP4的大腸桿菌M15(Qiagen.Inc)中，獲得抗200μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的菌株M15/pREP4+pQEDXR。
于37℃在包含200μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株M15/pREP4+pQEDXR。當(dāng)于660nm的濁度達(dá)到0.8時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷至終濃度為0.2mol/l。隨后，于37℃培養(yǎng)所述菌株5小時(shí)，然后通過(guò)離心(3000rpm，10分鐘)去除培養(yǎng)物的上清液。在6ml 100mol/l的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中懸浮所述細(xì)胞，然后使用超聲振蕩器(SONIFIER，BRANSON)破碎，同時(shí)用冰冷卻。獲得的細(xì)胞破碎溶液于4℃、10,000rpm離心20分鐘，從而收集上清液。將由細(xì)胞提取物中離心的上清液上Ni-NTA樹(shù)脂柱(Qiagen.Inc)，然后用20ml洗滌緩沖液(100mol/l Tris-HCl(pH8.0)、50mol/l咪唑、0.5％Tween 20)洗滌。接著將10ml洗脫緩沖液(100mol/l Tris-HCl(pH 8.0)、200mol/l咪唑)上所述柱，然后將流出液分部收集成每份1ml。
使用定量蛋白量的試劑盒(Bio-Rad Laboratories)檢測(cè)每一流分的蛋白量，由此獲得包含作為純蛋白組分蛋白的流分。
②制備底物1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸如下制備反應(yīng)底物1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。通過(guò)使用HPLC[柱Senshu pak NH2-1251-N(4.6×250mm，Senshu)，流動(dòng)相100mol/lKH2PO4(pH 3.5]測(cè)定于195nm的吸光度，檢測(cè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。
以如上所述的相同的方式，將允許過(guò)量表達(dá)大腸桿菌dxs基因的質(zhì)粒pQDXS-1引入到大腸桿菌M15/pREP4中，獲得菌株M15/pREP4+pQDXS-1。
以如在實(shí)施例8(2)①中相同的方式培養(yǎng)該菌株，然后使用Ni-NTA樹(shù)脂柱純化dxs蛋白。
將純化的dxs蛋白加入到20ml反應(yīng)溶液[100mol/l Tris-HCl(pH7.5)、10mol/l丙酮酸鈉、30mol/l DL-甘油醛-3-磷酸、1.5mol/l硫胺素丙酮酸、10mol/l MgCl2、1mol/l DL-二硫蘇糖醇]中，然后保持在37℃
反應(yīng)12小時(shí)后，用水將反應(yīng)溶液稀釋至300ml，上活性炭柱(2.2×8厘米)繼之以Dowex 1-X8(C1型，3.5×25厘米)，然后用1％鹽水溶液洗脫。在濃縮洗脫的流分后，將所述流分上Sephadex G-10(1.8×100厘米)，然后用水洗脫。最后冷凍干燥包含1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的流分，從而獲得約50mg白色粉末。
通過(guò)NMR分析(A-500，JEOL Ltd.)證實(shí)該粉末是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。
③測(cè)定yaeM基因產(chǎn)物的酶活性將如上所述合成的0.3mol/l的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(終濃度)加入到1ml反應(yīng)溶液中，所述反應(yīng)溶液包含100mol/l Tris-HCl(pH7.5)、1mol/l MmCl2、0.3mol/l NADPH和在實(shí)施例8(2)①中獲得的yaeM基因產(chǎn)物，然后于37℃溫育。通過(guò)使用分光光度計(jì)(UV-160，SHIMADZU CORP.)讀取于340nm的吸光度，監(jiān)測(cè)在溫育過(guò)程中NADPH的增加和減少，結(jié)果表明NADPH隨時(shí)間減少。
為證實(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，同樣進(jìn)行該反應(yīng)，只是規(guī)模較大，然后分離產(chǎn)物。將200ml反應(yīng)溶液于37℃溫育30分鐘，該反應(yīng)溶液除1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸濃度為0.15mol/l以外，具有與如上所述的反應(yīng)溶液相同的組成。然后將反應(yīng)溶液的全部量加入到活性炭柱上，用水稀釋至1L，然后加入到Dowex 1-X8柱(C1型，3.5×20厘米)。
用400ml的1％鹽水溶液洗脫該溶液，將其加入到Sephadex G-10(1.8×100厘米)，然后用水洗脫。冷凍干燥洗脫的流分，從而分離反應(yīng)產(chǎn)物。
根據(jù)HR-FABMS分析推測(cè)分離的反應(yīng)產(chǎn)物的分子式為C5H12O7P[m/z 215.0276(M-H)-，Δ-4.5mmu]。1H和13C的NMR分析獲得以下的化學(xué)位移。
1H NMR(D20，500MHz)δ4.03(ddd，J＝11.5，6.5，2.5Hz，1H)，3.84(ddd，J＝11.5，8.0，6.5Hz，1H)，3.78(dd，J＝80，2.5Hz，1H)，3.60(d，J＝12.0Hz，1H)，3.50(d，J＝12.0Hz，1H)，1.15(s，3H)；13C NMR(D20，125MHz)δ75.1(C-2).74.8(C-3)，674(C-1)，65.9(C-4)，19.4(2-Me)。
用堿性磷酸酶(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)處理反應(yīng)產(chǎn)物獲得的化合物和用在Tetrahedron Letter，38，6184(1997)中描述的方法合成的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的1H和13C NMR分析得到的化學(xué)位移完全一致。
而且，前一化合物的旋光角為[α]D21＝+6.0(c＝0.050，H2O)，與在Tetrahedron Letter，38，6184(1997)中報(bào)導(dǎo)的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的旋光角[α]D25＝+7.0(c＝0.13，H2O)相同。
這些結(jié)果揭示，yaeM基因產(chǎn)物的反應(yīng)產(chǎn)物是2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸。即發(fā)現(xiàn)yaeM基因產(chǎn)物具有由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸的活性，同時(shí)消耗NADPH?；诖舜呋钚?，將該酶命名為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶。
④特征鑒定1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶使用如在實(shí)施例8(2)③中描述的1ml反應(yīng)系統(tǒng)，檢測(cè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的酶學(xué)特征。此處的1單位定義為每分鐘氧化1mmol NADPH的活性。
當(dāng)用NADH代替NADPH時(shí)，活性降低至1/100以下。
當(dāng)使用1-脫氧-D-木酮糖代替1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸時(shí)，沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)。
SDS-PAGE分析顯示，該酶由42kDa的多肽組成。
表9顯示了加入金屬對(duì)所述反應(yīng)系統(tǒng)的影響。
表9各種金屬離子對(duì)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性的影響

加入這些金屬離子和EDTA，以使每種的濃度為1mol/l。 N.D.表示檢測(cè)不到活性。
在MgCl2存在的情況下，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸和NADP的Km分別為249μmol/l和7.4μmol/l圖1顯示了反應(yīng)溫度的影響，而圖2顯示了反應(yīng)pH的影響。
實(shí)施例9構(gòu)建和特征鑒定yaeM缺失突變體(1)構(gòu)建yaeM被破壞的失突變體為測(cè)試1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是否必要，如下所述構(gòu)建1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶缺失突變體。
如下所述產(chǎn)生用于插入到y(tǒng)aeM基因中的卡那霉素抗性基因盒。
用限制酶BalI消化在實(shí)施例1(2)②中獲得的質(zhì)粒pMEW41，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從而獲得BalI處理的DNA片段。
用限制酶Hind III和SamI消化Tn5，然后使用DNA平端化試劑盒(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)對(duì)兩端平端化。
產(chǎn)生的平端DNA片段與先前獲得的BalI處理的pMEW41DNA片段混合，然后用乙醇處理該混合物。接下來(lái)將獲得的DNA沉淀溶解在5μl蒸餾水中，發(fā)生連接反應(yīng)，從而獲得重組DNA。
使用此重組DNA按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(購(gòu)自TAKARA SHUZO CO.，LTD.)。接著將該轉(zhuǎn)化體涂布在包含100μg/ml氨芐青霉素和15μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
