專利名稱：利用增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及鑒定微觀活生物的領(lǐng)域，并且更特別地涉及使用噬菌體鑒定微 生物。
背景技術(shù)：
已建議噬菌體擴(kuò)增可作為加速微生物鑒定的方法。參見(jiàn)，例如1999年11月16日 授權(quán)的美國(guó)專利No. 5，985，596以及10月8日授權(quán)的No. 6，461，833B1 (二者皆授予Stuart Mark Wilson) ；1989 年 8 月 29 日授予 Ulitzur 等的美國(guó)專利 No. 4，861，709 ；1998 年 10 月 20日授予Scherer等的美國(guó)專利No. 5，824，468 ； 1997年8月12日授予Jurgensen等的美 國(guó)專利 No. 5,656,424 ；2001 年 10 月 9 日授予 Jacobs，Jr.等的美國(guó)專利 No. 6，300，061B1 ； 2003 年 4 月 29 日授予 Hiroshi Nakayama 的美國(guó)專利 No. 6，555，312B1 ；2003 年 4 月 8 日授 予 Sayler 等的美國(guó)專利 No. 6，544，729B2 ；1999 年 3 月 30 日授予 Michael F. Sanders 的美 國(guó)專禾Ij No. 5，888，725 ；2002 年 8 月 20 日授予 Adams 等的美國(guó)專利 No. 6，436，661B1 ； 1996 年 3 月 12 日授予 Rees 等的美國(guó)專利 No. 5，498，525 ；Angelo J. Madonna, Sheila VanCuyk 禾口Kent J. Voorhees,"Detection Of Esherichia Coli Using ImmunomagneticSeparation And Bacteriophage Amplification Coupled WithMatrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time-Of-Flight MassSpectrometry", Wiley InterScience, DOI 10.1002/ rem. 900，2002年12月24日；以及2004年11月11日公開的美國(guó)專利申請(qǐng)公開 No. 2004/0224359。噬菌體是自然界中進(jìn)化的使用細(xì)菌作為復(fù)制自身之手段的病毒。噬菌 體通過(guò)自身附著于細(xì)菌并將其遺傳物質(zhì)注入細(xì)菌來(lái)實(shí)現(xiàn)復(fù)制自身，這使得其復(fù)制出數(shù)十至 數(shù)千倍的噬菌體。一些稱為“裂解性噬菌體”的噬菌體使宿主細(xì)菌破裂并將子代噬菌體釋放 進(jìn)入環(huán)境以搜尋其它細(xì)菌。取決于噬菌體、細(xì)菌以及環(huán)境條件，親代噬菌體感染細(xì)菌、噬菌 體在細(xì)菌中擴(kuò)增以產(chǎn)生子代噬菌體以及裂解后釋放子代噬菌體的總孵育時(shí)間可花費(fèi)少至1 小時(shí)。因此，已提出，與傳統(tǒng)的基于底物的鑒定相比，使用噬菌體擴(kuò)增聯(lián)合噬菌體或噬菌體 標(biāo)志物測(cè)試也許能顯著地縮短測(cè)定時(shí)間。一個(gè)被感染細(xì)菌可產(chǎn)生IO1 IO4個(gè)子代噬菌體， 并且每個(gè)噬菌體顆?？砂琁O1 IO3拷貝的衣殼或其它結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。因此，如果檢測(cè)子 代噬菌體、噬菌體核酸或噬菌體蛋白質(zhì)的方法合適的話，那么從每個(gè)被感染細(xì)菌得到IO2 IO7倍的信號(hào)放大是有可能的。本領(lǐng)域中已知多種方法適于檢測(cè)，其包括但不限于PCR、質(zhì) 譜法、基于抗體或適配體的結(jié)合測(cè)定以及空斑測(cè)定。在上述每一種噬菌體擴(kuò)增方法中，將可能含有靶標(biāo)細(xì)菌的樣品與特異性針對(duì)該細(xì)菌的噬菌體一起孵育。當(dāng)存在所述細(xì)菌時(shí)，噬菌體感染并在細(xì)菌中復(fù)制，導(dǎo)致產(chǎn)生可測(cè)量的 表明靶標(biāo)細(xì)菌存在的信號(hào)。一些方法通過(guò)檢測(cè)從被感染靶標(biāo)細(xì)菌釋放出的子代噬菌體來(lái)進(jìn) 行檢測(cè)和鑒定。在這種情形中，如果親代噬菌體沒(méi)有成功地感染靶標(biāo)細(xì)菌的話，則不會(huì)產(chǎn)生 子代噬菌體。