抗體-藥物綴合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示一種抗5T4抗體-藥物綴合物及制備和使用方法。
【專利說明】抗體-藥物綴合物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明整體上涉及用于治療癌的抗5T4抗體-藥物綴合物。
【背景技術】
[0002]抗體-藥物綴合物(ADC)兼具單克隆抗體的結合特異性及化學治療劑的效力。與發(fā)展抗腫瘤相關性標靶分子的單克隆抗體有關的技術、更有效的細胞毒性劑的用途及共價結合這些成份的化學接頭的設計，在近年來已快速進展(Ducry L., et al.BioconjugateChemistry, 21:5-13, 2010)。
[0003]極具潛力的ADC 諸如 SGN-75 (US2009/148942)和曲妥珠單抗(trastuzumab) -DMl (US2009/0226465)目前正進行臨床試驗。然而，因考慮以其它腫瘤相關性抗原作為標靶，仍存在許多挑戰(zhàn)。各種單克隆抗體必須被分別特征化并設計適當?shù)慕宇^，并且識別在遞送至腫瘤細胞時仍保留其效力的適當細胞毒性劑。必須考慮癌標靶上的抗原密度，及正常組織是否表達該標靶抗原。其它考慮包括當與標靶結合時該整個ADC是否被內化、考慮可能的正常組織暴露及/或欲治療的癌類型及分期時以選用細胞靜止劑或細胞毒性劑為較佳、及連接該抗體與該載荷藥物的接頭是可被切割或不可切割的連接。另外，該抗體對藥物基團的綴合比必須足夠，且不損害該抗體的結合活性及/或該藥物的效力。很明顯地，ADC是復雜的生物制劑，且發(fā)展有效ADC的挑戰(zhàn)仍然很高。
[0004]人5T4腫瘤相關性抗原是本發(fā)明的標靶抗原。最近已有數(shù)據顯示，該5T4抗原以高量表達于某些高成瘤性細胞上，這些高成瘤性細胞亦稱為引發(fā)腫瘤細胞(W02010/111659)。引發(fā)腫瘤細胞顯示對標準療法的抗藥性，其被認為是造成腫瘤復發(fā)及轉移的原因，因此代表另一種ADC發(fā)展的障礙。
[0005]本發(fā)明的新穎的抗5T4A DC克服該些與ADC技術相關的挑戰(zhàn)，提供能與表達5T4抗原的腫瘤細胞結合且遞送足夠細胞毒性藥物至該等細胞的高特異性及強效的ADC，因此提供創(chuàng)新且有效的癌治療。

【發(fā)明內容】

[0006]在一實施方式中，本發(fā)明的抗體-藥物綴合物具有下式:Ab-(LU-D)p或其藥學上可接受的鹽，其中Ab是抗5T4抗體或其抗原結合部分，該抗5T4抗體或其抗原結合部分包含具有如SEQ ID NO:5所示的VH CDRl區(qū)、如SEQ ID NO:6所示的VH CDR2區(qū)及如SEQ ID NO:7所示的VH⑶R3區(qū)的重鏈可變區(qū)，LU是選自順丁烯二酰亞氨基己?；?maleimidocaproyl)和順丁烯二酰亞氨基己酰基-纟顏氨酸(Val)-瓜氨酸(Cit)-PABA的接頭單元，P是約I至約8的整數(shù)，且D是選自MMAE、MMAF和MMAD的藥物單元。
[0007]本發(fā)明另提供抗5T4抗體-藥物綴合物，其中該抗5T4抗體或其抗原結合部分包含具有(a)如SEQ ID NO:5所示的VH CDRl區(qū)、(b)如SEQ ID NO:6所示的VH CDR2區(qū)、及
(c)如SEQ ID NO:7所示的VH CDR3區(qū)的重鏈可變區(qū)。
[0008]本發(fā)明另提供抗5T4抗體-藥物綴合物，其中該抗5T4抗體或其抗原結合部分包含具有(a)如SEQ ID NO:8所示的VL CDRl區(qū)、(b)如SEQ ID NO:9所示的VL CDR2區(qū)、及
(c)如SEQ ID NO:10所示的VL CDR3區(qū)的輕鏈可變區(qū)。
[0009]本發(fā)明另提供抗5T4抗體-藥物綴合物，其中該抗5T4抗體或其抗原結合部分另包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)具有(a)如SEQ ID NO:5所示的VH⑶Rl區(qū)、
(b)如SEQID NO:6所示的VH CDR2區(qū)、及(c)如SEQ ID NO:7所示的VH CDR3區(qū)，且該輕鏈可變區(qū)具有(a)如SEQ ID NO:8所示的VL CDRl區(qū)、(b)如SEQ ID NO:9所示的VL CDR2區(qū)、及(c)如SEQ ID NO:10所示的VL CDR3區(qū)。
