專利名稱：蝦白斑綜合癥病毒病核酸樣品制備方法及蝦白斑綜合癥病毒檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中的病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種蝦白斑綜合癥病毒病核酸 樣品制備方法以及利用核酸樣品經(jīng)LAMP擴(kuò)增后檢測(cè)蝦白斑綜合癥病毒的方法。
背景技術(shù)：
白斑綜合征病毒病是一種烈性病毒性傳染病，其病原為白斑綜合征病毒(WSSV)， WSSV是一種感染力極強(qiáng)、致死率極高的病毒，可在感染一周內(nèi)死亡率高達(dá)80% -100%,而 且其宿主域非常廣泛，已經(jīng)成為海、淡水養(yǎng)殖對(duì)蝦或者螯蝦中具有嚴(yán)重威脅的疾病，一旦發(fā) 病就難以做到及時(shí)治療，可能導(dǎo)致養(yǎng)殖蝦類出現(xiàn)暴發(fā)性死亡，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致整池絕產(chǎn)， 給廣大養(yǎng)殖者造成慘重?fù)p失。目前WSSV已遍及亞洲主要對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家和地區(qū)，并已傳播到 北美洲。在已報(bào)道的所有對(duì)蝦病毒中，該病毒毒力最強(qiáng)，危害最大，南美白對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、 日本對(duì)蝦、墨吉對(duì)蝦、長(zhǎng)毛對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、印度對(duì)蝦、桃紅對(duì)蝦、藍(lán)對(duì)蝦、白對(duì)蝦、褐對(duì)蝦、刀 額新對(duì)蝦、脊尾白蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等，大部分養(yǎng)殖對(duì)蝦皆可被WSSV侵染，在浮游生物、?？?、糠 蝦、白蝦、毛蝦、天津厚蟹、日本大眼蟹等動(dòng)物中可檢測(cè)出WSSV，在蝦池的蟹、橈足類和昆蟲(chóng) (Ephydridae)體內(nèi)也檢到過(guò)WSSV，因此早在1995年國(guó)際獸疫局(OIE)、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織 (FAO)以及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中心(NACA)就將其列為需要報(bào)告的重要的水生動(dòng) 物病毒病病原之一。國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為只有綜合預(yù)防才能控制WSSV。用碘制劑消毒養(yǎng)殖池 水、給養(yǎng)殖蝦投喂免疫增強(qiáng)劑、監(jiān)控養(yǎng)殖塘的各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)以及采取及時(shí)清理死蝦、病蝦以 切斷病毒傳播途徑。總的來(lái)說(shuō)，采用減少感染機(jī)會(huì)的措施是大多數(shù)養(yǎng)殖戶用以避免健康蝦 感染W(wǎng)SSV的主要方法。有關(guān)WSSV的研究在病原學(xué)、病理學(xué)、流行病學(xué)以及診斷學(xué)研究方面已深入到分子 水平，但由于由于諸多原因，到目前為止還不能完全控制WSSV的疫情，面對(duì)WSSV的傳播所 能采取最主要的措施是及早發(fā)現(xiàn)和消滅傳染源，果斷切斷傳播途徑，特別是在養(yǎng)殖環(huán)境中， 早期靈敏、簡(jiǎn)便、快速的診斷可以為及時(shí)采取有效措施，減少損失，防WSSV大規(guī)模暴發(fā)提供 科學(xué)的依據(jù)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP，loop-mediated isothermalamplification)，是一種全新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，該方法可以高靈敏地非常 有選擇性地高效擴(kuò)增靶序列(Notomi et al.，2000)，最終的LAMP產(chǎn)物是是一系列反向重復(fù) 的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)不 同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜。它具有所需儀器少只需要一個(gè)恒溫裝置就可以；靈敏高 模板僅需要10個(gè)拷貝或更少；擴(kuò)增特異性強(qiáng)應(yīng)用包含了六個(gè)區(qū)段的四條引物按嚴(yán)格順序 進(jìn)行擴(kuò)增；檢測(cè)時(shí)間短一般擴(kuò)增可以在60min以內(nèi)完成，比普通PCR反應(yīng)還要省時(shí)間。