還有另一些方法依賴于檢測(cè)噬菌體復(fù)制產(chǎn)物，而非整個(gè)子代噬菌體。例如當(dāng) 螢光素酶報(bào)告基因噬菌體成功地感染靶標(biāo)細(xì)菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生螢光素酶。繼而，螢光素酶產(chǎn)生光， 如被檢測(cè)到則表明樣品中存在靶標(biāo)細(xì)菌。另一些方法依賴于檢測(cè)細(xì)菌碎片，其在特異性噬菌體成功對(duì)靶標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行裂解性感染后釋放。還有一些方法依賴于噬菌體附著于細(xì)菌的能 力而不利用擴(kuò)增。為了精確地鑒定靶標(biāo)細(xì)菌，上述每一種基于噬菌體的診斷方法要求噬菌 體兼具針對(duì)靶標(biāo)細(xì)菌的高靈敏度和高特異性以避免在非靶標(biāo)菌株或菌種中復(fù)制。發(fā)現(xiàn)或開 發(fā)具有上述特質(zhì)的噬菌體是極具挑戰(zhàn)性的。因此，盡管已考慮將噬菌體擴(kuò)增作為檢測(cè)微生 物的有前景的方法，但是尚未開發(fā)出可與常規(guī)市售微生物檢測(cè)方法相競(jìng)爭(zhēng)的使用噬菌體的 商業(yè)可用診斷方法。具有可接受之靈敏度的噬菌體常常缺乏足夠的特異性，也就是說(shuō)它們 與眾多非靶標(biāo)細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。這種缺乏可接受之靈敏度和足夠之特異性的問(wèn)題成為使 噬菌體診斷方法商業(yè)化中的關(guān)鍵問(wèn)題。眾所周知，在給定的細(xì)菌物種內(nèi)，個(gè)體菌株在其對(duì)噬菌體毒株的靈敏度方面具有差異；事實(shí)上，這種差異化易感性形成了用于鑒定細(xì)菌菌株之噬菌體分型方案的基礎(chǔ)。盡 管對(duì)這種差異化易感性的生化基礎(chǔ)還知之甚少，但是已鑒定出一些因子。這包括毒力因子， 其常被發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌染色體內(nèi)的可移動(dòng)遺傳元件上。熟知的實(shí)例有針對(duì)中毒性休克綜合征的 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)因子，其由致病個(gè)生島(pathogenicity island) SaPll所編碼，在約20%的金黃色葡萄球菌臨床分離物中發(fā)現(xiàn)。這些致病性島通過(guò)噬菌體 感染宿主細(xì)菌而移動(dòng)，并被包殼(encapsidate)在感染性顆粒中。這種移動(dòng)和包殼作用的 發(fā)生以犧牲感染噬菌體為代價(jià)，所述噬菌體的復(fù)制可減少100倍(Lindsay等，Molecular Microbiology, 1998，29 2527)。這種減少為任何依賴于噬菌體擴(kuò)增的測(cè)定或方法制造了問(wèn) 題，因?yàn)樗沟么蟛糠旨?xì)菌宿主不能產(chǎn)生大量的噬菌體。因此，仍需要檢測(cè)微生物的更快更有效的方法，使其同時(shí)實(shí)現(xiàn)特異性和靈敏性同 時(shí)保持高度擴(kuò)增。發(fā)明概述本發(fā)明提供了本領(lǐng)域的改進(jìn)技術(shù)，并通過(guò)向暴露于噬菌體的樣品添加一種或多種 物質(zhì)來(lái)克服上述問(wèn)題，所述物質(zhì)增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增而不會(huì)降低特異性或靈敏度。例如，已發(fā)現(xiàn) 中毒性休克蛋白以及多種其它金黃色葡萄球菌外蛋白(exoprotein)的表達(dá)被培養(yǎng)基中存 在的亞致死濃度的脂肪酸和有關(guān)化合物所抑制。我們發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基添加脂肪酸、經(jīng)綴合脂 肪酸、脂肪酸酯或脂肪酰胺顯著地增強(qiáng)基于噬菌體之測(cè)試用于診斷和研究目的的檢測(cè)、鑒 定和表征細(xì)菌宿主的表現(xiàn)和功用。舉例來(lái)說(shuō)，我們已表明添加這樣的脂肪酸和有關(guān)化合物 大大提高噬菌體在差的金黃色葡萄球菌細(xì)菌宿主中和好的金黃色葡萄球菌細(xì)菌宿主中的 擴(kuò)增，并且還大大提高存在β-內(nèi)酰胺抗生素(如頭孢西丁(cefoxitin))下培養(yǎng)的甲氧西 林(methicillin)抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株中的噬菌體擴(kuò)增。