專利名稱：編碼乙酰乳酸合成酶的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼乙酰乳酸合成酶的基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料(alcoholicbeverages)及所述酒精飲料的制造方法等。更具體地說，本發(fā)明涉及通過抑制編碼釀造酵母的乙酰乳酸合成酶的基因ILV2，特別是啤酒酵母中特征性的nonScILV2基因的表達(dá)量，從而使造成產(chǎn)品不良味道的連二酮類，特別是雙乙酰的生產(chǎn)量降低的酵母及使用該酵母制造酒精飲料的方法。
背景技術(shù)：
酒精飲料的呈味成份中，雙乙酰(以下為DA)味是啤酒、清酒及葡萄酒等釀造的酒精飲料中具有代表性的不良味道之一。DA味(在啤酒中表現(xiàn)為餿飯味或黃油味，清酒中表現(xiàn)為使人想吐的味)是以DA為主的連二酮類(以下為VDK)在產(chǎn)品中以閾值以上濃度存在時所產(chǎn)生的，啤酒中的閾值為0.1ppm[Joumal of the Institute of Brewing，76，486(1970)]。
酒精飲料中的VDK大致分為DA和2，3-戊二酮(以下為PD)。DA和PD分別以纈氨酸及異亮氨酸生物合成體系的中間產(chǎn)物α-乙酰乳酸及α-乙酰羥基丁酸為前體物質(zhì)，通過酵母不參與的非酶促反應(yīng)而生成。
由以上可知，VDK(DA及PD)及其前體物質(zhì)α-乙酰羥基酸類(α-乙酰乳酸及α-乙酰羥基丁酸)均可作為可帶給產(chǎn)品DA味的物質(zhì)，培養(yǎng)出能降低這些物質(zhì)的酵母，不僅可使酒精飲料的生產(chǎn)質(zhì)量控制容易進(jìn)行，還可擴(kuò)展新商品的開發(fā)。
DA味的控制方法，例如日本特開2001-204457公報中報道了清酒的制造方法，其通過米-麥芽-酵母的培養(yǎng)物來抑制DA生成，該培養(yǎng)基含有低濃度的作為α-乙酰羥基酸類前體物質(zhì)的丙酮酸。乙酰乳酸合成酶是把丙酮酸或α-氧代丁酸分別轉(zhuǎn)換為α-乙酰乳酸或α-乙酰羥基丁酸的酶，編碼酵母的乙酰乳酸合成酶的基因有ILV2及ILV6。已知，ILV2編碼活性亞基，而ILV6編碼調(diào)控亞基。Journal of Basic Microbiology，28(3)，175-183(1988)中報道了如下結(jié)果，即通過對ILV2實行誘變、基因破壞，抑制了上述酶活性，從而降低前體物質(zhì)(α-乙酰羥酸類)的合成，結(jié)果降低了DA的濃度。關(guān)于作為調(diào)控亞基的Ilv6p，例如在Biochemistry，38(16)，5222-31(1999)中對乙酰乳酸合成酶的活性進(jìn)行了酶學(xué)上的分析，但尚不明確其對DA生成是否產(chǎn)生影響。
雖有如下報道，即在啤酒生產(chǎn)中，使用纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型酵母可降低VDK生成量，但由于營養(yǎng)缺陷型菌株易產(chǎn)生生長遲緩、發(fā)酵延遲，所以未能達(dá)到實用化。日本特開2002-291465號公報中公開的方法是，獲得對這些支鏈氨基酸的類似物具有敏感性的突變株，從中選拔DA累積較少的株。在Journal of American Society of Brewing Chemists，Proceeding，81-84(1987)中報道了調(diào)節(jié)來自實驗室設(shè)計的基因工程酵母的ILV5基因的表達(dá)量。在European Brewery Convention，Proceedings of the 21st EBC congress，Madrid，553-560(1987)中同樣報道了調(diào)節(jié)基因工程酵母的ILV3基因的表達(dá)量。此時ILV5基因編碼的乙酰羥基酸還原異構(gòu)酶的酶活性增加了5-7倍，VDK生成量減少到40％左右。
而ILV3基因編碼的二羥酸脫水酶的酶活性雖增加了5-6倍，但VDK生成量無顯著的減少。上述2個報道均使用了合成培養(yǎng)基，而對于實際啤酒釀造的影響未與分析。另外，Villa等在Journal of American Society of BrewingChemists，5349-53(1995)中報道，通過ILV5基因、ILV3基因或者ILV5和ILV3的基因產(chǎn)物的質(zhì)粒擴(kuò)增，使VDK生成量與實際的啤酒釀造中的正常釀造酵母的相比，分別減少了70％、40％、60％。
Dulieu等在European Brewery Convention，Proceedings of the 26th EBCcongress，Maastricht，455-460(1997)中，雖提出了通過使用α-乙酰乳酸脫羧酶使DA的前體物質(zhì)α-乙酰乳酸迅速轉(zhuǎn)換成3-羥基-2-丁酮的方法，但由于α-乙酰乳酸脫羧酶僅能通過DNA重組技術(shù)制得，因此日本的稅制上規(guī)定在發(fā)酵過程中的發(fā)酵液內(nèi)不能添加該酶。日本特開平2-265488號公報及日本特開平7-171號公報均報道了使用編碼α-乙酰乳酸脫羧酶的DNA鏈的基因工程酵母。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述情況，有必要開發(fā)一種方法來生產(chǎn)香味優(yōu)異的酒精飲料，所述方法利用編碼能減少VDK(連二酮)味，特別是DA味的蛋白質(zhì)的基因以及該蛋白質(zhì)來培育VDK生成量少的酵母菌來實現(xiàn)的。
本發(fā)明的發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了不斷的研究，并從啤酒酵母中成功地鑒定、分離出了編碼乙酰乳酸合成酶的基因。
本發(fā)明涉及啤酒酵母中特征性存在的新型乙酰乳酸合成酶基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因表達(dá)受到調(diào)控的轉(zhuǎn)化酵母、通過使用該基因表達(dá)受到調(diào)控的酵母控制產(chǎn)品中VDK濃度，特別是DA濃度的方法等。具體地說，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體或DNA片段、導(dǎo)入了該載體或DNA片段的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母制造酒精飲料的方法等。
(1)多核苷酸，其選自由以下(a)～(f)組成的群組(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％或60％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)中所述的多核苷酸，其選自由以下(g)～(i)組成的群組(g)編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或編碼序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10個氨基酸的氨基酸序列組成的且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(h)編碼與序列號2的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(i)與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸或與序列號1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
(6)多核苷酸，其選自由以下(j)～(m)組成的群組(j)編碼具有與上述(5)中所述多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作用而抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸；(1)編碼具有特異性切割上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性的RNA的多核苷酸；以及(m)編碼通過共抑制作用而抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸。
(7)蛋白質(zhì)，其由上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸所編碼。
(8)載體，其含有上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)中所述的載體，其含有具有以下(x)～(z)組成要素的表達(dá)盒(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)上述(1)～(5)中任一項所述的多核苷酸，其與該啟動子以正義方向或反義方向結(jié)合；以及(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號。
(9)載體，其含有上述(6)中所述的多核苷酸。
(10)酵母，其中導(dǎo)入了上述(8)～(9)中任一項所述的載體。
(11)上述(10)中所述的酵母，其通過導(dǎo)入上述(8)～(9)中任一項所述的載體，降低總連二酮的生產(chǎn)能力或總雙乙酰的生產(chǎn)能力。