將幾個(gè)在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體菌落在10ml包含100μg/ml氨芐青霉素和15μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃振搖培養(yǎng)16小時(shí)。
對(duì)產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心，以收集細(xì)胞。
按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由所述細(xì)胞中分離質(zhì)粒。
用各種限制酶切割如上所述分離的質(zhì)粒，以檢測(cè)其結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)該質(zhì)粒包含目的DNA片段，將其命名為pMEW41Km。
通過(guò)用pMEW41Km進(jìn)行同源重組，破壞大腸桿菌染色體DNA上的yaeM基因。圖3顯示該重組的示意圖。
用限制酶Hind III和SacI消化pMEW41Km，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，由此純化線性片段。使用所述片段按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌FS1576。所述菌株FS1576以菌株ME9019由國(guó)立遺傳研究所(National Institute of Genetics)獲得。將所述轉(zhuǎn)化體涂布在包含15μg/ml卡那霉素和1g/l 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
將幾個(gè)在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的卡那霉素抗性菌落在10ml包含15μg/ml卡那霉素和1g/l 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的LB液體培養(yǎng)基中于37℃振搖培養(yǎng)16小時(shí)。
對(duì)產(chǎn)生的培養(yǎng)物離心，以收集細(xì)胞。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)由所述細(xì)胞中分離染色體DNA。
用限制酶SmaI或PstI消化所述染色體DNA。以同樣的方式用限制酶消化菌株FS1576的染色體DNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)這些用限制酶消化的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用卡那霉素抗性基因和yaeM基因作為探針進(jìn)行DNA雜交分析。因此證實(shí)，卡那霉素抗性菌落的染色體DNA具有在圖3中顯示的結(jié)構(gòu)，即所述卡那霉素抗性基因破壞yaeM基因。
(2)特征鑒定yaeM被破壞的突變體將如上所述產(chǎn)生的yaeM被破壞的菌株和其親代菌株FS1576涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基和包含1g/l 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后于37℃培養(yǎng)。表10顯示了在培養(yǎng)2天后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
表10yaeM基因缺失對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

*1細(xì)胞生長(zhǎng)(+表示良好生長(zhǎng)；-表示無(wú)生長(zhǎng))*2ME表示加入1g/l的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇。
在沒(méi)有2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的培養(yǎng)基上yaeM缺失突變體不生長(zhǎng)。因此表明此基因在沒(méi)有2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的情況下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是必不可少的。
實(shí)施例10 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶抑制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
基于膦胺霉素能夠抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的假設(shè)進(jìn)行以下的實(shí)施例，因?yàn)樽鳛?-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶反應(yīng)產(chǎn)物的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸或預(yù)期在此酶反應(yīng)中產(chǎn)生的反應(yīng)中間體在結(jié)構(gòu)上與膦胺霉素類似。
在膦胺霉素存在下，為了檢測(cè)對(duì)酶活性的影響，通過(guò)如在實(shí)施例8中描述的方法檢測(cè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶活性。
已經(jīng)按照在Chem.Pharm.Bull.，30，111-118(1982)中描述的方法合成膦胺霉素。
反應(yīng)溶液的總體積由在實(shí)施例8(2)中描述的反應(yīng)溶液的體積減少至0.2ml，但每種濃度都保持在和實(shí)施例8③的系統(tǒng)相同的水平上。向所述反應(yīng)溶液中加入各種濃度的膦胺霉素，然后于37℃進(jìn)行反應(yīng)。使用Bench標(biāo)記微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(Bio-Rad Laboratories)檢測(cè)NADPH的增加和減少。
如圖4所示，膦胺霉素顯示抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶。
在LB瓊脂培養(yǎng)基、包含3.13mg/l膦胺霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基以及包含3.13mg/l膦胺霉素和0.25mg/l 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的LB瓊脂培養(yǎng)基上涂布大腸桿菌W3110，然后于37℃培養(yǎng)。
培養(yǎng)后兩天，該微生物能夠在兩種類型的培養(yǎng)基，即LB瓊脂培養(yǎng)基和包含膦胺霉素和0.25mg/l 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但其不能在僅補(bǔ)充以膦胺霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
這些結(jié)果清楚顯示，膦胺霉素通過(guò)抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，抑制yaeM基因產(chǎn)物(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶)活性的物質(zhì)可以是有效的抗生劑或除草劑。
本文提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
工業(yè)適用性本發(fā)明可以提供一種生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，該方法包括將包含一個(gè)或多個(gè)參與類異戊二烯化合物(可用于針對(duì)心臟病、骨質(zhì)疏松癥、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、預(yù)防癌癥和免疫強(qiáng)化的藥物、健康食品和抗依附物的防污漆產(chǎn)品)生物合成的DNA的DNA整合到載體中，將產(chǎn)生的重組DNA引入到得自原核生物的宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體，使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積類異戊二烯化合物，并從所述培養(yǎng)物中回收所述類異戊二烯化合物；一種生產(chǎn)具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的方法，該方法包括將包含一個(gè)或多個(gè)編碼所述蛋白的DNA的DNA整合到載體中，將產(chǎn)生的重組DNA引入到宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體，使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積所述蛋白，并從該培養(yǎng)物中回收所述蛋白；所述蛋白；和新的具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的酶蛋白；以及篩選具有抗生和/或除草活性的化合物的方法，該方法包括篩選抑制所述酶的物質(zhì)。
序列表的獨(dú)立文本SEQ ID NO12合成DNASEQ ID NO13合成DNASEQ ID NO14合成DNASEQ ID NO15合成DNASEQ ID NO16合成DNASEQ ID NO17合成DNASEQ ID NO18合成DNASEQ ID NO19合成DNASEQ ID NO20合成DNASEQ ID NO21合成DNASEQ ID NO22合成DNASEQ ID NO23合成DNA
SEQ ID NO24合成DNASEQ ID NO25合成DNASEQ ID NO32合成DNASEQ ID NO33合成DNASEQ ID NO34合成DNA
序列表<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.