另一種已發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增而不會(huì)降低特異性或靈敏度的物質(zhì)是各種形式 的丙酮酸類，例如丙酮酸和丙酮酸鈉。例如，發(fā)現(xiàn)向多種金黃色葡萄球菌菌株添加IOmmol/ L(毫摩爾每升)至50mmol/L的丙酮酸鈉顯著增強(qiáng)噬菌體靈敏度。發(fā)現(xiàn)添加12mmol/L至 37mmol/L的丙酮酸鈉將這些菌株中的噬菌體靈敏度從約78%提高到87 % 92 %。在 15mmol/L 31mmol/L的濃度范圍內(nèi)，靈敏度增加至90%以上。最優(yōu)選的濃度為27mmol/L， 在該濃度下的靈敏度與未添加丙酮酸鈉時(shí)的靈敏度相比提高約15%。類似地，在lOmmol/L 至60mmol/L丙酮酸鈉的范圍內(nèi)，噬菌體的平均擴(kuò)增顯著提高。例如平均擴(kuò)增從未添加丙 酮酸鈉時(shí)的約92提高至添加約30mmol/L丙酮酸鈉時(shí)的150。本發(fā)明提供了測(cè)定待測(cè)試樣品中靶標(biāo)微生物存在與否的方法，該方法包括將樣品與能夠附著于所述靶標(biāo)微生物的一定量噬菌體相組合以得到暴露于噬菌體的樣品；向所 述暴露于噬菌體的樣品提供足以允許所述噬菌體感染所述微生物的條件；以及測(cè)定該暴露 于噬菌體的樣品以檢測(cè)噬菌體標(biāo)志物存在與否，從而確定所述靶標(biāo)微生物存在與否；該方 法的特征在于組合，包括將噬菌體和靶標(biāo)微生物與增強(qiáng)靶標(biāo)生物中噬菌體擴(kuò)增或噬菌體對(duì) 靶標(biāo)微生物之靈敏度的物質(zhì)相組合。本發(fā)明還提供了用于測(cè)定待測(cè)試樣品中靶標(biāo)微生物存在與否的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含噬菌體并且特征在于該培養(yǎng)基包含增強(qiáng)噬菌體在靶標(biāo)微生物中復(fù)制或者增強(qiáng)噬菌體 對(duì)靶標(biāo)生物之靈敏度的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述微生物是細(xì)菌，所述測(cè)定包括檢測(cè)作為樣品中存在靶標(biāo)細(xì)菌之指示 的噬菌體標(biāo)志物。優(yōu)選地，所述物質(zhì)抑制細(xì)菌毒力因子。優(yōu)選地，所述毒力因子為中毒性休 克蛋白。優(yōu)選地，所述物質(zhì)為脂肪酸化合物。優(yōu)選地，所述脂肪酸化合物是月桂酸。優(yōu)選地， 所述物質(zhì)選自脂肪酸、經(jīng)綴合脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酰胺。優(yōu)選地，所述物質(zhì)包括丙酮酸 類。優(yōu)選地，所述物質(zhì)包括丙酮酸鈉。優(yōu)選地，所述方法還包括抑制噬菌體在可能發(fā)生交叉 反應(yīng)的非靶標(biāo)微生物中復(fù)制。優(yōu)選地，所述抑制包括使用附著于支持物的選擇性結(jié)合試劑 從樣品中選擇性地除去可能發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌，或者選擇性地破壞可能發(fā)生交叉反應(yīng)的 細(xì)菌。本發(fā)明解決了如下問(wèn)題增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增方法的靈敏度，同時(shí)維持或增強(qiáng)噬菌體 的選擇性。當(dāng)結(jié)合附圖閱讀以下說(shuō)明書時(shí)，本發(fā)明的多種其它的特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將顯現(xiàn)出來(lái)。


圖1表明添加月桂酸提高在差的或限制性的金黃色葡萄球菌宿主上的擴(kuò)增；圖2表明月桂酸提高在許可性金黃色葡萄球菌宿主上的噬菌體擴(kuò)增；圖3表明月桂酸減輕了由頭孢西丁在MRSA菌株中引起的噬菌體擴(kuò)增抑制；圖4顯示噬菌體靈敏度，表示為百分比對(duì)比丙酮酸鈉濃度(mmol/L)；以及圖5顯示噬菌體平均擴(kuò)增對(duì)比丙酮酸鈉濃度(mmol/L)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及使用噬菌體來(lái)檢測(cè)微生物。噬菌體是自然界中進(jìn)化的使用細(xì)菌作為復(fù) 制自身之手段的病毒。