因 此LAMP在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和預(yù)防、動(dòng)物胚胎的性別鑒定和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等 領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。通常為了使用LAMP方法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，需要先期制備供擴(kuò)增用的 模板，在LAMP擴(kuò)增后，還需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化觀察，以確定LAMP的最終擴(kuò)增結(jié)果，該結(jié)果代表了檢測(cè)的最終結(jié)果。2004年Tomoya Kono將WSSV從kuruma shrimp中純化出 來(lái)，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技術(shù)對(duì)此核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以電泳觀察LAMP結(jié)果。最后證 實(shí)LAMP可用于WSSV相應(yīng)序列的擴(kuò)增，為蝦的WSSV診斷打下了基礎(chǔ)。2008年Lakshmi等 用病毒吸附技術(shù)分離病毒，細(xì)胞培養(yǎng)液用蔗糖梯度超速離心方法獲得模板，用RT-LAMP檢 測(cè)CHIK病毒。擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)向反應(yīng)管內(nèi)加入SYBR Green I，根據(jù)顯色來(lái)判斷。2008年 楊秋林等用醋酸可的松經(jīng)皮下注射Wistar大鼠誘導(dǎo)Pc，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)經(jīng) 離心、加入裂解緩沖液、多次消化后提純Pc基因組DNA，然后用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技 術(shù)檢測(cè)卡氏肺孢子蟲(chóng)(Pc)，結(jié)果陽(yáng)性Pc檢測(cè)管經(jīng)顯色后呈綠色，陰性對(duì)照組均呈棕色。袁 文等于2009年使用QIAamp viral RNA mini kit提取病毒的基因組RNA，建立小鼠肝炎病 毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)檢測(cè)技術(shù)并進(jìn)行初步應(yīng)用。在檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果時(shí)，往 LAMP反應(yīng)管中加入SYBR Green I熒光染料顯色，可見(jiàn)MHV陽(yáng)性管變?yōu)榫G色，而陰性管仍為 染料原色橙色。這些研究表明，使用純化過(guò)的病毒(病原)制備模板，通過(guò)LAMP擴(kuò)增后可 以通過(guò)向LAMP反應(yīng)管中加入SYBR Green I熒光染料顯色，用肉眼直接判斷LAMP的擴(kuò)增結(jié) 果，簡(jiǎn)化了原來(lái)的通過(guò)電泳觀察結(jié)果的步驟。顯然在已有的基于LAMP檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程中，其模板制備及LAMP結(jié)果觀察的過(guò)程 呈現(xiàn)二類，一類是通過(guò)先期純化病毒(或特定的待檢測(cè)對(duì)象)，以后可以通過(guò)多種方法來(lái)制 備模板，此時(shí)制備模板的方法可以是通過(guò)試劑盒或簡(jiǎn)單的煮沸法，在LAMP擴(kuò)增后可通過(guò)電 泳或加入SYBR Green I熒光染料顯色以肉眼直接觀察結(jié)果；第二類是不純化病毒，而是直 接將包含宿主及病毒在內(nèi)的組織進(jìn)行共提取，利用LAMP擴(kuò)增的特異進(jìn)行擴(kuò)增的，由于是在 模板制備中混合了宿主核酸和病毒核酸，如果以加入SYBR Green I熒光染料通過(guò)顯色后直 接憑肉眼觀察判別結(jié)果，會(huì)由于共提取時(shí)存在的混合核酸，與SYBR Green I結(jié)合，也會(huì)產(chǎn)生 熒光，因此不能通過(guò)SYBR Green I顯色后直接以肉眼觀察來(lái)判斷擴(kuò)增的結(jié)果，對(duì)擴(kuò)增準(zhǔn)確 結(jié)果目前是通過(guò)電泳來(lái)判斷。然而，具廣泛實(shí)用性的LAMP檢測(cè)的方法應(yīng)該是具高靈敏性、高特異性、操作簡(jiǎn)便、 耗時(shí)短、成本低等特點(diǎn)，因此，需要研究一種簡(jiǎn)單實(shí)用的蝦白斑綜合癥病毒病核酸樣品制備 方法以及在此基礎(chǔ)上的蝦白斑綜合癥病毒檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種蝦白斑綜合癥病毒病診斷用核酸樣品制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種蝦白斑綜合癥病毒病核酸樣品 制備方法，包括以下步驟取處死的新鮮的蝦的組織，加到緩沖液III中，然后95 100°C 加熱3分鐘以上，離心后取上清作為核酸擴(kuò)增的模板；其中，所述緩沖液III的組成為 20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，IOmM氯化鉀(KCl)，體積百分?jǐn)?shù)0. 