專利名稱：抗fgf23抗體和含有該抗體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以與FGF23抗原特異性結(jié)合的抗FGF23抗體。而且，本發(fā)明還涉及ー種可用于預(yù)防或治療FGF23過量引起的或其他原因引起的礦物質(zhì)代謝紊亂的藥物，其包含抗FGF23抗體作為活性成分。尤其是，本發(fā)明涉及一種用于治療低血磷癥性佝僂病(hypophosphatemic ricket)和軟骨病(osteomalachia)的藥物。
背景技術(shù)：
作為ー種可以刺激成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞增長的物質(zhì)，成纖維細(xì)胞生長因子 首次分離純化自牛垂體。然后，從不同組織中分離出多種類似的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物組成了一個(gè)多肽家族(FGF家族)。到目前為止，在脊椎動(dòng)物中，得到分離純化的FGF家族成員已有22種蛋白質(zhì)。關(guān)于這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，目前已知，其不僅具有成纖維細(xì)胞生長活性，還具有多種其它不同功能如中胚層和神經(jīng)外胚層生長活性，血管生成活性，特定發(fā)育階段肢芽形成活性等。FGF的基因表達(dá)也具有位置和時(shí)間差異性。它通常僅僅表達(dá)于特定發(fā)育階段或成人的某些位點(diǎn)。目前已知，至少有四個(gè)編碼FGF受體的基因，F(xiàn)GFRl, FGFR2，F(xiàn)GFR3，和FGFR4。另外，關(guān)于FGFR1，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)GFR3，已知的是，對于每ー種受體，由于不同的剪切方式，產(chǎn)生的受體蛋白具有不同的胞外結(jié)構(gòu)域。另外，目前已知，肝素和硫酸こ酰肝素蛋白聚糖通過與FGF和FGF受體的相互作用而控制其活性。另外，還有很多雖因具有與FGF相似的結(jié)構(gòu)，而屬于FGF家族，但其生物學(xué)活性和受體結(jié)合特性等幾乎不明。有ー篇綜述(詳情請看文獻(xiàn)Ornitz, D.等,Genome biology, 2 :3005. 1-3005. 12,2001)總結(jié)了這些FGF家族成員的特性。FGF23 ( 一般來講，有時(shí)候也被記作FGF-23)的首次克隆是利用FGF15同源性的數(shù)據(jù)庫搜索和PCR方法自小鼠獲得的。隨后，利用小鼠FGF23同源序列，人FGF23也得到克隆。人FGF23是一條由251個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。另外，預(yù)計(jì)，作為分泌信號(hào)序列，在蛋白質(zhì)分泌時(shí)，多肽N-末端由多達(dá)24個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列被剪切(詳情請看文獻(xiàn)Yamashita, T.等，Biochem. Biophy. Res. Commun. , 277 :494-498, 2000)。然后，對常染色體顯性型低血磷癥性佝僂病/軟骨病(以下稱作ADHR)的研究發(fā)現(xiàn)，ADHR病人的基因突變區(qū)域變窄(narrow down)，隨著相關(guān)基因鑒定的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)ADHR病人的FGF23基因發(fā)生了一個(gè)導(dǎo)致此現(xiàn)象的特有的錯(cuò)義突變(詳情請看文獻(xiàn)White, K. E.等，Nature Genet. ,26 345-348, 2000) 0這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈表明，F(xiàn)GF23在體內(nèi)具有重要的生理學(xué)意義。另ー方面，是什么在決定FGF23的生物學(xué)活性，這通過低血磷癥性佝僂病和軟骨病的一種類型-腫瘤性軟骨病(neoplastic osteomalachia)得到了研究。在這些疾病中，惡性腫瘤產(chǎn)生和分泌一種液態(tài)疾病起始因子，正如所想的那樣，像低血磷癥性佝僂病和軟骨病等疾病是由此疾病起始因子導(dǎo)致的。
在對所述由惡性腫瘤產(chǎn)生的疾病起始因子的研究中，F(xiàn)GF23作為ー種在腫瘤中過量表達(dá)的基因被克隆。此外，通過給予這種因子，低血磷癥性佝僂病/軟骨病被重現(xiàn)(詳情請看文獻(xiàn) Shimada, T.等，Proc. Natl. Acad. Sci.，98 :6500-6505, 2001 以及 InternationalPublication Number W002/14504 pamphlet)。基于以上研究表明，在體內(nèi)，F(xiàn)GF23表現(xiàn)出與磷和鈣元素相關(guān)的的代謝控制有關(guān)的生物學(xué)功能。另外，由此表明，作為系統(tǒng)性因子，F(xiàn)GF23通過體內(nèi)循環(huán)來實(shí)現(xiàn)自己功能。此外，最近的研究顯示與健康人相比，腫瘤性軟骨病患者血管中 FGF23 濃度更高(詳情請看文獻(xiàn) Yamazaki, Y.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,87 4957-4960，2002 以及 Jonsson, K. B.，等，N. Engl. J. Med.，348 1656-1663，2003)。此外，已知X染色體-連鎖遺傳的低血磷癥性佝僂病(以下稱為XLH)是ー種在臨床上與ADHR和腫瘤性軟骨病患者具有相似表現(xiàn)的疾病?；加羞@種疾病的患者血液中也含有高水平的 FGF23 (詳情請看文獻(xiàn) Yamazaki, Y.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,87 4957-4960，2002 以及 Jonsson, K. B.，等，N. Engl. J. Med.，348 1656-1663，2003)。換句話說，在腫瘤性軟骨病和XLH等疾病中發(fā)現(xiàn)的維生素D耐受性佝僂病和軟骨病的病因先前并不清楚，但而今表明此分泌性致病因子正是FGF23。此外，在關(guān) 于其它類型的礦物質(zhì)代謝性疾病如骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、麥-奧ニ氏綜合征、常染色體隱性低血磷癥性佝僂病等疾病的研究中，也有過有關(guān)血液中高濃度的FGF23與低血磷癥(hypophosphatemia)、拘僂病和軟骨病的相關(guān)性報(bào)道(詳情請看文獻(xiàn)Riminucci,M.等，J. Clin. Invest. , 112 :683-692, 2003 ；Yamamoto, T.等，J. Bone Miner. Metab. ,23 231-237, 2005 ；Lorenz-Depiereux, B.等，Nat. Genet.，38 :1248-1250,2006)。以上報(bào)道表明，體內(nèi)過量表達(dá)FGF23會(huì)導(dǎo)致低血磷癥、低血磷癥伴隨性佝僂病和軟骨病等疾病。此外，有報(bào)道表明，慢性腎功能不全性高血磷癥患者的血清中出現(xiàn)反常高水平FGF23。有證據(jù)證明FGF23的過量表達(dá)可能與慢性腎功能不全時(shí)發(fā)生的部分礦物質(zhì)代謝疾病有關(guān)(詳情請看文獻(xiàn) Gupta, A.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,89 :4489-4492,2004,Larsson, T.等，Kidney Int. , 64 :2272-2279, 2003)。由于引起這些疾病的原因是FGF23的過量表達(dá)，那么抑制FGF23的活性或消除FGF23就可能成為治療這些疾病的辦法。到目前為止，已見有抗-FGF23小鼠單克隆抗體用于抑制FGF23活性的研究報(bào)道(詳情請看文獻(xiàn)Yamashita, T.等，Biochem. Biophy. Res.Commun.，277 :494_498，2000)。在這篇報(bào)道中，當(dāng)將抗-FGF23鼠單克隆抗體2C3B和3C1E給予正常小鼠時(shí)，小鼠內(nèi)源性FGF23功能被抑制，通過腎完成的磷排泄也被抑制。通過干擾腎中維生素D代謝酶的表達(dá)，干擾結(jié)果表明血清中磷和Ia，25_ ニ羥維生素D(以下記作1，25D)的濃度升高。此外，將抗-FGF23鼠單克隆抗體重復(fù)給予Hyp小鼠，所述Hyp小鼠是ー種具有高水平FGF23血清，低血磷癥，骨延長機(jī)能障礙和鈣化機(jī)能障礙的XLH疾病的模型小鼠，其結(jié)果，可以看到小鼠血液中磷濃度升高，而且，骨延長機(jī)能障礙和鈣化機(jī)能障礙癥狀得到改善。通過這些結(jié)果可以看到，F(xiàn)GF23活性抑制性抗體作為ー種用于FGF23過量表達(dá)型疾病的治療藥物是可行的。然而，在文獻(xiàn)報(bào)道中所用到的2C3B和3C1E抗體是鼠源抗體。鼠源抗體會(huì)被人宿主當(dāng)做異物從而導(dǎo)致人宿主產(chǎn)生ー種所謂的“人抗鼠抗體”(也即是HAMA)反應(yīng),這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用(詳情請看文獻(xiàn)Van Kroonenbergh7M. J.等,Nucl.Med. Commun. 9 :919-930,1988)。為避免產(chǎn)生這種問題，一種解決方法是研制嵌合型抗體(詳情請看歐洲專利申請公告號(hào)120694說明書和歐洲專利申請公告號(hào)125023說明書)。嵌合型抗體包含來源于兩個(gè)或兩個(gè)以上物種的抗體片段(如鼠源抗體可變區(qū)和人源抗體恒定區(qū)等)。這種類型的嵌合型抗體的優(yōu)勢是原鼠源抗體的對抗原的結(jié)合特性得到保留。但是，另一方面，嵌合型抗體仍然會(huì)誘導(dǎo)人宿主產(chǎn)生“人抗嵌合型抗體”(也即是“HACA”)反應(yīng)(詳情請看文獻(xiàn)Bruggemann, M.等，J. Exp. Med.，170 :2153-2157,1989)。此外，已經(jīng)有重組型抗體被研制出來，其中，只有取代型抗體的一部分是互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region, CDR)(詳情請看英國專利號(hào) GB2188638A 專利說明書和美國專利號(hào)5585089專利說明書)。應(yīng)用CDR移植技術(shù)，制成一種由鼠CDR、人可變構(gòu)架區(qū)和恒定區(qū)組成的抗體(也即是人源化抗體)(詳情請看文獻(xiàn)Riechmann, L.等，Nature, 332 :323_327，1988)。目前已經(jīng)知道，使用上述方法，抗-FGF23鼠源抗體(如2C3B抗體等)可通過人抗體序列取代鼠源抗體而被人源化。然而，在發(fā)生人源化時(shí)，有可能導(dǎo)致對抗原的親和性降低。、
另外，目前對由XLH等類似疾病引起的低血癥性佝僂病的主要治療方法是定期ロ服給藥維生素D制劑和磷酸。但是，這種治療手段會(huì)導(dǎo)致ー個(gè)問題，也即是這會(huì)導(dǎo)致患者及其家庭要承受由每天用藥次數(shù)和劑量決定的相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)。因此，為減輕患者及其家庭承受的這種負(fù)擔(dān)，需要對血清磷酸鹽濃度和血清1，25D濃度有長時(shí)間持續(xù)性增長作用的(sustained raising action)低血磷癥治療性藥物,從而延長給藥之間的間_時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人抗FGF23抗體及其藥物組合物，所述藥物組合物例如用于預(yù)防或治療等作用并且?guī)缀鯖]有副作用的藥物，其通過利用所述抗體抑制FGF23作用并由此預(yù)防和治療疾病。此外，本發(fā)明的目的是提供ー種抗體，所述抗體是能用作低血磷癥治療藥物的抗-FGF23抗體，與現(xiàn)有的抗-FGF23抗體相比，它僅使用單ー劑量即可產(chǎn)生對血清磷酸鹽(phosphate)濃度和血清1，2 濃度的更長時(shí)間的持續(xù)增長作用。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種藥物組合物，例如使用所述抗體用于預(yù)防和治療FGF23相關(guān)性疾病的藥物。目前，低血磷癥性佝僂病的主流治療手段是每天數(shù)次定期ロ服維生素D和磷酸鹽的給藥方式。然而，每天數(shù)次的大劑量ロ服藥物，產(chǎn)生ー個(gè)問題，也即病人被迫承受ー個(gè)大的負(fù)擔(dān)。本發(fā)明獲得的抗-FGF23人單克隆抗體，ClO抗體，被證實(shí)具有對血清磷酸鹽濃度和血清1，2 濃度的更長時(shí)間持續(xù)增長作用。這些表明，與目前已有的低血磷癥治療性藥物相比，ClO抗體可望在治療上具有明顯的優(yōu)越性。本發(fā)明如下[I] 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有雜交瘤細(xì)胞ClO (索取號(hào)FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)。[2] 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有SEQ ID NO 12的從第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示的重鏈氨基酸序列和/或SEQ ID NO 14的從第23位A到第128位K的氨基酸序列所示的輕鏈氨基酸序列。[3] 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其中，所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段含有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；且此重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO :12的從第20位Q到第136位S的氨基酸序列所示，此輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO 14的從第23位A到第128位K的氨基酸序列所示。[4]由雜交瘤細(xì)胞ClO (索取號(hào)FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段。[5] ー種抗體或此抗體的功能性片段，其結(jié)合于人FGF23上的全部或部分表位，所述人FGF23上的全部或部分表位結(jié)合由雜交瘤細(xì)胞ClO (索取號(hào)FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗體。[6] 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有在上述[3]中所述的重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有任何ー個(gè)或所有以下互補(bǔ)決定區(qū)(OTR):由SEQ ID N0:40的氨基酸序列所示的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻1，由SEQ ID NO 41的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 42的氨基酸序列所示的CDR3。 [7] 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有在上述[3]中所述的輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)具有任何ー個(gè)或所有以下互補(bǔ)決定區(qū)(CDR):由SEQ ID N0:43的氨基酸序列所示的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶幻1，由SEQ ID NO 44的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 45的氨基酸序列所示的CDR3。[8] 一種抗人FGF23抗體或該抗體的功能性片段，所述抗人FGF23抗體或該抗體的功能性片段含有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有任何ー個(gè)或所有以下互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)由SEQ ID NO 40的氨基酸序列所示的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 1，由SEQ ID NO 41的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 42的氨基酸序列所示的⑶R3 ;所述抗人FGF23抗體或該抗體的功能性片段還含有輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)具有任何ー個(gè)或所有以下互補(bǔ)決定區(qū)(CDR):由SEQ ID NO :43的氨基酸序列所示的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 1，由SEQ ID NO :44的氨基酸序列所示的⑶R2，以及由SEQ ID NO 45的氨基酸序列所示的⑶R3。[9]如[1]-[8]中任何ー項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其中所述功能性片段是選自Fab、Fab'、F(ab' )2、ニ硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)、ニ聚化的V區(qū)域(雙體)、單鏈Fv (scFv)和CDR的肽段。[10]如[1]-[8]中任何ー項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其包含重鏈和/或輕鏈，所述重鏈和/或輕鏈具有的氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基被缺失、取代或添加。[11]如[I]-[10]中任何ー項(xiàng)所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體的種類是IgG、IgA、IgE 或 IgM。[12]如[11]所述抗人？6 23抗體，其中，所述抗體的亞類是1861、1862、化63、或IgG4。[13] ー種藥物組合物，其含有如[1]_[12]中任何ー項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分。[14] ー種藥物組合物，其可通過FGF23控制磷代謝和/或維生素D代謝并含有如[1]-[12]中任何ー項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分。[15] ー種用于礦物質(zhì)代謝紊亂相關(guān)性疾病的預(yù)防或治療的藥物組合物，其含有如[1]-[12]中任何ー項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分。[16]如[15]所述藥物組合物，其中，所述礦物質(zhì)代謝紊亂相關(guān)性疾病選自腫瘤性軟骨病、ADHR、XLH、骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、麥-奧ニ氏綜合征和常染色體隱性低血磷癥。[17] ー種藥物組合物，其用于預(yù)防或治療選自骨質(zhì)疏松癥、佝僂病、高鈣血癥、低鈣血癥、異位鈣化癥、骨硬化、派杰病、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、甲狀旁腺機(jī)能減退癥和搔癢癥的疾病，此藥物組合物含有如[1]_[12]中任何一項(xiàng)所述的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分，[18]雜交瘤細(xì)胞 ClO (索取號(hào) FERM BP-10772)。[19] 一種編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列的核酸，其中，此重鏈可變區(qū)氨基酸序列由SEQ ID NO : 11所示從第58位C到第408位A的堿基序列編碼。[20] 一種編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的核酸，其中，此輕鏈可變區(qū)氨基酸序列由