[0010]本發(fā)明另提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中該抗5T4抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO:3的VH區(qū)及SEQ ID NO:4的VL區(qū)。
[0011]本發(fā)明另提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中該抗5T4抗體是由具有SEQ IDNO:1的重鏈及具有SEQ ID NO:2的輕鏈組成。
[0012]本發(fā)明另提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中:(a)該抗5T4抗體是由具有SEQID NO:1的重鏈及具有SEQ ID NO:2的輕鏈組成、(b)該LU是順丁烯二酰亞氨基己?；?、
(c)該藥物是MMAF、及(d)p是大約4的整數(shù)。
[0013]本發(fā)明另提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中:(a)該抗5T4抗體是由具有SEQ ID NO:1的重鏈及具有SEQ ID NO:2的輕鏈組成、(b)該LU是順丁烯二酰亞氨基己?；?Val-Cit-PABA、(c)該藥物是MMAE、及(d)p是大約4的整數(shù)。
[0014]本發(fā)明另提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中:(a)該抗5T4抗體是由具有SEQ ID NO:1的重鏈及具有SEQ ID NO:2的輕鏈組成、(b)該LU是順丁烯二酰亞氨基己?；?Val-Cit-PABA、(c)該藥物是`MMAD、及(d)p是約I至約8的整數(shù)。
[0015]本發(fā)明另提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中:(a)該抗5T4抗體是由具有SEQ ID NO: 15的重鏈及具有SEQ ID NO: 2的輕鏈組成、(b)該LU是順丁烯二酰亞氨基己?；?Val-Cit-PABA、(c)該藥物是MMAE、及(d)p是約I至約8的整數(shù)。
[0016]本發(fā)明提供一種抗5T4抗體-藥物綴合物，其中該抗體識別人5T4抗原上的表位，其中該表位包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的氨基酸殘基173至258及282至361。
[0017]本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含上述的抗體-藥物綴合物及藥學上可接受的載體。
[0018]本發(fā)明另提供一種治療有需要治療的患者的5T4陽性癌的方法，該方法包含對該患者施用上述的抗體-藥物綴合物。
[0019]本發(fā)明另提供一種治療5T4陽性癌的方法，其中該癌選自膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、皮膚癌、胃癌和
睪丸癌。
[0020]更佳地，本發(fā)明提供一種治療5T4陽性癌的方法，其中該癌選自結直腸癌、乳腺癌、胰癌和非小細胞肺癌。
[0021]本發(fā)明另提供一種用于治療的上述的抗體-藥物綴合物。
[0022]本發(fā)明另提供一種上述的抗體-藥物綴合物于制造藥物的用途。
[0023]本發(fā)明另提供上述的用途，其中該用途是治療5T4陽性癌，且其中該癌選自膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、皮膚癌、胃癌和睪丸癌。[0024]更佳地，本發(fā)明另提供上述的用途，其中該用途是治療5T4陽性癌，且其中該癌選自結直腸癌、乳腺癌、胰癌和非小細胞肺癌。
[0025]本發(fā)明另提供編碼抗5T4抗體的核酸、包含該核酸的載體及包含該載體的宿主細胞。
[0026]本發(fā)明另提供一種制備抗5T4抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)包含該上述的載體的宿主細胞及自該細胞培養(yǎng)物回收該抗體。