噬菌體通過(guò)自身附著于細(xì)菌并將其DNA(或RNA)注入細(xì)菌來(lái)實(shí)現(xiàn)復(fù) 制自身，這使得其復(fù)制出成百上千倍的噬菌體。這稱為“噬菌體擴(kuò)增”。如本發(fā)明背景技術(shù) 中所概述地，有許多文獻(xiàn)基于如下想法噬菌體擴(kuò)增可提供指示細(xì)菌的標(biāo)志物，與檢測(cè)細(xì)菌 相比，檢測(cè)噬菌體擴(kuò)增可更加容易和快速。允許通過(guò)噬菌體標(biāo)志物測(cè)定噬菌體擴(kuò)增來(lái)檢測(cè) 特定細(xì)菌的基本原理是，特定噬菌體僅感染特定細(xì)菌。也就是說(shuō)，噬菌體對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)是特異 性的。因此，如果將特異性針對(duì)特定細(xì)菌的特定噬菌體引入樣品中，并且后來(lái)發(fā)現(xiàn)所述噬菌 體得以擴(kuò)增，則對(duì)于該噬菌體具有特異性的細(xì)菌一定存在于該樣品中。以這種方式，現(xiàn)有技 術(shù)教導(dǎo)噬菌體擴(kuò)增可用于鑒定樣品中存在的特定細(xì)菌。然而，自然界中不存在100%特異性 針對(duì)期望檢測(cè)之單一菌種的噬菌體。此外，自然界中發(fā)現(xiàn)的噬菌體也不是對(duì)期望檢測(cè)之細(xì) 菌具有100%靈敏度。由于自然界中發(fā)現(xiàn)的噬菌體在這些期望特質(zhì)方面并不完美，因此商業(yè)上可用的細(xì)菌檢測(cè)方法比最初希望的要困難得多。本申請(qǐng)公開了增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增和噬菌體 靈敏度并因此首次使商業(yè)可用方法成為可能的系統(tǒng)和方法。如上所概述地，本發(fā)明提供了 增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增而不會(huì)降低特異性或靈敏度的物質(zhì)和方法。事實(shí)上，如以下所顯示地，本發(fā) 明的物質(zhì)和方法不僅增強(qiáng)擴(kuò)增還提高靈敏度。在本公開內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“噬菌體”包括噬菌體、分枝桿菌噬菌體(例如針對(duì)結(jié)核桿菌(TB)和副結(jié)核桿菌(paraTB))、真菌噬菌體(例如針對(duì)真菌)、支原體噬菌體，以及任何 其它指可侵入活的細(xì)菌、真菌、支原體、原生動(dòng)物、酵母和其它微觀活生物并利用它們復(fù)制 自身的病毒的術(shù)語(yǔ)。本文中，“微觀”是指最大尺寸為一毫米以下。在本公開內(nèi)容中，噬菌體標(biāo)志物是可與噬菌體之存在有關(guān)的任何生物學(xué)元件或有 機(jī)元件。不受限制地，其可以是噬菌體本身、摻入噬菌體結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)、與噬菌體有關(guān)的蛋 白質(zhì)、與噬菌體有關(guān)的RNA或DNA或者上述任何物質(zhì)的任何部分。在本公開內(nèi)容中，細(xì)菌標(biāo) 志物是當(dāng)細(xì)菌被噬菌體裂解時(shí)所釋放的任何生物學(xué)元件或有機(jī)元件，包括細(xì)胞壁組分、細(xì) 菌核酸、蛋白質(zhì)、酶、小分子或上述物質(zhì)的任何部分。在圖1和圖2中，每個(gè)符號(hào)(例如12)代表金黃色葡萄球菌的獨(dú)立臨床分離物。將 金黃色葡萄球菌臨床分離物在35°下、添加有20%血液的BacTec需氧F/10培養(yǎng)液中培養(yǎng) 至密度為約108cfu/ml。然后，將這些培養(yǎng)物的等分試樣以1 250稀釋成測(cè)試混合物—— 含有噬菌體菌株MP112和MP115(每種107pfu/ml)的胰酶大豆培養(yǎng)液(Tryptic Soy Broth) 以及不同濃度的月桂酸。將所述培養(yǎng)物在35°下培養(yǎng)4小時(shí)，然后進(jìn)行稀釋并使用頂部瓊 脂法(top agar method)鋪板在菌苔上。過(guò)夜孵育后，計(jì)算板上每種培養(yǎng)物的pfu/ml，并除 以輸入pfu/ml以獲得圖1中所示的擴(kuò)增值。這些分離物不使用月桂酸的結(jié)果顯示為15 ；月 桂酸濃度為5μ g/ml的結(jié)果顯示為19 ；月桂酸濃度為10μ g/ml的結(jié)果顯示為22 ；月桂酸濃 度為15 μ g/ml的結(jié)果顯示為26 ；月桂酸濃度為20 μ g/ml的結(jié)果顯示為29 ；月桂酸濃度為 30 μ g/ml的結(jié)果顯示為34。