SEQ ID NO 13所示從第67位G到第384位A的堿基序列編碼。[21] ー種載體，其含有如[19]或[20]中所述核酸。[22] ー種宿主細(xì)胞,其含有如[21]中所述載體。[23] 一種抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段的制造方法，包括步驟培養(yǎng)如中所述的宿主細(xì)胞以表達(dá)抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段。


圖I為ClO表達(dá)載體構(gòu)建過程示意2顯示的是N5KG1_C10_LH中抗體重鏈基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 30)和氨基酸序列(SEQ ID NO 31)。圖中矩形框標(biāo)記的氨基酸序列為分泌信號(hào)序列(前導(dǎo)序列)。圖3顯示的是N5KG1_C10_LH中抗體輕鏈基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 32)和氨基酸序列(SEQ ID NO 33)。圖中矩形框標(biāo)記的氨基酸序列為分泌信號(hào)序列(前導(dǎo)序列)。圖4顯示的是ClO表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。圖5A顯示的是用夾心酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)對純化得到的全長人FGF23蛋白進(jìn)行檢測所得到的測定結(jié)果，其中利用2C3B抗體或ClO抗體作為固定抗體，3C1E抗體為檢測抗體。圖5B顯示的是用夾心酶聯(lián)免疫分析法(ELISA法)對表達(dá)FGF23的獼猴(cynomolgus monkey)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液檢測后所得到的測定結(jié)果,其中利用2C3B抗體或ClO抗體作為固定抗體，3C1E抗體為檢測抗體。圖6中圖表所顯示的是對獼猴作2C3B抗體或ClO抗體給藥時(shí)，隨時(shí)間推移在不同時(shí)間點(diǎn)獼猴血清磷濃度的檢測結(jié)果。測定值以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法(Student-test)檢驗(yàn)其與溶劑給藥組的顯著差異,對有顯著差異(P <0.05)的測定值在圖表中標(biāo)上*號(hào)。圖7中圖表所示為以對獼猴溶劑給藥5天后，獼猴血清磷濃度為基準(zhǔn)，對獼猴作可溶性2C3B抗體或ClO抗體給藥5天后，獼猴血清磷濃度的升高。圖8中圖表所示為對獼猴作溶剤、2C3B抗體或ClO抗體給藥吋，隨時(shí)間推移在不同時(shí)間點(diǎn)獼猴血清1，2 濃度的檢測結(jié)果。測定值以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法在同一天進(jìn)行測試組與溶劑給藥組之間的顯著性差異測試吋，對有顯著差異(P < O. 05)的測定值在圖表中標(biāo)上*號(hào)。圖9中圖片顯示的是用C15抗體和蛋白質(zhì)雜交(Western blotting)技術(shù),檢測非強(qiáng)制性表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(作為對照)、表達(dá)FGF23的人細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和表達(dá)FGF23的獼猴細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。圖10顯示的是pPSs FGF23載體的結(jié)構(gòu)。圖11顯示的是pUS FGF23 KI載體的結(jié)構(gòu)。圖12所為3種等位基因結(jié)構(gòu)一種等位基因結(jié)構(gòu)為其中的藥物抗性基因(loxp-pec/)被定向，ー種等位基因結(jié)構(gòu)為其中的人FGF23(-SP)+藥物抗性基因(loxp-peor)通過pUS hFGF23 KI載體被定向，ー種等位基因結(jié)構(gòu)為其中的藥物抗性基因(loxp-peor>loxpv-puror)被敲除，以及DNA印跡分析用探針的位置。對圖中出現(xiàn)的專有名詞的詳細(xì)解釋如下
hFGF23(_SP):缺少特定的信號(hào)肽編碼區(qū)的人FGF23基因。Ck :小鼠IgK基因恒定區(qū)。loxpv-puro :其兩端帶有Ioxpv序列的嘌呤霉素抗性基因,所述Ioxpv序列是具有部分突變的Ioxp序列。loxp-nec/ :其兩端帶有Ioxp序列的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因。Ck3 '探針DNA印跡(Southern blotting)分析探針，用于篩選hFGFZSdPHloxpv-purc/基因的轉(zhuǎn)入和loxpv-puro1基因的敲除克隆。3' KO-探針DNA印跡分析探針，用于篩選loxp-nec/基因的轉(zhuǎn)入和敲除克隆。E =EcoRI限制酶切位點(diǎn)。圖13中圖表顯示的是對照抗體或ClO抗體給藥處理前7天的血清FGF23濃度的檢測結(jié)果。測定值以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法(Student’s t-test)檢驗(yàn)測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(P<0. 001)的組在圖表中標(biāo)上***號(hào)。圖14中圖表顯示的是對照抗體或ClO抗體給藥處理前7天和對照抗體或ClO抗體首次給藥處理3天后的血清磷酸鹽濃度檢測結(jié)果。測定值以平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(P < O. 001)的組在圖表中標(biāo)上號(hào)。另外，一天中檢驗(yàn)hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組之間的顯著差異時(shí)，對有顯著差異(P < O. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗體給藥組在圖表中標(biāo)上###號(hào)。圖15中圖表顯示的是第五次對照抗體或ClO抗體給藥處理I天后血清磷濃度檢測結(jié)果。測定值以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(P <0.001)的組在圖表中標(biāo)上***號(hào)。另外，檢驗(yàn)hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組之間的顯著差異時(shí)，對有顯著差異(P < 0. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗體給藥組在圖表中標(biāo)上###號(hào)。圖16中圖表顯示的是第四次對照抗體或ClO抗體給藥處理I天后動(dòng)物握力試驗(yàn)檢測結(jié)果。測定值以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(p<0.001)的組在圖表中標(biāo)上***號(hào)。此外，檢驗(yàn)hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組之間的顯著差異時(shí)，對有顯著差異(P < 0. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗體給藥組在圖表中標(biāo)上###號(hào)。圖17所示的是小鼠股骨組織染色圖像，所用的股骨來自于第五次對照抗體或ClO抗體給藥處理I天后的小鼠，其中使用的染色方法為Villanueva-Goldner染色法。圖18中圖表顯示的是小鼠脛骨灰燼重量占脛骨干重的比值測定結(jié)果，其中所用的股骨來自于第五次對照抗體或ClO抗體給藥處理I天后的小鼠。測定值以平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。此外，用斯氏T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)測試組與野生型小鼠組的顯著差異，對有顯著差異(P < O. 001)的組在圖表中標(biāo)上號(hào)。另外，檢驗(yàn)hFGF23KI型小鼠對照抗體給藥組與測試組之間的顯著差異時(shí)，對有顯著差異(P < O. 001)的hFGF23KI型小鼠ClO抗體給藥組在圖表中標(biāo)上###號(hào)。[序列表純文本]SEQ ID NO : 1-3、5-27、30-33、44_50 合成
具體實(shí)施例方式下面，通過對本發(fā)明中所用到的專有名詞定義的闡述，對本發(fā)明作詳細(xì)說明。 I、本發(fā)明中的抗體I.抗-FGF23抗體和它的功能性片段本發(fā)明所述抗體是抗-FGF23抗體，其是成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族的成員。在本發(fā)明中，抗FGF23抗體與FGF23或其部分相結(jié)合，對FGF23或其部分具有反應(yīng)活性，或識(shí)別FGF23或其部分。抗FGF23抗體也被稱為抗-FGF23抗體。在本發(fā)明中，抗體是免疫球蛋白，其中，組成該免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)的所有結(jié)構(gòu)區(qū)域均來自于編碼此免疫球蛋白的基因。此抗體優(yōu)選單克隆抗體。在這里，F(xiàn)GF23的部分表示SEQ ID NO 4所示的FGF 23全長氨基酸序列的一部分氨基酸序列，且此部分是包括連續(xù)性氨基酸序列的FGF 23肽段。優(yōu)選此抗體含有SEQ ID NO : 12中從第20位Q到第136位S的氨基酸序列和/或SEQ ID NO 14中從第23位A到第128位K的氨基酸序列。此抗體更優(yōu)選是由雜交瘤細(xì)胞ClO產(chǎn)生的抗體。SEQ ID NO :12是包含前導(dǎo)序列在內(nèi)的抗FGF 23抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，SEQ ID NO 12中從第20位Q到第136位S的氨基酸序列是此氨基酸序列被剪去前導(dǎo)序列后形成的成熟氨基酸序列片段。另外，SEQ ID NO : 14是包含前導(dǎo)序列在內(nèi)的抗FGF 23抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，SEQ IDNO 14中從第23位A到第128位K的氨基酸序列是此氨基酸序列被剪去前導(dǎo)序列后形成的成熟氨基酸序列片段。關(guān)于抗體類型，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白M(IgM)均可被使用。優(yōu)選免疫球蛋白G(IgG)，進(jìn)ー步地，對于免疫球蛋白G(IgG)的亞類，1861、1862、1863、1864均可被使用，優(yōu)選1861、化62和IgG4。更優(yōu)選 IgGl。本發(fā)明所述抗體也包括抗FGF23抗體，此抗體含有新型互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)氨基酸序列。CDR存在于抗體可變區(qū)，這部分結(jié)構(gòu)提供抗原識(shí)別特異性?？勺儏^(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)之外的部分起到保持互補(bǔ)決定區(qū)結(jié)構(gòu)的作用，被稱為框架區(qū)(framework region, FR)。恒定區(qū)存在于重鏈和輕鏈的C-末端，且分別稱為重鏈恒定區(qū)(CH)和輕鏈恒定區(qū)(CL)。出現(xiàn)在重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)是互補(bǔ)決定區(qū)1(⑶R1)、互補(bǔ)決定區(qū)2(⑶R2)和互補(bǔ)決定區(qū)3(⑶R3)。在重鏈可變區(qū)的這3種互補(bǔ)決定區(qū)一起被稱為重鏈互補(bǔ)決定區(qū)。同樣地，出現(xiàn)在輕鏈可變區(qū)的的3種互補(bǔ)決定區(qū)是互補(bǔ)決定區(qū)I (⑶Rl)、互補(bǔ)決定區(qū)2(⑶R2)和互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)。在輕鏈可變區(qū)中的這3種互補(bǔ)決定區(qū)一起被稱為輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)。這些互補(bǔ)決定區(qū)的序列可利用在美國公共衛(wèi)生和人類服務(wù)部(1991)的“具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)序列，，(Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Healthand Human Services (1991))等中所描述的方法獲得。本發(fā)明所述抗體優(yōu)選具有SEQ ID NO 40中所示的CDR1、SEQ ID NO 41中所示的⑶R2和SEQ ID NO :42中所示的⑶R3中的至少任意ー種或所有互補(bǔ)決定區(qū)作為抗體的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)。另外，本發(fā)明所述抗體優(yōu)選具有SEQ ID NO :43中所示的CDR1、SEQ ID NO 44中所示的⑶R2和SEQ ID NO :45中所示的⑶R3中的至少任意ー種或所有互補(bǔ)決定區(qū)作為抗體的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)。本發(fā)明所述抗體優(yōu)選是與FGF23結(jié)合的抗體，并具有SEQ ID NO:40中所示的⑶R1、SEQ ID NO 41中所示的⑶R2和SEQ ID NO 42中所示的⑶R3作為抗體的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，且具有SEQ ID NO :43中所示的CDR1、SEQ ID NO :44中所示的CDR2和SEQ ID NO 45中所示的⑶R3作為抗體的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)。本發(fā)明所述抗體的CDR序列沒有特別限制。然而 ，本發(fā)明所述抗體優(yōu)選包含SEQID NO 40-45所示的互補(bǔ)決定區(qū)序列中任ー種或多種互補(bǔ)決定區(qū)，更優(yōu)選包含3種重鏈互補(bǔ)決定區(qū)，更進(jìn)ー步優(yōu)選包含所示6種互補(bǔ)決定區(qū)。對互補(bǔ)決定區(qū)以外的其他氨基酸序列沒有特別限制。本發(fā)明所述抗體包括所謂的CDR移植型抗體，其中，所述移植型抗體中互補(bǔ)決定區(qū)以外的氨基酸序列來自于其它抗體，尤其是來源于其它物種的抗體。在這些CDR移植型抗體中，優(yōu)選CDR以外的氨基酸序列來源于人的人源化抗體或人抗體。根據(jù)需要，可以對FR進(jìn)行ー個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的添加、缺失、取代和/或插入。用于制造人源化抗體或人抗體的方法可用公知的方法?！肮δ苄云巍敝缚贵w的部分(部分片段)，具有此抗體對抗原的ー種或多種活性(action)。換句話說，指保留了與抗原的結(jié)合能力、對抗原的反應(yīng)活性或者對抗原的識(shí)別能カ的片段。例如，F(xiàn)v、ニ硫鍵穩(wěn)定的Fv (dsFv)、單鏈Fv(scFv)、及其聚合物等。更具體的例子包括那些含有 Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、雙體(diabody)、dsFv 和 Q)R 的肽[D. J. King,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies.，1998T. J. Internationa丄Ltd] o利用木瓜蛋白酶處理與FGF23結(jié)合的抗體得到這些片段中，F(xiàn)ab片段為具有與抗原結(jié)合活性，分子量約為50，000的抗體片段。Fab片段中單條重鏈(H鏈)的氨基酸末端一側(cè)將近一半?yún)^(qū)段和單條完整輕鏈(L鏈)通過ニ硫鍵連接在一起。本發(fā)明中的Fab片段可通過木瓜蛋白酶處理與FGF23結(jié)合的抗體而制得?；蛘咄ㄟ^將編碼此抗體Fab片段的DNA序列插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將此載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后,表達(dá)此載體后獲得。利用胃蛋白酶處理IgG得到的片段中，F(xiàn)(ab' )2片段為具有與抗原結(jié)合活性，分子量約為100，000的抗體片段。F(ab' )2片段比通過絞鏈區(qū)ニ硫鍵結(jié)合在一起的Fab片段還要大。本發(fā)明中的F(ab' )2片段可通過胃蛋白酶處理與FGF23結(jié)合的抗體而制得，或者通過以下所述的利用ニ硫鍵或硫醚鍵將Fab'連接一起而制得。Fab'是ー種分子量約為50，000，具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。其中，所述Fiah1 )2鉸鏈區(qū)的ニ硫鍵被切斷。本發(fā)明中的Fab'可通過用還原劑ニ硫蘇糖醇處理本發(fā)明中能與所述FGF23結(jié)合的F(ab' )2而得?；蛘咄ㄟ^將編碼此抗體Fab'片段的DNA序列插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將此載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后，表達(dá)此載體后獲得。