[0027]本發(fā)明另提供一種制備抗5T4抗體-藥物綴合物的方法，該方法包含:(a)取得自該細胞培養(yǎng)物回收的抗體，(b)使該抗體經由選自順丁烯二酰亞氨基己?；蝽樁∠┒啺被乎；?Val-Cit的接頭單元與選自MMAE、MMAD和MMAF的藥物單元化學連接，及(c)純化該抗體-藥物綴合物。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明提供用于治療癌的抗5T4抗體-藥物綴合物。為了更清楚地了解本發(fā)明，首先定義一些術語。[0029]本揭示內容中使用的所有氨基酸縮寫是那些于37C.F.R.§ 1.822(B) (I)闡述的美國專利商標局接受的縮寫。
[0030]“5T4”是指5T4腫瘤胎兒抗原，其為72kDa的高度糖基化的跨膜糖蛋白，該跨膜糖蛋白包含42kDa的非糖基化核心(見US5，869，053)。人5T4是表達于多種癌類型，包括膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、腎癌、肺癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、皮膚癌、胃癌及睪丸癌。聞成瘤性細胞(又稱為癌干細胞或引發(fā)腫瘤細胞)已經顯不具有高量的5T4表達(W02010/111659)。本發(fā)明的抗5T4抗體包括與該人5T4抗原特異性結合的抗體(見US2007/0231333)。
[0031]“抗體”是免疫球蛋白分子，其可透過位于該免疫球蛋白分子的可變區(qū)的至少一個抗原辨認區(qū)特異性地與目標結合，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此處所使用的“抗體”不僅包含完整的多克隆或單克隆抗體，亦包含其任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈、包含抗體的融合蛋白及包含抗原辨認區(qū)的免疫球蛋白分子的任何其它經修飾的構象，包括例如但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、由VH和CHl結構域組成的Fd片段、由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段、經分離的互補決定區(qū)(OTR)、scFv、單結構域抗體(例如S魚抗體(shark antibodies)及胳騎抗體(camelid antibodies))、大型抗體(maxibodies)、迷你抗體(minibodies)、細胞內抗體(intrabodies)、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及bis-scFv。
[0032]抗體包括任何類型的抗體,諸如IgG、IgA或IgM (或其亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。根據其重鏈的恒定區(qū)的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同類型。有五種主要的免疫球蛋白類型:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些類型可進一步分成亞型(同型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類型的免疫球蛋白的次單位結構及三維構象是廣為周知。
[0033]抗體的“可變區(qū)”是指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)(不論單獨或組合)。如該領域所知，重鏈及輕鏈的可變區(qū)各由四個架構區(qū)(FR)及連接該四個架構區(qū)的三個互補決定區(qū)(CDR)(亦稱為超變異區(qū))組成，以形成該抗體的抗原結合部分。若希望主體可變區(qū)的變異體，特別是具有CDR區(qū)以外(即架構區(qū))的氨基酸殘基取代，適當?shù)陌被崛〈?較佳地保守性氨基酸取代)可通過比較該主體可變區(qū)與其它包含和該主體可變區(qū)相同的典范類型(canonical class)的⑶Rl及⑶R2序列的抗體的可變區(qū)加以識別(Chothiaand Lesk, J Mol Biol 196 (4):901-917, 1987)。當選擇 FR 以于旁側連接主體 CDR 時，例如當人源化或最佳化抗體時，源自包含該相同典范類型的CDRl及CDR2序列的抗體的FR是較佳。