(12)上述(11)中所述的酵母，其通過使上述(7)中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少，降低總連二酮的生產(chǎn)能力或總雙乙酰的生產(chǎn)能力。
(13)酵母，其通過導(dǎo)入上述(8)～(9)中任一項所述的載體，或通過破壞與上述(5)中所述多核苷酸(DNA)有關(guān)的基因，抑制上述(5)中所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。
(14)酒精飲料的制造方法，其包括培養(yǎng)上述(10)～(13)中任一項所述的酵母。
(15)上述(14)中所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
(16)上述(14)中所述的酒精飲料的制造方法，其釀造的酒精飲料是葡萄酒。
(17)酒精飲料，其用上述(14)～(16)中任一項所述的方法制造。
(18)評價被檢酵母的總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力的方法，其包括使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的堿基序列而設(shè)計的引物或探針。
(18a)使用上述(18)中所述的方法，選擇總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力低的酵母的方法。
(18b)使用通過上述(18a)中所述方法選擇的酵母制造酒精飲料(例如啤酒)的方法。
(19)評價被檢酵母的總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；以及測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量。
(19a)酵母的選擇方法，其包括根據(jù)上述(19)中所述的方法評價被檢酵母，選擇乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量低的酵母。
(19b)使用根據(jù)上述(19a)中所述的方法選擇的酵母制造酒精飲料(例如啤酒)的方法。
(20)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；對上述(7)中所述的蛋白質(zhì)定量或測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量；以及根據(jù)目標(biāo)總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力選擇具有所述蛋白質(zhì)生成量或所述基因表達(dá)量的被檢酵母。
(21)上述(20)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因在各酵母中的表達(dá)量；以及選擇該基因的表達(dá)量低于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母。
(22)上述(20)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；對各酵母中上述(7)中所述的蛋白質(zhì)定量；以及選擇該蛋白質(zhì)的量比標(biāo)準(zhǔn)酵母少的被檢酵母。即上述(20)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)多個酵母；對各酵母中上述(7)中所述的蛋白質(zhì)定量；以及選擇其中該蛋白質(zhì)的量較少的被檢酵母。
(23)酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(10)～(13)中任一項所述的酵母或通過上述(20)～(22)中任一項所述的方法選擇的酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵；以及調(diào)節(jié)總連二酮的生產(chǎn)能力或總雙乙酰的生產(chǎn)能力。
根據(jù)使用本發(fā)明所述的酒精飲料的制造方法，可降低產(chǎn)品中不良味道的連二酮類(VDK)[例如雙乙酰(DA)、2，3-戊二酮(PD)等]或其前體物質(zhì)(例如α-乙酰羥酸類等)，特別是雙乙酰(DA)或其前體物質(zhì)(例如α-乙酰乳酸等)的生產(chǎn)量，所以易于制造出香味優(yōu)異的酒精飲料。


圖1是啤酒試驗釀造中酵母生長經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示660nm處的光密度(OD660)。
圖2是啤酒試驗釀造中浸出物消耗量經(jīng)時變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是啤酒試驗釀造中酵母的non-ScILV2基因表達(dá)變動的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時間，縱坐標(biāo)表示檢測出的信號輝度。
圖4是使用ILV2破壞株而進(jìn)行的的nonScILV2補(bǔ)充試驗的結(jié)果圖。
a)是由于ILV2破壞形成纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸缺陷型的示意圖。親株用S.cerevisiae X2180-1A。所述菌株在SC(-Leu，Ile，Val)平板培養(yǎng)基、30℃下培養(yǎng)3日。
b)是通過將nonScILV2導(dǎo)入ILV2破壞株而形成非缺陷型的示意圖。親株用X2180-1A(ilv2nat1)。所述菌株在含有300mg/L的氨基糖苷類抗生素(Geneticin)的SC(-Leu，Ile，Val)平板培養(yǎng)基中，于30℃下培養(yǎng)3日。
具體實施例方式
本發(fā)明人等以用日本特開2004-283169中公開的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎(chǔ)，分離、鑒定了啤酒酵母特有的編碼乙酰乳酸合成酶的non-ScILV2基因。該基因的堿基序列如序列號1所示。且由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號2所示。
本文中有時把VDK與其前體物質(zhì)α乙酰羥酸總稱為“總連二酮”。把DA與其前體物質(zhì)α-乙酰乳酸總稱為“總雙乙酰”。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；以及(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
作為本發(fā)明對象的多核苷酸，不只限于來自上述啤酒酵母的編碼乙酰乳酸合成酶的多核苷酸，還包含編碼與此蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。同等功能的蛋白質(zhì)包括，例如，(c)由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1個或多個的氨基酸的氨基酸序列組成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)包括，由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了例如1～100個、1～90個、1～80個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個(1至數(shù)個)、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個氨基酸殘基的氨基酸序列組成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或添加的數(shù)量，一般優(yōu)選為較小的數(shù)量。此種蛋白質(zhì)包括(d)具有與序列號2的氨基酸序列有約60％或以上、約70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或者99.9％或以上的同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。上述同一性的數(shù)值一般越大越好。
乙酰乳酸合成酶活性，例如可根據(jù)Pang等的方法[Biochemistry，38，5222-5231(1999)]測定。
另外，本發(fā)明也包含(e)含有與序列號1堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
此處的“在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸”，是指以序列號1的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸的全部或一部分、或編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。雜交方法可以是，例如Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本文中所述的“嚴(yán)格條件”可為低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件中的任一種。“低嚴(yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件?！爸袊?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件?！案邍?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，溫度越高，越能高效地獲得具有較高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴(yán)格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過適宜選擇這些因素，均可實現(xiàn)類似的嚴(yán)格條件。