1 %曲拉通 X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚，TritonX-100)，IOmM 硫酸銨(NH4) 2S04，2mM 硫酸鎂 MgSO4。上述技術(shù)方案中，所述蝦的組織可以選用蝦的任何組織，沒(méi)有嚴(yán)格要求，例如蝦 足(包括螯足、步足均可，而且不用去殼，可對(duì)帶殼的組織進(jìn)行處理、這是現(xiàn)有技術(shù)中的各 種方法均不能實(shí)現(xiàn)的，這樣無(wú)需解剖蝦，而且剪了一小節(jié)足的蝦還能繼續(xù)存活，因此，實(shí)際 操作過(guò)程中，不一定需要對(duì)蝦進(jìn)行處死處理)、蝦鰓、肌肉、或是其它組織；按比例每Ig蝦組 織需要0. 5 50mL緩沖液III。
上述技術(shù)方案中，加熱方式優(yōu)選沸水浴加熱，加熱的時(shí)間優(yōu)選為3 15分鐘，更優(yōu) 選為5分鐘。上述技術(shù)方案中，離心方式優(yōu)選為離心機(jī)5000rpm離心5分鐘。采用上述技術(shù)方案獲得的核酸擴(kuò)增的模板可用于LAMP反應(yīng)或PCR反應(yīng)，具體地， 上述方法制備的上清液1 μ L作為模板可用于25 μ L總體積的LAMP反應(yīng)或0. 5 μ L作為模 板可用于25 μ L總體積的PCR反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是提供一種采用上述模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)蝦 白斑綜合癥病毒的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種蝦白斑綜合癥病毒檢測(cè)方法，包 括以下步驟(1)以上述上清液為擴(kuò)增模板，按照常規(guī)方法，構(gòu)建環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系，所述擴(kuò) 增體系包括緩沖液、擴(kuò)增引物對(duì)、dNTP、Bst DNA聚合酶，并且，每25 μ L擴(kuò)增體系還包括 1 μ L上述上清液；(2)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)完成后，向稀釋千倍至萬(wàn)倍后的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò) 增(LAMP)產(chǎn)物中添加SYBR Green I，在紫外光激發(fā)下，通過(guò)肉眼直接觀察是否有被激發(fā)出 的綠色熒光結(jié)果來(lái)判斷實(shí)際檢測(cè)結(jié)果。上述技術(shù)方案中，所述擴(kuò)增引物對(duì)根據(jù)所要擴(kuò)增的蝦白斑綜合癥病毒核酸的特異 性保守區(qū)域設(shè)計(jì)，已經(jīng)證實(shí)的擴(kuò)增目的區(qū)域可為WSSV234或WSSV131。其中，酶是在將反應(yīng)混合物于95°C預(yù)變性5min，再迅速至冰上冷卻后加入擴(kuò)增反 應(yīng)體系。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1、由于本發(fā)明在核酸模板制備過(guò)程中采用緩沖液III處理蝦組織，所述緩沖液 III不僅不會(huì)對(duì)后續(xù)的LAMP或PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不利影響，還可以充分裂解蝦組織，有利于釋放 核酸，使核酸盡量伸展，并且核酸在該溶液中具有相對(duì)的穩(wěn)定性，混合在其中的蛋白質(zhì)能在 制備樣品的過(guò)程中同時(shí)被失活，所有加入的成分將不會(huì)對(duì)后續(xù)的LAMP或PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不利 影響，來(lái)自于模板制備過(guò)程中沒(méi)有去除的非WSSV的核酸(包括蝦的核酸、其它病原的核酸 等)也不會(huì)影響SYBR GREEN I對(duì)特異性擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生顯色干擾，因此能保證后續(xù)的檢測(cè)能 順禾IJ、快速、高特異性地進(jìn)行；2、本發(fā)明制備核酸模板耗時(shí)約為15min，即使與用專業(yè)的病毒核酸提取試劑盒直 接從病蝦組織中提取核酸比較時(shí)，仍具有所需樣品少、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力、成本低的優(yōu)占.