[0034]可變結構域的“CDR”是位于可變區(qū)內的氨基酸殘基，其是根據卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、卡巴及柯西亞二者的累積定義、AbM定義、接觸定義、及/或構形定義、或該領域廣為周知的任何CDR測定方法加以識別。抗體CDR可能被識別為原本由卡巴等人所定義的超變異區(qū)。見例如Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th ed.，Public Health Service, NIH, Washington, D.C.。該等CDR的位置亦可能被識別為最初由柯西亞等人所描述的結構環(huán)狀結構。參見例如Chothiaet al.，1989，Nature342:877-883。其它其它識別CDR的方法包括“AbM定義”(其是卡巴法及柯西亞法的綜合，源自利用牛津分子(Oxford Molecular)的AbM抗體模式軟件(現(xiàn)為AaxiIrys^ ))，或如MacCalIum et al., 1996，J.Mol.Biol.，262:732-745所述以觀察到的
抗原接觸為基礎的CDR的“接觸定義”。在此處稱為CDR的“構形定義”的另一方法中，CDR的位置可能被鑒別為對抗原結合造成洽貢獻的殘基。參見例如Makabe et al., 2008, Journalof Biological Chemistry, 283:1156-1166。其它CDR邊界定義可能不嚴格遵守上述方法中的一者，但將與至少部分的卡巴CDR重疊，雖然它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用的CDR可能指由該領域已知的任何方法(包括多種方法的組合)所定義的CDR。此處所使用的方法可利用根據這些方法中任一者所定義的CDR。以包含超過一種CDR的任何給定實施方式而言，該CDR可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
[0035]術語“單克隆抗體”(Mab`)是指源自單一細胞或細胞株的抗體，包括例如任何真核、原核或噬菌體克隆，并不是指其制備方法。較佳地，本發(fā)明的單克隆抗體存在于均質或實質上均質的族群。
[0036]
人源化抗體是指離入如說)抗體的形式，其為包含源自.#人免疫球蛋『I的敁少序列的嵌合性免疫球蛋η、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’ )2)或抗體的其它抗原結合子序列)。較佳地，人源化抗體是其中源自接受者的互補決定區(qū)(CDR)的殘基被源自諸如具有該所希望的特異性、親和性及能力的小鼠、大鼠或兔等非人物種(捐贈者抗體)的CDR的殘基所取代的人免疫球蛋白(接受者抗體)。
[0037]術語“嵌合抗體”是用來指其中該可變區(qū)序列是源自一物種且該恒定區(qū)序列是源自另一物種的抗體，諸如其中該可變區(qū)序列是源自小鼠抗體且該恒定區(qū)序列是源自人抗體的抗體。
[0038]本發(fā)明的抗體可利用該領域廣為周知的技術制備，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術的組合、或該領域已知的其它技術(見例如Jayasena, S.D.，Clin.Chem.，45:1628-50 (1999)及Fellouse, F.A.，et al, J.Mol.Biol.，373 (4): 924-40 (2007))。
[0039]下表1及2說明用于本發(fā)明的抗體的較佳⑶R。
[0040]表1
[0041]
【權利要求】
1.一種下式的抗體-藥物綴合物:
Ab-(LU-D) P 或其藥學上可接受的鹽，其中 (a)Ab是抗5T4抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分包含具有下列的重鏈可變區(qū): ⑴如SEQ ID NO:5所示的VH CDRl區(qū)， (ii)如SEQ ID NO:6 所示的 VH CDR2 區(qū)，及