scFv是ー種具有抗原結(jié)合活性的抗體片段，它是由單條重鏈可變區(qū)(以下記作VH)和單條輕鏈可變區(qū)(以下記作VL)通過合適的肽段連接物(以下記作P)連接組成的VH-P-VL 或 VL-P-VH 型多肽。 本發(fā)明中的scFv片段可通過獲取與FGF23結(jié)合的本發(fā)明所述抗體中編碼VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFV的DNA序列，并將編碼此抗體片段的DNA序列插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將此載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后，表達(dá)此載體后獲得。雙體是ー種由scFv ニ聚化形成的抗體片段，它具有雙價(jià)抗原結(jié)合活性。雙價(jià)抗原的結(jié)合活性可以相同也可以不同。本發(fā)明的雙體的制備，可通過獲取與本發(fā)明FGF23結(jié)合的所述抗體中編碼VH和VL的cDNA，按照使肽段連接物的氨基酸序列的長度在8個(gè)殘基以下的方式，構(gòu)建編碼scFV的 DNA序列，并將所述DNA序列插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將此載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后，表達(dá)此載體后獲得。在dsFv中，組成sFv的VH和VL片段中各有一個(gè)氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代，這兩個(gè)多肽片段通過這些半胱氨酸殘基之間形成的ニ硫鍵連接在一起。被半胱氨酸殘基取代的氨基酸殘基的選擇，可按照Reiter等(Protein Engineering, 7 :697-704,1994)所用方法，基于對抗體的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測來進(jìn)行。本發(fā)明中的dsFv片段的制備，可通過獲取與FGF23結(jié)合的本發(fā)明所述抗體中編碼VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA序列，并將編碼此抗體片段的DNA序列插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將此載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后，表達(dá)此載體后獲得。構(gòu)建的含有互補(bǔ)決定區(qū)的肽段至少含有ー種以上的VH或VL互補(bǔ)決定區(qū)。含有多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)的肽段可以直接連接或通過合適的肽段連接物連接。本發(fā)明中包含互補(bǔ)決定區(qū)的肽段的制備，可以通過構(gòu)建編碼與FGF23結(jié)合的本發(fā)明所述抗體VH和VL互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的DNA序列，并將所述DNA序列插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將此載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后，表達(dá)此載體后獲得。此外，包含互補(bǔ)決定區(qū)的所述肽段的制備，也可通過諸如Fmoc法(芴甲氧羰基法，fluorenylmethyloxyc&rboriyl method)矛ロ tBoc (t—butyloxyc&rbony丄method)等化學(xué)合成法制得。此外，“功能性片段”是能與抗原(FGF23)結(jié)合的抗體的片段。這種“功能性片段”優(yōu)選可與FGF23結(jié)合的片段并包含SEQ ID NO : 12中從第20位Q到136位S的氨基酸序列，和/或SEQ ID NO 14中從第23位A到第128位K的氨基酸序列。這種“功能性片段”優(yōu)選是包含SEQ ID NO 40-45中所示至少ー種或全部互補(bǔ)決定區(qū)并可與FGF23結(jié)合的片段。這種“功能性片段”更優(yōu)選衍生自ClO雜交瘤產(chǎn)生的抗體可變區(qū)并可與FGF23結(jié)合。本發(fā)明所述抗體包括抗體衍生物，其中，將放射性同位素、低分子量藥物、大分子藥物和蛋白等，通過化學(xué)方法或基因工程使之結(jié)合于本發(fā)明的抗FGF23抗體或此抗體的功能性片段上。本發(fā)明所述抗體衍生物的制備，可以通過化學(xué)等方法將放射性同位素、低分子量藥物、大分子藥物和蛋白等使之結(jié)合于本發(fā)明的抗FGF23抗體或此抗體的“功能性片段”的重鏈或輕鏈的N-末端或C-末端，此抗FGF23抗體或此抗體的“功能性片段”的合適的取代基團(tuán)或側(cè)鏈，此抗FGF23抗體或此抗體的“功能性片段”的糖鏈等而制得(Koutai KogakuNyuumon, Osamu Kanamitsu, Chijin shokan,1994)。此外，結(jié)合了蛋白的抗體衍生物的制備，可通過將編碼本發(fā)明的抗FGF23抗體或此抗體的“功能性片段”的DNA序列與編碼使之被結(jié)合蛋白的DNA序列相連后，將此DNA序列插入表達(dá)載體后，再將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞中并表達(dá)此載體的方法制得。對于放射性同位素，其實(shí)例包括1311、1251等。tヒ如，放射性同位素可通過氯胺T標(biāo)記法等方法使之與所述抗體相連在一起。低分子量藥物包括包括氮芥(nitrogen mustard)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)在內(nèi)的燒基化藥物(alkylating agents)；抗代謝藥物(antimetabolites)如 5_ 氟尿卩密 P定(5-fIuorouracil)> 甲氨蝶呤(methotrexate)等；抗生素(antibiotics)如道諾霉素(daunomycin)、爭光霉素(bleomycin)、絲裂 霉素 C (mitomycin C)、柔紅霉素(daunorubicin)和阿霉素(doxorubicin)等；植物堿(plant alkaloids)類，如長春新堿(vincristine)、長春花堿(vinblastine)和長春地辛(vindesine)等；抗癌藥物如激素類藥物三苯氧胺(tamoxifenand)和地塞米松(dexamethasone)(しIinica丄 oncology ;Japanese Clinical Oncology Research Meeting,Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Co. , 1996);留族化合物(steroids)如皮質(zhì)醇(hydrocortisone)和強(qiáng)的松(prednisone)等；包括阿司匹林(aspirin)和消炎痛(indomethacin)在內(nèi)的非留族化合物；免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulators)如硫代蘋果酸金(gold thiomalate)和青霉胺(penicillamine)等；免疫抑制劑(immunosuppressors)如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和咪唑硫嘌呤(azathioprine)等；抗炎藥(anti-inflammatories)如抗組月安類(anti-histamines)藥物撲爾敏(chlorpheniraminemaieate)矛ロ氧馬斯ネ丁、ciemastine)等(Inflammation and anti-inflammatory treatmentmethod, Ishiyaku Publishing Corp. Ltd. , 1982).可用公知的方法使所述這些低分子量藥物和抗體結(jié)合，例如，用于道諾霉素和抗體結(jié)合的方法的實(shí)例包括通過戊ニ醛使道諾霉素和抗體的氨基基團(tuán)間相結(jié)合的方法，通過水溶性碳化ニ亞胺使道諾霉素的氨基基團(tuán)和抗體的羧基基團(tuán)結(jié)合在一起的方法。通過將低分子量藥物和抗體結(jié)合在一起，可制得具有該低分子量藥物功能的抗體衍生物。對于大分子藥物，其實(shí)例包括聚こニ醇(以下記作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚環(huán)氧こ烷、苯こ烯-馬來酸共聚物、聚こ烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯酰胺等。通過將這些大分子化合物結(jié)合在抗體或抗體的“功能性片段”上，預(yù)期獲得以下幾種效果(I)提高其對各種化學(xué)、物理和生物因子的穩(wěn)定性。(2)顯著延長其在血液中的半衰期，
(3)免疫原性消失，抗體產(chǎn)生被抑制等(Bioconjugate Pharmaceutical,Hirokawa Shoten,1993)。用于結(jié)合PEG和抗體的ー種方法的實(shí)例是與PEG修飾性試劑反應(yīng)的方法。PEG修飾性試劑的實(shí)例包括ε -氨基基團(tuán)修飾劑賴氨酸(Laid-Open Patent Publication NumberS61-178926)、羧基基團(tuán)修飾劑天冬氨酸和谷氨酸(Laid-Open Patent Publication NumberS56-23587)、狐基基團(tuán)修飾劑精氨酸(Laid-Open Patent Publication Number H2-117920)
坐寸ο
結(jié)合了蛋白的所述抗體也可以作為ー種融合抗體被制得。換句話說，將編碼所述抗體或此抗體的功能性片段的cDNA與編碼特異性蛋白的cDNA連接在一起，則編碼由所述抗體和特異性蛋白組成的融合蛋白的DNA即被構(gòu)建。這段DNA被插入原核生物用或真核生物用表達(dá)載體中。將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核生物和真核生物中后，表達(dá)此載體后，即可生產(chǎn)得到與特異性蛋白相結(jié)合的所述融合抗體。關(guān)于本發(fā)明中所述抗FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其對人FGF23結(jié)合活性或?qū)θ薋GF23的功能抑制活性的評(píng)估，可通過免疫學(xué)方法檢測如ELISA法(Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14,1988 ;Monoclona丄Antibodies Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996),或通過生物傳感技術(shù)如Biacore生物傳感器測定其結(jié)合解離常數(shù)(Journal of Immunological Methods,145 :229-240，1991)，以及通過檢測用klothoc表達(dá)細(xì)胞對人FGF23刺激引起的早期生長反應(yīng)基因-1啟動(dòng)子活性的抑制作用(Nature，444 :770-774，2006)等來進(jìn)行。在本發(fā)明中，“人抗體”被定義為來源于人的抗體基因的基因表達(dá)產(chǎn)物的抗體。正如下面所描述的那樣，可以通過將此人抗體基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)入動(dòng)物，從而將抗原給予有產(chǎn)生此人源抗體能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后獲得。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)例包括小鼠。能產(chǎn)生人抗體的小鼠的已建立的方法描述在，如國際專利出版號(hào)W002/43478中。對于本發(fā)明所述抗體的實(shí)例包括下面實(shí)施例中所述的由ClO雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體(C10抗體)。在2007年2月2日，ClO雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏，保藏在專利有機(jī)體保藏中心(Central 6,1-IHigashi 1-chome, Tsukuba-shi,Ibaraki-ken,日本)獨(dú)立的行政機(jī)構(gòu)“先進(jìn)エ業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院(Advanced IndustrialScience and Technology) ”，索取號(hào)為 FERM ABP-10772 (識(shí)別表示C10)。本發(fā)明抗體或其功能性片段也包括包含重鏈和/或輕鏈的單克隆抗體或其功能性片段，組成所述重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列各具有ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、取代和添カロ。在此，“I個(gè)或幾個(gè)”、“幾個(gè)”指的是9個(gè)以下，優(yōu)選5個(gè)以下，更優(yōu)選3個(gè)以下，尤其優(yōu)選2個(gè)。如先前所描述氨基酸序列的部分修飾(缺失、取代、插入、添加)可通過對編碼此氨基酸序列的核苷酸序列的部分修飾而被引入組成本發(fā)明所述抗體或功能性片段的氨基酸序列。這些核苷酸序列的部分修飾可通過已知的位點(diǎn)特異性突變弓I入法的常規(guī)方法被弓I入[Proc Natl Acad Sci USA. ,81 :5662-5666,1984] 本發(fā)明所述抗體包括所有免疫球蛋白類型和同種型的抗體。本發(fā)明所述抗FGF23抗體可通過以下生產(chǎn)方法制得。如將FGF23，或FGF23的一部分，或者FGF23的一部分和合適的能引起其抗原的抗原性增長的藥物載體物(例如，牛血清白蛋白等)所形成的偶合物(conjugate)，必要時(shí)與相應(yīng)的佐劑(弗氏完全或不完全佐劑等)一起免疫所需的非人哺乳動(dòng)物如人抗體生成轉(zhuǎn)基因小鼠。對于FGF23，天然型或重組型FGF23均可使用?；蛘?，通過將編碼FGF23的基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體并在此動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)此FGF23蛋白的方法來產(chǎn)生免疫致敏作用。通過雜交瘤(由來自免疫致敏動(dòng)物的抗體生成細(xì)胞和沒有抗體生產(chǎn)能力的骨髄瘤細(xì)胞融合而成)的培養(yǎng)，產(chǎn)生與用于免疫作用的抗原有特異親和性的單克隆抗體，篩選產(chǎn)生所述單克隆抗體的克隆，由此制得了單克隆抗體。本發(fā)明所述抗體包括那些通過利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因工程修飾技術(shù) (例如，參見歐洲專利申請EP314161)而被轉(zhuǎn)換成不同亞類的抗體。也即是說，通過基因エ程技術(shù)，利用編碼本發(fā)明所述抗體可變區(qū)的DNA，可以制得ー種不同于原有亞類的亞類抗體。2.本發(fā)明所述抗體的生產(chǎn)生產(chǎn)ー種單克隆抗體包括以下幾個(gè)步驟。也即是(I)用作免疫原的抗原蛋白或該抗原蛋白表達(dá)載體的制備，(2)通過動(dòng)物體內(nèi)抗原注射或動(dòng)物體內(nèi)抗原表達(dá),免疫動(dòng)物后,抽取動(dòng)物血樣和分析血樣中抗體滴度,且在確定脾臟分離時(shí)間后，制備抗體生產(chǎn)細(xì)胞(3)制備骨髓瘤細(xì)胞(4)融合抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髄瘤細(xì)胞(5)篩選能產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤細(xì)胞團(tuán)(6)雜交瘤細(xì)胞團(tuán)被打散成單個(gè)細(xì)胞克隆
(7)可任選地培養(yǎng)雜交瘤或飼養(yǎng)已被移植雜交瘤的動(dòng)物以用于大量單克隆抗體的生產(chǎn)(8)檢測分析以此種方法生產(chǎn)的單克隆抗體的生物活性和識(shí)別特異性，或檢測作為標(biāo)記性試劑的特性。、下文將按上面步驟對抗-FGF23單克隆抗體的生產(chǎn)方法作詳細(xì)描述。然而，這種抗體的生產(chǎn)方法并不限于此種方法。如，也可使用脾臟細(xì)胞以外的抗體生成細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(此抗體的生產(chǎn))。(I)抗原的純化作為抗原，可使用利用基因重組技術(shù),將編碼FGF23的DNA序列整合到一個(gè)合適的表達(dá)質(zhì)粒上，在FGF23于宿主如大腸桿菌或動(dòng)物細(xì)胞等中產(chǎn)生后，已純化的FGF23蛋白。因?yàn)槿薋GF23蛋白的ー級(jí)結(jié)構(gòu)是公知的[GenBank索取號(hào)No. AAG09917，SEQ ID N0:4]，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法化學(xué)合成的來源于FGF23氨基酸序列組成的不完全肽段也可當(dāng)作此抗原使用。(2)抗體生成細(xì)胞的制備步驟已制得的上述(I)所提到的抗原與佐劑如弗氏完全或不完全佐劑或鋁鉀等混合，且混合物作為免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對于所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，最適合使用具有人源抗體生產(chǎn)能カ的轉(zhuǎn)基因小鼠。此類小鼠在參考文獻(xiàn)[Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA. ,97 722-727,2000]中被 Tomizuka 等描述。免疫小鼠時(shí)，免疫原的給藥方法可以是皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、足趾注射等方法中的任意ー種。優(yōu)選腹腔注射、足趾注射或靜脈注射。可進(jìn)行一次免疫或在一個(gè)合適的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行多次免疫。隨后，測量存在于免疫動(dòng)物血清的抗所述抗原的抗體滴度。當(dāng)使用具有很高抗體滴度的動(dòng)物作為抗體生成細(xì)胞的生產(chǎn)原料吋，后續(xù)操作步驟的效率將得到提高。一般來講，優(yōu)選使用來源于最終免疫后3-5天的動(dòng)物的抗體生成細(xì)胞用于后續(xù)的細(xì)胞融蟲合。在這里，用于抗體滴度檢測方法的例子包括如放射性同位素免疫定量測定法(以下記作"RIA法")、固定酶免疫定量測定法(以下記作"ELISA法")、熒光抗體法、被動(dòng)血凝反應(yīng)法等各種公知技木。從檢測靈敏度、快速性、精確性和自動(dòng)化操作的可行性來看，RIA法或ELISA法是合適的方法。本發(fā)明所述抗體的滴度檢測，例如使用ELISA檢測法，可通過以下步驟進(jìn)行。首先，將抗人抗體的抗原被吸附于ELISA96孔板等的固定表面。然后，用與此抗原無關(guān)的蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，封閉沒有吸附抗原的此固定表面。漂洗此表面后，與作為ー抗的連續(xù)濃度梯度稀釋的試劑(如來自于具有人抗體生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)基因小鼠的血清)接觸反應(yīng)，以使所述抗原與樣品中的抗-FGF23抗體相結(jié)合。再然后，作為ニ抗的酶標(biāo)記抗人抗體被加入，此ニ抗可與所述人抗體結(jié)合。漂洗后，加入所述酶的底物。然后，檢測因底物降解引起的顏色變化所導(dǎo)致的光吸收改變，以計(jì)算抗體滴度。(3)骨髓瘤制備步驟對于骨髄瘤，可使用來源于哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人等自身不具有抗體生產(chǎn)能力的細(xì)胞。一般來講，優(yōu)選使用來自于小鼠的細(xì)胞系，如8-氮鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8U. I (P3-U1) [Yelton,D. E.等，Current Topics in Microbiologyand Immunology,81 1-7,1978], P3/NSI/l_Ag4_l(NS-1) [Kohler, G.等，EuropeanJ. Immunology, 6 :511-519,1976]，Sp2/0_Agl4 (SP2/0)[Shulman, M.等，Nature,276 269-270，1978]，P3X63Ag8. 653 (653) [Kearney, J. F.等，J. Immunology, 123 :1548-1550，1979]，P3X63Ag8(X63) [Horibata,K. Harris,A. ff. ,Nature, 256 :495-497,1975]等。這些細(xì)胞系的繼代培養(yǎng)要用合適的培養(yǎng)基，如8-氮鳥嘌呤培養(yǎng)基[一種補(bǔ)充有谷氨酰胺、2-巰基こ醇、慶大霉素和胎牛血清(FCS)、還有8-氮鳥嘌呤的RPMI-1640培養(yǎng)基]、Iscove' sModified Dulbecco; s培養(yǎng)基(MDM)或Dulbecco' s改良(Modified)Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)。然而，在細(xì)胞融合前3-4天，細(xì)胞系的繼代培養(yǎng)要用正常培養(yǎng)基(如包含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基)，為細(xì)胞融合準(zhǔn)備的細(xì)胞數(shù)目不低于2xl07。(4)細(xì)胞融合 抗體生成細(xì)胞是漿細(xì)胞和其前體細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞可以從生物個(gè)體任意位置獲得。一般來講，脾臟、淋巴結(jié)、骨髄、扁桃體、外周血、或者它們的合適組合均可被融合。一般來講，最常使用脾臟細(xì)胞。.最后一次免疫動(dòng)物后，存在抗體生成細(xì)胞的部位，如脾臟，從能得到指定的抗體滴度的小鼠中分離出來，從而制得作為抗體生成細(xì)胞的脾臟細(xì)胞。