^ \\\ 3、本發(fā)明所制備的可用于檢測(cè)WSSV模板，可直接從病蝦組織中獲取，無(wú)需先對(duì)病 蝦中病毒進(jìn)行分離純化的復(fù)雜處理；4、采用本發(fā)明技術(shù)方案制備的模板，可用于LAMP和PCR反應(yīng)，尤其適用于LAMP，同 時(shí)LAMP的優(yōu)點(diǎn)例如高靈敏性、高特異性、時(shí)間短等，在此完全被保留；5、采用本發(fā)明技術(shù)方案制備的模板，經(jīng)LAMP聯(lián)合使用，LAMP擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)簡(jiǎn)單稀釋 千倍至萬(wàn)倍后，可消除其中來(lái)自蝦的DNA所造成的顯色背景污染，因此仍可通過(guò)加入SYBR GREEN I后經(jīng)肉眼判定診斷結(jié)果，不需要電泳，從而解決了只有使用純化病毒(或純化的特 定檢測(cè)對(duì)象)模板的LAMP產(chǎn)物才能用SYBR GREEN I顯色后肉眼直接檢測(cè)的限制；
6、采用本發(fā)明所述方法檢測(cè)蝦白斑綜合癥病毒所用時(shí)間在90min左右，與其它 LAMP檢測(cè)相比較，整個(gè)診斷全程(包括前期樣品制備、LAMP擴(kuò)增、LAMP產(chǎn)物檢測(cè))所用時(shí) 間大為縮短，適合于大批量檢測(cè)；7、本發(fā)明所述蝦白斑綜合癥病毒的檢測(cè)方法不需要PCR儀，也不再需要電泳儀， 自然也不會(huì)用到EB這類有毒的核酸染料，僅需一個(gè)恒溫裝置(例如水浴鍋)、一個(gè)小型的普 通離心機(jī)和一個(gè)紫外燈即可完成檢測(cè)，整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單，步驟小，成本低，有利于推廣應(yīng)用。


圖1是實(shí)施例一中不同方法提取模板后進(jìn)行LAMP結(jié)果電泳；其中，1 用苯酚/氯 仿法提取模板；2-6 分別用緩沖液III、緩沖液I、緩沖液II、超純水以及TE，通過(guò)快速煮沸 法提取模板；圖2是實(shí)施例四中稀釋后LAMP產(chǎn)物的SYBR Green I顯色比較圖，其中，上行1-5 以健康蝦制備模板的LAMP產(chǎn)物分別稀釋10、102、103、IO4UO5后的SYBR Green I顯色結(jié)果； 下行1-5 以WSSV病蝦制備模板的LAMP產(chǎn)物分別稀釋10、ΙΟ2、ΙΟ3、104、IO5后的SYBR Green I顯色結(jié)果；圖3是實(shí)施例四中通過(guò)SYBR Green I在管內(nèi)直接顯色和電泳方法檢測(cè)LAMP產(chǎn)物 結(jié)果對(duì)比圖，其中，A:WSYBR Green I直接在離心管中顯色結(jié)果；B 為相應(yīng)的EB染色電泳 結(jié)果；1 以健康蝦制備模板LAMP擴(kuò)增反應(yīng)后經(jīng)1000稀釋；2-4 以病蝦制備模板先經(jīng)103、 IO2UO1倍稀釋再作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)后稀釋1000倍的顯色結(jié)果；圖4是實(shí)施例六中注射組LAMP產(chǎn)物在紫外燈下的SYBR Green I顯色結(jié)果，其中， 1-6 注射2. 5 μ L病毒懸液4h、5h、6h、12h、18h及24h后取樣檢測(cè)WSSV的結(jié)果；7 注射失 活病毒液24h后取樣檢測(cè)WSSV的結(jié)果；圖5是實(shí)施例六中注射組LAMP及一步PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；其中，1，2，3，5，7，9， 11 注射2. 5 μ L病毒懸液4h、5h、6h、12h、18h、24h后和注射失活病毒液24h后的LAMP檢測(cè) 結(jié)果；4，6，8，10 注射 6h、12h、18h、24h 取樣的一步 PCR 檢測(cè)結(jié)果；M =Marker0
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一采用不同模板制備方法制備擴(kuò)增用模板并進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，對(duì)比擴(kuò)增結(jié)^ ο具體操作過(guò)程如下(1)模板DNA的提取第一類方法，經(jīng)典的苯酚/氯仿提取法取確認(rèn)被自然感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦，處 死、充分剪碎，取新鮮組織0. IgJn TE 100 μ 1，①加入500 μ 1飽和酚，充分混勻lOmin，再 IOOOOrpm離心lOmin，取水相，②重復(fù)①后，再加入500μ 1酚/氯仿(1 1)，充分混勻后， IOOOOrpm離心lOmin，取水相，③再加入500 μ 1氯仿混勻后，IOOOOrpm離心lOmin，取水相， ④加入1/10體積的3M醋酸鈉，及2倍總體積的95%乙醇混勻，IOOOOrpm離心lOmin，棄上 清，將沉淀以75%乙醇清洗后干燥，再溶于50 μ 1 TE后備作為檢測(cè)用DNA模板。