(iii)如SEQ ID NO:7 所示的 VH CDR3 區(qū)， (b)LU是選自順丁烯二酰亞氨基己酰基和順丁烯二酰亞氨基己?；?Val-Cit的接頭單元， (C)P是約I至約8的整數(shù)，且 (d) D是選自MMAE、MMAD和MMAF的藥物單元。
2.如權利要求1的抗體-藥物綴合物，其中所述抗5T4抗體或其抗原結合部分包含具有下列的輕鏈可變區(qū):
(a)如SEQ ID NO:8 所示的 VL CDRl 區(qū)， (b)如SEQ ID NO:9 所示的 VL CDR2 區(qū)，及
(c)如SEQ ID NO:10 所示的 VL CDR3 區(qū)。
3.如權利要求1或2的抗體-藥物綴合物，其中所述抗5T4抗體或其抗原結合部分還包含: 1)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有:
(a)如SEQ ID NO:5 所示的 VH CDRl 區(qū)， (b)如SEQ ID NO:6 所示的 VH CDR2 區(qū)，及
(c)如SEQ ID NO:7 所示的 VH CDR3 區(qū)， 2)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有:
(a)如SEQ ID NO:8 所示的 VL CDRl 區(qū)， (b)如SEQ ID NO:9 所示的 VL CDR2 區(qū)，及
(c)如SEQ ID NO:10 所示的 VL CDR3 區(qū)。
4.如權利要求1至3中任一項的抗體-藥物綴合物，其中所述抗5T4抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO:3的VH區(qū)及SEQ ID NO:4的VL區(qū)。
5.如權利要求1至4中任一項的抗體-藥物綴合物，其中所述抗5T4抗體或其抗原結合部分由具有SEQ ID NO:1的重鏈及具有SEQ ID NO:2的輕鏈組成。
6.如權利要求1至5中任一項的抗體-藥物綴合物，其中所述抗體或其抗原結合部分識別人5T4抗原上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的氨基酸殘基173 至 258 及 282 至 361。
7.如權利要求1至6中任一項的抗體-藥物綴合物，其中所述LU是順丁烯二酰亞氨基己?；?。
8.如權利要求1至7中任一項的抗體-藥物綴合物,其中所述藥物是MMAF。
9.如權利要求1至8中任一項的抗體-藥物綴合物,其中P是約I至約4的整數(shù)。
10.如權利要求1的抗體-藥物綴合物，其中:(a)所述抗5T4抗體由具有SEQID NO:1的重鏈及具有SEQ ID NO:2的輕鏈組成， (b)所述LU是順丁烯二酰亞氨基己?；?， (c)所述藥物是MMAF，且
(d)P 是 4。
11.一種藥物組合物,其包含如權利要求1至10中任一項的抗體-藥物綴合物及藥學上可接受的載體。
12.—種治療需要該治療的患者中5T4陽性癌的方法，包括對所述患者施用權利要求1至11中任一項的抗體-藥物綴合物。
13.如權利要求12的方法，其中所述癌選自結直腸癌、乳腺癌、胰癌和非小細胞肺癌。
14.一種如權利要求1至11中任一項的抗體-藥物綴合物，用于治療。
15.一種如權利要求1至11中任一項的抗體-藥物綴合物在制備藥物中的用途。
16.如權利要求14或15的用途，其中所述用途是用于治療5T4陽性癌。
17.—種核酸,其編碼如權利要求1至6中任一項的抗5T4抗體。
18.—種載體，其包含如權利要求17的核酸。
19.一種宿主細胞,其包含如權 利要求18的載體。
20.—種用于制備抗體的方法,其包括培養(yǎng)如權利要求19的宿主細胞及從培養(yǎng)物回收抗體。
21.一種用于制備抗5T4抗體-藥物綴合物的方法，所述方法包括: (a)化學連接選自順丁烯二酰亞氨基己酰基或順丁烯二酰亞氨基己?；?Val-Cit的接頭單元與選自MMAE、MMAD或MMAF的藥物單元， (b)將所述接頭-藥物與從權利要求20的細胞培養(yǎng)物回收的抗體綴合，及 (c)純化所述抗體-藥物綴合物。
【文檔編號】A61P35/00GK103517719SQ201280015379
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年3月19日 優(yōu)先權日:2011年4月1日
【發(fā)明者】H-P·格貝爾, J·F·迪約瑟夫, K·M·漢多克, K·A·馬凱特, P·薩普拉, L·G·奇思蒂亞科娃 申請人:惠氏有限責任公司