下一歩，融合脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。對于脾臟細(xì)胞和步驟(3)中得到的骨髄瘤細(xì)胞的融合方法，最常用的方法是使用聚こニ醇。這種方法的細(xì)胞毒性相對較低，融合操作也簡單容易。這種方法有以下步驟，比如將脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(如DMEM)或磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)漂洗好，脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以5 1-10 I的比例混合并離心。移去上清液，打散沉淀的細(xì)胞團(tuán)，邊攪拌邊加入ImL含50% (w/v)聚こニ醇(分子量1000-4000)的無血清培養(yǎng)基。然后，緩慢加入IOmL的無血清培養(yǎng)基，隨后離心。棄去上清液，在正常培養(yǎng)基(以下稱HAT培養(yǎng)基)中懸浮沉淀的細(xì)胞，所述正常培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)含有合適量的次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶脫氧核苷(以下稱HAT)溶解物和人白細(xì)胞介素_6(以下稱IL-6)。這些細(xì)胞被等量均分至培養(yǎng)板各孔(以下稱培養(yǎng)板)，并在37 □和存在5% CO2的條件下培養(yǎng)約兩個(gè)星期。在培養(yǎng)期間，根據(jù)需要補(bǔ)充HAT培養(yǎng)基。(5)雜交瘤細(xì)胞團(tuán)的篩選上述所提到的骨髄瘤細(xì)胞為8-氮鳥嘌呤抗性株吋，也即是說，如果它是一種次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷性細(xì)胞株時(shí)，沒有融合的骨髓瘤細(xì)胞或僅由骨髓瘤細(xì)胞融合形成的融合型細(xì)胞，在含有HAT的培養(yǎng)基中不能存活。而另一方面，僅由抗體生成細(xì)胞形成的融合型細(xì)胞，或由抗體生成細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞形成的融合型細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞是能夠生存的。但是僅由抗體生成細(xì)胞融合形成的融合型細(xì)胞的生存周期是有限的。因此，通過在含HAT培養(yǎng)基中的持續(xù)培養(yǎng)，僅僅由抗體生成細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞形成的融合型細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞能夠生存。從而，雜交瘤細(xì)胞可被篩選出來。對于正在克隆中生長的雜交瘤，培養(yǎng)基被換成不含氨基蝶呤的培養(yǎng)基(以下稱作HT培養(yǎng)基)。然后，收集部分培養(yǎng)基上清液，用如ELISA法檢測抗-FGF23抗體滴度。上面，為利用8-氮鳥嘌呤抗性細(xì)胞系的方法示例。但是，其他細(xì)胞系也可相應(yīng)地應(yīng)用于雜交瘤細(xì)胞的篩選方法。在這些情況下，所使用的培養(yǎng)基組合物也可變化。(6)克隆步驟通過利用與(2)中所用相同的抗體滴度檢測方法檢測抗體滴度，決定用于生產(chǎn)所述特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞被移至另ー個(gè)培養(yǎng)板，并進(jìn)行克隆?？寺》椒ǖ膶?shí)例包括限制性稀釋法，在此方法中，雜交瘤細(xì)胞被稀釋至培養(yǎng)板中每個(gè)培養(yǎng)孔僅含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞， 并被培養(yǎng)；軟瓊脂培養(yǎng)法，在這種方法中，雜交瘤細(xì)胞被培養(yǎng)在軟瓊脂培養(yǎng)基中，克隆被收集；ー種在此方法中用顯微操作器每次轉(zhuǎn)移一個(gè)細(xì)胞并對其培養(yǎng)的方法；分類機(jī)分揀克隆法，在這種方法中，利用細(xì)胞分揀機(jī)分離單個(gè)細(xì)胞等。限制性稀釋法較為簡單和常用。關(guān)于培養(yǎng)孔，在培養(yǎng)孔里抗體滴度被觀察到，如，當(dāng)利用限制性稀釋法重復(fù)克隆2-4次時(shí)，產(chǎn)生具有穩(wěn)定的抗體滴度的細(xì)胞系被篩選出來，以用作抗-FGF23單克隆抗體生成雜交瘤細(xì)胞系。(7)通過雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)制備單克隆抗體將HT培養(yǎng)基換成正常培養(yǎng)基，以培養(yǎng)已完成克隆的雜交瘤細(xì)胞。對于大規(guī)模培養(yǎng)，有利用大容量培養(yǎng)瓶的循環(huán)培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)器培養(yǎng)，或利用中空纖維系統(tǒng)的培養(yǎng)等。通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法如凝膠過濾等方法對大規(guī)模培養(yǎng)上清液的純化，獲得抗-FGF23單克隆抗體。此外，通過將所述雜交瘤在相同品系小鼠(如BALB/c)或nu/nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔等腹膜中的生長，獲得含有大量抗-FGF23單克隆抗體的腹膜液。簡單的抗體純化方法是使用商品化的單克隆抗體純化試劑盒(比如，MAbTrap GII kit ；GE HealthcareBioscience Co. )以這些方法獲得的單克隆抗體具有高抗FGF23抗原特異性。此外，重組型抗體的制備可通過利用基因重組技術(shù)(Delves，P. J.，ANTIBODYPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. ，1997 WILEY, Shepherd, P.和 Dean C. ， MonoclonalAntibodies.，2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Goding, J. ff.，Monoclonal Antibodies principles and practice. , 1993 ACADEMIC PRESS),從骨髓瘤等抗體生成細(xì)胞中克隆編碼所述抗體的基因，將此基因整合到ー種合適的載體并轉(zhuǎn)入ー種宿主(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、大腸桿菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等)而得到。本發(fā)明包括含有由產(chǎn)生本發(fā)明抗體的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的基因序列的核酸,尤其包括下述的含有由本發(fā)明的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核酸。在這里，核酸包括DNA和RNA。此外，本發(fā)明也包括本發(fā)明中所述的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)成熟片段的核酸，在此，所述成熟片段是指去除所述信號(hào)肽序列后剰余的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)肽段。此外，除上述的核酸外，本發(fā)明中所述核酸還包括具有與本發(fā)明中所述抗體氨基酸序列的氨基酸和所述抗體重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸相對應(yīng)的密碼子的核酸。為制備編碼來自于所述雜交瘤的單克隆抗體的基因，ー種方法被運(yùn)用，按照這種方法，編碼所述單克隆抗體每條輕鏈可變區(qū)，輕鏈恒定區(qū)，重鏈可變區(qū)，重鏈恒定區(qū)的DNA可通過PCR等方法得到制備。在此制備方法中，根據(jù)抗-FGF23抗體基因或其氨基酸序列設(shè)計(jì)的寡DNA被用作引物。對于模板，從雜交瘤中制得的DNA可用作模板。所述這些DNA被整合到一個(gè)合適的載體上并被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，得到表達(dá)，或者將這些DNA —起整合到一個(gè)合適的載體后共表達(dá)。對于載體，可以使用能在微生物宿主中自主生長的噬菌體或質(zhì)粒。對于質(zhì)粒DNA，其實(shí)例包括來源于大腸桿菌、枯草桿菌或酵母等的質(zhì)粒。對于噬菌體DNA，其實(shí)例包括λ噬菌體。所有能表達(dá)目的基因的宿主均可用作轉(zhuǎn)化宿主。其實(shí)例包括細(xì)菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動(dòng)物細(xì)胞(COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等)和昆蟲細(xì)胞等。將基因轉(zhuǎn)入宿主中所用的方法是眾所周知的，可例舉出許多方法(如鈣離子法、
電穿孔法、原生質(zhì)體法、こ酸鋰法、磷酸鈣、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等)。此外，將基因轉(zhuǎn)入下述動(dòng)物中所用的方法，其實(shí)例包括以下所述方法顯微注射法、應(yīng)用電穿孔技術(shù)或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)讓法將基因轉(zhuǎn)入胚胎細(xì)胞的方法、以及核移植法等。在本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，以及對培養(yǎng)產(chǎn)物的收集，獲得抗-FGF23抗體。在這里，“培養(yǎng)產(chǎn)物”表示以下的任何ー種(a)培養(yǎng)物上清液，(b)培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)的菌體或它們的勻漿，以及(c)轉(zhuǎn)化子分泌物。為了培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，要使用適合所用宿主的培養(yǎng)基，并使用靜止培養(yǎng)法、滾瓶培養(yǎng)法等培養(yǎng)方法。培養(yǎng)完畢后，當(dāng)所述目標(biāo)抗體產(chǎn)生于細(xì)菌菌體或細(xì)胞內(nèi)時(shí)，所述抗體通過細(xì)菌菌體或細(xì)胞的勻楽:得到收集。此外，當(dāng)所述目標(biāo)抗體產(chǎn)生于細(xì)菌菌體或細(xì)胞外時(shí),培養(yǎng)物溶液被直接使用，或者是通過離心等方法除去細(xì)菌菌體或細(xì)胞。隨后，通過單獨(dú)使用或適當(dāng)組合使用各種用于蛋白質(zhì)分離純化的色譜技術(shù)的常規(guī)生物化學(xué)方法，從所述培養(yǎng)產(chǎn)物中分離純化所述目標(biāo)抗體此外，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建所述目標(biāo)抗體基因被整合為內(nèi)源基因的動(dòng)物宿主如轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因山羊、轉(zhuǎn)基因綿羊或轉(zhuǎn)基因豬等。從這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的奶中可以得到大量的來源于所述目標(biāo)抗體基因的單克隆抗體(Wright, G.,等，Bio/Technology
9=830-834,1991)。當(dāng)在體外培養(yǎng)雜交瘤吋，按照培養(yǎng)細(xì)胞的特性、試驗(yàn)研究的目的和培養(yǎng)方法等各種條件，使所述雜交瘤得到生長、保持和儲(chǔ)存。已知營養(yǎng)培養(yǎng)基或各種來源和制備于已知基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營養(yǎng)培養(yǎng)基可被用于在培養(yǎng)上清液中生產(chǎn)所述單克隆抗體。(8)所述單克隆抗體的分析在這些方法中制得的所述單克隆抗體的同型類和亞類分析可通過以下方法進(jìn)行。首先，鑒定方法的實(shí)例包括平板雙向擴(kuò)散(Ouchterlony)法、ELISA法或RIA法等。平板雙向擴(kuò)散法較簡單，但當(dāng)所述單克隆抗體濃度低時(shí)，必需進(jìn)行濃縮操作。另ー方面，當(dāng)使用ELISA法或RIA法吋，培養(yǎng)上清液可直接與被吸附于固定表面的抗原反應(yīng)，且通過使用與各種免疫球蛋白的同型類和亞類反應(yīng)的抗體作為ニ抗抗體，可對所述單克隆抗體的同型類和亞類進(jìn)行鑒定。此外,可用Folin/Lowry法，以及通過計(jì)算其在280nm的光吸收[I. 4(0D280)=免疫球蛋白lmg/mL]的方法，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。所述單克隆抗體識(shí)別表位的鑒定(表位作圖)按如下進(jìn)行。首先，構(gòu)建單克隆抗體識(shí)別的分子的各部分結(jié)構(gòu)。對于部分結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，其方法如下ー種方法是采用眾所周知的寡肽合成技術(shù)，制取分子的各部分肽段；ー種方法是利用基因重組技術(shù)將編碼所述目標(biāo)部分肽段的DNA序列整合到一個(gè)合適的表達(dá)質(zhì)粒，所述肽段在宿主如大腸桿菌等體內(nèi)或體外制得。然而，為實(shí)現(xiàn)上述目的，一般是將上述兩種方法組合使用。例如，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因重組技術(shù)構(gòu)建以隨機(jī)長度從羧基末端或氨基末端開始連續(xù)性縮短的抗原蛋白多肽系列。然后，研究所述單克隆抗體與這些多肽的反應(yīng)活性，并大致確定其識(shí)別位點(diǎn)。以下，作更詳細(xì)的說明，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的寡肽合成技術(shù)，合成這些肽的相應(yīng)部分的寡肽或變體等。為了確定表位，研究單克隆抗體與這些多肽的結(jié)合能力，所述單克隆抗體含有在本發(fā)明用于預(yù)防或治療的藥物中作為活性成分，或者研究這些多肽對所述單克隆抗體與相應(yīng)抗原的結(jié)合能力的競爭性抑制活性。作為獲得各種寡肽的簡單方法，可使用商品試劑盒(如SPOTs kit (Genosis Biotechnologies),利用多肽合成技術(shù)的多肽系列合成試劑盒(Chiron Co)等)(9)所述抗體片段的生產(chǎn) 基于上述(7)中所描述抗體，利用基因工程或蛋白質(zhì)化學(xué)方法生產(chǎn)所述抗體片段。對于基因工程技術(shù)方法，其實(shí)例是構(gòu)建編碼目的抗體片段的基因，并用合適的宿主如動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌等表達(dá)此基因，純化所述抗體片段。對于蛋白質(zhì)化學(xué)方法，其實(shí)例是蛋白酶(如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)被用于特異性位點(diǎn)剪切并進(jìn)行純化。對于所述抗體片段，其實(shí)例是含有Fab、F(ab' )2、Fab'、scFv、雙體、dsFv、CDR的肽段等。每ー種抗體片段的生產(chǎn)方法將在下面得到詳細(xì)描述。 (i) Fab 的生產(chǎn)Fab可用蛋白質(zhì)化學(xué)方法,通過利用木瓜蛋白酶處理IgG制得。木瓜蛋白酶處理后，如果所述初始抗體是具有蛋白A結(jié)合能力的IgG亞類，則通過蛋白A層析柱，分離IgG分子和 Fe 片段，回收均質(zhì) Fab (Monoclonal Antibodies !Principles and Practice,第三版，1995)。如果所述抗體為不具有蛋白A結(jié)合能力的IgG亞類抗體，利用離子交換層析，F(xiàn)ab從被洗脫在低鹽濃縮液的片斷中得到回收(Monoclonal Antibodies principles andPractice，第三版，1995)。此外，對于利用基因工程技術(shù)獲得Fab，在大多數(shù)情況下使用大腸桿菌，或者使用昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等來生產(chǎn)Fab。如，在上面2(7)中被描述的編碼所述抗體可變區(qū)的DNA被克隆到Fab表達(dá)載體中，以構(gòu)建Fab表達(dá)載體。對于所述Fab表達(dá)載體，任何可使Fab的DNA得到整合和表達(dá)的質(zhì)粒都可使用。ー個(gè)實(shí)例是pIT106 (Science，240 :1041-1043,1988)等。Fab表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入合適的大腸桿菌，并可生成并聚集于包涵體或外周質(zhì)中。對于來自于包涵體的Fab，可通過被常用于蛋白質(zhì)的重折疊的方法而被激活。此外，當(dāng)Fab表達(dá)于外周質(zhì)時(shí)，具有活性的Fab被釋放到培養(yǎng)上清液中。利用結(jié)合有抗原的層析柱，經(jīng)過重折疊處理或來自于培養(yǎng)上清中的Fab被純化得到均質(zhì)Fab (AntibodyEngineering,A Practical Guide, W. H. Freeman and Company,1992).(ii)F(ab' )2 的生產(chǎn)F(ab' )2可用蛋白質(zhì)化學(xué)方法，通過利用胃蛋白酶處理IgG制得。胃蛋白酶處理后，利用與Fab相同的純化操作，可回收得到均質(zhì)F(ab' ) 2 (Monoclonal Antibodies Principles and Practice,第三版，1995)。此外，也可通過馬來酰亞胺類(如o_PDM或雙馬來酰亞胺己烷等)處理以下(iii)所述的Fab'，形成硫醚鍵，或者通過DTNB (5，5' -ニ硫代-雙(硝基苯甲酸))處理，形成S-S鍵的方法,得到F (ab' ) 2 (Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。(iii)Fab'的生產(chǎn)Fab'可通過用 還原性試劑(如ニ硫蘇糖醇等)處理上述(ii)中所述的F(ab' )2制得。此外，F(xiàn)ab'的生產(chǎn)可用基因工程技術(shù)，在大多數(shù)情況下使用大腸桿菌，或者使用昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞等。例如，在上述2(7)中的編碼所述抗體可變區(qū)的DNA被克隆到Fab'表達(dá)載體中，以構(gòu)建Fab'表達(dá)載體。對于所述Fab'表達(dá)載體，任何可使Fab'的DNA得到整合和表達(dá)的質(zhì)粒都可使用。ー個(gè)實(shí)例是pAK19(BI0/TECHN0L0GY，10 :163-167，1992)等。Fab'表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入合適的大腸桿菌。Fab'可生成并聚集于包涵體或外周質(zhì)中。對于來自于包涵體的Fab'，可通過被常用于蛋白質(zhì)的重折疊的方法而被激活。此外，當(dāng)Fab'表達(dá)于外周質(zhì)時(shí)，通過溶菌酶部分消化、滲透壓休克、超聲波裂解等方法，勻漿細(xì)菌，這些(Fab')可從菌體外得到回收。利用G蛋白層析柱等，經(jīng)過重折疊處理或來自于細(xì)菌勻漿液中的 Fab'被純化得到均質(zhì) Fab' (Antibody Engineering,A Practical Approach, IRLPRESS,1996)。(iv)scFv 的生產(chǎn)利用基因工程技術(shù)，可用噬菌體或大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞等來生產(chǎn)ScFv0如，在上述2(7)中的編碼所述抗體可變區(qū)的DNA被克隆到scFv表達(dá)載體中，以構(gòu)建scFv表達(dá)載體。