專利名稱：禽流感病毒單域抗體、五聚抗體及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和抗體工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明是一類源于羊駝的新型抗體及經(jīng)過改造后將其應(yīng)用于禽流感病毒診斷的生物傳感器方法。
背景技術(shù)：
流感已經(jīng)逐漸成為威脅人類健康的主要疾病之一。2009年甲型Hmi流感病毒在全球范圍內(nèi)的爆發(fā)以及2003年以來高致病性禽流感H5W給人們帶來的恐慌促使人們不斷提高應(yīng)對(duì)流感病毒的診斷和治療能力。在病毒感染早期進(jìn)行診斷有利于提高治愈率，減少病毒傳播。對(duì)于流感病毒的檢測(cè)，除了傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如病毒分離、RT-PCR等，特異性抗體也廣泛地用于各種ELISA及免疫熒光等檢測(cè)方法中。此外，也有很多提高檢測(cè)特異性及靈敏度的嘗試，例如開發(fā)特異性更強(qiáng)的抗體，在檢測(cè)系統(tǒng)中引入微球體等。盡管如此，開發(fā)基于抗體的高靈敏度流感病毒檢測(cè)方法仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，也有很大的空間去探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特色在于它是利用基因工程的方法獲得的對(duì)于禽流感病毒高親和的五聚抗體及將其應(yīng)用在基于磁性納米顆粒的生物傳感器中進(jìn)行禽流感病毒的檢測(cè)。本發(fā)明的理論根據(jù)是基于駱駝抗體的特殊性質(zhì)駱駝血清中有近一半的IgG由重鏈抗體組成，并且可以功能性的結(jié)合抗原；同樣缺失輕鏈的抗體——新抗原受體(NARs)在鯊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。由此克隆構(gòu)建的只含重鏈可變區(qū)的抗體稱為單域抗體，即VHH抗體，分子量?jī)H為15kD，可以結(jié)合一些更小的抗原表位，有更高的結(jié)合活性。此小分子抗體通過噬菌體展示技術(shù)從預(yù)先建立好的單域抗體庫中篩選得到，并亞克隆于表達(dá)載體中，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌大量表達(dá)。單域抗體僅僅由重鏈可變區(qū)便可以發(fā)揮結(jié)合抗原的功能，并顯示出可比擬的親和力。此外，由于駱駝抗體中天然存在不含有輕鏈的重鏈抗體，其可變區(qū)的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸由傳統(tǒng)抗體中的疏水突變?yōu)橛H水氨基酸，因此源于駱駝天然重鏈抗體的單域抗體具有以下三個(gè)顯著特點(diǎn) 1、具有和傳統(tǒng)抗體相比擬的親和力；2、原核表達(dá)時(shí)可溶性非常強(qiáng)，表達(dá)量較高；3、分子量更小，更易于進(jìn)行基因工程操作。這就彌補(bǔ)了傳統(tǒng)小分子抗體的致命弱點(diǎn)，為基因工程抗體的發(fā)展拓展出廣闊的空間。因此，與傳統(tǒng)的鼠源單克隆抗體相比，利用噬菌體展示技術(shù)制備單域抗體所需時(shí)間周期更短，工作量更小，且由于可以用大腸桿菌表達(dá)，產(chǎn)量也大大提高?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，首先，我們利用流感病毒免疫羊駝，建立了流感病毒免疫單域抗體噬菌體庫，并利用純化的滅活流感病毒從抗體庫中篩選出一株高親和的單域抗體 VffiKB。為了提高該抗體對(duì)禽流感病毒的親和力，使之更適用于高靈敏度檢測(cè)，我們又將單域抗體VffiKB與志賀氏毒素B亞基進(jìn)行融合表達(dá)，通過志賀氏毒素B亞基自身的五聚化使得表達(dá)產(chǎn)物五聚化，形成五聚抗體。最后利用磁性納米顆粒偶聯(lián)的五聚抗體捕獲樣本中的病毒，再以膠體金顆粒偶聯(lián)的鼠源禽流感病毒特異性抗體3C8為檢測(cè)抗體，通過這樣的組合，建立起高靈敏的生物傳感器方法，進(jìn)行病毒的高靈敏度檢測(cè)。本發(fā)明在技術(shù)路線方面的創(chuàng)新之處在于1、利用滅活禽流感H5m和H5N2病毒共同免疫成年羊駝，經(jīng)過三次加強(qiáng)免疫后，分離B細(xì)胞建立免疫羊駝單域抗體庫，并篩選出禽流感特異的高親和力單域抗體；2、利用志賀氏毒素B亞基自身五聚化的性質(zhì)，將禽流感單域抗體與之融合表達(dá)，形成禽流感病毒特異性的五聚抗體。五聚后的抗體表現(xiàn)出更高的親和力，更適用于禽流感病毒的高靈敏度檢測(cè)的需要。3、利用磁性納米顆粒偶聯(lián)的五聚抗體作為捕獲抗體和膠體金顆粒偶聯(lián)的鼠源抗禽流感單抗進(jìn)行禽流感病毒的檢測(cè)。4、利用金催化的對(duì)苯二酚氧化生成苯醌的反應(yīng)作為檢測(cè)結(jié)果的反映。具體內(nèi)容如下1.獲得對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟1)建立禽流感病毒免疫單域抗體噬菌體庫，和2)利用噬菌體展示技術(shù)從所述單域抗體噬菌體庫中篩選對(duì)禽流感病毒親和力高的單域抗體克隆，其中，優(yōu)選地，所述禽流感病毒是流感疫苗H5m亞型Rel株和H5N2亞型擬8株。