第二類方法，通過(guò)加入不同緩沖液后經(jīng)快速煮沸法制備(簡(jiǎn)稱快煮法)分別取確 認(rèn)被自然感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦處死，各取同樣新鮮組織0. Ig稍剪碎后，分別加100 μ 1 下述液體混勻，于100°C水浴5min，再經(jīng)5000rpm離心5min后的上清作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的 模板備用；所用的五種液體均以滅菌超純配置，分別為TE緩沖液(lOmmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA)；緩沖液 I (20mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L KCl，0· Triton X-100,lmmol/ L EDTA)；緩沖液 II(20mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L K C1,0. 1% Triton X-100)；緩沖液 III (20mmol/L Tris-HCl, lOmmol/L KC1,0. 1% Triton X-100, lOmmol/L (NH4) 2SO4, 2mmol/L MgSO4)以及滅菌超純水。其中緩沖液I、II、III均為本發(fā)明中提供的配方。(2) LAMP 擴(kuò)增LAMP所用的引物為前內(nèi)引物(FIP-234)參見(jiàn)SEQ ID No. 1 5' -CGCATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3‘。后內(nèi)引物(BIP-234)參見(jiàn) SEQ ID No. 2 5' -GGT CTG AM TAT ACA TGGGTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3'； 外引物 F3-234 參見(jiàn) SEQ ID No. 3 5' -GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG_3'、B3_234 參見(jiàn) SEQ IDNo. 4 5' -GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3‘。擴(kuò)增 WSSV 0RF234 區(qū)域。LAMP 的反應(yīng)為 25 μ L 體系，2. 5μ L 的 IOXbuffer, FIP-234、ΒΙΡ-234 終濃度為 0. 8 μ mol/L, F3-234、B3-234 終濃度為 0. 2 μ mol/L, dNTP 終濃度為 0. 4 μ mol/L, 1· 0 μ L 的 按上述方法制備的模板及8U(lyL)的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs (Beijing)， Ltd.)。酶是在將反應(yīng)混合物于95°C預(yù)變性5min，再迅速至冰上冷卻后加入。將反應(yīng)液混 勻后于63°C水浴反應(yīng)60min。(3)LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(EB染色)，得到圖1 結(jié)果顯示 用傳統(tǒng)苯酚/氯仿法抽提模板的LAMP呈陽(yáng)性，有較清楚條帶產(chǎn)生；用快煮法提取的模板進(jìn) 行的LAMP反應(yīng)，除了用超純水作為緩沖液，通過(guò)快煮法提取的模板經(jīng)LAMP擴(kuò)增后無(wú)明顯條 帶產(chǎn)生外，用其它四種緩沖液，通過(guò)快煮法所制備模板的LAMP結(jié)果都呈陽(yáng)性；其中，用緩沖 液III、通過(guò)快速煮沸法制備DNA模板進(jìn)行的LAMP效果最好，表現(xiàn)為L(zhǎng)AMP特有的梯形條帶 亮度最高、最清晰。