對于所述scFv表達(dá)載體，任何可使scFv的DNA得到整合和表達(dá)的質(zhì)粒都可使用。其實(shí)例包括 pCANTAB5E(GE Healthcare Bioscience Co.), pHFA(HumanAntibodies&Hybridomas, 5 :48-56,1994)等。將scFv表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的大腸桿菌,通過使輔助性噬菌體感染，可得到其中scFv以與噬菌體表面蛋白融合的形式而被表達(dá)于噬菌體表面的噬菌體。此外,scFv可生成并聚集于轉(zhuǎn)入有scFv表達(dá)載體的大腸桿菌的包涵體或外周質(zhì)中。對于來自于包涵體的scFv，可通過被常用于蛋白質(zhì)的重折疊的方法而被激活。此夕卜，當(dāng)scFv表達(dá)于外周質(zhì)時(shí)，通過溶菌酶部分消化、滲透壓休克、超聲波裂解等方法，勻漿細(xì)菌，這些(scFv)從菌體外被回收。利用陽離子交換層析等，經(jīng)過重折疊處理或來自于細(xì)菌勻楽·液中的 scFv被純化得到均質(zhì) scFv (Antibody Engineering, A Practical Approach,IRL PRESS,1996)。(V)雙體的生產(chǎn)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)雙體時(shí)，主要使用大腸桿菌，也可使用昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。例如，制備DNA，其中連接上述2(7)中所述抗體的VH和VL，從而接頭(linker)編碼的氨基酸殘基為8個(gè)殘基或更少，并將其克隆到雙體表達(dá)載體上，從而構(gòu)建了雙體表達(dá)載體。任何可使雙體DNA得到整合和表達(dá)的質(zhì)粒都可用作雙體表達(dá)載體。其實(shí)例包括PCANTAB5E(GEHealthcare Bioscience)、pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5,48,1994)等，雙體可產(chǎn)生和聚集在轉(zhuǎn)入雙體表達(dá)載體的大腸桿菌包涵體或外周質(zhì)中。從包涵體中獲得的雙體，可通過常被用于蛋白質(zhì)的重折疊法而被激活。此外，當(dāng)(雙體)被表達(dá)于外周質(zhì)時(shí)，通過溶菌酶部分消化、滲透壓休克、超聲波裂解法等方法，勻漿細(xì)菌，這些(雙體)從菌體外被回收。通過使用陽離子交換層析等技術(shù)(Antibody Engineering,A Practical Approach, IRLPRESS, 1996)處理，經(jīng)過重折疊處理或來自細(xì)菌勻漿液的雙體被純化得到均質(zhì)雙體。(vi)dsFv 的生產(chǎn)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)dsFv時(shí)，主要使用大腸桿菌，也使用昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。首先，將突變引入到在上述(ii)、(iv)和(V)中編碼抗體VH和VL的DNA的合適位點(diǎn)，從而得到所述編碼的氨基酸殘基被半胱氨酸取代的DNA。所述制得的每條DNA均可被克隆于dsFv表達(dá)載體中以構(gòu)建VH和VL表達(dá)載體。任何可使dsFv的DNA得到整合和表達(dá)的質(zhì)粒均可用作 dsFv 表達(dá)載體。例如 pUL19 (Protein Engineering, 7 :697-704,1944)等。所述VH和VL表達(dá)載體可被轉(zhuǎn)入合適的大腸桿菌中，且其可在包涵體或外周質(zhì)中產(chǎn)生和聚集。獲得來自包涵體或外周質(zhì)的VH和VL,并使之混合,dsFv可通過常被用于蛋白質(zhì)的重折疊法而被激活。經(jīng)過重折疊法處理后，可通過離子交換層析法和凝膠過濾法進(jìn)ー步純化(ProteinEngineering,7 :697-704,1994)。(vii) CDR 肽的生產(chǎn) 含有⑶R的肽可通過化學(xué)合成法(如Fmoc法或Boc法等)制得。此外，⑶R肽表達(dá)載體可通過制備編碼含有CDR肽的DNA，并克隆于合適的表達(dá)載體后獲得。任何可使編碼⑶R肽的DNA得到整合和表達(dá)的質(zhì)粒均可用作所述表達(dá)載體。如pLEX (Invitrogen)和pAX4a+ (Invitrogen)等。所述表達(dá)載體可被轉(zhuǎn)入合適的大腸桿菌中，且其可在包涵體或外周質(zhì)中產(chǎn)生和聚集。從包涵體或外周質(zhì)中得到⑶R肽，并可通過離子交換層析法和凝膠過濾法對其進(jìn)行純化(Protein Engineering, 7 :697-704,1994)。3.本發(fā)明中所述抗體和此抗體的功能性片段的特征本發(fā)明中所述抗體和此抗體的功能性片段具有任何以下特征(a)FGF23結(jié)合試驗(yàn)；與具有SEQ ID NO :4中從第25位到第251位的氨基酸殘基的全長FGF蛋白序列結(jié)合。(b)體外試驗(yàn)；一種檢測方法中FGF23的活性受抑制，利用此檢測方法可以檢測FGF23活性。體外檢測FGF23活性的ー個(gè)方法的實(shí)例是用FGF23刺激引起早期生長反應(yīng)基因-I 的啟動(dòng)子活化(Nature,444 =770-774,2006)。(c)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；對人給藥時(shí)，抑制內(nèi)源性FGF23活性，增加血清磷濃度和血清1，25D濃度。與常規(guī)抗體(2C3B抗體(抗FGF23蛋白的小鼠單克隆抗體，公開于W003/057733，由索取號(hào)為FERM BP-7838的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗-FGF23抗體)相比，血清磷濃度和血清1，25D濃度增加程度更大，且增加血清磷濃度和血清1，25D濃度的持續(xù)時(shí)間長。比如，當(dāng)給予獼猴時(shí)，其引起血清磷濃度升高的持續(xù)時(shí)間約是2C3B抗體的約3倍以上，優(yōu)選約5倍，其引起血清1，25D濃度升高的持續(xù)時(shí)間約是2C3B抗體的約I. 5倍以上，優(yōu)選約2. 5倍。本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的抗FGF23抗體的氨基酸序列的核酸。此核酸可以是DNA或RNA。本發(fā)明中的核酸，優(yōu)選編碼ClO雜交瘤產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的核酸。ー個(gè)實(shí)例是編碼重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核酸(C10抗體的重鏈核酸序列)，所述氨基酸序列由SEQ ID NO 11中從第58位C到第408位A的核苷酸序列編碼。此外，另ー個(gè)實(shí)例是編碼輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列由SEQ ID NO :13中從第67位G到第384位A的核苷酸序列編碼。II.藥物組合物制劑，即含有本發(fā)明的人抗-FGF23抗體或此抗體的功能性片段的藥物組合物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種制劑，除所述抗體或此抗體的功能性片段之外，優(yōu)選包括生理上可接受的稀釋劑或藥物載體，或可以是ー種與其他藥物(如其它抗體或抗生素)的混合物。合適的藥物載體包括生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水葡萄糖溶液、緩沖生理鹽水，但不限于這些載體。此外，抗體可以是凍干的和在必要時(shí)添加上述緩沖液后得到重建。給藥方法包括ロ服給藥、或腸胃外給藥如口腔內(nèi)、氣管支氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射等給藥，優(yōu)選給藥方法優(yōu)選靜脈注射給藥。可通過各種制劑形式進(jìn)行給藥，這些劑型包括氣霧劑、膠囊、藥片、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏劑和月交布制齊U (tapes) O被制成液態(tài)制劑如乳劑和糖漿劑時(shí)，可使用添加劑如水；糖類如蔗糖、山梨醇和果糖等；醇類如聚こニ醇、丙ニ醇等；油類如芝麻油、橄攬油和大豆油等；防腐劑如對羥基苯甲酸酯類等；調(diào)味劑如草莓調(diào)味劑和薄荷等。被制備膠囊、藥片、粉劑、顆粒劑等時(shí)，可使用添加劑如賦形劑如乳糖、葡萄糖、蔗糖、和甘露(糖)醇等；崩解劑如淀粉、海草酸鈉等；潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石粉等；粘合劑如聚こ烯醇、羥丙基纖維素和凝膠等；表面活性劑如脂肪酸酷等；增塑劑如丙三醇等。注射制劑可使用的添加劑包括水；糖類如蔗糖、山梨醇、木糖、海藻糖、果糖等；糖醇如甘露(糖)醇、木糖醇和山梨糖醇等；緩沖液如磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液和谷氨酸鹽緩沖液等；表面活性劑如脂肪酸酷等。腸胃外給藥的合適制劑包括注射劑、栓劑、氣霧劑等。在使用注射劑時(shí)，通常以單劑量安瓿或多劑量容器的形式被提供。它可能是合適的粉劑，在使用時(shí)以合適的藥物載體，如不含熱源質(zhì)的無菌水重新溶解。這些制劑含有常被用于制劑配制的添加劑如乳化剤、懸浮劑等。注射劑使用方法包括，如靜脈輸注、靜脈注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等。此外，給藥劑量隨給藥對象的年齡、給藥方式、給藥頻率而不同，井能在很寬范圍內(nèi)調(diào)整。栓劑可用藥物載體(如可可脂、氫化脂肪、羧酸等)進(jìn)行配制。氣霧劑可用載體所述抗體或此抗體的功能性片段本身進(jìn)行配制，或者用載體進(jìn)行配制，所述載體對給藥對象(患者)的ロ部和呼吸道粘膜不產(chǎn)生刺激作用，且能使所述抗體或此抗體的功能性片段擴(kuò)散成微粒，使其容易吸收。載體的具體實(shí)例包括乳糖、丙三醇等。根據(jù)所述抗體或此抗體的功能性片段的特性和所用載體的特性，可選用氣霧劑、干粉等劑劑。此外，在ロ服制劑中所用的添加劑組分也可添加到這些腸胃外給藥制劑中。所用劑量一般因癥狀、年齡、體重等而異，但是一般來說，對成年人的ロ服給藥，約為姆天O. Olmg-lOOOmg。此劑量可一次給藥或分成幾次給藥。在腸胃外給藥時(shí)，可通過皮下注射、肌肉注射或靜脈注射每次的給藥量為O. Olmg-IOOOmgo本發(fā)明包括本發(fā)明所述抗體，或此抗體的功能性片段，或使用包含本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段的藥物組合物預(yù)防或治療下述疾病的方法，此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段在制備用于預(yù)防或治療下述疾病的藥物中的用途?？杀槐景l(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段預(yù)防和治療的疾病包括具有FGF23過度活性的疾病，如腫瘤引起的軟骨病(tumor-induced osteomalachia)、ADHR、XLH、、骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、麥-奧ニ氏(McCune+Albright)綜合征，以及伴隨有異常礦物質(zhì)代謝的疾病如常染色體隱性低血磷癥。此外，(本發(fā)明)還有望提高對低血磷癥、骨鹽沉積衰竭、骨骼疼痛、肌肉無力、骨骼畸形、成長障礙、低1，2 血癥等疾病相關(guān)的綜合征的療效。由于FGF23在生理?xiàng)l件下具有重要作用，被磷代謝和維生素D代謝控制所介導(dǎo)的FGF23鈣代謝控制活性，可通過本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段來調(diào)控，因此，它們(本發(fā)明所述抗體、或此抗體的功能性片段)可用于預(yù)防和治療由礦物質(zhì)代謝和維生素D代謝異常所導(dǎo)致的疾病，如骨質(zhì)疏松癥、佝僂病(包括低血磷癥性佝僂病和維生素D抗性佝僂病)、高鈣血癥、低I丐血癥、異位I丐化癥(ectopic calcification)、骨硬化、派杰(Paget’ s)病、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、甲狀旁腺機(jī)能減退癥、搔癢癥等。此外，本發(fā)明所述抗體或此抗體的功能性片段也可用于以腎病性骨營養(yǎng)不良、透析性骨病、腎小管功能障礙為代表的由腎衰竭透析和腎衰竭并發(fā)癥引起的疾病的預(yù)防和治療。另ー方面，據(jù)報(bào)道，1，25D不僅具有上述的對礦物質(zhì)代謝(如鈣代謝等)的活性，也具有細(xì)胞生長抑制作用、細(xì)胞分化活性等。因此，本發(fā)明所述抗體或此抗體的功能性片段也可用于其生長分化由1，25D調(diào)控的細(xì)胞引起的疾病的預(yù)防和治療。
此外，眾所周知，在腫瘤引起的軟骨病中，由腫瘤引起的FGF23過量表達(dá)可導(dǎo)致病變。因此，可以想到，通過使用連接有放射性物質(zhì)(如放射性同位素等)、或者連接有各種毒素治療試劑(如低分子量藥物等)的本發(fā)明抗體，和所述抗體在過量產(chǎn)生FGF23的腫瘤中的聚集，會(huì)導(dǎo)致腫瘤回縮。III.制劑實(shí)例包含本發(fā)明所述抗體或此抗體的功能性片段的制劑，以溶解在水或除水以外的藥理上可接受的溶液中的無菌溶液或懸浮液的安瓿形式供使用。此外，也可將無菌粉劑(優(yōu)選凍干的本發(fā)明所述抗體分子)填充在安瓿中，使用時(shí)用藥理上可接受的溶液稀釋后供使用。實(shí)施例下面是通過實(shí)施例對本發(fā)明作更詳細(xì)描述，但這并不意味著本發(fā)明僅受限于實(shí)施例的這些描述。實(shí)施例I重組人FGF23表達(dá)載體的制備。(I)人FGF23H蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。使用可造成腫瘤引起的軟骨病(tumor-induced osteomalachia)的腫瘤的人cDNA文庫為模板，擴(kuò)增編碼人FGF23基因的cDNA，所述操作過程使用FlEc0RI引物(SEQ IDNO 1)和LHisNot引物(SEQ ID NO 2)和LA-Taq DNA聚合酶，進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)PCR循環(huán)的組成為96°C保溫lmin，然后96°C 30秒，55°C 30秒和72°C 30秒。所述FIEcoRI引物在退火后與存在于編碼人FGF23基因的核苷酸片段5'上游遠(yuǎn)端的序列結(jié)合，并在擴(kuò)增獲得的編碼人FGF23基因的核苷酸片段5'端處引入EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。所述LHisNot引物中含有可與編碼人FGF23基因的核苷酸序列中的終止密碼子5'端發(fā)生退火的序列、編碼末端(terminal)密碼子的序列(其在編碼His6標(biāo)記序列(His-His-His-His-His-His)和NotI限制性位點(diǎn)的序列之后)。結(jié)果，擴(kuò)增片段編碼人FGF23蛋白，在所述FGF23蛋白的羧基末端被加入一段His6-標(biāo)記的序列，其下游處有ー個(gè)NotI限制酶位點(diǎn)。所述擴(kuò)增片段經(jīng)EcoRI和NotI消化后，與同樣經(jīng)EcoRI和NotI消化的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.IZeo(Invitrogen)相連接。以這種方法構(gòu)建的所述表達(dá)載體被克隆且其核苷酸序列得以確定，從而確認(rèn)該表達(dá)載體編碼添加有His6標(biāo)記序列的目標(biāo)蛋白，即人FGF23蛋白。所述載體被稱為 pcDNA/hFGF23H。FIEcoRI CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(SEQ ID NO :1)LHisNot ATAAGAATGCGGCCGCTCA ATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(SEQ ID NO :2)(2)人FGF23蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建用pcDNA/hFGF23H作為模板擴(kuò)增片段，其中使用FIEcoRI引物和LNot引物(SEQ IDNO 3)和LA-Taq DNA聚合酶，進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)PCR循環(huán)的組成為94°C保溫lmin，然后94°C 30秒，55°C 30秒和72°C lmin。結(jié)束反應(yīng)后，所述編碼人FGF23片段用EcoRI和NotI進(jìn)行消化處理，然后純化。通過將其插入到pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoRI和NotI限制酶位點(diǎn)，這些純化得到的片段被克隆，所述PEAK8/IRES/EGFP載體是動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，其是通過在pEAKS (Edge Biosystem)內(nèi)連接分子內(nèi)核糖體進(jìn)入序列(intramolecularribosomal entry sequence, IRES)和增強(qiáng)型綠色突光蛋白(EGFP)而得到的。由此獲得的質(zhì)粒的核苷酸序列得以確定，從而確認(rèn)其編碼人FGF23蛋白。所述載體被稱為PEAK8/IRES/EGFP/hFGF23。LNot ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(SEQ ID NO :3)(實(shí)施例2)(I)重組人FGF23蛋白和重組突變型人FGF23H蛋白的表達(dá)。通過對所述載體中氨芐青霉素抗性基因上FspI限制酶位點(diǎn)的剪切，使pcDNA/hFGF23H被線性化并被純化，然后與鼠CHO克隆-I細(xì)胞(Shirahata，S.，等，Biosci BiotechBiochem, 59 :345-347,1995)混合，并利用 Gene Pulser II (Bio Rad)穿孔儀,使用電穿孔法被轉(zhuǎn)染到此細(xì)胞內(nèi)。在用含有10% FCS的MEMa培養(yǎng)基(Gibco BRL)培養(yǎng)這些細(xì)胞24小時(shí)后，培養(yǎng)基中加入Zecocin(Invitrogen)到終濃度O. 5mg/ml,然后(用此培養(yǎng)基)培養(yǎng)所述細(xì)胞I個(gè)星期。胰酶消化后，貼壁生長的細(xì)胞被釋放，并通過有限稀釋法，使其在Zecocin終濃度為O. 3mg/ml的條件下被克隆，以得到很多的細(xì)胞克隆。利用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)技術(shù)，表達(dá)人FGF23H效率最高的細(xì)胞被鑒定出來。每個(gè)細(xì)胞克隆的培養(yǎng)上清液都被收集并對其進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將(電泳得到的)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上。通過使用抗-His-tag (羧基末端)抗體和ECL光致發(fā)光系統(tǒng)(photo-luminescent, GE Healthcare Bioscience),檢測出來自約 32kDa 附近的 FGF23H蛋白的信號(hào)。因此，具有最高表達(dá)能力的被稱為#20的細(xì)胞克隆被發(fā)現(xiàn)，此細(xì)胞克隆被命名為CH0-0ST311H，并于2000年8月11日保藏于位于日本的國際專利生物體保藏中心國立先進(jìn)エ業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院(International Patent Organism Depositary (IPOD) NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)),Tsukuoa Centra丄6，l-l-lHigashi，Tsukuba，Ibaraki (保藏號(hào)FERM BP-7273)。