2. 一種對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體，其特征在于所述單域抗體是通過以上1的方法獲得的。3. 一種對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體，其特征在于所述單域抗體的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。4. 一種對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的五聚抗體，其特征在于所述五聚抗體是由以上2或3所述的單域抗體通過五聚體核心形成的五聚抗體，其中所述五聚體核心可以是含有志賀氏毒素B亞基基因片段的五聚體載體，優(yōu)選是pVT2。5.以上4所述的五聚抗體，其特征在于所述五聚抗體具有5個(gè)氨基酸序列如SEQ ID No 2所示的單體。6.構(gòu)建以上4或5所述的五聚抗體的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟1)將以上2或3所述的單域抗體的基因片段亞克隆到含有志賀氏毒素B亞基基因片段的五聚體載體中以獲得重組載體，和2)表達(dá)所述重組載體，其中所述含有志賀氏毒素B亞基基因片段的五聚體載體優(yōu)選是pVT2。7.以上2或3所述的單域抗體或以上4或5所述的五聚抗體用于捕獲禽流感病毒顆粒的應(yīng)用。8.對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的磁性五聚抗體，其特征在于所述磁性五聚抗體通過使以上4或5的五聚抗體與磁性納米顆粒偶聯(lián)形成。9.檢測(cè)禽流感病毒的試劑盒，其包括1)以上8所述的磁性五聚抗體；2)與金納米顆粒偶聯(lián)的抗禽流感抗體；和3)對(duì)苯二酚。10.檢測(cè)禽流感病毒的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)向樣品和空白對(duì)照中分別加入以上8的磁性五聚抗體并利用磁性進(jìn)行分離，以獲得具有磁性的被分離物，2)向步驟1)中獲得的被分離物中加入與金納米顆粒偶聯(lián)的抗禽流感抗體并利用磁性進(jìn)行分離，以獲得具有磁性的被分離物3)向步驟2)中獲得的被分離物中加入對(duì)苯二酚并在390nm處測(cè)量其光吸收值，和4)通過對(duì)所述樣品獲得的390nm處的光吸收值大于對(duì)所述空白對(duì)照獲得的390nm 處的光吸收值，確定所述樣品中具有禽流感病毒。11.以上8所述的磁性五聚抗體和以上9所述的試劑盒用于檢測(cè)禽流感病毒的應(yīng)用。附圖簡(jiǎn)述

圖1.禽流感病毒抗體庫經(jīng)四輪篩選富集數(shù)計(jì)算；圖2. SDS-PAGE分析抗禽流感病毒單域抗體的純度，其中左側(cè)泳道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；右側(cè)泳道純化的抗禽流感病毒單域抗體；圖3.抗禽流感病毒單域抗體結(jié)合特異性；圖4.表面等離子共振技術(shù)分析單域抗體的結(jié)合能力；圖5. SDS-PAGE分析抗禽流感病毒五聚體抗體的純度，其中左側(cè)泳道蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；右側(cè)泳道純化的抗禽流感病毒五聚體抗體；圖6.抗禽流感病毒五聚體抗體結(jié)合特異性；圖7.表面等離子共振技術(shù)分析五聚體抗體的結(jié)合能力；圖8.基于磁性納米顆粒的生物傳感器檢測(cè)禽流感病毒；圖9.雙抗夾心ELISA檢測(cè)禽流感病毒；圖10.噬菌粒載體pCANTAB5E圖譜；圖11.表達(dá)載體pET28a圖譜；和圖12.五聚體載體pVT2序列圖譜。序列說明SEQ ID No 1單域抗體VffiKB的氨基酸序列；和SEQ ID No 2五聚抗體pVffiKB的單體的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式為了更全面地理解和應(yīng)用本發(fā)明，提供下列實(shí)施例。實(shí)施例一單域抗體的制備和鑒定應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)單域抗體VffiKB (Arbabi Ghahroudi and Muyldermans, Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies,FEBS Letters，1997)。簡(jiǎn)述如下利用商品化的禽流感疫苗H5m 亞型Rel株(商購(gòu)自北京獸醫(yī)總站)和H5N2亞型擬8株(商購(gòu)自北京獸醫(yī)總站)對(duì)兩只成年羊駝(Alpaca，駱駝科，美洲駝屬，購(gòu)自中華羊駝養(yǎng)殖基地，Vicugna pacos)(代號(hào)分別為 B007和B008)進(jìn)行頸部?jī)蓚?cè)淋巴結(jié)皮下多點(diǎn)免疫接種，每隔10天免疫一次，共分三次。最后一次免疫接種后10天分別取兩只羊駝的外周血，用紅細(xì)胞裂解液(商購(gòu)自天根生化科技 (北京)有限公司)裂解血細(xì)胞，離心收集白細(xì)胞。加入ImlTrizol (商購(gòu)自hvitrogen)， 室溫靜置5min。加入200μ 1氯仿靜置2-;3min。12000rpm，4°C離心15min。轉(zhuǎn)移上層水相到另一新離心管內(nèi)，加入500 μ 1異丙醇充分混勻后-20°C靜置lOmin，12000rpm 4°C離心 IOmin后，棄上清。沉淀RNA用Iml 75%乙醇漂洗2_3次，4°C 7500rpm離心5min，棄上清。