用這種方法制備的DNA作為模板也比用傳統(tǒng)苯酚/氯仿法抽提的模板 進(jìn)行LAMP反應(yīng)的結(jié)果要好得多(圖1)，但制備所需的時(shí)間要少得多(用經(jīng)典苯酚/氯仿法 提取DNA的時(shí)間與本實(shí)施例提供的完成整個(gè)檢測(cè)工作的時(shí)間大致相當(dāng))，同時(shí)操作步驟少、 操作簡(jiǎn)單、成本低廉。實(shí)施例二 以緩沖液III經(jīng)快煮法制備模板分別擴(kuò)增WSSV ORF 234和WSSV ORF 131中特異區(qū)域。具體操作過(guò)程如下(1)模板DNA的提取以實(shí)施例一中，將羅氏沼蝦的WSSV病蝦組織加緩沖液III經(jīng) 快煮后制備的模板作為母液，再經(jīng)10倍系列梯度稀釋后，作為模板分別用于LAMP擴(kuò)增WSSV ORF 234 禾口 WSSV 131。(2) LAMP 擴(kuò)增 WSSV ORF 234 的引物為實(shí)施例一中所述 FIP_234、BIP_234、F3-234、 B3-234 ；擴(kuò)增 WSSV ORF 131 的引物為FIP-131 參見(jiàn) SEQ ID No. 5(5' -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCATTA TTG TC_3' )、BIP-131 參見(jiàn) SEQ ID No. 6(5' -CCT TTT GCC CCT TCAGCT GA TTT TCT GAG CCA GGT GTT CTG-3' )、F3_131 參見(jiàn) SEQ ID No. 7(5' -TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3' )、B3_131 參見(jiàn) SEQ ID No. 8(5' -TCTCTC TGG TGA ACC CAT-3‘)。LAMP 擴(kuò)增擴(kuò)增WSSV ORF 234同實(shí)施例一；擴(kuò)增WSSV ORF 131的方法參照實(shí)施例一，除引物以FIP-131、BIP-131、F3-131、 B3-131 分別取代 FIP-234、BIP-234、F3-234、B3-234,以 63°C反應(yīng) 75min 不同外其余均相同。(3) LAMP結(jié)果的觀察同實(shí)施例一。結(jié)果顯示，通過(guò)針對(duì)WSSV ORF 234區(qū)域擴(kuò)增的效率比通過(guò)針對(duì)WSSV0RF 131的區(qū) 域要高10倍，但二者都非常靈敏，將通過(guò)快煮法制備的模板經(jīng)IO11倍稀釋后再用于LAMP擴(kuò) 增，均可獲得滿意的結(jié)果。實(shí)施例三分別用LAMP、一步PCR與巢式PCR檢測(cè)WSSV的靈敏性比較(1)模板DNA的制備將0. Ig克氏原螯蝦WSSV病蝦組織稍剪碎后加緩沖液III 100 μ 1于100°C水浴5min，再經(jīng)5000rpm離心5min后的上清作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板備用。(2) LAMP 擴(kuò)增 WSSV ORF 234，方法同實(shí)施例一。(3) WSSV ORF 234 的一步 PCR 檢測(cè) WSSV =WSSV ORF 234 一步 PCR 的兩個(gè)引物序列 分別是 Pl 參見(jiàn) SEQ ID No. 9(5' -CCG AAT TCA CCA TGG AGTATA TAG GGG-3 ‘ )、P2 參見(jiàn) SEQ ID No. 10(5' -CGA AGC TTG ATA CAG TGACCG TCC CTG-3 ‘)。25μ L 的一步 PCR反應(yīng)體系包括 2· 5μ L 10XPCR buffer, 2. OyL MgCl2 (25mmol/ L)，各為 0. 25 μ L 的 Pl、P2，0. 5 μ L 的制備好的模板，0. 5 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，IU 的 Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94°C變性50S，51°C退火 lmin，72°C延伸lmin，最后72°C再延伸IOmin結(jié)束反應(yīng)。(4) WSSV ORF 234的巢式PCR檢測(cè)WSSV 兩個(gè)引物是上述一步PCR擴(kuò)增片段內(nèi)的 兩個(gè)區(qū)域引物 Pm 參見(jiàn) SEQ ID No. 11(5' -GGG GTT GAA CATTAC GGG-3 ‘)禾Π PN2 參見(jiàn) SEQ ID No. 12(5' -GAT GAC GAG TGG CTTGCT-3‘)。