<120>微生物生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法和篩選具有抗菌或除草活性的化合物的方法<130>
<140>PCT/JP99/01987<141>1999-04-14<150>JP98/103101<151>1998-04-14<150>JP98/221910<151>1998-08-05<150>JP99/035739<151>1999-02-15<160>34<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>620<212>PRT<213>大腸桿菌<400>1Met Ser Phe Asp Ile Ala Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser1 5 10 15Thr Gln Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys20 25 30Asp Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly35 40 45His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His50 55 60Tyr Val Tyr Asn Thr Pro Phe A sp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His65 70 75 80Gln Ala Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly85 90 95
Thr Ile Arg Gln Lys Gly Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu100 105 110Ser Glu Tyr Asp Val Leu Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser115 120 125Ala Gly Ile Gly Ile Ala Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg130 135 140Arg Thr Val Cys Val Ile Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala145 150 155 160Phe Glu Ala Met Asn His Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val165 170 175Ile Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu180 185 190Asn Asn His Leu Ala Gln Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu195 200 205Arg Glu Gly Gly Lys Lys Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu210 215 220Leu Leu Lys Arg Thr Glu Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly225 230 235 240Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Asn Tyr Ile Gly Pro Val Asp Gly245 250 255His Asp Val Leu Gly Leu Ile Thr Thr Leu Lys Asn Met Arg Asp Leu260 265 270Lys Gly Pro Gln Phe Leu His Ile Met Thr Lys Lys Gly Arg Gly Tyr275 280 285Glu Pro Ala Glu Lys Asp Pro Ile Thr Phe His Ala Val Pro Lys Phe290 295 300Asp Pro Ser Ser Gly Cys Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser305 310 315 320Tyr Ser Lys Ile Phe Gly Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp325 330 335Asn Lys Leu Met Ala Ile Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met340 345 350
Val Glu Phe Ser Arg Lys Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala Ile355 360 365Ala Glu Gln His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Ile Gly Gly370 375 380Tyr Lys Pro Ile Val Ala Ile Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr385 390 395 400Asp Gln Val Leu His Asp Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe405 410 415Ala Ile Asp Arg Ala Gly Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln420 425 430Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile435 440 445Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly450 455 460Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn465 470 475 480Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys485 490 495Gly Ile Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly500 505 510Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr515 520 525Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu530 535 540Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala545 550 555 560Ile Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His565 570 575Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn Ile Gly Leu Pro Asp Phe Phe Ile580 585 590Pro Gln Gly Thr Gln Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala595 600 605Ala Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ala Trp Leu Ala
610 615 620<210>2<211>299<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln1 5 10 15Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val20 25 30Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg35 40 45Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn50 55 60Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser65 70 75 80Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg85 90 95Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu100 105 110Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala115 120 125Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu130 135 140Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu145 150 155 160Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg165 170 175Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu180 185 190Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu195 200 205Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp
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Leu Val Ala Gly Lys Asn Val Thr Arg Met Val Glu Gln Cys Leu Glu35 40 45ttc tct ccc cgc tat gcc gta atg gac gat gaa gcg agt gcg aaa ctt 192Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Val Met Asp Asp Glu Ala Ser Ala Lys Leu50 55 60ctt aaa acg atg cta cag caa cag ggt agc cgc acc gaa gtc tta agt 240Leu Lys Thr Met Leu Gln Gln Gln Gly Ser Arg Thr Glu Val Leu Ser65 70 75 80ggg caa caa gcc gct tgc gat atg gca gcg ctt gag gat gtt gat cag 288Gly Gln Gln Ala Ala Cys Asp Met Ala Ala Leu Glu Asp Val Asp Gln85 90 95gtg atg gca gcc att gtt ggc gct gct ggg ctg tta cct acg ctt gct 336Val Met Ala Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Leu Pro Thr Leu Ala100 105 110gcg atc cgc gcg ggt aaa acc att ttg ctg gcc aat aaa gaa tca ctg 384Ala Ile Arg Ala Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu115 120 125gtt acc tgc gga cgt ctg ttt atg gac gcc gta aag cag agc aaa gcg 432Val Thr Cys Gly Arg Leu Phe Met Asp Ala Val Lys Gln Ser Lys Ala130 135 140caa ttg tta ccg gtc gat agc gaa cat aac gcc att ttt cag agt tta 480Gln Leu Leu Pro Val Asp Ser Glu His Asn Ala Ile Phe Gln Ser Leu145 150 155 160ccg caa cct atc cag cat aat ctg gga tac gct gac ctt gag caa aat 528Pro Gln Pro Ile Gln His Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Leu Glu Gln Asn165 170 175ggc gtg gtg tcc att tta ctt acc ggg tct ggt ggc cct ttc cgt gag 576Gly Val Val Ser Ile Leu Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Phe Arg Glu180 185 190acg cca ttg cgc gat ttg gca aca atg acg ccg gat caa gcc tgc cgt 624
Thr Pro Leu Arg Asp Leu Ala Thr Met Thr Pro Asp Gln Ala Cys Arg195 200 205cat ccg aac tgg tcg atg ggg cgt aaa att tct gtc gat tcg gct acc 672His Pro Asn Trp Ser Met Gly Arg Lys Ile Ser Val Asp Ser Ala Thr210 215 220atg atg aac aaa ggt ctg gaa tac att gaa gcg cgt tgg ctg ttt aac 720Met Met Asn Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Ala Arg Trp Leu Phe Asn225 230 235 240gcc agc gcc agc cag atg gaa gtg ctg att cac ccg cag tca gtg att 768Ala Ser Ala Ser Gln Met Glu Val Leu Ile His Pro Gln Ser Val IIe245 250 255cac tca atg gtg cgc tat cag gac ggc agt gtt ctg gcg cag ctg ggg 816His Ser Met Val Arg Tyr Gln Asp Gly Ser Val Leu Ala Gln Leu Gly260 265 270gaa ccg gat atg gta cgc caa ttg ccc aca cca tgg gca tgg ccg aat 864Glu Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Pro Thr Pro Trp Ala Trp Pro Asn275 280 285cgc gtg aac tct ggc gtg aag ccg ctc gat ttt tgc aaa cta agt gcg 912Arg Val Asn Ser Gly Val Lys Pro Leu Asp Phe Cys Lys Leu Ser Ala290 295 300ttg aca ttt gcc gca ccg gat tat gat cgt tat cca tgc ctg aaa ctg 960Leu Thr Phe Ala Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Tyr Pro Cys Leu Lys Leu305 310 315 320gcg atg gag gcg ttc gaa caa ggc cag gca gcg acg aca gca ttg aat 1008Ala Met Glu Ala Phe Glu Gln Gly Gln Ala Ala Thr Thr Ala Leu Asn325 330 335gcc gca aac gaa atc acc gtt gct gct ttt ctt gcg caa caa atc cgc 1056Ala Ala Asn Glu Ile Thr Val Ala Ala Phe Leu Ala Gln Gln Ile Arg340 345 350ttt acg gat atc gct gcg ttg aat tta tcc gta ctg gaa aaa atg gat 1104
Phe Thr Asp Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ser Val Leu Glu Lys Met Asp355 360 365atg cgc gaa cca caa tgt gtg gac gat gtg tta tct gtt gat gcg aac 1152Met Arg Glu Pro Gln Cys Val Asp Asp Val Leu Ser Val Asp Ala Asn370 375 380gcg cgt gaa gtc gcc aga aaa gag gtg atg cgt ctc gca agc 1194Ala Arg Glu Val Ala Arg Lys Glu Val Met Arg Leu Ala Ser385 390 395<210>11<211>4390<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
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1 5agc ttt gaa aag gcg ctg agc gag ctg gaa cag att gta acc cgt ctg 282Ser Phe Glu Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gln Ile Val Thr Arg Leu10 15 20 25gaa agt ggc gac ctg ccg ctg gaa gag gcg ctg aac gag ttc gaa cgc 330Glu Ser Gly Asp Leu Pro Leu Glu Glu Ala Leu Asn Glu Phe Glu Arg30 35 40ggc gtg cag ctg gca cgt cag ggg cag gcc aaa tta caa caa gcc gaa 378Gly Val Gln Leu Ala Arg Gln Gly Gln Ala Lys Leu Gln Gln Ala Glu45 50 55cag cgc gta caa att ctg ctg tct gac aat gaa gac gcc tct cta acc 426Gln Arg Val Gln Ile Leu Leu Ser Asp Asn Glu Asp Ala Ser Leu Thr60 65 70cct ttt aca ccg gac aat gag ta atg gac ttt ccg cag caa ctc gaa473Pro Phe Thr Pro Asp Asn GluMet Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu75 80 1 5gcc tgc gtt aag cag gcc aac cag gcg ctg agc cgt ttt atc gcc cca 521Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro10 15 20ctg ccc ttt cag aac act ccc gtg gtc gaa acc atg cag tat ggc gca 569Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala25 30 35 40tta tta ggt ggt aag cgc ctg cga cct ttc ctg gtt tat gcc acc ggt 617Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly45 50 55cat atg ttc ggc gtt agc aca aac acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc 665His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala60 65 70gtt gag tgt atc cac gct tac tca tta att cat gat gat tta ccg gca713
Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala75 80 85atg gat gat gac gat ctg cgt cgc ggt ttg cca acc tgc cat gtg aag 761Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg Gly Leu Pro Thr Cys His Val Lys90 95 100ttt ggc gaa gca aac gcg att ctc gct ggc gac gct tta caa acg ctg 809Phe Gly Glu Ala Asn Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Gln Thr Leu105 110 115 120gcg ttc tcg att tta agc gat gcc gat atg ccg gaa gtg tcg gac cgc 857Ala Phe Ser Ile Leu Ser Asp Ala Asp Met Pro Glu Val Ser Asp Arg125 130 135gac aga att tcg atg att tct gaa ctg gcg agc gcc agt ggt att gcc 905Asp Arg Ile Ser Met Ile Ser Glu Leu Ala Ser Ala Ser Gly Ile Ala140 145 150gga atg tgc ggt ggt cag gca tta gat tta gac gcg gaa ggc aaa cac 953Gly Met Cys Gly Gly Gln Ala Leu Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His155 160 165gta cct ctg gac gcg ctt gag cgt att cat cgt cat aaa acc ggc gca 1001Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala170 175 180ttg att cgc gcc gcc gtt cgc ctt ggt gca tta agc gcc gga gat aaa 1049Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys185 190 195 200gga cgt cgt gct ctg ccg gta ctc gac aag tat gca gag agc atc ggc 1097Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly205 210 215ctt gcc ttc cag gtt cag gat gac atc ctg gat gtg gtg gga gat act 1145Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr220 225 230gca acg ttg gga aaa cgc cag ggt gcc gac cag caa ctt ggt aaa agt 1193
Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser235 240 245acc tac cct gca ctt ctg ggt ctt gag caa gcc cgg aag aaa gcc cgg 1241Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg250 255 260gat ctg atc gac gat gcc cgt cag tcg ctg aaa caa ctg gct gaa cag 1289Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln265 270 275 280tca ctc gat acc tcg gca ctg gaa gcg cta gcg gac tac atc atc cag 1337Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln285 290 295cgt aat aaa taaacaataa gtattaatag gcccctg atg agt ttt gat att gcc 1391Arg Asn LysMet Ser Phe Asp Ile Ala1 5aaa tac ccg acc ctg gca ctg gtc gac tcc acc cag gag tta cga ctg 1439Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser Thr Gln Glu Leu Arg Leu10 15 20ttg ccg aaa gag agt tta ccg aaa ctc tgc gac gaa ctg cgc cgc tat 1487Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys Asp Glu Leu Arg Arg Tyr25 30 35tta ctc gac agc gtg agc cgt tcc agc ggg cacttc gcc tcc ggg ctg1535Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly His Phe Ala Ser Gly Leu40 45 50ggc acg gtc gaa ctg acc gtg gcg ctg cac tat gtc tac aac acc ccg 1583Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val Tyr Asn Thr Pro55 60 65 70ttt gac caa ttg att tgg gat gtg ggg cat cag gct tat ccg cat aaa 1631Phe Asp Gln Leu Ile Trp Asp Val Gly His Gln Ala Tyr Pro His Lys75 80 85
att ttg acc gga cgc cgc gac aaa atc ggc acc atc cgt cag aaa ggc 1679Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys Ile Gly Thr Ile Arg Gln Lys Gly90 95 100ggt ctg cac ccg ttc ccg tgg cgc ggc gaa agc gaa tat gac gta tta 1727Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu Ser Glu Tyr Asp Val Leu105 110 115agc gtc ggg cat tca tca acc tcc atc agt gcc gga att ggt att gcg 1775Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala Gly Ile Gly Ile Ala120 125 130gtt gct gcc gaa aaa gaa ggc aaa aat cgc cgc acc gtc tgt gtc att 1823Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg Arg Thr Val Cys Val Ile135 140 145 150ggc gat ggc gcg att acc gca ggc atg gcg ttt gaa gcg atg aat cac 1871Gly Asp Gly Ala Ile Thr Ala Gly Met Ala Phe Glu Ala Met Asn His155 160 165gcg ggc gat atc cgt cct gat atg ctg gtg att ctc aac gac aat gaa 1919Ala Gly Asp Ile Arg Pro Asp Met Leu Val Ile Leu Asn Asp Asn Glu170 175 180atg tcg att tcc gaa aat gtc ggc gcg ctc aac aac cat ctg gca cag 1967Met Ser Ile Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu Asn Asn His Leu Ala Gln185 190 195ctg ctt tcc ggt aag ctt tac tct tca ctg cgc gaa ggc ggg aaa aaa 2015Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu Arg Glu Gly Gly Lys Lys200 205 210gtt ttc tct ggc gtg ccg cca att aaa gag ctg ctc aaa cgc acc gaa 2063Val Phe Ser Gly Val Pro Pro Ile Lys Glu Leu Leu Lys Arg Thr Glu215 220 225 230gaa cat att aaa ggc atg gta gtg cct ggc acg ttg ttt gaa gag ctg 2111Glu His Ile Lys Gly Met Val Val Pro Gly Thr Leu Phe Glu Glu Leu235 240 245
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395 400 405gtg gcg att caa aag ctt ccg gtc ctg ttc gcc atc gac cgc gcg ggc 2639Val Ala Ile Gln Lys Leu Pro Val Leu Phe Ala Ile Asp Arg Ala Gly410 415 420att gtt ggt gct gac ggt caa acc cat cag ggt gct ttt gat ctc tct 2687Ile Val Gly Ala Asp Gly Gln Thr His Gln Gly Ala Phe Asp Leu Ser425 430 435tac ctg cgc tgc ata ccg gaa atg gtc att atg acc ccg agc gat gaa 2735Tyr Leu Arg Cys Ile Pro Glu Met Val Ile Met Thr Pro Ser Asp Glu440 445 450aac gaa tgt cgc cag atg ctc tat acc ggc tat cac tat aac gat ggc 2783Asn Glu Cys Arg Gln Met Leu Tyr Thr Gly Tyr His Tyr Asn Asp Gly455 460 465 470ccg tca gcg gtg cgc tac ccg cgt ggc aac gcg gtc ggc gtg gaa ctg 2831Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Ala Val Gly Val Glu Leu475 480 485acg ccg ctg gaa aaa cta cca att ggc aaa ggc att gtg aag cgt cgt 2879Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro Ile Gly Lys Gly Ile Val Lys Arg Arg490 495 500ggc gag aaa ctg gcg atc ctt aac ttt ggt acg ctg atg cca gaa gcg 2927Gly Glu Lys Leu Ala Ile Leu Asn Phe Gly Thr Leu Met Pro Glu Ala505 510 515gcg aaa gtc gcc gaa tcg ctg aac gcc acg ctg gtc gat atg cgt ttt 2975Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr Leu Val Asp Met Arg Phe520 525 530gtg aaa ccg ctt gat gaa gcg tta att ctg gaa atg gcc gcc agc cat 3023Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu Ile Leu Glu Met Ala Ala Ser His535 540 545 550gaa gcg ctg gtc acc gta gaa gaa aac gcc att atg ggc ggc gca ggc 3071