在本說明書中，CH0-0ST311H被稱作 CH0-hFGF23H。(2)人FGF23表達(dá)細(xì)胞的獲得pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23載體對CHO Ras克隆-I細(xì)胞的轉(zhuǎn)染通過使用膜融合脂的基因轉(zhuǎn)染方法完成。當(dāng)培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中的CHO Ras克隆-I細(xì)胞已經(jīng)覆蓋住所述6孔培養(yǎng)板底部約60%時(shí)，移去所述培養(yǎng)基，并加入Iml無血清的MEMa培養(yǎng)基。2. 5 μ g轉(zhuǎn)入載體和10 μ I Transfectam(注冊■商標(biāo))(Promega)分別與50 μ I MEM α無血清培養(yǎng)基混合，兩種溶液混合后，靜置lOmin。將混合物加入事先準(zhǔn)備好的6孔板的培養(yǎng)孔中。孵育2小時(shí)后，移去含有DNA的培養(yǎng)基，換上含有10% FCS的培養(yǎng)基，孵育培養(yǎng)物一整夜。第二天，加入嘌呤霉素(Sigma)至終濃度5 μ g/ml，以選擇具有藥物抗性的細(xì)胞。通過有限稀釋法，由此獲得的具有藥物抗性的細(xì)胞被克隆。此外，利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，得到表達(dá)目標(biāo)蛋白效率最高的細(xì)胞系。所述細(xì)胞被稱為CH0-hFGF23。(3)重組人FGF23蛋白在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)和檢測。用抗羧基端-His6標(biāo)記序列的抗體對培養(yǎng)物上清液中CH0_hFGF23H重組物的蛋白質(zhì)印跡，檢測到兩條約為32kDa和IOkDa的條帶。將這兩條帶從凝膠中切出，并測定其N-末端氨基酸序列。在較大分子量條帶(約為32kDa)中，所檢測到的序列是從SEQ ID NO :4中 第25位氨基酸開始的氨基酸序列，它可被視為是在分泌過程中其信號(hào)肽段序列已被切除的人FGF23蛋白。另ー方面，在較小分子量條帶中，所檢測序列被確認(rèn)是從SEQ ID NO :4中第180位氨基酸開始的氨基酸序列，事實(shí)證明此片段是179與180位氨基酸之間發(fā)生剪切后產(chǎn)生的羧基末端片段。此外，通過利用可識(shí)別所述人FGF23N-末端ー側(cè)的多克隆抗體對其的檢測，具有從第179位氨基酸開始到N-末端氨基酸序列的多肽(氨基酸末端肽段)的存在也得到確認(rèn)(國際專利出版號(hào)W002/14504)。相似地，在所述不具His6標(biāo)記序列的CH0_hFGF23培養(yǎng)上清液中，發(fā)生于第179與180位氨基酸殘基之間的剪切也得到確認(rèn)(國際專利出版號(hào)W002/14504)。因此，以下的操作被用于分離和純化沒有發(fā)生剪切的全長人FGF23蛋白，所述全長人FGF23蛋白具有SEQID NO 4中從第25位到第251位的氨基酸序列(有時(shí)稱作全長FGF23)。(4)重組全長人FGF23蛋白的純化所述CH0_hFGF23培養(yǎng)上清液用 SuperCap (注冊■商標(biāo))(Pall Gelman Laboratory)過濾，所使用的SuperCap是ー種孔徑為O. 2μπι的膜過濾裝置，過濾所得濾液通過SP-Sepharose FF (GE Healthcare Bioscience)。與層析柱結(jié)合能力較弱的物質(zhì)被50mM的磷酸鈉鹽緩沖液(PH 6. 7)漂洗和洗脫下來。所述(洗脫)成分包括發(fā)生于第179與180位氨基酸殘基之間的剪切作用產(chǎn)生的所述羧基末端片段。吸附在層析柱中的蛋白被濃度梯度為0-0. 7M的NaCl溶液洗脫下來，全長人FGF23蛋白在約O. 3M NaCl溶液的洗脫成分中被觀察到。下ー步，全長人FGF23蛋白被吸附到金屬親和性層析柱Talon Superflow(注冊■商標(biāo))(Clonetech)中，并經(jīng)50mM的磷酸鈉鹽緩沖液(pH6. 7)漂洗,通過加入不同濃度咪唑，將所述全長人FGF23蛋白洗脫純化。包含目標(biāo)蛋白的所述(洗脫)成分被SP-S印harose FF柱吸收，洗脫后純化。人FGF23 氨基酸序列(SEQ ID NO 4)MLGARLRLffV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSffGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGHVDGAPHQTIYSALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMTPAPASCSQELPSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKFI(實(shí)施例3)生產(chǎn)人抗體的小鼠的產(chǎn)生(KM小鼠)用于制備人單克隆抗體的生產(chǎn)完全人抗體的小鼠具有內(nèi)源性Ig重鏈和K-輕鏈都被破壞的純合體遺傳背景，同時(shí)具有包含人Ig重鏈基因位點(diǎn)的第14號(hào)染色體片段(SC20)和人Ig K -輕鏈轉(zhuǎn)基因(KCo5)。所述小鼠通過A品系小鼠和B品系小鼠的雜交育種獲得，其中A品系小鼠具有人Ig重鏈基因位點(diǎn)，B品系小鼠具有人Ig K -輕鏈轉(zhuǎn)基因(KCo5)。所述A品系小鼠為內(nèi)源性Ig重鏈和K-輕鏈都被破壞的純合體，且具有可被傳遞給后代的第14號(hào)染色體片段(SC20)的小鼠品系。此小鼠品系在如Tomizuka等作出的報(bào)道中被描述(Tomizuka，等，Proc Natl. Acad. Sci. USA. , 97 :722-727, 2000) 此外，所述 B品系小鼠為內(nèi)源性Ig重鏈和K -輕鏈都被破壞的純合體,且具有所述人Ig K -輕鏈轉(zhuǎn)基因(KCo5)的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。此小鼠品系在如Fishwild等作出的報(bào)道中被描述(Nat.Biotechnol. ， 14 ;845_851，1996)。在以下的免疫實(shí)驗(yàn)中所用的小鼠個(gè)體是由雄性A品系小鼠和雌性B品系小鼠或雄性B品系小鼠和雌性A品系小鼠雜交所獲得的小鼠，并且，在此所用的小鼠血清中可同時(shí)檢測到人 Ig 重鏈和 K _ 輕鏈[Ishida&Lonberg, IBC' s Ilth Antibody Engineering,Abstract 2000]。此外,所述產(chǎn)生人抗體的小鼠也可通過締結(jié)合約的方法從Kirin BeerCompany公司獲得。(實(shí)施例4)抗人FGF23的人單克隆抗體的制備(I).產(chǎn)生抗人FGF23的人單克隆抗體的雜交瘤的獲得。本實(shí)施例中所用單克隆抗體可用普通方法制備,如，由Tamio Ando等編寫的"單克隆抗體實(shí)驗(yàn)室操作說明"("Introduction to monoclonal antibody experimentalmanipulation" ), (Kodansha出版，1991)。實(shí)施例2中制備的全長人FGF23蛋白被用作免疫原，使用可產(chǎn)生實(shí)施例3中制得的人免疫球蛋白的人抗體生成小鼠。為制備人抗FGF23單克隆抗體，首先，將實(shí)施例2中得到的經(jīng)純化的全長人FGF23蛋白與RIBI佐劑(Corixa)在腹腔內(nèi)混合，并在首次免疫時(shí)以每只小鼠20 μ g的劑量，將其腹腔接種于人抗體生成小鼠。與首次免疫相類似，在兩周的時(shí)間間隔內(nèi)，將純化得到的FGF23蛋白與RIBI佐劑(Corixa)混合物共接種小鼠3次。五只小鼠被用于免疫作用，第三次免疫后，抽取血液樣本，利用下述酶標(biāo)識(shí)免疫吸附法(ELISA法)，血清中抗FGF23人IgG抗體的存在得到確認(rèn)。利用ELISA方法，使用由用抗FGF23蛋白單克隆鼠抗體一3CIE抗體而固定化的FGF23，血清中含有最高(抗FGF23人IgG抗體)濃度值的小鼠被篩選出來，其中，所用抗FGF23蛋白單克隆鼠抗體--3CIE抗體被公開于國際專利出版號(hào)W003/057733(作為FERM BP-7839被保藏的雜交瘤產(chǎn)生的抗-FGF23抗體)。在進(jìn)行如下所描述的脾臟分離之前3天，通過鼠尾靜脈(接種)給藥，以每個(gè)小鼠給藥20μ g全長人FGF23蛋白免疫小鼠。所述脾臟用外科手術(shù)從經(jīng)免疫的小鼠中分離出來，并被浸入含有350mg/mL碳酸氫鈉、50單位/mL青霉素、50 μ g/mL鏈霉素的IOmL無血清DMEM培養(yǎng)基中(Invitrogen,以下稱作無血清DMEM培養(yǎng)基)，然后用刮勺(spatula)將其碾碎在濾網(wǎng)(mesh)上(細(xì)胞濾器Falcon)。通過此濾網(wǎng)(mesh)的所述細(xì)胞懸浮液經(jīng)離心后，生成細(xì)胞沉淀，然后，用無血清DMEM培養(yǎng)基漂洗這些細(xì)胞兩次，接著，對懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中的這些細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0(ATCC No. CRL-1581)在含有10% FCS(Sigma)的DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)基(以下稱作含血清DMEM培養(yǎng)基)中，于37°C和存在5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，要使其細(xì)胞密度不高于I X IO6細(xì)胞/mL。同樣，用無血清DMEM培養(yǎng)基漂洗這些骨髄瘤細(xì)胞，并懸浮在無血清DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)?；厥盏玫降钠⑴K細(xì)胞懸浮液與鼠骨髄瘤細(xì)胞懸浮液按5 I的細(xì)胞數(shù)目比例混合并離心后，將上清液完全去除。對所述細(xì)胞團(tuán),在一邊用移液管尖端攪拌此細(xì)胞團(tuán)時(shí),一邊緩慢加入作為融合介質(zhì)的ImL 50%(w/v)的聚こニ醇1500 (Boehringer-Manheim),然后分兩次緩慢加入預(yù)熱到37°C的ImL無血清DMEM培養(yǎng)基，再加入7mL無血清DMEM培養(yǎng)基。離心后，去除上清液，得到融合細(xì)胞。由此所得的融合細(xì)胞用如下所述的有限稀釋法進(jìn)行篩選。雜交瘤的篩選通過在含10% FCS、IL-6(10ng/mL)(或10%雜交瘤克隆因子(以下稱作HCF) =Biobase)、次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶脫氧核苷(T)(以下稱作HAT Sigma)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)來完成的。此 夕卜，用含HT(Sigma)、10% FCS和10% HCF的DMEM培養(yǎng)基，并通過有限稀釋法，進(jìn)行單個(gè)克隆。(細(xì)胞的)培養(yǎng)在96孔微量滴定板(Becton，Dickinson)上進(jìn)行。生成抗-FGF23人單克隆抗體的雜交瘤克隆的選擇(篩選)和由各個(gè)產(chǎn)生雜交瘤的人單克隆抗體的品質(zhì)鑒定，通過如下所述的酶標(biāo)識(shí)免疫吸附法(ELISA法)進(jìn)行。結(jié)果，得到許多雜交瘤，所述雜交瘤包含人免疫球蛋白Y鏈(hlg Y)和人免疫球蛋白輕鏈K，并且可產(chǎn)生具有與人FGF23特殊反應(yīng)活性的人單克隆抗體。從這些所得到的許多雜交瘤中，作為產(chǎn)生識(shí)別FGF23蛋白的抗體的雜交瘤，特別獲得2個(gè)克隆(C10和C15)。此外，在包括本實(shí)施例在內(nèi)的以下所有實(shí)施例中，生成本發(fā)明的抗-FGF23人單克隆抗體的各雜交瘤克隆用符號(hào)代表。在所述符號(hào)的前或后所出現(xiàn)的“抗體”意指由雜交瘤生成的抗體，或由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組抗體，所述宿主細(xì)胞帶有從所述雜交瘤中分離出來的抗體基因(全長或可變區(qū))。在本文明確指出的范圍內(nèi)，有時(shí)雜交瘤克隆的名稱可表示抗體的名稱。在2007年2月2日，ClO雜交瘤克隆已保藏于位于日本的國際專利生物體保藏中心國立先進(jìn)エ業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院(International PatentOrganism Depositary(IPOD)National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology (AIST)), Tsukuba Central 6,1-1-lHigashi, Tsukuba, Ibaraki)(保藏號(hào)為FERM ABP-10772) (ID 標(biāo)簽C10)。(2)來自于所述雜交瘤培養(yǎng)物上清液的ClO和C15抗體的純化實(shí)施例4(1)中得到的ClO和C15雜交瘤被限制培養(yǎng)在含有胰島素(Syg/ml，Invitrogen)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(5 μ g/ml, Invitrogen)、ニ磷脂酰甘油(0. OlmM, Sigma)、亞硒酸鈉(2. 5X 10-5mM, Sigma) >I % Low IgG 胎牛血清(Hyclone)的 eRDF 培養(yǎng)基(KyokutoSeiyaku)中。所述雜交瘤被培養(yǎng)在長頸瓶中，所得培養(yǎng)物上清液被回收。利用Protein GFast Flow凝膠(GE Healthcare, Bioscience),使所述培養(yǎng)物上清液被親和性純化,此法使用PBS(-)為吸附緩沖液，O. IM甘氨酸緩沖液為洗脫緩沖液(pH 2. 8)。通過加入IM Tris (pH
9.0)，將洗脫成分的pH值調(diào)整到約為pH 7. 2。使用S^hadex G25脫鹽層析柱(NAP column ；GE Healthcare Bioscience),由此制得的所述抗體溶液被PBS所置換,然后通過孔徑為
O.22 μ m膜過濾器MILLEX-GV(MiIlipore)的過濾滅菌作用，使其無菌化，從而得到純化的ClO和C15抗體。通過測定經(jīng)純化的抗體在280nm的吸光值，來測定其濃度，其中，計(jì)算基準(zhǔn)為 I.40D = lmg/mL。(實(shí)施例5)編碼ClO抗體的抗體基因的獲得及其序列的測定(I). ClO抗體的cDNA序列的合成為獲得表達(dá)于ClO雜交瘤的含有人抗體重鏈和輕鏈的抗體可變區(qū)的所述DNA片段，應(yīng)用5' RACE法(5, cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù))進(jìn)行克隆，所述5, RACE法使用可與人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)特異性結(jié)合的引物。具體是，進(jìn)行克隆時(shí)所用的試劑盒為BD SMARTRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Becton Dickinson Bioscience Clonetech),克隆按試劑盒所附的操作說明進(jìn)行。、根據(jù)操作說明，將RNA抽提試劑ISOGEN(Nippon Gene)加入到ClO雜交瘤中，取15 μ g純化得到的總RNA用作cDNA合成的原料。以各個(gè)約I μ g的純化獲得的總RNA為模板，制得第一鏈cDNA。除RNA之外的所有試劑和酶均由BD SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(cDNA擴(kuò)增試劑盒)提供。在第一鏈cDNA的合成中，總RNAI μ g/3 μ I5' CDSI μ ISMART Oligo I μ I由上述組分組成的反應(yīng)混合物于70°C孵育2分鐘，然后，加入
5 X Buffer 2 μ DTT I μ dNTP Mix I μ PowerScript 反轉(zhuǎn)錄醉 I μ 接著，于42°C孵育1. 5小時(shí)。進(jìn)ー步地，加入50μ1 Tricine-EDTA緩沖液，然后于72°C孵育7分鐘，獲得第一鏈cDNA。⑵PCR方法擴(kuò)增所述重鏈和輕鏈基因，并確認(rèn)其核苷酸序列(2)-I ；PCR方法擴(kuò)增所述重鏈和輕鏈基因?yàn)閿U(kuò)增編碼所述ClO抗體的基因的cDNA，下述的反應(yīng)混合物被制備并被用于PCR，所使用的ー組PCR引物包括3'引物和5'引物，其中，所述3'引物序列具有對人抗體基因的特異性序列(所述特異性序列將在下面被描述)，所述5'引物(通用引物A混合物)與添加于所述cDNA的5'末端的序列特異性雜交結(jié)合，所述cDNA用BD SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒合成，此外，PCR所用酶為KOD-Plus-DNA聚合酶(Toyobo)。無菌水H2028 μ
第 I 鏈 cDNA2.5 μ
KOD-Plus-緩沖液(IΟΧ)5 μ
dNTP Mix (2 mM)5 μ
MgSO4 (25 mM)2 μ
KOD-Plus- (I 單位/μ )I μ 通用引物A混合物(UPM) (IOX)5 μ
基因特異性引物(GSP)(IOpM)1.5 μ 總體積50 μ 對于所述重鏈基因的擴(kuò)增反應(yīng)，所使用的引物為SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒中的UPM引物和IgGlp引物(SEQ ID NO :5)，而對于所述輕鏈基因的擴(kuò)增，所使用的引物為SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒中的UPM引物和hk_2引物(SEQ ID NO 6)。IgG Ip TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG(SEQ ID NO :5)hk-2 GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC (SEQ ID NO:引物 6)此外，所用的反應(yīng)條件如下重復(fù)5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C /30秒，72°C /3min,重復(fù)5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C /30秒，70V /30秒，72V /3min重復(fù)25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C /30秒，68°C /30秒，72°C /3min進(jìn)ー步地,2 μ I所述反應(yīng)混合物通過加入98 μ I Tricine-EDTA緩沖液得到稀釋，所得5 μ I稀釋液作為模板用于第二次(巢式)PCR反應(yīng)所述PCR反應(yīng)溶液的組成如下
無菌水H2O30 μ
第一次PCR反應(yīng)溶液(50倍稀釋) 5 μ KOD-Plus-緩沖液(IOX)5 μ
dNTP Mix (2 mM)5 μ
MgSO4 (25 mM)2 μ
KOD-Plus- (I 單位/μ )I μ 巢式通用引物A (NUP; 10 μΜ)I μ
基因特異性引物(GSP)(10pM)I μ