取一步PCR產(chǎn)物L(fēng)OyL作為第二步PCR的模板，用Pm和ΡΝ2引物進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，反應(yīng)液中除以Pm取代Pl、ΡΝ2取代Ρ2弓丨物外，其它組份與第一步PCR相同；反應(yīng)條件 除以51°C退火30s替代第一步PCR中的51°C退火Imin外，其余步驟相同。(5)檢測(cè)結(jié)果的觀察同實(shí)施例一。結(jié)果表明用LAMP方法可以從稀釋IO12倍的模板中檢測(cè)到WSSV。一步PCR擴(kuò)增時(shí)， 最低只能從稀釋IO4倍的模板中檢測(cè)到WSSV。巢式PCR可以從稀釋IO8倍的模板中檢測(cè)到 WSSV,而模板被稀釋IO9倍后，巢式PCR也無(wú)法擴(kuò)增出理論值為400bp左右的條帶。實(shí)施例四對(duì)比檢測(cè)模板的制備分別以健康克氏原螯蝦及克氏原螯蝦WSSV病蝦按實(shí)施例 三中的方法制備擴(kuò)增模板，其中用健康蝦制備的模板作為陰性對(duì)照。LAMP擴(kuò)增陰性對(duì)照使用不稀釋的模板進(jìn)行擴(kuò)增，以病蝦制備的模板再分別稀釋 10、100、1000倍后用于LAMP擴(kuò)增，其余同實(shí)施例一。熒光直接顯色觀察將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)十、百、千、萬(wàn)和十萬(wàn)倍梯度稀釋后取 25 μ L，加入0. 5 μ L的100 X SYBR Green I，室溫靜置5min后在紫外燈下觀察它們是否有綠 色熒光顯示，得到圖2 ；并以電泳驗(yàn)證結(jié)果。
LAMP結(jié)果的電泳觀察驗(yàn)證同實(shí)施例一，得到圖3。結(jié)果顯示當(dāng)陰性對(duì)照模板在LAMP擴(kuò)增后，經(jīng)千倍以上稀釋后，背景色消失。WSSV 病蝦以同樣LAMP擴(kuò)增后，經(jīng)十萬(wàn)倍稀釋后仍能發(fā)出明顯的熒光(圖2)，說(shuō)明不經(jīng)稀釋由于 存在背景，無(wú)法使用SYBR GREEN I顯色后直接以肉眼判別結(jié)果，稀釋可以消除干擾熒光，同 時(shí)一定范圍內(nèi)的稀釋不會(huì)影響到對(duì)LAMP陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確判別。當(dāng)使用經(jīng)稀釋的模板進(jìn)行 LAMP反應(yīng)，之后反應(yīng)液經(jīng)千倍以上稀釋，也同樣可以準(zhǔn)確顯示結(jié)果。電泳結(jié)果同直接顯色結(jié) 果完全吻合(圖3)。實(shí)施例五對(duì)比檢測(cè)模板的制備分別以健康南美白對(duì)蝦、南美白對(duì)蝦WSSV病蝦按實(shí)施例三 中的方法制備擴(kuò)增模板。LAMP擴(kuò)增同實(shí)施例一。LAMP擴(kuò)增后加SYBR GREEN I顯色同實(shí)施例四。LAMP結(jié)果的電泳觀察驗(yàn)證同實(shí)施例一。結(jié)果顯示當(dāng)陰性對(duì)照模板在LAMP擴(kuò)增后，經(jīng)千倍稀釋后，背景色消失。WSSV病 蝦以同樣LAMP擴(kuò)增后，經(jīng)十萬(wàn)倍稀釋后仍能發(fā)出明顯的熒光。說(shuō)明將LAMP反應(yīng)后的反應(yīng) 液經(jīng)千倍或萬(wàn)倍稀釋后，可以以熒光顯色的結(jié)果準(zhǔn)確判別對(duì)WSSV的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)施例六以緩沖液III通過(guò)快煮制備模板、LAMP擴(kuò)增、直接顯色早期檢測(cè)人工感 染克氏原螯蝦WSSV ；人工感染病蝦及對(duì)照蝦取自然感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦病蝦，處死剪碎，取蝦組 織約l.og，冰上充分研磨(以槍頭不受阻為準(zhǔn))后，3000rpm，離心5min所得上清為注射健 康蝦所用病毒懸液；失活的病毒懸液是將上述病毒懸液在100°C煮5min后所得，并用于對(duì) 照組。注射劑量為每頭蝦注射2. 5 μ L。取樣注射病毒懸液后411、511、611、1211、1811及2411分別剪取人工感染蝦的一小節(jié) 附肢，按實(shí)施例三的方法制備擴(kuò)增模板。對(duì)照蝦以注射失活病毒懸液24h后，以同樣方式取樣。LAMP擴(kuò)增同實(shí)施例一，得到圖4。