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60 65 70 75ata aat ttc ttt gat acc gcc aac agt tat tct gac ggc agc agc gaa 3616Ile Asn Phe Phe Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Glu80 85 90gag atc gtc ggt cgc gca ctg cgg gat ttc gcc cgt cgt gaa gac gtg 3664Glu Ile Val Gly Arg Ala Leu Arg Asp Phe Ala Arg Arg Glu Asp Val95 100 105gtc gtt gcg acc aaa gtg ttc cat cgc gtt ggt gat tta ccg gaa gga 3712Val Val Ala Thr Lys Val Phe His Arg Val Gly Asp Leu Pro Glu Gly110 115 120tta tcc cgt gcg caa att ttg cgc tct atc gac gac agc ctg cga cgt 3760Leu Ser Arg Ala Gln Ile Leu Arg Ser Ile Asp Asp Ser Leu Arg Arg125 130 135ctc ggc atg gat tat gtc gat atc ctg caa att cat cgc tgg gat tac 3808Leu Gly Met Asp Tyr Val Asp Ile Leu Gln Ile His Arg Trp Asp Tyr140 145 150 155aac acg ccg atc gaa gag acg ctg gaa gcc ctc aac gac gtg gta aaa 3856Asn Thr Pro Ile Glu Glu Thr Leu Glu Ala Leu Asn Asp Val Val Lys160 165 170gcc ggg aaa gcg cgt tat atc ggc gcg tca tca atg cac gct tcg cag 3904Ala Gly Lys Ala Arg Tyr Ile Gly Ala Ser Ser Met His Ala Ser Gln175 180 185ttt gct cag gca ctg gaa ctc caa aaa cag cac ggc tgg gcg cag ttt 3952Phe Ala Gln Ala Leu Glu Leu Gln Lys Gln His Gly Trp Ala Gln Phe190 195 200gtc agt atg cag gat cac tac aat ctg att tat cgt gaa gaa gag cgc 4000Val Ser Met Gln Asp His Tyr Asn Leu Ile Tyr Arg Glu Glu Glu Arg205 210 215gag atg cta cca ctg tgt tat cag gag ggc gtg gcg gta att cca tgg 4048Glu Met Leu Pro Leu Cys Tyr Gln Glu Gly Val Ala Val Ile Pro Trp
220 225 230 235agc ccg ctg gca agg ggc cgt ctg acg cgt ccg tgg gga gaa act acc 4096Ser Pro Leu Ala Arg Gly Arg Leu Thr Arg Pro Trp Gly Glu Thr Thr240 245 250gca cga ctg gtg tct gat gag gtg ggg aaa aat ctc tat aaa gaa agc 4144Ala Arg Leu Val Ser Asp Glu Val Gly Lys Asn Leu Tyr Lys Glu Ser255 260 265gat gaa aat gac gcg cag atc gca gag cgg tta aca ggc gtc agt gaa 4192Asp Glu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Glu Arg Leu Thr Gly Val Ser Glu270 275 280gaa ctg ggg gcg aca cga gca caa gtt gcg ctg gcc tgg ttg ttg agt 4240Glu Leu Gly Ala Thr Arg Ala Gln Val Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ser285 290 295aaa ccg ggc att gcc gca ccg att atc gga act tcg cgc gaa gaa cag 4288Lys Pro Gly Ile Ala Ala Pro Ile Ile Gly Thr Ser Arg Glu Glu Gln300 305 310 315ctt gat gag cta ttg aac gcg gtg gat atc act ttg aag ccg gaa cag 4336Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala Val Asp Ile Thr Leu Lys Pro Glu Gln320 325 330att gcc gaa ctg gaa acg ccg tat aaa ccg cat cct gtc gta gga ttt 4384Ile Ala Glu Leu Glu Thr Pro Tyr Lys Pro His Pro Val Val Gly Phe335 340 345aaa taa 4390Lys<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA
<400>12ccggatccat ggcggcaatg gttcgttggc aag 33<210>13<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>14ccggatccat gagttttgat attgccaaat acc 33<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>16ccgaattctt actcattgtc cggtgtaaaa ggg 33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>17ccggatccat ggactttccg cagcaactcg aag 33<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>22gggggatcca gttttgatat tgccaaatac cc 32<210>23<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>23gggggatcct gccagccagg ccttgatttt gg 32
<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>24gggggatccg agcaactcac cattctgggc 30<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>25gggggatccg cttgcgagac gcatcacctc 30<210>26<211>637<212>PRT<213>類球紅細(xì)菌<400>26Met Thr Asp Arg Pro Cys Thr Pro Thr Leu Asp Arg Val Thr Leu Pro1 5 10 15Val Asp Met Lys Gly Leu Thr Asp Arg Glu Leu Arg Ser Leu Ala Asp20 25 30Glu Leu Arg Ala Glu Thr Ile Ser Ala Val Ser Val Thr Gly Gly His35 40 45Leu Gly Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Ala50 55 60Val Phe Asp Ala Pro Arg Asp Lys Ile Ile Trp Asp Val Gly His Gln65 70 75 80Cys Tyr Pro His Lys Ile Leu Thr Gly Arg Arg Asp Arg Ile Arg Thr
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1 5 10 15Thr Phe Asp Leu Val Met Arg Lys Gly Gly Pro Glu Ala Phe Arg Thr20 25 30Val Ala Leu Thr Gly Gly Arg Asn Ile Arg Arg Leu Ala Glu Met Ala35 40 45Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Ala Val Thr Ala His Glu Asp Cys Leu50 55 60Pro Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ala Gly Thr Gly Thr Glu Val Ala Gly65 70 75 80Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Ala Ala Asp Arg Pro Ala Asp Trp Thr85 90 95Met Ser Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Met Arg Ala100 105 110Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu Val115 120 125Thr Ala Gly Gln Leu Leu Met Arg Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ala Thr130 135 140Ile Leu Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Ala Leu Ala145 150 155 160Gly Glu Asp Thr Ala Cys Val Glu Arg Val Ile Ile Thr Ala Ser Gly165 170 175Gly Pro Phe Arg Asp Trp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Cys Thr Val180 185 190Ala Glu Ala Gln Ala His Pro Asn Trp Ser Met Gly Gln Arg Ile Ser195 200 205Ile Asp Ser Ala Ser Met Phe Asn Lys Ala Leu Glu Leu Ile Glu Thr210 215 220Arg Glu Phe Phe Gly Phe Glu Pro Asp Arg Ile Glu Ala Val Val His225 230 235 240Pro Gln Ser Ile Val His Ala Met Val Gly Phe Cys Asp Gly Gly Leu245 250 255Met Ala His Leu Gly Pro Ala Asp Met Arg His Ala Ile Gly Phe Ala260 265 270
