專利名稱：藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物克隆技術一手導式克隆技術(Handmade cloning)的細胞融合 技術環(huán)節(jié)，尤其涉及藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法。
背景技術：
動物克隆的研究對生物醫(yī)藥、治療性克隆的探索、模式生物的建立以及畜牧業(yè)生 產(chǎn)等具有重要的意義，可實現(xiàn)動物克隆的技術手段包括傳統(tǒng)的依賴于顯微操作系統(tǒng)的核移 植技術和2004年最新發(fā)明的手導式克隆技術。相對于顯微操作系統(tǒng)，手導式克隆技術的優(yōu) 點在于其僅用一個刀片就能完成卵母細胞的去核，且去核效率高，整個克隆程序耗時少，成 為一種可能代替顯微操作技術的新方法。該方法主要技術環(huán)節(jié)包括供體細胞培養(yǎng)、卵母細 胞體外成熟、卵母細胞去核、細胞融合、種間克隆胚的激活與體外培養(yǎng)。其中細胞融合技術 為手導式克隆技術的難點，通常手導式克隆技術中細胞融合時的技術要求特別高，耗時長， 電場對融合細胞的作用時間長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種提高融合效率的藏羚羊成纖維細胞與受 體卵母細胞的化學輔助融合方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔 助融合方法，包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng) 在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃?；蚰膛Ｂ涯讣毎械娜我庖环N；(2)制作體積為25 μ L的融合微滴； (3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至Τ20、植物血凝 素、Τ2Β、融合液微滴內(nèi)進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復合體；將復合體 移至融合液內(nèi)平衡2 3min后，再至融合槽內(nèi)進行電融合即可。所述步驟(3)中的T20是由占總溶液體積的20%的胎牛血清(FBS)和80%的含 IOmM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié) PH值至7. 2 7. 4的溶液；其中雙抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素。所述步驟(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基礎培養(yǎng)液 中所得的溶液。所述步驟(3)中的T2B是指在TCM199基礎培養(yǎng)液中加入總溶液體積的2%的胎牛 血清(FBS)和8mg/mL牛血清白蛋白(BSA)所得的溶液。所述步驟(3)中的融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0. 025g MgSO4,過濾保存； 再用20mL蒸餾水溶解0.0147g CaCl2 · 2H20，過濾保存；將10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙 烯醇(PVA)充分溶解于196mL蒸餾水中，然后向其分別加入2mL預先配制好的MgSO4和 CaCl2 · 2H20溶液，過濾后即得。
所述步驟(3)中的電融合的條件是交流電場7V，脈沖電場70V，持續(xù)時間20μ s，持 續(xù)兩次，每次間隔0. Is。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點1、由于本發(fā)明以化學試劑——植物血凝素為輔助試劑，因此，改進了以往手導式 克隆技術中低效率的細胞融合方式，使得藏羚羊成纖維細胞與山羊、牦牛、黃牛和奶牛卵 母細胞在植物血凝素的輔助下高效融合，其融合率分別達到98. 25%,99. 00%,97. 71%和 93. 17%，從而提高了克隆動物的整體效率。2、由于本發(fā)明采用融合前先用植物血凝素處理使兩個卵母細胞和一個體細胞粘 附形成三元復合體，然后再進行融合，因此，有效地降低了操作難度，縮減了操作時間。3、由于本發(fā)明采用上覆石蠟油的微滴進行操作，因此，防止了蒸發(fā)和潛在的污染， 提高了體外操作溶液的穩(wěn)定性。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細的說明。圖1為本發(fā)明中用兩個去核卵母細胞和一個藏羚羊成纖維細胞在植物血凝素的 輔助下在電場的作用下正在進行融合。圖2為采用本發(fā)明方法融合的兩個去核卵母細胞與一個藏羚羊成纖維細胞，經(jīng)過 細胞核熒光染色證實已經(jīng)完全融合。
具體實施例方式一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng)在24孔板中；核移植時選擇培養(yǎng)孔 內(nèi)底部全部長滿的細胞作為供體細胞。每次消化1孔細胞，然后將少量細胞移入到T2B的 微滴中。受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃牛或奶牛卵母細胞中的任意一種。(2)在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)按常規(guī)方法制作體積為25 μ L的融合微滴。(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至Τ20、植物血凝 素、Τ2Β、融合液微滴內(nèi)進行操作，微滴上覆石蠟油，避免微滴蒸發(fā)和位置移動。