總體積50 μ 在上述反應(yīng)中，用于所述重鏈基因擴(kuò)增的ー組引物為NUP引物(在SMART RACEcDNA 擴(kuò)增試劑盒中；Becton Dickinson Bioscience Clonetech)和 hh2 引物(SEQ ID NO:7) ο用于所述輕鏈基因擴(kuò)增的ー組引物為UPM引物和hk-5引物(SEQ ID NO :8)。所述反應(yīng)溫度條件如下起始溫度94°C lmin，然后重復(fù)20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)由94°C/5sec，68°C/10秒和72°C /3min組成，最后，72°C加熱7min。hh2 GCTGGAGGGCACGGTCACCACGC(SEQ ID NO :7)hk-5 AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC(SEQ ID NO :8)⑵-2 ;所述抗原基因的核苷酸序列的測定經(jīng)擴(kuò)增的重鏈PCR片段(以下稱作HV [C]:由H鏈 的5'-非翻譯區(qū)的前導(dǎo)序列，可變區(qū)(HV)和恒定區(qū)的部分區(qū)域[C]組成)和經(jīng)擴(kuò)增的輕鏈PCR片段(以下稱作LV[C]由L鏈的5'-非翻譯區(qū)的前導(dǎo)序列，可變區(qū)(LV)和所述恒定區(qū)的部分區(qū)域[C]組成)通過こ醇沉淀法被回收，然后用瓊脂糖凝膠電泳法回收。再通過使用膜的DNA純化試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen))進(jìn)行純化。經(jīng)純化的HV[C]擴(kuò)增片段或LV[C]擴(kuò)增片段分別被亞克隆到Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒(Zero Blunt TOPO PCR克隆盒)(Invitrogen)的PCR 4 Blunt-ΤΟΡΟ載體上，對所獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，作插入DNA的核苷酸序列分析。DNA的核苷酸序列測定所用的引物是M13-20FW(SEQ ID NO 9)和M13RV(SEQID NO :10)。M13-20FW GTAAAACGAC GGCCAGTG(SEQ ID NO :9)M13RV CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO :10)編碼CIO抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA核苷酸序列，以及重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列展示如下〈C10重鏈核酸序列 > (可變區(qū)從ATG起始密碼子到編碼羧基末端氨基酸殘基的DNA 序列)(SEQ ID NO 11)102030405060ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CTCCAGGTGC TCACTCCCAG708090100110120GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTTTCC130140150160170180TGCAAGGCAT CTGGATACAC CTTCACCAAC CACTATATGC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT190200210220230240GGACAAGGGC TTGAGTGGAT GGGAATAATC AACCCTATTA GTGGTAGCAC AAGTAACGCA250260270280290300CAGAAGTTCC AGGGCAGAGT CACCATGACC AGGGACACGT CCACGAGCAC AGTCTACATG310320330340350360GAGCTGAGCA GCCTGAGATC TGAGGACACG GCCGTGTATT ATTGTGCGAG AGATATTGTG370380390400408GATGCTTTTG ATTTCTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCTTCA〈C 10重鏈氨基酸序列 > (到前導(dǎo)序列和可變區(qū))(SEQ ID NO : 12)(劃線部分氨基酸殘基代表作為分泌信號(hào)的前導(dǎo)序列)102030405060MDffTffRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN HYMHWVRQAP708090100110120
GQGLEWMGII NPISGSTSNA QKFQGRVTMT RDTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCARDIV130136DAFDFffGQGT MVTVSS〈CIO輕鏈核酸序列 > (可變區(qū)從ATG起始密碼子到編碼羧基末端氨基酸殘基的DNA 序列)(SEQ ID NO 13)102030405060ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC
708090100110120AGATGTGCCA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA130140150160170180GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGGGC ATTAGCAGTG CTTTAGTCTG GTATCAGCAG190200210220230240AAACCAGGGA AAGCTCCTAA GCTCCTGATC TATGATGCCT CCAGTTTGGA AAGTGGGGTC250260270280290300CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG310320330340350360CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTTTA ATGATTACTT CACTTTCGGC370380384CCTGGGACCA AAGTGGATAT CAAA〈C10輕鏈氨基酸序列 > (到前導(dǎo)序列和可變區(qū))(SEQ ID NO 14)(劃線部分氨基酸殘基代表作為分泌信號(hào)的前導(dǎo)序列)102030405060MDMRVPAQLL GLLLLffLPGA RCAIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALVffYQQ708090100110120KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNDYFTFG128PGTKVDIK此外，在亞克隆于載體PCR 4Blunt_T0P0的ClO抗體的基因序列中，所述人抗體恒定區(qū)的部分序列被克隆，且此區(qū)域的DNA核苷酸序列也得到分析。其結(jié)果，可確認(rèn)編碼由Kabat等編寫的EU index中所示的重鏈恒定區(qū)118位到191位氨基酸殘基的序列，在此區(qū)域中，此序列被確認(rèn)與人IgGl的氨基酸序列完全一致，且ClO抗體亞類為IgGl。此外，通過使用同樣的方法，編碼C15抗體的抗體基因也被獲得，此抗體所屬序列也得到確定。(實(shí)施例6)重組ClO抗體表達(dá)載體的構(gòu)建ClO表達(dá)載體的產(chǎn)生(技術(shù)方案顯不在圖I)利用PCR技術(shù)，使用KOD-Plus-DNA聚合酶，以獲得的含有ClO抗體LV[C]鏈的質(zhì)粒DNA為模板，使用在其末端被設(shè)計(jì)成連上限制酶切位點(diǎn)(5,末端Bglll，3'末端BgIII)的引物 C10_L5_Bgl(SEQ ID NO :15)和 C10_L3_Bsi (SEQ ID NO :16)，所述ClO 抗體的 LV (輕鏈的前導(dǎo)序列+可變區(qū))DNA被擴(kuò)增。所述反應(yīng)溫度條件為起始溫度94°C加熱lmin，每個(gè)循環(huán)包括94°C /5秒和68°C /45秒重復(fù)此循環(huán)35次，最后，72°C加熱3min。經(jīng)擴(kuò)增的DNA片段用限制性內(nèi)切酶BglII和BsiWI消化處理后，再用瓊脂糖凝膠電泳法純化，回收得到約400bp DNA。另一方面，所述載體,N5KGl_Val Lark 載體(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 修飾型載體(美國專利6001358))同樣經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglII和BsiWI消化處理，并經(jīng)堿性磷酸酶(E. coli C75) (Takara Shuzo Co. ,Ltd.)去磷酸化作用處理,然后用瓊脂糖凝膠和DNA純化試劑盒純化，回收得到稍小于9kb的DNA。這兩條DNA片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)染到大腸桿菌DH10B，以獲得轉(zhuǎn)化子。對含有插入DNA的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA作DNA核苷酸序列分析后，獲得質(zhì)粒DNA，N5KGl_C10_Lv，其中，ClO抗體的LV被插入到編碼N5KGl_Val Lark人抗體輕鏈恒定區(qū)的5'上游處的框架內(nèi)。下一歩，所述ClO抗體的HV DNA(重鏈前導(dǎo)序列+可變區(qū))被插入質(zhì)粒載體(N5KGl_C10-_Lv)，其中，此質(zhì)粒載體中已被插入LV。以含有所述ClO抗體的HV [C]的被亞克隆于pCR4Blunt-T0P0載體的質(zhì)粒DNA為模板，使用設(shè)計(jì)成末端連有限制酶切位點(diǎn)(Sail位于Y末端，NheI位于:V末端)的引物C10_H5_Sal (SEQID NO 17)和C10_H3_Nhe (SEQ ID NO :18)，用PCR擴(kuò)增HV0所述反應(yīng)溫度條件為起始溫度94°C加熱lmin，每個(gè)循環(huán)包括94°C /5秒和68°C /45秒，重復(fù)此循環(huán)35次，最后，72°C加熱7min。經(jīng)純化的擴(kuò)增的HV DNA片段被亞克隆于pCR4Blunt_T0P0載體，對由此獲得的克隆的質(zhì)粒DNA，作插入DNA的核苷酸序列分析。DNA的核苷酸序列測定所用的引物是上面所述的M13-20FW和M13RV。對亞克隆，作插入部分DNA的核苷酸序列的分析，這與作為模板的HV沒有差異，此外，選擇的質(zhì)粒DNA(T0P0_C10_Hv)，其中的引物部分具有所設(shè)計(jì)的序列。這些DNA被限制酶SalI和NheI消化后，用瓊脂糖凝膠電泳法純化，回收得到約420bp的DNA，此DNA片段用T4DNA連接酶連接到同樣地經(jīng)限制酶(Sail和NheI)處理和去磷酸化處理的N5KGl_C10_Lv DNA (約9kb)上，然后，將所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH10B，從由此得到的轉(zhuǎn)化子中篩選出所述目標(biāo)的質(zhì)粒DNA。大量純化由上述方法得到的抗體表達(dá)質(zhì)粒DNA—N5KG1_C10_IH (克隆#1)，并證實(shí)在克隆過程中，L鏈和H鏈整個(gè)區(qū)域，及其插入位點(diǎn)周圍的DNA核苷酸序列沒有被引入變化(圖2，圖3)。進(jìn)行DNA核苷酸序列的確認(rèn)吋，使用SEQ ID NO :19-25的各種引物。制得的所述ClO抗體表達(dá)載體的簡圖見圖4。此外，使用同樣的方法，構(gòu)建重組ClO抗體表達(dá)載體。C10_L5_Bgl GAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT(SEQ ID NO :15)C10_L3_Bsi AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC(SEQ ID NO :16)C10_H5_Sal AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC(SEQ ID NO :17)C10_H3_Nhe AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC(SEQ ID NO :18)hh-4 GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG(S EQ ID NO :19)hh-1 CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC (SEQ ID NO :20)CMVH903F GACACCCTCATGATCTCCCGGACC(SEQ ID NO :21)
CMVHRl303 TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT(SEQ ID NO :22)SEQU4618 TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC(SEQ ID NO :23)
hk-1 TGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTC (SEQ ID NO :24)SEQU1783 GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA(SEQ ID NO :25)(實(shí)施例7)重組型CIO抗體的制備通過將所述構(gòu)建完成的ClO抗體表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，制得ClO抗體表達(dá)細(xì)胞。對于表達(dá)宿主細(xì)胞，使用在無血清培養(yǎng)基一EX-CELL325PF培養(yǎng)基(JRH，含有2mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HT)補(bǔ)充物(I : 100) (Invitrogen))中條件性(conditioned)培養(yǎng)的ニ氫葉酸還原酶(DHFR)缺失的突變型CHO DG44細(xì)胞系(以下稱作CHO細(xì)胞，IDEC Pharmaceuticals)。用電穿孔法進(jìn)行
所述載體對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)入。通過電穿孔法，用限制酶AscI使約2yg ClO表達(dá)載體線性化，并在350V, 500 μ F條件下，使用BioRad Electroporator (BioRad電穿孔儀),將所述基因轉(zhuǎn)入4X106 CHO細(xì)胞中，然后，將所得細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，加入G418并繼續(xù)培養(yǎng)。對克隆進(jìn)行確認(rèn)檢驗(yàn)后，篩選得到抗體表達(dá)株系。篩選得到的CHO細(xì)胞系在EX-CELL-325PF培養(yǎng)基(含有2mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HT)補(bǔ)充物(I 100) (Invitrogen))中，于5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所得培養(yǎng)物上清液被吸收在Mabselect Protein A column (GEHealthcare Bioscience)中，用 PBS 漂洗后，再用 20mM 朽1 樣酸鈉鹽(citrate-Na)和 5OmMNaCl (pH 3.4)緩沖液洗脫。用50mM pH 7. O磷酸鈉鹽緩沖液中和洗脫液。用去離子水稀釋
I.5倍，將經(jīng)稀釋的洗脫液的導(dǎo)電率調(diào)整到4. 0ms/cm以下。緊接著，所得樣品進(jìn)料后被吸收到由 Q-Sepharose (Hitrap Q HP, GE Healthcare Bioscience)和 SP-Sepharose (HitrapSP FF, GE Healthcare Bioscience)連接組成的層析柱上，用20mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH
5.0)漂洗，然后用PBS(-)洗脫。因此制得的抗體溶液通過孔徑為0.22 μ m的膜過濾器，MlLLEX-GV(Millipore)，過濾除菌。通過檢測其在280nm的光吸收值，計(jì)算經(jīng)純化的ClO抗體濃度，計(jì)算基準(zhǔn)為[1.40D280 = lmg/mL]。另外，通過使用同樣的方法，制備重組C15抗體。(實(shí)施例8)獼猴FGF23蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建將經(jīng)EDTA處理后的獼猴靜脈血和懸浮在PBS㈠中的5 % DextranT-2000 (GEHealthcare Bioscience)以2 : I的比例混合，以沉淀血紅細(xì)胞。隨后，上清液分層在淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Plaque) (GE Healthcare Bioscience)的上層，離心得到淋巴細(xì)胞成分。由此所得的淋巴細(xì)胞被懸浮在IS0GEN-LS (Nippon Gene)，按照所附的實(shí)驗(yàn)方案，得到獼猴總淋巴細(xì)胞RNA。按照所附的實(shí)驗(yàn)方案，利用所制得獼猴總淋巴細(xì)胞RNA和第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen)，制備得到獼猴淋巴細(xì)胞cDNA文庫。通過實(shí)施以下操作過程使編碼獼猴FGF23的cDNA擴(kuò)增所述獼猴淋巴細(xì)胞cDNA文庫為模板，使用猴yFGF23FW引物(SEQID NO 26)和猴 FGF23RV 引物(SEQ ID NO :27)，以及 KOD plus DNA 聚合酶(Toyobo), 94°C孵育5min，然后進(jìn)行45個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)PCR循環(huán)由94°C /20秒，55°C /30秒和72°C /50秒組成。所述猴FGF23FW引物退火后與存在于編碼人FGF23的核苷酸序列5'上游區(qū)域的序列相結(jié)合，并在擴(kuò)增得到的DNA片段FGF23編碼區(qū)的5'處加入EcoRI限制酶位點(diǎn)。所述猴FGF23RV引物包含一段退火后可與包括編碼人FGF23編碼區(qū)終止密碼子的序列相結(jié)合的序列，并包含有Not I限制酶位點(diǎn)。擴(kuò)增所得的片段經(jīng)EcoRI和NotI消化，再插入在pEAKS/IRES/EGFP載體的EcoRI和NotI限制酶位點(diǎn)處而被克隆，其中，所述pEAK8/IRES/EGFP載體在表達(dá)載體PEAKS (Edge Biosystem)內(nèi)連接了內(nèi)核糖體進(jìn)入序列(IRES)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)。對由此得到的質(zhì)粒的核苷酸序列測序，以確定其編碼獼猴FGF23蛋白，此載體被稱為PEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23。此外，在本實(shí)施例中獲得的獼猴FGF23的核酸序列和氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 29中。猴FGF23FW :CGGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCT(SEQ ID NO :26)猴FGF23RV :ATTTGCGGCCGCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGC (SEQ ID NO :27)獼猴FGF23 核酸序列(SEQ ID NO 28)ATGTTGGGGGCCCGCCTCAGGCTCTGGGTCTGTGCCTTGTGCAGCGTCTGCAGCATGAGCGTCATCAGA GCCTATCCCAATGCCTCCCCATTGCTCGGCTCCAGCTGGGGTGGCCTGATCCACCTGTACACAGCCACAGCCAGGAACAGCTACCACCTGCAGATCCACAAGAATGGCCACGTGGATGGCGCACCCCATCAGACCATCTACAGTGCCCTGATGATCAGATCAGAGGATGCTGGCTTTGTGGTGATTACAGGTGTGATGAGCAGAAGATACCTCTGCATGGATTTCGGAGGCAACATTTTTGGATCACACTATTTCAACCCGGAGAACTGCAGGTTCCGACACTGGACGCTGGAGAACGGCTACGACGTCTACCACTCTCCTCAGCATCACTTTCTGGTCAGTCTGGGCCGGGCGAAGAGGGCCTTCCTGCCAGGCATGAACCCACCCCCCTACTCCCAGTTCCTGTCCCGGAGGAACGAGATCCCCCTCATCCACTTCAACACCCCCAGACCACGGCGGCACACCCGGAGCGCCGAGGACGACTCGGAGCGGGACCCCCTGAACGTGCTGAAGCCCCGGGCCCGGATGACCCCGGCCCCGGCCTCCTGCTCACAGGAGCTCCCGAGCGCCGAGGACAACAGCCCGGTGGCCAGCGACCCGTTAGGGGTGGTCAGGGGCGGTCGGGTGAACACGCACGCTGGGGGAACGGGCCCGGAAGCCTGCCGCCCCTTCGCCAAGTTCATCTAG獼猴FGF23 氨基酸序列(SEQ ID NO 29)MLGARLRLffV CALCSVCSMS VIRAYPNASP LLGSSffGGLIHLYTATARNS YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDAGFVVITGVMS RRYLCMDFGG NIFGSHYFNP ENCRFRHWTLENGYDVYHSP QHHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSRRNEIPLIHFN TPRPRRHTRS AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQELPSAEDNSPVA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEACRPFAKFI(2)獼猴FGF23表達(dá)細(xì)胞上清液的制備通過磷酸鈣法，將pEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到PEAK快速細(xì)胞(rapidcells) (Edge Biosystem)中，從而獲得它們的培養(yǎng)物上清液。