雜交中使用市售的試劑盒時，例如，可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時，根據(jù)試劑盒中附帶的說明方案，與標(biāo)記了的探針溫育整夜后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的首次洗滌緩沖液洗滌，之后檢測雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
其它可雜交的多核苷酸包括與編碼序列號2的氨基酸序列的多核苷酸有約60％或以上、約70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2或％以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸，上述同一性例如是通過FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認(rèn)參數(shù)(default parameter)所計算得。
氨基酸序列或堿基序列的同一性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)而確定。開發(fā)了基于BLAST算法、被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，參數(shù)例如為score＝100、wordlength＝12。使用BLASTX分析氨基酸序列時，參數(shù)例如為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。
而且，本發(fā)明的多核苷酸包含(j)編碼具有與上述(5)中所述多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸；(1)編碼具有特異性切割上述(5)中所述多核苷酸(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性的RNA的多核苷酸；以及(m)編碼通過共抑制作用抑制上述(5)中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸。這些多核苷酸可被整合進(jìn)載體，而且可在導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中抑制上述(a)～(i)的多核苷酸(DNA)的表達(dá)。因此，可優(yōu)選用于適合抑制上述多核苷酸(DNA)表達(dá)的場合。
本文中，“編碼具有與DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列的RNA的多核苷酸”，是指所謂的反義DNA。反義技術(shù)作為抑制特定的內(nèi)源性基因表達(dá)的方法而公知，且在種種文獻(xiàn)中均有記載[例如，參照平島及井上新生化學(xué)實驗講座2核酸IV基因的復(fù)制和表達(dá)(日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人)pp.319-347，1993等][平島および井上新生化學(xué)実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現(xiàn)(日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人)pp.319-347，1993など]。反義DNA的序列是優(yōu)選與內(nèi)源性基因或其一部分互補(bǔ)的序列，但只要能有效抑制基因的表達(dá)，即使不完全互補(bǔ)也可以。被轉(zhuǎn)錄的RNA與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物優(yōu)選具有90％以上，更優(yōu)選具有95％以上的互補(bǔ)性。反義DNA的長度至少為15個堿基或以上，優(yōu)選100個堿基或以上，更優(yōu)選500個堿基或以上。
本文中，“編碼通過RNAi作用抑制DNA表達(dá)的RNA的多核苷酸”，是指用于通過RNA interference(RNAi)抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的多核苷酸?！癛NAi”是指將具有與靶基因序列同一或類似的序列的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時，導(dǎo)入的外源基因及內(nèi)源性靶基因的表達(dá)均被抑制的現(xiàn)象。此處使用的RNA，例如可為21～25堿基長度的、且可產(chǎn)生RNA干擾的雙鏈RNA，例如，dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或shRNA(shorthairpin RNA)。此種RNA可通過脂質(zhì)體等的運輸系統(tǒng)向所需位點局部運輸，或使用產(chǎn)生上述雙鏈RNA的載體使其局部表達(dá)。此種雙鏈RNA(dsRNA、siRNA或shRNA)的制備方法、使用方法等已由許多文獻(xiàn)公開(參照日本特表2002-516062；US2002/086356A；Nature Genetics，24(2)，180-183，2000 Feb.；Genesis，26(4)，240-244，2000 April；Nature，4076802，319-20，2002 Sep.21；Genes & Dev.，Vol.16，(8)，948-958，2002 Apr.15；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(8)，5515-5520，2002 Apr.16；Science，296(5567)，550-553，2002 Apr.19；ProcNatl.Acad.Sci.USA，999，6047-6052，2002 Apr.30；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，497-500，2002 May；Nature Biotechnology，Vol.20(5)，500-505，2002May；Nucleic Acids Res.，3010，e46，2002 May 15等)。
本文中，“編碼具有特異性切割DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性的RNA的多核苷酸”一般是指核酶。核酶是指具有催化活性的RNA分子，其通過切割靶DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，抑制該基因的功能。核酶的設(shè)計可參照各種公知文獻(xiàn)(例如參照FEBS Lett.228228，1988；FEBS Lett.239285，1988；Nucl.Acids.Res.177059，1989；Nature 323349，1986；Nucl.Acids.Res.196751，1991；ProteinEng 3733，1990；Nucl.Acids Res.193875，1991；Nucl.Acids Res.195125，1991；Biochem Biophys Res Commun 1861271，1992等)?！熬幋a通過共抑制作用抑制DNA表達(dá)的RNA的多核苷酸”，是指通過“共抑制”，阻斷靶DNA功能的核苷酸。
本文中，“共抑制”是指細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入與內(nèi)源性靶基因具有同一或類似序列的基因，而使導(dǎo)入的外源基因及內(nèi)源靶基因的表達(dá)均被抑制的現(xiàn)象。具有共抑制作用的多核苷酸的設(shè)計，可參照種種公知文獻(xiàn)(例如，參照SmythDRCurr.Biol.7R793，1997、Martienssen RCurr.Biol.6810，1996等)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a)～(i)中任一個編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)包括序列號2中的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)包括序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了如上所述數(shù)量的氨基酸殘基的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。且此種蛋白質(zhì)包括與序列號2的氨基酸序列具有如上所述同源性的氨基酸序列、且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點誘變法獲得。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1個或以上的氨基酸殘基，是指在同一序列中任意的1個或多個氨基酸序列的位置上，缺失、取代、插入及/或添加了1個或多個氨基酸殘基，2種或2種以上類型的缺失、取代、插入及添加也可同時發(fā)生。
