專利名稱：辣根過(guò)氧化物酶基因與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因的連接及克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有殺傷腫瘤細(xì)胞作用的融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)成，具體涉及人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因 與辣根過(guò)氧化物酶基因的連接及克隆。
背景技術(shù)：
許多酶和前體藥物被用于殺傷腫瘤細(xì)胞，并且取得了很多成功。辣根過(guò)氧化物酶正在被用于殺滅腫瘤 細(xì)胞。吲哚-3-乙酸(IAA)作為一種普遍存在的植物生長(zhǎng)激素，可被辣根過(guò)氧化物酵催化形成活性氧攜帶分 子，包括活性氧自由基(ROS)，自甴基會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)損傷和凋亡， 從而產(chǎn)生動(dòng)物細(xì)胞毒性作用。又由于IAA不能被動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶氧化，對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影 響，因此，可以成為酶介導(dǎo)抗癌藥物治療的候選藥物。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)特異性結(jié)合，是刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖 和移行的重要因子，并可影響血管通透性。VEGF受體表達(dá)高的細(xì)胞其VEGF檢出率高于受體表達(dá)低的細(xì)胞， 提示了 VEGF多集中在與耙細(xì)胞結(jié)合的部位，腫瘤血管對(duì)VEGF的反應(yīng)要比正常血管強(qiáng)。
利用VEGF或VEGF的單克隆抗體與VEGFR或VEGF結(jié)合，阻斷VEGF與受體的結(jié)合，達(dá)到抑制其促 進(jìn)血管生長(zhǎng)的作用,發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)。使用抗體中和VEGF可間接抑制腫瘤的生長(zhǎng)?？扇苄訴EGF受體 能特異地結(jié)合VEGF，間接阻斷VEGF與其受體作用。Drake等在鳥(niǎo)胚胎內(nèi)注入可溶性VEGFR l，結(jié)果導(dǎo)致胚 胎血管畸形和大血管生成障礙。
將VEGF與小分子毒性物質(zhì)結(jié)合后，通過(guò)VEGF與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤表面受體的特異性結(jié)合，發(fā) 揮抑制血管形成及殺瘤效應(yīng)。Arora等將白喉毒素分子DT390分別與VEGF165和VEGF121結(jié)合。發(fā)現(xiàn) 兩者均可抑制表達(dá)VEGFR的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及卡波西肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且DT390 VEGF165的作用是 DT390VEGF121的3 4倍，對(duì)不表達(dá)VEGFR的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和B細(xì)胞則無(wú)毒性作用。 兩者均有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
VEGF受體flt-l/VEGFR-l和Flk-1/ KDR/VEGFR-2在腫瘤組織中表達(dá)量很高，通過(guò)融合的方法將 VEGF165或VEGF121與白喉毒素(DT)制成耙向的有毒物質(zhì)，兩個(gè)融合蛋白對(duì)繁殖中的內(nèi)皮細(xì)胞有高度的 毒性作用，而對(duì)血管平滑肌細(xì)胞無(wú)毒性作用，與只用毒素的對(duì)照組相比，用VEGF和毒素的融合產(chǎn)物對(duì)腫 瘤組織有明顯的抑制作用。
在本項(xiàng)研究中，將辣根過(guò)氧化物酶基因與VEGF基因進(jìn)行連接與克隆，以為表達(dá)有生物活性的融合 蛋白做準(zhǔn)備。將用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，以表達(dá)出產(chǎn)量高而且有生物活性的融合蛋白，用于殺滅腫 瘤細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
首先獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因與辣根過(guò)氧化物酶基因，然后將二者通過(guò)小分子連接肽基因進(jìn)行 連接，再連接到畢赤酵母的表達(dá)載體pPlC9K上，在大腸桿菌中進(jìn)行克隆，通過(guò)測(cè)序鑒定所構(gòu)建重組基因 的正確性。本重組基因可用于表達(dá)具有腫瘤細(xì)胞殺傷作用的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
