專利名稱：藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其涉及藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方 法。
背景技術(shù)：
藏羚羊(Pantholops hodgsoni)隸屬于偶蹄目?？粕窖騺喛撇亓鐚?，青藏高原特 有物種，屬國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物和《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)中嚴(yán)禁進(jìn)行貿(mào) 易活動(dòng)的瀕危動(dòng)物，主要分布在中國(guó)境內(nèi)的青海、西藏、新疆三省的高寒荒漠化草原、高寒 草原和高寒草甸地區(qū)，平均生活在海拔4100 5500m之間惡劣的環(huán)境中。由于環(huán)境因素導(dǎo) 致深入研究藏羚羊存在著很大困難，目前關(guān)于藏羚羊的研究主要以宏觀動(dòng)物學(xué)研究為主， 包括動(dòng)物行為、種群分布、個(gè)體生物學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、寄生蟲、疾病的診斷和治療、羊絨的物 理和化學(xué)性質(zhì)等。關(guān)于藏羚羊分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究較少。鑒于此，建立藏羚羊 細(xì)胞系以解決研究材料的問題十分必要。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要研究技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)中無(wú)論是基因 治療、干細(xì)胞、動(dòng)物克隆都以細(xì)胞為載體進(jìn)行。細(xì)胞的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，用于維持 細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基。目前商品化的常用培養(yǎng)基包括MEM培養(yǎng)基系列、DMEM培 養(yǎng)基系列、RPMI-1640培養(yǎng)基系列、199培養(yǎng)基系列、水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基、F10、F12細(xì)胞 培養(yǎng)基系列等。在眾多培養(yǎng)基中，哪種培養(yǎng)基可以培養(yǎng)藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞以及建立藏 羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的具體方法沒有詳細(xì)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種獲得藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞、為開展藏羚 羊分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究提供研究材料的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建 方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括 以下步驟(1)采樣從雌性成年藏羚羊個(gè)體的耳部取1cm2皮膚組織，并將其放入裝有貯存 液的離心管中；(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)將所述步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織 依次經(jīng)含有雙抗的杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)浸洗、含有雙抗的D/F12培養(yǎng)液沖洗后，將樣 本組織塊放入35mm培養(yǎng)皿中，剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預(yù)先用胎牛血清涂布的培 養(yǎng)瓶中，均勻地?cái)[放于培養(yǎng)瓶底部；最后將培養(yǎng)瓶倒置放在飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中，3h 后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3 5mL D/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 18天，得到生長(zhǎng)至80% 90% 匯合的原代細(xì)胞；(3)傳代與純化將所述步驟(2)所得的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；首先將原代細(xì) 胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸
4(EDTA)的混合液消化，得到消化液A ；然后將所述消化液A放入飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱 2 3min，取出，加入與消化液A等量的D/F12培養(yǎng)液終止消化，得到消化液B ；將所述消化 液B經(jīng)離心、去上清液后，得到細(xì)胞沉淀物A ；用D/F12培養(yǎng)液將所述細(xì)胞沉淀物A傳入另 一個(gè)培養(yǎng)瓶中，在37. 5°C、含5% C02的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 6天，得 到生長(zhǎng)至80% 90%匯合的皮膚成纖維細(xì)胞；(4)細(xì)胞凍存將所述步驟(3)所得的皮膚成纖維細(xì)胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白 酶和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，離心后加入細(xì)胞凍存液混勻，先在4°C保 存半小時(shí)，然后在-70°C冰箱中過(guò)夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存皮膚成纖維細(xì)胞；(5)細(xì)胞復(fù)蘇將所述步驟(4)所得的凍存皮膚成纖維細(xì)胞放入37°C水浴中融化， 吸出細(xì)胞懸液，用9倍所述細(xì)胞懸液體積的D/F12培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，經(jīng)離心、去上清后，得到 細(xì)胞沉淀物B ；用D/F12培養(yǎng)液充分懸浮細(xì)胞沉淀物B，并接種于培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度二 氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。所述步驟(1)中的貯存液為加入雙抗的T20 ；所述加入雙抗的T20是由占總?cè)芤?體積的20%的胎牛血清(FBS)和80%的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液 組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2 7. 4的溶液。所述步驟(2)中的杜氏磷酸緩沖液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 0203g/100mL的 KC1、0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、 0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸鈉、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的鏈霉素和0. lg/100mL的葡萄糖組成。所述步驟(2)、(3)和(5)中的D/F12培養(yǎng)液均是由占總培養(yǎng)液體積的10%的胎 牛血清(FBS)、90%的D/F12和雙抗組成。所述步驟(3)中的磷酸鹽緩沖液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 02g/100mL的KC1、 0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 組成。