在這些濃度中，擴(kuò)增的平均水平從不含月桂酸的3倍提高到月 桂酸為30 μ g/ml的45倍。擴(kuò)增的平均水平用每列中的實(shí)線表示(例如14)。從先前的實(shí)驗(yàn)已知，圖1中使用的分離物組合是對(duì)噬菌體感染具有抗性的或者在 感染后擴(kuò)增噬菌體較差。該研究中的28個(gè)菌株選自202種作為噬菌體擴(kuò)增之最差宿主的 臨床分離物集合。由于這些菌株代表了集合的 14%，因此有理由相信大多數(shù)和全部菌株 為TSS陽(yáng)性的；月桂酸通過(guò)抑制TSS基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增。然而，我們發(fā)現(xiàn)月桂酸 (并延伸至其它脂肪酸)通常在幾乎所有的測(cè)試宿主中促進(jìn)噬菌體擴(kuò)增。這一新的結(jié)果表 明TSS抑制并未充分解釋脂肪酸對(duì)噬菌體擴(kuò)增的作用。月桂酸對(duì)好的噬菌體宿主的作用顯示在圖2中。沒(méi)有月桂酸時(shí)這些分離物的結(jié)果 顯示為42 ；月桂酸濃度為5 μ g/ml的結(jié)果顯示為45 ；月桂酸濃度為10 μ g/ml的結(jié)果顯示為 48 ；月桂酸濃度為15 μ g/ml的結(jié)果顯示為52 ；月桂酸濃度為20 μ g/ml的結(jié)果顯示為56 ； 月桂酸濃度為30μ g/ml的結(jié)果顯示為59。該組中的平均擴(kuò)增從69倍提高到添加了月桂酸 的高于100倍。擴(kuò)增的平均水平用每列中的實(shí)線表示(例如49)。迄今，超過(guò)80%的測(cè)試 金黃色葡萄球菌菌株響應(yīng)于月桂酸刺激而顯示噬菌體擴(kuò)增。如圖3所示，月桂酸、其它脂肪酸及其衍生物改善了 β -內(nèi)酰胺抗生素對(duì)甲氧西林 抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)宿主中噬菌體擴(kuò)增的作用。這一性質(zhì)增強(qiáng)了基于噬菌體的測(cè) 試在檢測(cè)、分類以及將MRSA與甲氧西林易感的金黃色葡萄球菌(MSSA)進(jìn)行區(qū)分中的表現(xiàn)和功用。在圖3中，每個(gè)符號(hào)代表能夠在β -內(nèi)酰胺抗生素(例如頭孢西丁 )存在下生長(zhǎng) 的臨床MRSA(甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌)分離物。第一列62 (圓圈)表示沒(méi)有頭孢西 丁和月桂酸時(shí)利用MRSA菌株的擴(kuò)增。第二列64(方形)表示添加了頭孢西丁的擴(kuò)增。注 意噬菌體擴(kuò)增的抑制。第三列66 (菱形)表示添加了月桂酸的擴(kuò)增。第四列70 (X形)表 示添加了月桂酸和頭孢西丁的擴(kuò)增。這顯示月桂酸減輕了頭孢西丁對(duì)MRSA菌株中噬菌體 擴(kuò)增的抑制。 正向刺激噬菌體擴(kuò)增的另一些脂肪酸化合物包括飽和脂肪酸己酸、辛酸、癸酸和 肉豆蔻酸；經(jīng)綴合脂肪酸甘油單月桂酸酯；以及不飽和脂肪酸油酸和亞油酸。為了本發(fā) 明的目的，術(shù)語(yǔ)“脂肪酸”應(yīng)當(dāng)指所有這類化合物和相關(guān)化合物。丙酮酸是聯(lián)系需氧和厭氧代謝與碳水化合物、脂肪酸和氨基酸合成的代謝化合 物。通過(guò)圖1-3顯示的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體擴(kuò)增對(duì)宿主有較高的代謝要求，因此我們推斷向噬 菌體宿主生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充該化合物可刺激噬菌體擴(kuò)增，導(dǎo)致更好的測(cè)定效果。圖4和圖5 顯示培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉的效果。圖4顯示所測(cè)量的噬菌體靈敏度曲線80(百分比)對(duì) 比丙酮酸鈉的濃度(mmol/L)。將一組32個(gè)金黃色葡萄球菌菌株培養(yǎng)在經(jīng)添加的BacTecSA 血液培養(yǎng)基中至對(duì)數(shù)中期，然后稀釋成包含噬菌體和所示濃度丙酮酸鈉(mmol/L)的生長(zhǎng) 培養(yǎng)基。在35°孵育4小時(shí)后，利用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法測(cè)試培養(yǎng)物中的噬菌體擴(kuò)增。若菌 株顯示顯著擴(kuò)增(定義為超過(guò)輸入噬菌體>8倍)，則評(píng)定為陽(yáng)性。