以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化學(xué)合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、Shimazu公司制的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述(a)～(i)中所述的任一多核苷酸(例如DNA)。本發(fā)明的載體通常包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括如下構(gòu)成因子(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(v)與該啟動子以正義方向或反義方向結(jié)合的、上述(a)～(i)中任一項所述的多核苷酸(例如DNA)；以及(z)含有與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號。在含有上述(i)～(m)中任一項所述的多核苷酸的載體中導(dǎo)入這些多核苷酸，使這些多核苷酸表達(dá)。本發(fā)明中，通過破壞上述靶基因(DNA)，可抑制上述DNA的表達(dá)或上述蛋白質(zhì)的表達(dá)?；虻钠茐模赏ㄟ^對參與靶基因中基因產(chǎn)物表達(dá)的區(qū)域，例如向編碼區(qū)域、啟動子區(qū)域等添加或缺失單個或多個堿基，或使這些區(qū)域的全體缺失來進(jìn)行。此種基因破壞的方法，可參照公知的文獻(xiàn)[例如，參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，4951(1979)、Methods in Enzymology，101，202(1983)、日本特開平6-253826號公報等]。
導(dǎo)入酵母時使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，Academic Press，New York，83，1983)、YCp型載體的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體的YIp5(K.Stmhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均為已知，且易獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達(dá)的啟動子/終止子可任意組合，前提是所述組合能在釀造用酵母中起作用，同時又不受發(fā)酵液中成分的影響，。例如可利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基因已被克隆，例如在M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中有詳細(xì)的記載，并且可通過已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所以，轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標(biāo)記例如可利用氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、或淺藍(lán)菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分別見Junji Inokoshi et al.，Biochemistry，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)。
如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母為可用于釀造的任意的酵母，例如可為啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可使用酵母屬(Saccharomyces)等的酵母。在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，例如Saccharomyces pastorianus W34/70、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453或NCYC456、或Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；還可使用例如日本協(xié)會的葡萄酒用1號、3號、4號等的葡萄酒酵母以及例如日本協(xié)會的清酒用7號、和9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。
酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法(Meth.Enzymol.，194，p182(1990))、原生質(zhì)球法(Spheroplast法)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978))、醋酸鋰法(J.Bacteriology，153，p163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)、Methods in yeastgenetics，2000 EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實施，但不限于此。
更具體地說，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養(yǎng)，使OD600nm值為1～6。將此培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。將此細(xì)胞在約30℃條件下靜置約60分鐘后，與要導(dǎo)入的DNA(約1～20μg)同時在約30℃條件下再靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃下靜置約30分鐘后，將此細(xì)胞在約42℃條件下加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入所定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，并約30℃、靜置約60分鐘。之后，接種到含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素或其類似物的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化體。
其他有關(guān)一般性的克隆技術(shù)，可參照(《Molecular Cloning(分子克隆)》第3版)、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒精飲料制造方法及根據(jù)其制法獲得的酒精飲料將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造所需酒精飲料產(chǎn)品的酵母中，并可通過使用該酵母制造所需要的且減少了VDK、特別是DA生成量的香味優(yōu)異的酒精飲料。具體地說，可通過使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明的載體的酵母，上述抑制了本發(fā)明的多核苷酸(DNA)表達(dá)的酵母或由下述本發(fā)明的酵母評價方法選擇的酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵，降低VDK生成量、特別是DA生成量，從而制造出所需要的且VDK含量、特別是DA含量降低了的酒精飲料。作為制造對象的酒精飲料包括但不限于例如啤酒、發(fā)泡酒(happoushu)等的啤酒味飲料、葡萄酒、威士忌、清酒等。
制造上述酒精飲料時，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母來代替親株以外，可利用公知的方法。由于原料、制造設(shè)備、生產(chǎn)質(zhì)量控制等可與常規(guī)方法完全相同，所以不會因制造濃度降低了的VDK、特別是DA生成量的酒精飲料而增加成本。即根據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設(shè)備、不減少成本的情況下，制造出香味優(yōu)異的酒精飲料。
5.本發(fā)明的酵母的評價方法本發(fā)明涉及使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的堿基序列而設(shè)計的引物或探針，評價被檢酵母的總VDK或總DA生產(chǎn)能力的方法。此種評價方法的一般方法為公知，例如，在WO 01/040514號公報、日本特開平8-205900號公報等中有記載。以下，就此評價方法進(jìn)行簡單說明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。使用根據(jù)乙酰乳酸合成酶基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計的引物或探針，測定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的設(shè)計可使用公知的方法進(jìn)行。