1. 目的基因的獲得辣根過(guò)氧化物酶基因的獲得是通過(guò)首先提取辣根的基因組DNA，以其為模板進(jìn) 行PCR，得到目的基因。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因的獲得是根據(jù)VEGF165基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)與合成，提取病人肺腫瘤 組織總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)cDNA，然后以其為模板進(jìn)行PCR，獲得VEGF165基因。
2. 目的基因的連接與克隆將兩種目的基因通過(guò)連接肽SerSerSerGtySerSerSerSerGlySer的相應(yīng) DNA序列連接，在重組基因的3'連上表達(dá)六個(gè)連續(xù)組氨酸的堿基序列，以便于用鎳柱進(jìn)行分離純化。連 接到pPIC9K上，保持正確的閱讀框，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。經(jīng)DNA測(cè)序和酶切鑒定正確后，將其轉(zhuǎn)入
大腸桿菌，以克隆重組表達(dá)載體。


插入目的基因的重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定圖 1 1Kb DNA Ladder DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物 2空載體的EcoRI和Sail酶切產(chǎn)物 3含目的基因的重組載體的EcoRI和Sail酶切產(chǎn)物 4以重組載體為模板的目的基因的PCR產(chǎn)物 5 DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1辣根過(guò)氧化物酶基因片段的擴(kuò)增
以提取的辣根基因組DNA為模板，采用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增其HRPC3基因中除去信號(hào)肽序列及終止密 碼子序列的剩余部分，共864bp。在上下游引物兩端分別加入酶切位點(diǎn)EcoRI和Bgl II,下游引物沒(méi)有終 止密碼子序列。5'端引物如序列表中的SEQ ID NO. 1， 3'端引物如序列表中的SEQ ID NO. 2。
實(shí)施例2 VEGF165基因片段的擴(kuò)增
通過(guò)PCR擴(kuò)增VEGF165基因片段，在上游引物5'端加入酶切位點(diǎn)BamHI，在下游引物5'端加入編碼 六個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的DNA序列和酶切位點(diǎn)Notl。 5'端引物如序列表中的SEQ ID NO. 3, 3'端引物如序列 表中的SEQ ID NO. 4。
實(shí)施例3辣根過(guò)氧化物酶基因與連接肽基因連接
合成兩條引物L(fēng)inkl和Link2, Linkl的3'端有16個(gè)堿基與辣根過(guò)氧化物酶基因3'端互補(bǔ)。Linkl 的5'端與Link2的3'端有15bp的相同序列。在Linkl中有Bgl II酶切位點(diǎn)，在Link2的5'端有BamHI 酶切位點(diǎn)。以實(shí)施例1中擴(kuò)增到的辣根過(guò)氧化物酶基因?yàn)槟０?，以SEQ ID NO. 1為上游引物，以Linkl為 下游引物進(jìn)行PCR，再以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO. 1和Link2為引物，應(yīng)用Pyrobest DNA聚合 酶進(jìn)行PCR，再用T叫DNA聚合酶和dATP進(jìn)行DNA末端加A。引物L(fēng)inkl如序列表中的SEQ ID NO. 5， 引物L(fēng)ink2如序列表中的SEQ ID NO. 6。
實(shí)施例4辣根過(guò)氧化物酶和連接肽基因的連接產(chǎn)物與VEGF165基因片段的連接
將實(shí)施例3中PCR產(chǎn)物及VEGF165基因的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行BamHI酶切，回收目的片段，二者進(jìn)行 連接反應(yīng)后，再以SEQ ID NO.l和SEQ ID N0.4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到HRPC3-Link-VEGF165，其序列如序列 表中的SEQ ID NO. 7。
實(shí)施例5服PC3-Link-VEGF165與pPIC9K連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌
分別對(duì)HRPC3-Link-VEGF165的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行EcoRI和Notl雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳， 回收目的基因片段和pPIC9f,連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(ExoliDH5cc、篩選陽(yáng)性克隆并對(duì)重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶 切和PCR鑒定以及進(jìn)行咖A測(cè)序鑒定，由英俊生物技術(shù)有限公司，以pPIC9K的3'AOX測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序， 結(jié)果在A07. CS060904024—0099. BLUEGF. 3A0X. seq中，均證明HRPC3-Link-VEGF165與pPIC9K進(jìn)行了正確 的連接與克隆。