靈敏度被定義為陽(yáng)性菌 株數(shù)占所有測(cè)試菌株的百分比。從圖中可以看出，添加12mmol/L 37mmol/L的丙酮酸鈉 使在這些菌株中的噬菌體靈敏度從約78%提高至87% 92%。15mmol/L 31mmol/L的 濃度范圍導(dǎo)致靈敏度超過(guò)90%。在27mmol/L濃度下的靈敏度與未添加丙酮酸鈉時(shí)的靈敏 度相比增加了約15%。這些數(shù)據(jù)表明，向生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充丙酮酸鈉可以顯著增強(qiáng)能夠擴(kuò)增 噬菌體之菌株分?jǐn)?shù)。圖5顯示所測(cè)量的平均噬菌體擴(kuò)增對(duì)比丙酮酸鈉濃度(mmol/L)的曲線90。當(dāng)使 用Student's配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試時(shí)，丙酮酸類為0mM(毫摩爾)和15或30mM之間的擴(kuò)增 差異是顯著的(P分別為0. 002,0. 005)。從約10mmol/L至60mmol/L的范圍內(nèi)，平均噬菌體 擴(kuò)增顯著增加。例如，平均擴(kuò)增從未添加丙酮酸鈉的約92提高至添加約30mmOl/L丙酮酸 鈉的150。這些數(shù)據(jù)顯示向生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加丙酮酸鈉導(dǎo)致噬菌體擴(kuò)增提高并因而提高基于 噬菌體擴(kuò)增之測(cè)試和測(cè)定的表現(xiàn)。增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增的方法和物質(zhì)優(yōu)選地與抑制在可能發(fā)生交叉反應(yīng)的非靶標(biāo)細(xì)菌 中復(fù)制的物質(zhì)和方法聯(lián)用，并使用此種抑制來(lái)提高基于噬菌體之診斷方法的選擇性。我們 將在本文中描述三種抑制方法的實(shí)施方案1)抑制可能發(fā)生可交叉反應(yīng)之細(xì)菌的生長(zhǎng)，同 時(shí)允許靶標(biāo)細(xì)菌的生長(zhǎng)；2)使用附著于某一支持物(例如微粒)的選擇性結(jié)合劑從樣品中 選擇性地除去可能發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌；以及3)選擇性地破壞可能發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌。 這些實(shí)施方案旨在舉例說(shuō)明，而本發(fā)明不限于這些實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將具有相 同結(jié)果的其它方法納入考慮之中?？墒褂贸Ｓ糜谖⑸飳W(xué)檢測(cè)的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)可能發(fā)生交叉反應(yīng)之細(xì)菌的抑制。例 如，物質(zhì)例如氯化鈉(高濃度)、多粘菌素B、多粘菌素E、其它多粘菌素以及金屬化合物(如 亞碲酸鉀)抑制某些凝固酶陰性的葡萄球菌(coagulase negative Staphylococcus,CNS) 的生長(zhǎng)，而允許金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。這些化合物還可以顯著地抑制或延遲CNS中的噬菌體復(fù)制，而最低限度地影響在金黃色葡萄球菌中的復(fù)制。使用選擇性培養(yǎng)基來(lái)差異性地影響噬菌體復(fù)制的效率和時(shí)序是一種用于提高基于噬菌體之細(xì)菌診斷方法特異性的新方 法。除去非靶標(biāo)細(xì)菌可通過(guò)使用抗體、選擇性針對(duì)非靶標(biāo)細(xì)菌的噬菌體或者選擇性結(jié)合非靶標(biāo)細(xì)菌的其它化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于金黃色葡萄球菌測(cè)試來(lái)說(shuō)，除去CNS物種可以是 有利的。將這些化合物與非靶標(biāo)細(xì)菌結(jié)合可足以阻斷噬菌體與那些阻止成功感染及復(fù)制之 細(xì)菌的結(jié)合。或者，這些化合物可以附著于其它基質(zhì)，例如微粒、磁珠或固體基質(zhì)。當(dāng)與樣 品一起孵育時(shí)，潛在的非靶標(biāo)細(xì)菌將選擇性地結(jié)合所述基質(zhì)。然后，可將基質(zhì)以物理方式從 樣品中移除。分離方法包括對(duì)微粒進(jìn)行離心或者對(duì)磁珠應(yīng)用磁場(chǎng)。