LAMP擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)將LAMP反應(yīng)后稀釋10000倍，取稀釋液25 μ L加入0. 5 μ L的 100X SYBR Green I，室溫靜置5min后在紫外燈下觀察它們是否有綠色熒光顯示。同時(shí)以 末稀釋的LAMP反應(yīng)液進(jìn)行電泳(EB染色)，以通過(guò)經(jīng)典方法予以驗(yàn)證。一步PCR擴(kuò)增及結(jié)果檢測(cè)以上述制備模板，以實(shí)施例三中一步PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)電泳(EB染色)觀察，得到圖5。結(jié)果顯示以LAMP擴(kuò)增通過(guò)直接顯色觀察發(fā)現(xiàn)在感染后4h，尚無(wú)法檢測(cè)到WSSV， 但在感染了 5h及以后，可以從人工感染蝦中檢測(cè)到WSSV。而對(duì)照蝦結(jié)果沒(méi)有綠色熒光出 現(xiàn)，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性(圖4)；以一步PCR則要在注射病毒懸液24h后才能檢測(cè)到WSSV; LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果與直接熒光顯色觀察結(jié)果呈現(xiàn)完全一致(圖5)。
權(quán)利要求
一種蝦白斑綜合癥病毒病診斷用核酸樣品制備方法，其特征在于，包括以下步驟取處死的新鮮的蝦的組織，加到緩沖液III中，然后95～100℃加熱3分鐘以上，離心后取上清液作為核酸擴(kuò)增的模板；所述緩沖液III的組成為20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，10mM氯化鉀，體積百分?jǐn)?shù)0.1％曲拉通X-100，10mM硫酸銨，2mM硫酸鎂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于每lg蝦組織需要0.5 50mL緩沖 液 III。
3.—種蝦白斑綜合癥病毒檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)采用權(quán)利要求1所述上清液為擴(kuò)增模板，按照常規(guī)方法，構(gòu)建環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體 系，所述擴(kuò)增體系包括緩沖液、擴(kuò)增引物對(duì)、dNTP、Bst DNA聚合酶，并且，每25 y L擴(kuò)增體系 還包括1 P L上述上清液；(2)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)完成后，向稀釋千倍至萬(wàn)倍后的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn) 物中添加SYBR Green I，在紫外光激發(fā)下，通過(guò)肉眼直接觀察是否有被激發(fā)出的綠色熒光 結(jié)果判斷檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中的病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種蝦白斑綜合癥病毒病診斷用核酸樣品制備方法以及利用核酸樣品經(jīng)LAMP擴(kuò)增后檢測(cè)蝦白斑綜合癥病毒的方法取處死的新鮮的蝦的組織，稍剪碎后加到緩沖液III中，快煮、離心后取上清作為核酸擴(kuò)增的模板；通過(guò)LAMP擴(kuò)增后，向稀釋千倍至萬(wàn)倍后的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)產(chǎn)物中添加SYBR GreenI，在紫外光激發(fā)下，通過(guò)肉眼直接觀察是否有被激發(fā)出的綠色熒光結(jié)果判斷檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明具有高靈敏性、高特異性、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、所需樣品少、成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101838677SQ20101020165
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者周小燕, 曹廣力, 朱越雄, 沈衛(wèi)德, 薛仁宇, 貢成良, 魏育紅 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)