所述步驟(4)中的凍存液是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛血清(FBS)、10%的二 甲基亞砜(DMS0)、70%的D/F12和雙抗組成。所述步驟(2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱是指溫度為37. 5°C、含 5% C02的飽和濕度空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱。所述雙抗是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的鏈霉素。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明通過(guò)建立藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法獲得藏羚羊皮膚成纖維細(xì) 胞，為開展藏羚羊分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究提供了研究材料。2、本發(fā)明在進(jìn)行組織塊帖壁法原代培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)預(yù)先對(duì)培養(yǎng)瓶底壁涂布血清和倒 置培養(yǎng)3h，有效地避免了組織塊在培養(yǎng)液中脫離底壁浮起，有效地提高了組織塊成活率。3、本發(fā)明采用了組織塊帖壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，與酶消化法相比，所獲得的成纖維 細(xì)胞較好的保持了原有組織細(xì)胞的特性，而避免了酶消化對(duì)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的破壞以及對(duì) 細(xì)胞特性的改變(參見圖1)。4、本發(fā)明利用皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)消化液較上皮細(xì)胞敏感的原理，控制合適的消化 時(shí)間便可使成纖維細(xì)胞脫壁，而上皮細(xì)胞因脫壁較慢仍貼在培養(yǎng)瓶壁上，因此，只需經(jīng)過(guò)幾 次傳代就可以得到純化的皮膚成纖維細(xì)胞(參見圖2)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1為本發(fā)明藏羚羊耳部皮膚組織經(jīng)培養(yǎng)前消毒處理及剔除毛發(fā)處理后，采用組 織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)10天培養(yǎng)組織塊周圍有成纖維細(xì)胞游出，環(huán)繞于組織塊 周圍。圖2為本發(fā)明原代培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞經(jīng)過(guò)2 3次傳代以后得到的較純的成纖維細(xì) 胞，成纖維細(xì)胞呈梭型。
具體實(shí)施例方式材料本實(shí)驗(yàn)所用耳部皮膚組織供體為患有嚴(yán)重腦包蟲病的雌性成年藏羚羊個(gè) 體。藏羚羊?yàn)槲艺n題組經(jīng)國(guó)家林業(yè)局批準(zhǔn)的人工馴養(yǎng)藏羚羊。試劑杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 0203g/100mL 的 KC1、 0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、 0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸鈉、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的鏈霉素和0. lg/100mL的葡萄糖組成。貯存液為加入雙抗的T20 ；所述加入雙抗的T20是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛 血清(FBS)和80%的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成，并在配置后加 入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2 7. 4的溶液。D/F12培養(yǎng)液均是由占總培養(yǎng)液體積的10%的胎牛血清(FBS)、90%的D/F12和雙 抗組成。磷酸鹽緩沖液(PBS)是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 02g/100mL 的 KC1、0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 組成。凍存液是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛血清(FBS)、10%的二甲基亞砜(DMS0)、 70%的D/F12和雙抗組成。雙抗是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的鏈霉素。一種藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)采樣取樣時(shí)，先用滅菌的剪刀剪掉雌性成年藏羚羊個(gè)體的耳部毛發(fā)，再用剃 須刀片盡可能的剔除殘留的發(fā)根。然后用香皂、蒸餾水、新潔爾滅、生理鹽水、75%酒精、 D-PBS依次清洗，最后剪取1cm2皮膚組織，并將其放入已裝有貯存液的50mL離心管中。(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)將步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織用含 有雙抗的D-PBS浸洗5次，每次浸泡3min ；再用含有雙抗的D/F12培養(yǎng)液沖洗3遍后，將樣 本組織塊放入35mm培養(yǎng)皿中，用剪刀盡量將組織塊剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預(yù)先 用胎牛血清涂布的培養(yǎng)瓶中，均勻地?cái)[放于培養(yǎng)瓶底部；最后將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)，倒置放在 飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中，3h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3 5mL D/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 10 18天，得到生長(zhǎng)至80% 90%匯合的原代細(xì)胞。(3)傳代與純化將步驟(2)所得的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；首先將原代細(xì)胞用無(wú) Ca2+、Mg2+的PBS清洗2次，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0. 01 %乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，得到消化液A(消化液A以鋪滿培養(yǎng)瓶底為宜)；將消化液A放入飽和濕度 二氧化碳培養(yǎng)箱2 3min，取出，在顯微鏡下觀察消化情況，輕輕敲打底部，然后加入與消 化液A等量的D/F12培養(yǎng)液終止消化，得到消化液B ；將消化液B轉(zhuǎn)移至離心管中以1000 轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，去上清液后，得到細(xì)胞沉淀物A ；用D/F12培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀物A輕輕 混勻，傳入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中，在飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 6天，得到生長(zhǎng)至 80% 90%匯合的皮膚成纖維細(xì)胞，該皮膚成纖維細(xì)胞呈梭型(參見圖2)。