選擇性地破壞非靶標(biāo)細(xì)菌可通過(guò)使用抗細(xì)菌化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述抗細(xì)菌化合物選 擇性地破壞非靶標(biāo)細(xì)菌從而使它們不對(duì)噬菌體感染易感，同時(shí)使靶標(biāo)細(xì)菌最大程度地不遭 到破壞并且易感于噬菌體感染。這樣的化合物包括a)選擇性抗生素，和b)選擇性地結(jié)合 和/或感染可能發(fā)生交叉反應(yīng)之非靶標(biāo)細(xì)菌的噬菌體。后者是用于選擇性地感染樣品中靶 標(biāo)細(xì)菌之主要噬菌體之外的補(bǔ)充性噬菌體。補(bǔ)充性噬菌體可通過(guò)成功感染并裂解非靶標(biāo)細(xì) 菌來(lái)破壞非靶標(biāo)噬菌體，從而使主要噬菌體的噬菌體感染被消除或者顯著降低。補(bǔ)充性噬 菌體還可用于通過(guò)稱作“自外裂解作用(lysis fromwithout)”的過(guò)程來(lái)破壞非靶標(biāo)細(xì)菌。 “自外裂解作用”是指當(dāng)成百上千的噬菌體顆粒與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合時(shí)對(duì)細(xì)菌的破壞。在本發(fā) 明中，可通過(guò)向樣品中添加高濃度的補(bǔ)充性噬菌體來(lái)利用該過(guò)程，從而使大量的補(bǔ)充性噬 菌體迅速且選擇性地結(jié)合可能發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌。在大量噬菌體結(jié)合的壓力下，交叉反 應(yīng)細(xì)菌可發(fā)生破裂，被清除，以避免它們成為主要噬菌體進(jìn)行噬菌體感染的位點(diǎn)。如2007年11月20日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)No. PCT/US07/085268 (其通過(guò)引用并 入本文)中所述，可僅通過(guò)使用噬菌體附著于細(xì)菌的性質(zhì)來(lái)將噬菌體用于檢測(cè)細(xì)菌，也就 是說(shuō)，沒(méi)有擴(kuò)增步驟。該申請(qǐng)還公開了噬菌體如何可用于測(cè)定微生物的抗生素易感性或抗 生素耐藥性。本發(fā)明還涉及，本文所述的材料和方法還可用于助益于任何上述方法和系統(tǒng)。 本發(fā)明的方法和裝置可增強(qiáng)用于鑒別微生物和/或測(cè)定抗生素耐藥性測(cè)試或抗生素易感 性的基于噬菌體之許多其它方法和裝置。應(yīng)當(dāng)理解，附圖中所示以及本說(shuō)明書中所述的特定實(shí)施方案是為了舉例的目的， 而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明(描述于以下權(quán)利要求中)的限制。例如，既然已發(fā)現(xiàn)月桂酸增強(qiáng) 噬菌體擴(kuò)增，很明顯其它相關(guān)的物質(zhì)也可增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增。舉另一個(gè)例子，由于有關(guān)丙酮酸 類物質(zhì)的推論已被證明是正確的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠遵循該推論推及其它增強(qiáng)噬菌體 擴(kuò)增和/或噬菌體靈敏度的物質(zhì)。此外，很顯然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明構(gòu)思 的前提下對(duì)所述特定實(shí)施方案進(jìn)行多種應(yīng)用和改動(dòng)。本文中描述了若干個(gè)實(shí)施例?？墒褂?等同結(jié)構(gòu)和方法來(lái)替代所述各結(jié)構(gòu)和方法；在某些情形中，本發(fā)明方法的子方法可以采用 不同的順序來(lái)進(jìn)行；或者可使用多種不同的材料和元件。因此，本發(fā)明應(yīng)理解為涵蓋所述微 生物檢測(cè)裝置和方法中存在和/或具有的每個(gè)新特征和新特征組合。
權(quán)利要求