(實(shí)施例9)ClO抗體對獼猴FGF23結(jié)合能力的研究。通過以下用夾心ELISA的方法，研究了 ClO抗體不僅結(jié)合于人FGF23，同樣也與獼猴FGF23結(jié)合。將實(shí)施例4中制得的ClO抗體、2C3B抗體和人IgGl對照抗體稀釋在50mMNaHCO3溶液中，得到濃度為5 μ g/ml的稀釋溶液，然后被加到96孔微孔板的各個(gè)孔中，4°C孵育12小時(shí)，以用于ELISA (Maxisorp (注冊■商標(biāo))，Nunc)反應(yīng)。由此，ClO抗體、2C3B抗體和作為對照的人IgGl對照抗體被吸收到微孔板中。接下來，除去所述這些溶液，并在每個(gè)孔中加入阻斷劑(SuperBlock (注冊商標(biāo))阻斷緩沖液，PIERCE)，室溫孵育30min，然后用含有O. 1% Tween20的Tris緩沖生理鹽水(T-TBS)漂洗各個(gè)孔兩次。將實(shí)施例2中純化制得的全長人FGF23蛋白或?qū)嵤├?中制得的表達(dá)獼猴FGF23的細(xì)胞上清液稀釋到合適的濃度后，加到被抗-FGF23抗體覆蓋的微孔板的各個(gè)孔中，與固定化的抗體反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)，然后用含有O. 1% Tween20的Tris緩沖生理鹽水(T-TBS)漂洗每個(gè)孔兩次。接下來加入3 μ g/ml生物素標(biāo)記的3C1E抗體，室溫孵育I. 5小時(shí)，以使生物素標(biāo)記的3C1E抗體與人或獼猴FGF23結(jié)合，其中，所述人或獼猴FGF23被結(jié)合在固定化抗體上。用T-TBS漂洗后，加入5000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親合素(DAKO)，使之反應(yīng)I小吋，并用T-TBS漂洗3次。每孔加入含有四甲基聯(lián)苯胺(DAKO)的底物緩沖液，室溫孵育30min。每孔中加入O. 5M的硫酸，終止反應(yīng)。以570nm波長為參照波長，用微孔板讀出機(jī)(MTP-300，ColonaElectric Co.)檢測其在450nm波長的吸光度。比較人全長FGF23蛋白和獼猴FGF23表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在以3倍的稀釋比進(jìn)行稀釋時(shí)的反應(yīng)活性。所得結(jié)果顯示在圖5A和圖B。正如圖5A清楚顯示的那樣ClO抗體或2C3B抗體固定化時(shí)，對人全長FGF23蛋白的反應(yīng)活性是相同的。在此條件下，對于獼猴FGF23表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的稀釋系列的反應(yīng)性，在ClO抗體反應(yīng)活性和2C3B抗體反應(yīng)活性之間，沒有觀察到太大差異(圖5B)。也即是，ClO抗體，與2C3B抗體相同，被證明能夠結(jié)合于人和獼猴FGF23。
(實(shí)施例10)ClO抗體和2C3B抗體對正常獼猴血中磷濃度和血中I α，25- ニ羥基維生素D濃度的作用效果比較。FGF23具有以下的作用促進(jìn)腎磷排泄和降低血液磷濃度，抑制腎中維生素D活化酶和降低血中Ia，25_ ニ羥基維生素D(以下稱作1，25D)濃度(國際專利出版號(hào)W002/14504)。已證實(shí)將對2C3B抗體等FGF23，具有抑制作用，也即是，中和活性的抗體，給藥于正常鼠，導(dǎo)致內(nèi)源性FGF23活性的抑制、血清磷酸鹽濃度和血清1，25D濃度升高(國際專利出版號(hào)W003/057733)。由此，這強(qiáng)烈表明對FGF23具有中和活性的抗體對由過量FGF23導(dǎo)致的包括腫瘤引起的軟骨病、XLH等在內(nèi)的人類疾病具有治療作用。因此，研究了本發(fā)明中得到的人抗體一CIO抗體在體內(nèi)對FGF23的中和活性。尤其是，由于對它在人體上的藥理作用的期望，通過使用猴的內(nèi)源性FGF23功能的抑制、以及猴的血清磷酸鹽濃度和血清1，2 濃度的升高為指標(biāo)，測定其中和活性能，其中，猴與其它動(dòng)物種如嚙齒類動(dòng)物等相比，猴在進(jìn)化上與人更接近。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用小鼠抗體一2C3B抗體，作為ClO抗體的比較對照。使用下面的方法，在未經(jīng)處理的正常獼猴體內(nèi)ClO抗體和2C3B對血清磷酸鹽濃度的增長效果進(jìn)行比較。使用實(shí)施例4中生產(chǎn)的ClO抗體。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為2-3歲的雌性獼猴，體重2-4kg。各有3只動(dòng)物被用于所述溶劑給藥組和2C3B抗體給藥組，4只動(dòng)物被用于ClO抗體給藥組。ClO抗體和2C3B抗體分別用PBS (-)配制成濃度為3mg/ml的抗體溶液，以此作為給藥溶液。所述PBS(-)溶劑被用作陰性對照。ClO和2C3B抗體分別通過頭臂靜脈以lml/min的流速,分別按lmL/kg(相當(dāng)于3mg/kg)給藥量給藥一次。通過L型 Wak 無機(jī)憐試劑(Wako Pure Chemical Industries)和 Hitachi Clinical AnalyzerModel 7180(Hitachi，Ltd·)，檢測血清磷酸鹽濃度。通過 1，25(0H)2D RIA Kit[TFB](Immunodiagnostic System),檢測血清1,2 濃度。所述檢測在抗體給藥后O. 5、1、2、3、5、7、10、14、21、28、35、42、和49天分別進(jìn)行。數(shù)據(jù)用平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。圖6的數(shù)據(jù)顯示了每種抗體給藥后10天內(nèi)定期收集的血液樣本中血清磷濃度的變化。在測試期間，PBS (-)給藥組血清磷濃度幾乎不變，而在所述ClO抗體給藥組和2C3B抗體給藥組，與給藥前和PBS(-)給藥組相比，觀察到明顯的血清磷濃度升高。在所述ClO抗體和2C3B抗體給藥組，血清磷濃度最高值出現(xiàn)時(shí)間均為抗體給藥后第5天。在此時(shí)間點(diǎn)上，PBS(-)組、2C3B抗體組和ClO抗體組的血清磷濃度分別為5. 28mg/dl,8. IOmg/dI和9. 59mg/dl。比較抗體給藥5天后2C3B抗體組和ClO抗體組的血清磷濃度與同時(shí)期的PBS(-)組的血清磷濃度的上升值，2C3B抗體組中血清磷濃度增長為2. 82mg/dl，而在ClO抗體組血清磷濃度增長為4. 31mg,(這些結(jié)果)表明，與所述2C3B抗體組相比，ClO抗體誘導(dǎo)的血清磷濃度增長是2C3B抗體誘導(dǎo)的血清磷濃度增長的I. 5倍以上(圖7)。因此，與所述2C3B抗體給藥組相比，ClO抗體給藥組對血清磷濃度增長的作用明顯更高。此外，給藥10天后，2C3B抗體給藥組的血清磷濃度與PBS (-)組的血清磷濃度處于相同水平，而ClO抗體給藥組中的血清磷濃度(8. 76mg/dl)仍維持在比2C3B抗體給藥組血清磷濃度最高水平(8. 10mg/dl)還要高的水平(圖6)。另外，由ClO抗體引起的增加后血清磷濃度的保持時(shí)間比由2C3B抗體引起的増加后血清磷濃度保持時(shí)間更長，用2C3B抗體的所述保持時(shí)間是7天，這與PBS (-)給藥組有明顯差別，而用ClO抗體的所述保持時(shí)間是令人驚訝的35天，兩者相差約5倍。同樣地，對于抗體給藥后的1，25D濃度，與2C3B抗體給藥相比，ClO抗體給藥后的1，25D濃度明 顯上升，并且其保持時(shí)間明顯延長(圖8)。這些結(jié)果表明，與現(xiàn)有的FGF23中和抗體一2C3B抗體相比，在獼猴體內(nèi)，ClO抗體具有更強(qiáng)的促血清磷濃度和血清1，2 濃度增長活性，也即是，具有更強(qiáng)的FGF23中和活性。目前對XLH等低血磷癥性佝僂病的治療，要求每天大劑量的磷和維生素D多次給藥，以勉強(qiáng)維持磷濃度處于正常范圍內(nèi)。有報(bào)道表明給藥多次性導(dǎo)致病人應(yīng)變性差。本研究中，ClO抗體的單次給藥即可得到對血清磷濃度和血清1，25D濃度持續(xù)性增長活性的事實(shí)表明，作為低磷血癥治療性藥物，與常規(guī)的治療方法相比，Cio抗體在治療的療效上很可能具有顯著的優(yōu)勢。(實(shí)施例11)C15抗體對人和獼猴FGF23反應(yīng)活性的確定用磷酸鈣法將實(shí)施例11中制得的pEAK8/IRES/EGFP/hFGF23或?qū)嵤├?中制得的PEAK8/IRES/EGFP/猴FGF23瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)染于PEAK快速細(xì)胞(Edge Biosystem)。轉(zhuǎn)染3天后，收集每個(gè)培養(yǎng)物上清液。以實(shí)施例13中制得的C15抗體為ー抗(圖9)，對所收集的培養(yǎng)物上清液作蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果表明類似于C15與人FGF23結(jié)合，C15也與獼猴FGF23結(jié)
ム
ロ ο(實(shí)施例12)ClO抗體和C15抗體對正常獼猴血磷濃度和血中I α，25- ニ羥基維生素D濃度的作用效果比較。實(shí)施例11表明C15抗體如同ClO抗體那樣具有與人和獼猴FGF23重組蛋白結(jié)合活性。隨后，對于ClO抗體和C15抗體，通過將其給予正常獼猴，比較其在體內(nèi)對FGF23的中和活性。對獼猴內(nèi)源性FGF23的中和活性的評(píng)價(jià)，以血磷濃度的上升值為指標(biāo)來進(jìn)行，使用實(shí)施例7中制得的ClO抗體和C15抗體。所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為2-3歲和體重2-3kg的正常獼猴。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組使用2只雄性和一只雌性共3只動(dòng)物。所用稀釋介質(zhì)為PBS(_)。制備的ClO抗體濃度為lmg/ml和3mg/ml, C15抗體濃度為3mg/ml。所述抗體通過隱靜脈以Iml/min的流速,按lmL/kg的容量給藥一次，以此獲得lmg/kg和3mg/kg的ClO抗體給藥劑量和3mg/kgC15抗體給藥劑量。血清磷濃度通過L型Wako無機(jī)磷試劑(L型Wako無機(jī)磷試劑)(Wako Pure Chemical Industries)和日立自動(dòng)分析儀7180 (Hitachi Clinical AnalyzerModel 7180 (Hitachi, Ltd.))被測定。采血在抗體給藥前和給藥1，3，5，7，10，14，21和28天后進(jìn)行。測定在所有采血點(diǎn)的血清磷濃度。在ClO抗體lmg/kg給藥組,ClO抗體3mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組，給藥前它們的血清磷濃度分別為5. 37，5. 70和5. 58mg/dL，各組之間沒有顯著差異。給藥后，所有獼猴體內(nèi)均被觀察到有血清磷濃度的增長。因此，不僅ClO抗體，而且C15抗體也顯示出對獼猴內(nèi)源性FGF23的中和活性。在ClO抗體lmg/kg給藥組，ClO抗體3mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組,給藥3天后血清磷濃度分別為
9.03,9. 10和8. 64mg/dL。在此時(shí)間點(diǎn)，ClO抗體lmg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組的血清磷濃度達(dá)到最高值。另ー方面，ClO抗體3mg/kg給藥組的血清磷濃度繼續(xù)增長并在給藥5天后達(dá)到最高值,此最高值為9. 75mg/dL。在ClO抗體lmg/kg給藥組,ClO抗體3mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組，給藥前和給藥后的血清磷濃度最大差額分別為3. 67，4. 65和3. 06mg/dL。由此結(jié)果可知,在同樣3mg/kg劑量下,與C15抗體( 對血清磷濃度的增長作用)相比，ClO抗體不僅顯示出對血清磷濃度更高的增長作用。而且讓人驚訝的是，ClO抗體lmg/kg劑量給藥對血清磷濃度的增長作用比C15抗體3mg/kg劑量給藥(對血清磷濃度的增長作用)還要高。接下來，對相比于給藥前水平的血清磷濃度增長的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行了比較。其結(jié)果是所述ClO抗體lmg/kg給藥組,ClO抗體3mg/kg給藥組和C15抗體3mg/kg給藥組的血清磷濃度增長的持續(xù)時(shí)間分別是14,28和7天。由此結(jié)果可知,在同樣3mg/kg劑量下,與C15抗體(對血清磷濃度增長的持續(xù)時(shí)間)相比，ClO抗體不僅顯示出對血清磷濃度增長活性的更高持續(xù)性。而且讓人驚訝的是，ClO抗體lmg/kg劑量，比C15抗體3mg/kg劑量，可將血清磷濃度更長期地保持在高水平。以上這些事實(shí)說明，在獼猴體內(nèi)，ClO抗體與同時(shí)獲得的C15抗體(對血清磷濃度的作用)相比，ClO抗體具有更強(qiáng)的對血清磷濃度的增長活性和對血清磷濃度增長活性的持續(xù)性。也即是，與C15抗體相比，ClO抗體具有明顯強(qiáng)的對獼猴FGF23的中和活性。(實(shí)施例13)人FGF23DNA片段(不含信號(hào)肽序列)的制備。按照操作說明書，用KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)制備反應(yīng)溶液。將FGF23 (-SP)FW 引物(SEQ ID NO :34)和 FGF23(-SP)RV 引物(SEQ ID NO :35)各 50pmol，作為模板的人FGF23-CDNA (從起始密碼子到終止密碼子共長756bp，SEQ ID NO :36)，添加到50 μ I反應(yīng)溶液中，94°C孵育3min后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)由98°C /15秒、63°C /15秒和680C /2min30秒組成。再在72°C孵育3min。所得684bp擴(kuò)增片段用O. 8%凝膠分離收集。按照操作說明書，使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen),從經(jīng)回收的凝膠中回收所述擴(kuò)增片段。用FseI (New England Biolabs Japan)對所回收的擴(kuò)增片段進(jìn)行酶消化,按照操作說明書，用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)回收經(jīng)酶處理的片段。由此得到與不含人FGF23的信號(hào)序列的人FGF23成熟形式相對應(yīng)的部分DNA片段。FGF23(-SP) Fff TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTCGGCTCCAGCTG(SEQ ID NO :34)FGF23 (-SP) RV :TTGGCCGGCCCTAGATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCAGCCTTCCG (SEQ ID NO :35，包括FseI 位點(diǎn))
所述人FGF23核苷酸序列(下劃線標(biāo)記為信號(hào)序列部分的，矩形框標(biāo)記的是來自于所述(FGF23)全長序列的不含所述信號(hào)序列的人FGF23成熟形式區(qū)域的核苷酸)(SEQ IDNO 36)。
權(quán)利要求
1.一種分離的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其含有SEQ ID NO :40所示的CDR1、SEQ ID N0:41 所示的 CDR2 和 SEQ ID NO :42 所示的 CDR3 作為重鏈 CDR，以及 SEQ IDNO 43所示的CDR1、SEQ ID NO 44所示的CDR2和SEQ ID NO 45所示的CDR3作為輕鏈CDR。
2.如權(quán)利要求I所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段，其中所述功能性片段是選自Fab、Fab'、F(ab' )2、二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dSFv)、二聚化的V區(qū)域(雙體)、單鏈Fv(scFv)和CDR的肽段。
3.如權(quán)利要求I所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體的種類是IgG、IgA、IgE或IgM。
4.如權(quán)利要求3所述抗人FGF23抗體，其中，所述抗體的亞類是IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4。
5.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段作為活性成分。
6.如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段在制備通過FGF23控制磷代謝和/或維生素D代謝的藥物中的用途。
7.如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段在制備預(yù)防或治療礦物質(zhì)代謝紊亂相關(guān)性疾病的藥物中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述礦物質(zhì)代謝紊亂相關(guān)性疾病選自腫瘤性軟骨病、ADHR、XLH、骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、麥-奧二氏綜合征和常染色體隱性低血磷癥。
9.如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段在制備預(yù)防或治療疾病的藥物中的用途，所述疾病選自骨質(zhì)疏松癥、佝僂病、高鈣血癥、低鈣血癥、異位鈣化癥、骨硬化、派杰病、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)癥、甲狀旁腺機(jī)能減退癥和搔癢癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗FGF23抗體和通過使用此抗體對FGF23活性的抑制起到預(yù)防或治療作用的一種作為預(yù)防或治療藥物的藥物組合物。一種由雜交瘤細(xì)胞C10(索取號(hào)FERM BP-10772)產(chǎn)生的抗人FGF23抗體或此抗體的功能性片段。
文檔編號(hào)A61P3/14GK102702355SQ201210161119
公開日2012年10月3日 申請日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者吉田均, 山下武美, 山崎雄司, 島田孝志, 浦川到, 長谷川尚, 青野友紀(jì)子 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社