基因或特異性序列的檢測，可使用公知的方法進(jìn)行。例如，將含有特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的一部分或全部多核苷酸作為一個引物使用，另一個引物使用含有此序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或含有其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的一部分或全部多核苷酸，通過PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，并測定擴(kuò)增物的有無、擴(kuò)增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為10bp或以上，優(yōu)選為15～25bp。且夾在兩引物間的堿基數(shù)，通常為300～2000bp較適當(dāng)。
PCR法的反應(yīng)條件無特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環(huán)數(shù)10次或以上等的條件。所得到的反應(yīng)生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，測定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。根據(jù)此方法，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子的大小，來預(yù)測、評價其酵母的總連二酮(VDK)的生產(chǎn)能力或總雙乙酰(DA)的生產(chǎn)能力。且通過分析擴(kuò)增物的堿基序列，可更進(jìn)一步準(zhǔn)確地預(yù)測、評價上述性能。
本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量，評價被檢酵母的總連二酮(VDK)生產(chǎn)能力或總雙乙酰(DA)生產(chǎn)能力。此時，乙酰乳酸合成酶基因表達(dá)量的測定，可通過培養(yǎng)被檢酵母，對乙酰乳酸合成酶基因的產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)定量進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可使用公知的方法。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量RT-PCR等，蛋白質(zhì)的定量例如可通過Western印跡法進(jìn)行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons1994-2003)。
而且，可通過培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量，選擇其基因表達(dá)量與總連二酮(VDK)的目標(biāo)生產(chǎn)能力或總雙乙酰(DA)的目標(biāo)生產(chǎn)能力相應(yīng)的酵母，借此來選擇適合所需酒精飲料釀造的酵母。也可通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母(例如基因組解讀株Saccharomycespastorianus Weihenstephan 34/70株)及被檢酵母，測定并比較各酵母中基因的表達(dá)量，由此選擇適宜的被檢酵母。更具體而言，例如培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和一種或多種被檢酵母，測定具有序列號1堿基序列的基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因的表達(dá)低于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母，借此來選擇適合酒精飲料釀造的酵母。
或者，可通過培養(yǎng)被檢酵母，選擇總連二酮(VDK)生產(chǎn)能力或總雙乙酰(DA)生產(chǎn)能力低的酵母，來選擇適合所需酒精飲料釀造的被檢酵母。
此時，被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如可使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、上述抑制了本發(fā)明多核苷酸(DNA)表達(dá)的酵母、上述抑制了本發(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)的酵母、實施了突變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等。VDK或DA的生產(chǎn)能力，可使用公知的方法測定。例如，總連二酮量的定量可通過Drews etal.，Mon.fur Brau.，34，1966中所述的方法進(jìn)行?？傠p乙酰量的定量，例如可通過J Agric Food Chem.50(13)3647-53，2002中所述的方法進(jìn)行。乙酰乳酸合成酶活性，可通過Pang等的方法[Biochemistry，38，5222-5231(1999)]測定。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過EMS(Ethylmethanesulfonate)、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學(xué)方法等的任何方法進(jìn)行(例如，參照大島泰治編著、生物化學(xué)實驗法39酵母分子遺傳學(xué)實驗法、p67-75、學(xué)會出版中心等)(日語原文名稱；大泰治編著、生物化學(xué)実験法39酵母分子遺伝學(xué)実験法、p67-75、學(xué)會出版センタ一など)。
可作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為包括釀造時可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母[例如，巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)、Saccharomyces cerevisiae、及Saccharomyces carlsbergensis)]。在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、或NCYC456等，或Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、或NBRC1954等。而且還可使用如下酵母威士忌酵母，例如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等；例如日本協(xié)會葡萄酒用1號、3號和4號等的葡萄酒酵母；例如日本協(xié)會清酒用7號和9號等的清酒酵母，但不限于此。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意組合選擇。
實施例以下，通過實施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。
實施例1新型乙酰乳酸合成酶基因(non-ScILV2)的克隆使用日本特開2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的新型乙酰乳酸合成酶基因non-ScILV2(序列號1)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，分別設(shè)計用于擴(kuò)增各自全長基因的引物non-ScILV2_F(序列號3)/non-ScILV2_R(序列號4)，以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstephan W34/70株的染色體DNA為模板，通過PCR，獲得了含有nonScILV2全長基因的DNA片段。
將如上所述得到的non-ScILV2基因片段通過TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體[Invitrogen公司制]。將non-ScILV2基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，2141215，1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。
實施例2啤酒試驗釀造中non-ScILV2基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒試驗釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用酵母DNA微陣列檢測。
麥芽汁浸出物濃度 12.69％麥芽汁容量 70L麥芽汁溶解氧濃度 8.6ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母投入量 12.8×106細(xì)胞/mL對發(fā)酵液經(jīng)時取樣，觀察酵母生長量(圖1)和表觀浸出物濃度(圖2)的經(jīng)時變化。與此同時對酵母菌體取樣以用于制備mRNA，對所制備的mRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其與啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號檢測使用GeneChip Operating System[GCOS；GeneChip Operating Software 1.0，AFFYMETRIX公司制]進(jìn)行。Non-ScILV2基因表達(dá)模式如圖3所示。由此結(jié)果，可確認(rèn)在通常的啤酒發(fā)酵中non-ScILV2基因進(jìn)行了表達(dá)。