Leu Asn Trp Pro Gly Arg Gly Glu Val Pro Val Ala Arg Ile Asp Leu275 280 285Ala Gln Ile Ala Ser Leu Thr Phe Gln Lys Pro Asp Glu Glu Arg Phe290 295 300Pro Ala Leu Arg Leu Ala Arg Asp Val Met Ala Ala Arg Gly Leu Ser305 310 315 320Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Lys Glu Ile Ala Leu Asp His Phe Ile325 330 335Ala Gly Arg Ile Gly Phe Leu Asp Met Ala Ala Val Val Glu Glu Thr340 345 350Leu Ala Gly Val Ser Thr Asp Pro Leu Phe Gly Lys Val Pro Asp Ala355 360 365Leu Glu Glu Val Leu Ala Met Asp His Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu370 375 380Glu Ala Ala Gly Leu Arg Gln Gln Lys Arg385 390<210>31<211>1182<212>DNA<213>類球紅細(xì)菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1182)<400>31atg cgc agc ctg tcg atc ttt ggg gcc acc ggc tcc atc ggc gaa tcc 48Met Arg Ser Leu Ser Ile Phe Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Glu Ser1 5 10 15acc ttc gac ctc gtc atg cgg aag ggc ggg ccc gag gcg ttc cgc acc 96Thr Phe Asp Leu Val Met Arg Lys Gly Gly Pro Glu Ala Phe Arg Thr20 25 30gtc gct ctg acc ggc ggg cgc aac atc cgg cga ctg gcc gaa atg gcg 144Val Ala Leu Thr Gly Gly Arg Asn Ile Arg Arg Leu Ala Glu Met Ala35 40 45cgt gcg ctg aag gcg gag ctt gcc gtc acc gcg cat gag gac tgc ctg 192
Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Ala Val Thr Ala His Glu Asp Cys Leu50 55 60ccc gcg ctg cgc gag gcg ctg gcc ggg acg ggc acc gag gtc gcg ggc 240Pro Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ala Gly Thr Gly Thr Glu Val Ala Gly65 70 75 80ggg gcg cag gcc atc gcc gag gcc gcc gac cgg ccg gcc gac tgg acc 288Gly Ala Gln Ala Ile Ala Glu Ala Ala Asp Arg Pro Ala Asp Trp Thr85 90 95atg tcg gcc atc gtg ggc gcc gcg ggc ctc gtg ccc gga atg cgg gcg 336Met Ser Ala Ile Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Pro Gly Met Arg Ala100 105 110ctg aag cac ggc cgc acg ctg gcg ctc gcc aac aag gaa agc ctc gtg 384Leu Lys His Gly Arg Thr Leu Ala Leu Ala Asn Lys Glu Ser Leu Val115 120 125acg gca ggg caa ctc ctg atg cgg acg gcc cag gag aac ggc gcc acg 432Thr Ala Gly Gln Leu Leu Met Arg Thr Ala Gln Glu Asn Gly Ala Thr130 135 140atc ctg ccg gtg gac agc gag cac tcc gcg gtc ttt cag gcg ctg gcg 480Ile Leu Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Ala Leu Ala145 150 155 160ggc gag gac acg gcc tgc gtc gag cgc gtc atc atc acg gcg tcc ggc 528Gly Glu Asp Thr Ala Cys Val Glu Arg Val Ile Ile Thr Ala Ser Gly165 170 175ggg ccg ttc cgc gac tgg agc ctc gag cgc atc cgc gcc tgc acc gtg 576Gly Pro Phe Arg Asp Trp Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Cys Thr Val180 185 190gcc gag gcg cag gcc cat ccc aac tgg tcc atg ggc cag cgg atc tcc 624Ala Glu Ala Gln Ala His Pro Asn Trp Ser Met Gly Gln Arg Ile Ser195 200 205atc gac agc gcc tcg atg ttc aac aag gcg ctc gag ctg atc gag acg 672Ile Asp Ser Ala Ser Met Phe Asn Lys Ala Leu Glu Leu Ile Glu Thr210 215 220cgc gaa ttc ttc ggc ttc gag ccg gac cgg atc gag gcg gtc gtc cat 720Arg Glu Phe Phe Gly Phe Glu Pro Asp Arg Ile Glu Ala Val Val His225 230 235 240ccg caa tcc atc gtc cat gcg atg gtg ggc ttc tgc gac ggg ggc ctg 768Pro Gln Ser Ile Val His Ala Met Val Gly Phe Cys Asp Gly Gly Leu
245 250 255atg gcc cat ctc ggc ccc gcc gac atg cgc cac gcc atc gga ttc gcg 816Met Ala His Leu Gly Pro Ala Asp Met Arg His Ala Ile Gly Phe Ala260 265 270ctg aac tgg ccg ggt cgc ggc gag gtg ccc gtc gcc cgg atc gac ctc 864Leu Asn Trp Pro Gly Arg Gly Glu Val Pro Val Ala Arg Ile Asp Leu275 280 285gca cag att gcg agc ctc acc ttc cag aag cct gac gag gaa cgc ttt 912Ala Gln Ile Ala Ser Leu Thr Phe Gln Lys Pro Asp Glu Glu Arg Phe290 295 300ccg gcc ctg agg ctt gcg cga gac gtc atg gcg gcg cgc ggc ctg tcg 960Pro Ala Leu Arg Leu Ala Arg Asp Val Met Ala Ala Arg Gly Leu Ser305 310 315 320ggc gcc gcc ttc aac gcg gcc aag gag atc gcg ctc gat cat ttc atc 1008Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Lys Glu Ile Ala Leu Asp His Phe Ile325 330 335gcc gga cgc atc ggg ttt ctg gac atg gcg gcg gtg gtc gag gag acg 1056Ala Gly Arg Ile Gly Phe Leu Asp Met Ala Ala Val Val Glu Glu Thr340 345 350ctc gcg ggc gtt tcg acc gac ccc ctg ttc gga aaa gtg ccc gac gcc 1104Leu Ala Gly Val Ser Thr Asp Pro Leu Phe Gly Lys Val Pro Asp Ala355 360 365ctt gag gaa gtg ctg gcc atg gac cat ctc gct cgg aga gcg gca gag 1152Leu Glu Glu Val Leu Ala Met Asp His Leu Ala Arg Arg Ala Ala Glu370 375 380gaa gcc gcc ggt ctc cgc cag cag aaa agg 1182Glu Ala Ala Gly Leu Arg Gln Gln Lys Arg385 390<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>32aagctgatct gggacgtggg gca 23
<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>33tgctatccgc acaagatcct gac 23<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>34gcatgctgtt ccgcgatgcc gac 2權(quán)利要求