測(cè)定待測(cè)試樣品中靶標(biāo)微生物存在與否的方法，該方法包括將所述樣品與能夠附著于所述靶標(biāo)微生物的一定量噬菌體相組合以得到暴露于噬菌體的樣品；向所述暴露于噬菌體的樣品提供足以允許所述噬菌體感染所述微生物的條件；以及測(cè)定所述暴露于噬菌體的樣品以檢測(cè)噬菌體標(biāo)志物存在與否，從而確定所述靶標(biāo)微生物存在與否；所述方法的特征在于所述組合包括將所述噬菌體和所述靶標(biāo)微生物與增強(qiáng)所述靶標(biāo)生物中噬菌體擴(kuò)增或針對(duì)所述靶標(biāo)微生物之噬菌體靈敏度的物質(zhì)相組合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是細(xì)菌，并且所述測(cè)定包括檢測(cè)作為所述樣品 中存在所述靶標(biāo)細(xì)菌之指示的所述噬菌體標(biāo)志物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述物質(zhì)抑制細(xì)菌毒力因子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述毒力因子是中毒性休克蛋白。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述物質(zhì)是脂肪酸化合物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述脂肪酸化合物是月桂酸。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述物質(zhì)選自脂肪酸、經(jīng)綴合脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪酰胺。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述物質(zhì)包含丙酮酸類。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述物質(zhì)包含丙酮酸鈉。
10.權(quán)利要求1的方法，其還包括抑制噬菌體在可能發(fā)生交叉反應(yīng)的非靶標(biāo)微生物中復(fù)制。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抑制包括使用附著于支持物的選擇性結(jié)合劑從所述 樣品中選擇性地除去可能發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抑制包括選擇性地破壞可能發(fā)生交叉反應(yīng)的細(xì)菌。
13.用于測(cè)定待測(cè)試樣品中靶標(biāo)微生物存在與否的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含噬菌體并且 特征在于該培養(yǎng)基包含增強(qiáng)所述噬菌體在所述靶標(biāo)微生物中復(fù)制或者增強(qiáng)噬菌體對(duì)所述 靶標(biāo)生物之靈敏度的物質(zhì)。
14.權(quán)利要求13的培養(yǎng)基，其中所述物質(zhì)抑制細(xì)菌毒力因子。
15.權(quán)利要求14的培養(yǎng)基，其中所述毒力因子是中毒性休克蛋白。
16.權(quán)利要求13的培養(yǎng)基，其中所述物質(zhì)是脂肪酸化合物。
17.權(quán)利要求16的培養(yǎng)基，其中所述脂肪酸化合物是月桂酸。
18.權(quán)利要求16的培養(yǎng)基，其中所述物質(zhì)選自脂肪酸、經(jīng)綴合脂肪酸、脂肪酸酯和脂肪 酰胺。
19.權(quán)利要求13的培養(yǎng)基，其中所述物質(zhì)包含丙酮酸類。
20.權(quán)利要求19的培養(yǎng)基，其中所述物質(zhì)包含丙酮酸鈉。
全文摘要
測(cè)定待測(cè)試樣品中靶標(biāo)微生物存在與否的方法，該方法包括將樣品與能夠附著于所述靶標(biāo)微生物以得到暴露于噬菌體之樣品的一定量噬菌體以及增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增或靈敏度的物質(zhì)相組合；向所述暴露于噬菌體的樣品提供足以允許所述噬菌體感染所述微生物的條件；以及測(cè)定該暴露于噬菌體的樣品以檢測(cè)噬菌體標(biāo)志物存在與否，從而測(cè)定所述靶標(biāo)微生物存在與否。向所述靶標(biāo)微生物添加了增強(qiáng)噬菌體擴(kuò)增(脂肪酸，例如月桂酸)或噬菌體靈敏度(例如丙酮酸類)的物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101802615SQ200880024912
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者喬恩·C·里斯, 喬納森·D·史密斯, 布雷亞納·C·史密斯, 布雷亞納·L·德賴林, 杜安·布什, 理查德·普羅克特, 蒂法尼·斯泰因馬克, 貝納德·斯波特曼, 馬里亞·伊佐 申請(qǐng)人:小噬菌體公司;布雷亞納·L·德賴林