實施例3使用了實驗室所設(shè)計的酵母菌株的nonScILV2的補(bǔ)充試驗用內(nèi)源性ILV2基因遭到破壞的實驗室所設(shè)計的酵母菌株確認(rèn)了nonScILV2基因產(chǎn)物作為乙酰乳酸合成酶起作用。
根據(jù)文獻(xiàn)[Goldstein et al.，yeast.151541(1999)]的方法，以含有抗藥性標(biāo)記的質(zhì)粒[pAG25(natl)]為模板，通過PCR，制備了用于破壞ILV2基因的片段。所使用的引物的序列如序列號5、6所示。使用此片段，用日本特開平07-303475中所述的方法轉(zhuǎn)化了S.cerevisiae X2180-1A株，并用含有nourseothricin 50mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)進(jìn)行選擇。將所得到的ILV2破壞株用不含纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的SC平板培養(yǎng)基
接種，在30℃下培養(yǎng)3日，確認(rèn)為支鏈氨基酸缺陷型菌株(圖4-a)。
其次，將實施例1中所述的nonScILV2/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI酶切，制備了含有蛋白質(zhì)編碼區(qū)域全長的DNA片段。將此片段與用限制性內(nèi)切酶SacI及NotIA處理的pYCGPYNot連接，構(gòu)建了nonScILV2高表達(dá)載體nonScILV2/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過丙酮酸激酶PYK1的啟動子高表達(dá)。酵母中的選擇性標(biāo)記包含氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
把制備的高表達(dá)載體導(dǎo)入ILV2基因破壞株(X2180-1A ILV2::natl)，用RT-PCR確認(rèn)nonScILV2在轉(zhuǎn)化體中的高表達(dá)。作為對照，制備了不含有插入片段的pYCGPYNot的導(dǎo)入株。用不含有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的SC平板培養(yǎng)基評價這些菌株。結(jié)果證明，nonScILV2的導(dǎo)入形成了支鏈氨基酸非缺陷型菌株(圖4-b、表1)，即nonScILV2基因產(chǎn)物作為乙酰乳酸合成酶起作用。
表1

實施例4nonScILV2基因的破壞按照文獻(xiàn)(Goldstein et al.，yeast.15 1541(1999))的方法，以含有抗藥性標(biāo)記的質(zhì)粒(pFA6a(G418r)，pAG25(natl)，pAG32(hph))為模板，通過PCR，制備了基因破壞用片段。用于PCR的引物由nonScILV2_delta_for(序列號7)和nonScILV2_delta_rv(序列號8)組成。
用上述方法制備的基因破壞用片段轉(zhuǎn)化從啤酒酵母Saccharomycespastorianus W34/70株分離的孢子克隆株(W34/70-2)。用日本特開平07-303475號公報中所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用含有氨基糖苷類抗生素(Geneticin)300mg/L、Nourseothricin 50mg/L或潮霉素B(Hygromycin B)200mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實施例5啤酒試驗釀造中VDK生產(chǎn)量的解析使用親株及用實施例4得到的non-ScILV2破壞株，按以下條件進(jìn)行發(fā)酵試驗。
麥芽汁浸出物濃度 12％麥芽汁容量 1L麥芽汁溶解氧濃度 約8ppm發(fā)酵溫度 15℃恒定酵母投入量 5g濕酵母菌體/L麥芽汁對發(fā)酵液經(jīng)時取樣，觀察酵母生長量(OD660)、浸出物消耗量的經(jīng)時變化。使VDK(DA及PD)與羥胺反應(yīng)，其生成的乙二肟衍生物與2價鐵離子反應(yīng)生成復(fù)合物，通過測定此復(fù)合物的吸光度，進(jìn)行發(fā)酵液中總VDA的定量(Drews et al.，Mon.fur Brau.，34，1966)。此時，通過將前體物質(zhì)的α-乙酰乳酸及α-乙酰羥基丁酸預(yù)先用氣體洗滌法(氧化脫羧反應(yīng))分別轉(zhuǎn)換為DA、PD，即可求出含有上述物質(zhì)的總VDK量。
根據(jù)本發(fā)明的酒精飲料制造法，可降低產(chǎn)品中不良味道的VDK、特別是DA的生產(chǎn)量，從而易于制造出香味優(yōu)異的酒精飲料。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會社(Suntory Limited)<120>編碼乙酰乳酸合成酶的基因及其用途(Gene encoding acetolactate synthase and use thereof)<130>G06-0084CN<150>JP2006-047558<151>2006-02-23<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2064<212>DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>1atgatcagac agtccacact caagaacttc gctattaagc gttgcttcca acaaatggca 60taccgtaaca cacctgctat gagatcagtc gccctcgcgc aacgctttta tagttcatct120tcccgttatt atagtgcgtc tccattgcca gcttccaata gaccggaacc agccccaagt180ttcaacgtcg agccagtggc acaggtgccc gagccttcta aactggccaa gagactacgc240actgagcctg acatggacac atcctttgtc ggcttaactg gtggtcaaat attcaatgaa300
atgatgtcta gacataatgt cgacactgta tttggctatc caggtggtgc tatcttgcct360gtgtatgatg ccatccacaa cagtgacaaa tttactttcg tcttaccaag acacgaacaa420ggtgctggcc acatggccga aggttatgcc agagcctctg gtaaaccagg tgttgtcttg480gtgacctccg gtccaggtgc tactaacgtc attactccaa tggcagatgc cttcgcagac540ggtattccaa tggtcgtttt tacagggcaa gtgccaacta gtgccatcgg taccgatgcc600ttccaagaag ccgatgttgt cggtatttcc agatcctgta ccaagtggaa tgtcatggca660aaaaccgtgg aagaattgcc attgcgtatc aacgaagctt ttgaaattgc cactagtggt720agaccaggtc ccgtcttggt tgacttacca aaggacgtca cagcggccat tttaagaaac780ccaattccaa caaaaactac tttgccatca aatgcgctaa accaattaac tagtcgtaca840caggatgagt tcgttttgca aaacatcaat agagcagcag atttgattaa tttggcaaag900aagcctgttt tatacgtcgg tgcaggtatt ttaaaccatg ctgatggtcc aagattacta960aaagagttaa gtgaccgtgc acaaataccc gttacaacta ctttgcaagg tttgggtgct 1020ttcgaccaag acgatccaaa atcccttgat atgttaggta tgcatggctg tgccactgct 1080aacttggcgg tacaaaatgc ggatttgcta attgctgtag gtgctagatt cgatgatcgt 1140gtcaccttga atatcgctaa atttgcacca gaggcccgtc gtgctgctgc tgaaggcaga 1200ggtggtatta tccattttga agttagcccc aaaaacataa acaaggtcgt ggagactcaa 1260atagcggtgg aaggtgacgc tactgggaat ttggataaaa tgatgccaaa aatctttcca 1320gtaaaggaga gatcagagtg gtttggtcaa ataaacgaat ggaagaagaa atacccatac 1380gcttacatga tggaaactcc aggatctaaa ataaaaccac aaacagtcat aacaaaacta 1440tccaagatcg ccaacgacac aggaagacat gttatagtca caaccggtgt cgggcaacat 1500caaatgtggg ctgcccaaca ctggacatgg aaaaccccac gtaccttcat cacatcaggt 1560ggtttaggta caatgggtta cggtcttcca gccgccatcg gcgctcaagt cgctaaacca 1620gattctttgg ttattgacat tgatggtgat gcatctttca acatgacctt gaccgaattg 1680agttctgccg tccaagctgg tactccagtg aagatcttgg ttttgaacaa tgaagaacaa 1740ggtatggtta ctcaatggca atcactattt tacgagaatc gttattctca cacacatcag 1800ttgaaccctg atttcataaa actagccgac gctatgggtc taaagggttt aagagtcaaa 1860aagcaagaag aattagatgc taaattgaaa gaatttgttt ccacaaaggg ccctgtcttg 1920