1.生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，該方法包括將包含一個(gè)或多個(gè)選自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的DNA的DNA整合到載體中(a)編碼具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA，(b)編碼法尼焦磷酸合酶的DNA，(c)編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白的DNA，或編碼具有其中在SEQ ID NO3的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA，(d)編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白的DNA，或編碼具有其中在SEQ ID NO4的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的DNA，(e)編碼具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA，(f)編碼能夠在嚴(yán)格條件下與選自(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的DNA雜交、并且其活性與由所選擇的DNA編碼的蛋白的活性基本相同的蛋白的DNA；將產(chǎn)生的重組DNA引入到得自原核生物的宿主細(xì)胞中；在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體；使所述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積類異戊二烯化合物；并從所述培養(yǎng)物中回收所述類異戊二烯化合物。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA，是編碼具有SEQ ID NO1、26和28中任何一個(gè)的氨基酸序列的蛋白的DNA，或是編碼具有其中在SEQ ID NO1、26或28的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO6、27和29中任何一個(gè)的核苷酸序列。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中編碼法尼焦磷酸合酶的DNA是編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白的DNA，或是編碼具有其中在SEQ ID NO2的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的法尼焦磷酸合酶的DNA。
5.按照權(quán)利要求1或4的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO7的核苷酸序列。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA，是編碼具有SEQ ID NO5或30的氨基酸序列的蛋白的DNA，或是編碼具有其中在SEQ ID NO5或30的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白的DNA。
7.按照權(quán)利要求1或6的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO10或31的核苷酸序列。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA具有SEQ ID NO8或9的核苷酸序列。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述類異戊二烯化合物選自泛醌、維生素K2和類胡蘿卜素。
10.具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率的活性、并選自以下(a)、(b)和(c)的蛋白(a)具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO3的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白，(b)具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO4的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白，和(c)具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的蛋白，或具有其中在SEQ ID NO5的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白。
11.生產(chǎn)具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白的方法，該方法包括將編碼權(quán)利要求10的蛋白的DNA整合到載體中，將產(chǎn)生的重組DNA引入到宿主細(xì)胞中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體，使該轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和累積所述蛋白，并從培養(yǎng)物中回收所述蛋白。
12.按照權(quán)利要求1或11的方法，其中所述轉(zhuǎn)化體是屬于埃希氏菌屬、紅細(xì)菌屬或歐文氏菌屬的微生物。
13.編碼具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的蛋白、并描述于以下(a)至(g)中任何一個(gè)的DNA(a)編碼具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白的DNA，(b)編碼具有SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白的DNA，(c)編碼具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的蛋白的DNA，(d)具有SEQ ID NO8的核苷酸序列的DNA，(e)具有SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA，(f)具有SEQ ID NO10的核苷酸序列的DNA，和(g)可以在嚴(yán)格條件下與(a)至(f)中的任何一個(gè)DNA雜交的DNA。
14.篩選具有抗生活性的物質(zhì)的方法，該方法包括篩選抑制蛋白反應(yīng)的物質(zhì)，所述蛋白具有選自那些存在于非甲羥戊酸途徑上的酶的酶活性，在所述途徑中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成產(chǎn)生的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，而由所述2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸生物合成異戊烯焦磷酸。
15.篩選具有除草活性的物質(zhì)的方法，該方法包括篩選抑制蛋白反應(yīng)的物質(zhì)，所述蛋白具有選自那些存在于非甲羥戊酸途徑上的酶的酶活性，在所述途徑中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸生物合成產(chǎn)生的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，而由所述2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸生物合成異戊烯焦磷酸。
16.按照權(quán)利要求14或15的方法，其中所述蛋白是描述于以下(a)或(b)中的蛋白(a)具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白，或(b)具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白。
17.按照權(quán)利要求16的篩選方法，其中所述催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)的蛋白，是具有SEQ IDNO1的氨基酸序列的蛋白，或是具有其中在SEQ ID NO1的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸產(chǎn)生1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應(yīng)活性的蛋白。
18.按照權(quán)利要求16的篩選方法，其中所述具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白，是具有SEQ ID NO5的氨基酸序列的蛋白，或是具有其中在SEQ IDNO5的氨基酸序列中缺失、置換或添加一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列、并具有催化由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸產(chǎn)生2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸反應(yīng)活性的蛋白。
19.通過(guò)按照權(quán)利要求14的篩選方法獲得的具有抗生活性的物質(zhì)。
20.通過(guò)按照權(quán)利要求15的篩選方法獲得的具有除草活性的物質(zhì)。
21.包含權(quán)利要求19的物質(zhì)的抗生劑。
22.包含權(quán)利要求20的物質(zhì)的除草劑。
全文摘要
使用至少一種DNA生產(chǎn)蛋白或類異戊二烯化合物的方法，所述DNA包含編碼具有提高類異戊二烯化合物生物合成效率活性的上述蛋白的DNA，所述類異戊二烯化合物可用于治療心臟病或骨質(zhì)疏松癥、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、預(yù)防癌癥、免疫強(qiáng)化等的藥物、健康食品、防污涂料等；以及檢測(cè)具有抗菌活性和除草活性的化合物的方法，該方法特征在于檢測(cè)能夠抑制非甲羥戊酸途徑上的酶反應(yīng)的上述DNA、上述蛋白或物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1982451SQ200610162868
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期1999年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月14日
發(fā)明者三宅浩一郎, 橋本信一, 本山裕章, 尾崎明夫, 瀨戶治男, 葛山智久, 高橋俊二 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社