(4)細(xì)胞凍存將步驟(3)所得的皮膚成纖維細(xì)胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶 和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，離心后加入細(xì)胞凍存液混勻，先在4°C保存 半小時(shí)，然后將細(xì)胞凍存盒直接放入-70°C冰箱中過(guò)夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存 皮膚成纖維細(xì)胞。(5)細(xì)胞復(fù)蘇將步驟(4)所得的裝有凍存皮膚成纖維細(xì)胞的凍存管從液氮中取 出，迅速放入37°C水浴中融化，吸出細(xì)胞懸液放于15mL離心管中，用9倍所述細(xì)胞懸液體積 的D/F12培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌后，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，去上清后，得到細(xì)胞沉淀物B ；用 D/F12培養(yǎng)液充分懸浮細(xì)胞沉淀物B，并接種于培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)即可。上述步驟(2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱是指溫度為37. 5°C、含 5% C02的飽和濕度空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱。
權(quán)利要求
一種藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)采樣從雌性成年藏羚羊個(gè)體的耳部取1cm2皮膚組織，并將其放入裝有貯存液的離心管中；(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)將所述步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織依次經(jīng)含有雙抗的杜氏磷酸緩沖液浸洗、含有雙抗的D/F12培養(yǎng)液沖洗后，將樣本組織塊放入35mm培養(yǎng)皿中，剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預(yù)先用胎牛血清涂布的培養(yǎng)瓶中，均勻地?cái)[放于培養(yǎng)瓶底部；最后將培養(yǎng)瓶倒置放在飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中，3h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3～5mL D/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10～18天，得到生長(zhǎng)至80％～90％匯合的原代細(xì)胞；(3)傳代與純化將所述步驟(2)所得的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；首先將原代細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；然后將所述消化液A放入飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱2～3min，取出，加入與消化液A等量的D/F12培養(yǎng)液終止消化，得到消化液B；將所述消化液B經(jīng)離心、去上清液后，得到細(xì)胞沉淀物A；用D/F12培養(yǎng)液將所述細(xì)胞沉淀物A傳入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中，在37.5℃、含5％CO2的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～6天，得到生長(zhǎng)至80％～90％匯合的皮膚成纖維細(xì)胞；(4)細(xì)胞凍存將所述步驟(3)所得的皮膚成纖維細(xì)胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，離心后加入細(xì)胞凍存液混勻，先在4℃保存半小時(shí)，然后在-70℃冰箱中過(guò)夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存皮膚成纖維細(xì)胞；(5)細(xì)胞復(fù)蘇將所述步驟(4)所得的凍存皮膚成纖維細(xì)胞放入37℃水浴中融化，吸出細(xì)胞懸液，用9倍所述細(xì)胞懸液體積的D/F12培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，經(jīng)離心、去上清后，得到細(xì)胞沉淀物B；用D/F12培養(yǎng)液充分懸浮細(xì)胞沉淀物B，并接種于培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。
2.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(1)中的貯存液為加入雙抗的T20；所述加入雙抗的T20是由占總?cè)芤后w積的20%的胎牛 血清和80%的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗， 然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 2 7. 4的溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(2)中的杜氏磷酸緩沖液是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 0203g/100mL 的 KC1、0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸鈉、0. 0075g/100mL 的青霉素、0. 005g/100mL 的鏈霉 素和0. lg/100mL的葡萄糖組成。
4.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟 ⑵、(3)和(5)中的D/F12培養(yǎng)液均是由占總培養(yǎng)液體積的10%的胎牛血清、90%的D/F12 和雙抗組成。
5.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步 驟(3)中的磷酸鹽緩沖液是由 0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 02g/100mL 的 KC1、0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 組成。
6.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟⑷中的凍存液是由占總?cè)芤后w積的20 %的胎牛血清、10 %的二甲基亞砜、70 %的D/F12和 雙抗組成。
7.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟 (2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱是指溫度為37. 5°C、含5% C02的飽和濕度空 氣的二氧化碳培養(yǎng)箱。
8.如權(quán)利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于所述雙抗 是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟(1)采樣；(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)；(3)傳代與純化；(4)細(xì)胞凍存；(5)細(xì)胞復(fù)蘇。本發(fā)明通過(guò)建立原代培養(yǎng)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的方法，獲得了高活力藏羚羊成纖維細(xì)胞系，為深入開展藏羚羊分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究提供了研究材料與技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101870962SQ20101020182
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者于鴻浩, 徐世曉, 曹俊虎, 趙新全, 郭志林, 郭松長(zhǎng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所