先將受體卵母細胞移至Τ20微滴內(nèi)，再移一個受體卵母細胞至植物血凝素微滴 內(nèi)，然后轉移到Τ2Β微滴中粘取一個供體細胞，再重新轉移至植物血凝素微滴中，再從Τ20 微滴中移一個受體卵母細胞至植物血凝素微滴中，由于植物血凝素可使細胞表面具有粘 性，所以通過調(diào)整供體細胞與受體卵母細胞復合體和另一卵母細胞的位置，可形成兩個卵 母細胞夾雜一個供體細胞的復合體；將復合體移至融合液內(nèi)平衡2 3min后，再至融合槽 內(nèi)以交流電場7V，脈沖電場70V，持續(xù)時間20 μ s，持續(xù)兩次，每次間隔0. Is進行電融合即可 (參見圖1、圖2)。其中Τ20是由占總溶液體積的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羥乙基哌嗪乙 磺酸的TCM199基礎培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)ρΗ值至7. 2 7. 4 的溶液；其中雙抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素。
植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基礎培養(yǎng)液中所得的溶液。該 植物血凝素以50 μ L分裝于離心管中，并在-20°c保存、待用。T2B是指在TCM199基礎培養(yǎng)液中加入總溶液體積的2 %的胎牛血清(FBS)和8mg/ mL牛血清蛋白(BSA)所得的溶液。融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0. 025g MgSO4,過濾保存；再用20mL蒸餾水溶 解0. 0147g CaCl2 · 2H20,過濾保存；將10. 93g甘露醇和0. 2g PVA充分溶解于196mL蒸餾 水中，然后向其分別加入2mL預先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液，過濾后即得。該融 合液以IOmL分裝于離心管中，并在-20°C保存、待用。
權利要求
一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng)在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃?；蚰膛Ｂ涯讣毎械娜我庖环N；(2)制作體積為25μL的融合微滴；(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴內(nèi)進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復合體；將復合體移至融合液內(nèi)平衡2～3min后，再至融合槽內(nèi)進行電融合即可。
2.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的T20是由占總溶液體積的20%的胎牛血清和80%的含IOmM羥 乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值 至7. 2 7. 4的溶液；其中雙抗是指75 μ g/mL的青霉素和100 μ g/mL的鏈霉素。
3.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL TCM199基礎培養(yǎng)液中 所得的溶液。
4.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的T2B是指在TCM199基礎培養(yǎng)液中加入總溶液體積的2%的胎牛 血清和8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液。
5.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0.025g MgSO4，過濾保存；再用 20mL蒸餾水溶解0. 0147g CaCl2 · 2H20,過濾保存；將10. 93g甘露醇和0. 2g聚乙烯醇充分 溶解于196mL蒸餾水中，然后向其分別加入2mL預先配制好的MgSO4和CaCl2 · 2H20溶液， 過濾后即得。
6.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特 征在于所述步驟(3)中的電融合的條件是交流電場7V，脈沖電場70V，持續(xù)時間20ys，持 續(xù)兩次，每次間隔0. Is。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，該方法包括以下步驟(1)供體細胞和受體細胞的選擇供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養(yǎng)在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃牛或奶牛卵母細胞中的任意一種；(2)制作體積為25μL的融合微滴；(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合依次將受體卵母細胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴內(nèi)進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復合體；將復合體移至融合液內(nèi)平衡，再至融合槽內(nèi)進行電融合即可。本發(fā)明有效地提高了細胞融合效率、降低了操作難度、縮減了操作時間，從而優(yōu)化了手導式克隆技術細胞融合的技術環(huán)節(jié)。
文檔編號C12N15/06GK101906412SQ20101020182
公開日2010年12月8日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權日2010年6月12日
發(fā)明者于鴻浩, 徐世曉, 曹俊虎, 趙新全, 郭志林, 郭松長 申請人:中國科學院西北高原生物研究所