cttgaagtgg aagttgacaa aaaagttcct gttttgccaa tggttccagc aggcaagggt 1980ctagatgagt tcatatactt tgatccagag gttgaaagac aacaaaatga attacgtcac 2040aagcgtacca atggtaagca ttga 2064<210>2<211>687<212>PRT<213>酵母屬(Saccharomyces sp.)<400>2Met Ile Arg Gln Ser Thr Leu Lys Asn Phe Ala Ile Lys Arg Cys Phe1 5 10 15Gln Gln Met Ala Tyr Arg Asn Thr Pro Ala Met Arg Ser Val Ala Leu20 25 30Ala Gln Arg Phe Tyr Ser Ser Ser Ser Arg Tyr Tyr Ser Ala Ser Pro35 40 45Leu Pro Ala Ser Asn Arg Pro Glu Pro Ala Pro Ser Phe Asn Val Glu50 55 60Pro Val Ala Gln Val Pro Glu Pro Ser Lys Leu Ala Lys Arg Leu Arg65 70 75 80Thr Glu Pro Asp Met Asp Thr Ser Phe Val Gly Leu Thr Gly Gly Gln85 90 95Ile Phe Asn Glu Met Met Ser Arg His Asn Val Asp Thr Val Phe Gly100 105 110Tyr Pro Gly Gly Ala Ile Leu Pro Val Tyr Asp Ala Ile His Asn Ser115 120 125
Asp Lys Phe Thr Phe Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His130 135 140Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Lys Pro Gly Val Val Leu145 150 155 160Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Val Ile Thr Pro Met Ala Asp165 170 175Ala Phe Ala Asp Gly Ile Pro Met Val Val Phe Thr Gly Gln Val Pro180 185 190Thr Ser Ala Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Val Val Gly195 200 205Ile Ser Arg Ser Cys Thr Lys Trp Asn Val Met Ala Lys Thr Val Glu210 215 220Glu Leu Pro Leu Arg Ile Asn Glu Ala Phe Glu Ile Ala Thr Ser Gly225 230 235 240Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Lys Asp Val Thr Ala Ala245 250 255Ile Leu Arg Asn Pro Ile Pro Thr Lys Thr Thr Leu Pro Ser Asn Ala260 265 270Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg Thr Gln Asp Glu Phe Val Leu Gln Asn275 280 285Ile Asn Arg Ala Ala Asp Leu Ile Asn Leu Ala Lys Lys Pro Val Leu290 295 300Tyr Val Gly Ala Gly Ile Leu Asn His Ala Asp Gly Pro Arg Leu Leu305 310 315 320Lys Glu Leu Ser Asp Arg Ala Gln Ile Pro Val Thr Thr Thr Leu Gln325 330 335Gly Leu Gly Ala Phe Asp Gln Asp Asp Pro Lys Ser Leu Asp Met Leu
340 345 350Gly Met His Gly Cys Ala Thr Ala Asn Leu Ala Val Gln Asn Ala Asp355 360 365Leu Leu Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Leu Asn370 375 380Ile Ala Lys Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala Glu Gly Arg385 390 395 400Gly Gly Ile Ile His Phe Glu Val Ser Pro Lys Asn Ile Asn Lys Val405 410 415Val Glu Thr Gln Ile Ala Val Glu Gly Asp Ala Thr Gly Asn Leu Asp420 425 430Lys Met Met Pro Lys Ile Phe Pro Val Lys Glu Arg Ser Glu Trp Phe435 440 445Gly Gln Ile Asn Glu Trp Lys Lys Lys Tyr Pro Tyr Ala Tyr Met Met450 455 460Glu Thr Pro Gly Ser Lys Ile Lys Pro Gln Thr Val Ile Thr Lys Leu465 470 475 480Ser Lys Ile Ala Asn Asp Thr Gly Arg His Val Ile Val Thr Thr Gly485 490 495Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Trp Thr Trp Lys Thr500 505 510Pro Arg Thr Phe Ile Thr Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Gly515 520 525Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Gln Val Ala Lys Pro Asp Ser Leu Val530 535 540Ile Asp Ile Asp Gly Asp Ala Ser Phe Asn Met Thr Leu Thr Glu Leu545 550 555 560
Ser Ser Ala Val Gln Ala Gly Thr Pro Val Lys lle Leu Val Leu Asn565 570 575Asn Glu Glu Gln Gly Met Val Thr Gln Trp Gln Ser Leu Phe Tyr Glu580 585 590Asn Arg Tyr Ser His Thr His Gln Leu Asn Pro Asp Phe Ile Lys Leu595 600 605Ala Asp Ala Met Gly Leu Lys Gly Leu Arg Val Lys Lys Gln Glu Glu610 615 620Leu Asp Ala Lys Leu Lys Glu Phe Val Ser Thr Lys Gly Pro Val Leu625 630 635 640Leu Glu Val Glu Val Asp Lys Lys Val Pro Val Leu Pro Met Val Pro645 650 655Ala Gly Lys Gly Leu Asp Glu Phe Ile Tyr Phe Asp Pro Glu Val Glu660 665 670Arg Gln Gln Asn Glu Leu Arg His Lys Arg Thr Asn Gly Lys His675 680 685<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>3