序列表 SEQ ID NO. 1
序列特征(A)長(zhǎng)度27bp; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類型
寡核苷酸。
序列描述
CCAGAATTC ATCCTTCGTCTTCACTTC SEQ ID NO. 2
序列特征(A)長(zhǎng)度25bp; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類型
4
寡核苷酸。 序列描述
TCAGATCTGG CATAGAGCTAACAAA
SEQ ID NO.'3
序列特征(A)長(zhǎng)度26bp; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類型 寡核苷酸。
序列描述CCGGATC CGATGAACTTTCTGCTGTC SEQ ID NO. 4
序列特征(A)長(zhǎng)度45bP; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類型 寡核苷酸。
序列描述
ATGCGGCCGCATGGTGGTGATGGTGGTGCCGCCTCGGCTTGTCAC SEQ ID NO. 5
序列特征(A)長(zhǎng)度40bp; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類型
寡核苷酸。
序列描述
GGAACCGGAGCTGGACAGATCTGGCATAGAGCTAACAAAG SEQ ID NO. 6
序列特征(A)長(zhǎng)度40bP; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類型
寡核苷酸。
序列描述
TCGGATCCGGGGAACCGCTGGAGCTGGAACCGGAGCTGGA SEQ ID NO. 7
序列特征(A)長(zhǎng)度1512 bp; (B)類型核酸；(C)鏈性單鏈；(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形；(E)分子類
型DNA。
序列描述
CCAGCGGTTCCCCGGATCCGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTCGAGCCTTGCCTTGCT
CCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTG<formula>complex formula see original document page 6</formula>
權(quán)利要求
1.兩種基因的連接及克隆，其特征在于先分別獲得人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因和辣根過(guò)氧化物酶基因，然后將二者通過(guò)小分子連肽DNA序列進(jìn)行連接，再連接到畢赤酵母的表達(dá)載體pPIC9K上，在大腸桿菌中進(jìn)行克隆。
2. 如權(quán)利要求1所述的兩種基因的連接及克隆，其特征在于，所述的辣根過(guò)氧化物酶基因?yàn)镠RPC3基因中 除去信號(hào)肽DNA序列及終止密碼子序列的剩余部分，共864bp。
3. 如權(quán)利要求1所述的兩種基因的連接及克隆，其特征在于，所述的序列為Ser Ser Ser GlySer Ser Ser Ser Gly Ser的連接肽，其相應(yīng)DNA序列為tccagctccggttccagctccagcggttcc。
4. 如權(quán)利要求1所述的兩種基因的連接及克隆，其特征在于，所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因?yàn)閂EGF165， 并在其下游連接有六個(gè)連續(xù)組氨酸對(duì)應(yīng)的DNA序列。
5. 如權(quán)利要求1所述的兩種基因的連接及克隆，用于表達(dá)具有腫瘤細(xì)胞殺傷作用的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺傷腫瘤細(xì)胞作用的融合蛋白質(zhì)的基因制備。本發(fā)明構(gòu)建了一種靶向性融合蛋白的重組基因，其中有人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因、辣根過(guò)氧化物酶基因及中間的連接肽DNA序列。該融合蛋白質(zhì)的基因的制備方法包括1)分別獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因與辣根過(guò)氧化物酶基因；2)將二者通過(guò)小分子連接肽基因進(jìn)行連接；2)連接到畢赤酵母的表達(dá)載體pPIC9K上；4)將所連接成的重組載體在大腸桿菌中進(jìn)行克隆。本發(fā)明重組基因可用于表達(dá)具有腫瘤細(xì)胞殺傷作用的融合蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101195829SQ20061016444
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月5日
發(fā)明者邵金輝 申請(qǐng)人:邵金輝