RNA沉淀室溫干燥5-lOmin，用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水50 μ 1于55°C溫育IOmin 完全溶解RNA。以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (Invitrogen試劑盒，反應(yīng)條件加RNA 2μ g,20yM oligo dT 3μ Ι,ΙΟμΜ dNTP 1 μ 1 于 PCR 管中，加水至 13 μ 1。65°C 孵育 5min，迅速置冰上 2-3min。加入 5Xbuffer 4 μ 1, IOOmM DTTl μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶 SSIII RT Ιμ ，RNase 抑制劑 HRPI Ιμ 混合均勻。50°C lh，75°C 15min)。以cDNA產(chǎn)物為模板，先后用表1中的兩對(duì)引物 VHBACKA6，CH2F0RTA4 和 F-PRCCAMEL，R-PCRCAMEL 進(jìn)行巢式 PCR (反應(yīng)條件94°C，5min 預(yù)變性；94°C，30s, 55°C，30s, 72°C，40s, 30個(gè)循環(huán)；72 V延伸7min)，擴(kuò)增出特異的VHH片斷。表1利用巢式PCR方法擴(kuò)增VHH片段所用兩組引物
權(quán)利要求
1.獲得對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟1)建立禽流感病毒免疫單域抗體噬菌體庫，和2)利用噬菌體展示技術(shù)從所述單域抗體噬菌體庫中篩選對(duì)禽流感病毒親和力高的單域抗體克隆，其中，優(yōu)選地，所述禽流感病毒是流感疫苗H5m亞型Rel株和H5N2亞型擬8株。
2.一種對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體，其特征在于所述單域抗體是通過權(quán)利要求1的方法獲得的。
3.一種對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體，其特征在于所述單域抗體的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。
4.一種對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的五聚抗體，其特征在于所述五聚抗體是由權(quán)利要求2或3所述的單域抗體通過五聚體核心形成的五聚抗體，其中所述五聚體核心可以是含有志賀氏毒素B亞基基因片段的五聚體載體，優(yōu)選是pVT2。
5.權(quán)利要求4所述的五聚抗體，其特征在于所述五聚抗體具有5個(gè)氨基酸序列如SEQ ID No 2所示的單體。
6.構(gòu)建權(quán)利要求4或5所述的五聚抗體的方法，其特征在于所述方法包括下列步驟1)將權(quán)利要求2或3所述的單域抗體的基因片段亞克隆到含有志賀氏毒素B亞基基因片段的五聚體載體中以獲得重組載體，和2)表達(dá)所述重組載體，其中所述含有志賀氏毒素B亞基基因片段的五聚體載體優(yōu)選是pVT2。
7.權(quán)利要求2或3所述的單域抗體或權(quán)利要求4或5所述的五聚抗體用于捕獲禽流感病毒顆粒的應(yīng)用。
8.對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的磁性五聚抗體，其特征在于所述磁性五聚抗體通過使權(quán)利要求4或5的五聚抗體與磁性納米顆粒偶聯(lián)形成。
9.檢測(cè)禽流感病毒的試劑盒，其包括1)權(quán)利要求8所述的磁性五聚抗體；2)與金納米顆粒偶聯(lián)的抗禽流感抗體；和3)對(duì)苯二酚。
10.檢測(cè)禽流感病毒的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)向樣品和空白對(duì)照中分別加入權(quán)利要求8的磁性五聚抗體并利用磁性進(jìn)行分離，以獲得具有磁性的被分離物，2)向步驟1)中獲得的被分離物中加入與金納米顆粒偶聯(lián)的抗禽流感抗體并利用磁性進(jìn)行分離，以獲得具有磁性的被分離物，3)向步驟2)中獲得的被分離物中加入對(duì)苯二酚并在390nm處測(cè)量其光吸收值，和4)通過對(duì)所述樣品獲得的390nm處的光吸收值大于對(duì)所述空白對(duì)照獲得的390nm處的光吸收值，確定所述樣品中具有禽流感病毒。
11.權(quán)利要求8所述的磁性五聚抗體和權(quán)利要求9所述的試劑盒用于檢測(cè)禽流感病毒的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的單域抗體及其制備方法。本發(fā)明還涉及對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的五聚抗體，及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明還涉及對(duì)禽流感病毒具有特異結(jié)合能力的磁性五聚抗體及利用該磁性五聚抗體檢測(cè)禽流感病毒的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102276719SQ20101020147
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者馮靜, 盧迪, 莊潔, 楊東玲, 穆彬, 閻錫蘊(yùn) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所