gagctctaga aatccactcg ccaa 24<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>4ggatcctcaa tgcttaccat tggtac26<210>5<211>120<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>5atgatcagac aatctacgct aaaaaacttc gctattaagc gttgctttca acatatagca 60taccgcaaca cacctgccat gagatcagta gctctcgcgc ccttgacagt cttgacgtgc120<210>6
<211>120<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>6ttcagtgctt accgcctgta cgcttatgac gtaattcagt ctgttgtctt tcaacttctg 60ggtcaaaatt tatgaactcg tctagaccgc taccacctgc cgcacttaac ttcgcatctg120<210>7<211>80<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>7attgcattaa catagtctat acgcatagga gaaaacacac aatagaaatc cactcgccaa 60ccttgacagt cttgacgtgc 80<210>8<211>80<212>DNA
<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>8tataagcatg gttaaataat aattaagtct aaatttttaa tggagaatgt gtttcagact60cgcacttaac ttcgcatctg80
權(quán)利要求
1.多核苷酸，其選自由以下(a)～(f)組成的群組(a)含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成的，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號2的氨基酸序列有60％或60％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號2氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其選自由以下(g)～(i)組成的群組(g)編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或編碼序列號2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加了1～10個氨基酸的氨基酸序列組成的且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(h)編碼與序列號2的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性的氨基酸序列，且具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的；以及(i)與序列號1的堿基序列組成的多核苷酸或與序列號1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在高嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有乙酰乳酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5.權(quán)利要求1～4中任一項所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
6.多核苷酸，其選自由以下(j)～(m)組成的群組(j)編碼具有權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的堿基序列的RNA的多核苷酸；(k)編碼通過RNAi作用而抑制權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸；(l)編碼具有特異性切割權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性的RNA的多核苷酸；以及(m)編碼通過共抑制作用而抑制權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)表達(dá)的RNA的多核苷酸。
7.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1～5中任一項所述的多核苷酸所編碼。
8.載體，其含有權(quán)利要求1～5中任一項所述的多核苷酸。
9.載體，其含有權(quán)利要求6中所述的多核苷酸。
10.酵母，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求8或9中所述的載體。
11.權(quán)利要求10中所述的酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求8或9中所述的載體，降低總連二酮的生產(chǎn)能力或總雙乙酰的生產(chǎn)能力。
12.權(quán)利要求11中所述的酵母，其通過使權(quán)利要求7中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少，降低總連二酮的生產(chǎn)能力或總雙乙酰的生產(chǎn)能力。
13.酵母，其通過導(dǎo)入權(quán)利要求8或9中所述的載體，或通過破壞與權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)有關(guān)的基因，抑制權(quán)利要求5中所述多核苷酸(DNA)的表達(dá)。
14.酒精飲料的制造方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求10～13中任一項所述的酵母。
15.權(quán)利要求14中所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
16.權(quán)利要求14中所述的酒精飲料的制造方法，其中所釀造的酒精飲料是葡萄酒。
17.酒精飲料，其用權(quán)利要求14～16中任一項所述的方法制造。
18.評價被檢酵母的總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力的方法，其包括使用根據(jù)具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的堿基序列而設(shè)計的引物或探針。
19.評價被檢酵母的總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力的方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；以及測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量。
20.酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母；對權(quán)利要求7中所述的蛋白質(zhì)定量或測定具有序列號1堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因的表達(dá)量；以及根據(jù)目標(biāo)總連二酮生產(chǎn)能力或總雙乙酰生產(chǎn)能力選擇具有所述蛋白質(zhì)生成量或所述基因表達(dá)量的被檢酵母。
21.權(quán)利要求20中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；測定具有序列號1的堿基序列的乙酰乳酸合成酶基因在各酵母中的表達(dá)量；以及選擇該基因的表達(dá)量低于標(biāo)準(zhǔn)酵母的被檢酵母。
22.權(quán)利要求20中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母；對各酵母中的權(quán)利要求7中所述的蛋白質(zhì)定量；以及選擇該蛋白質(zhì)的量比標(biāo)準(zhǔn)酵母少的被檢酵母。
23.酒精飲料的制造方法，其包括使用權(quán)利要求10～13中任一項所述的酵母或通過權(quán)利要求20～22中任一項所述的方法選擇的酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵；以及調(diào)節(jié)總連二酮的生產(chǎn)能力或總雙乙酰的生產(chǎn)能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙酰乳酸合成酶基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說，本發(fā)明涉及通過降低編碼釀造酵母的乙酰乳酸合成酶Ilv2p的基因ILV2，特別是啤酒酵母中特征性的nonScILV2基因的表達(dá)量，使造成產(chǎn)品不良味道的VDK、特別是DA的生成能力降低的酵母及使用該酵母制造酒精飲料的方法等。
文檔編號C12G1/00GK101024838SQ20061016467
公開日2007年8月29日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子, 下永朋子 申請人:三得利株式會社