專利名稱：乙酰乳酸脫羧酶衍生物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)衍生物及其應(yīng)用。
在發(fā)酵含碳水化合物物質(zhì)如麥芽汁或葡萄汁的過程中，可經(jīng)過生醇發(fā)酵之外的途徑生成多種付產(chǎn)物。其中一種不需要的付產(chǎn)物便是雙乙酰。
歐洲專利EP46066號(hào)中述及，可用ALDC來防止雙乙酰的生成。然而，天然存在之ALDC的最適pH均在pH6左右，而且在發(fā)酵麥芽汁的pH3.8-4.7，特別是以低麥芽含量發(fā)酵麥芽汁時(shí)低于4的常用pH條件下，該酶只能產(chǎn)生很低的活性，而不適于生產(chǎn)實(shí)踐之目的。為此，這一現(xiàn)有技術(shù)并沒有找到一種適于在任何大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中防止發(fā)酵生產(chǎn)啤酒或葡萄酒時(shí)產(chǎn)生雙乙酰的有效方法。歐洲專利46066號(hào)述及可以制備固相化ALDC。該專利還提到可參照Biochem.，Vol.11，No.22.PP.4022-4084(1972)中所述方法，對(duì)ALDC進(jìn)行化學(xué)修飾，以使之在較低pH值時(shí)發(fā)揮最佳活性。它所引用的上述參考文獻(xiàn)中提到的修飾方法包括在胰凝乳蛋白酶分子上加入聚(鳥氨酰)側(cè)鏈；故該文獻(xiàn)并沒有提出修飾ALDC的方法。該現(xiàn)有技術(shù)提出的使酶在低pH值條件下產(chǎn)生最佳活性的修飾方法不適于工業(yè)應(yīng)用，也不知道這種用于修飾胰凝乳蛋白酶的聚(鳥氨酰)方法是否適于ALDC。最后，上述方法也沒有說明按現(xiàn)有技術(shù)修飾的胰凝乳蛋白酶是否在低pH條件下仍具有令人滿意的穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種可適用于工業(yè)生產(chǎn)，并可在低pH下表現(xiàn)有令人滿意之穩(wěn)定性的ALDC衍生物。
已令人驚異地發(fā)現(xiàn)，用戊二醛處理ALDC，所得修飾產(chǎn)物首先表現(xiàn)有期望的pH曲線，第二是易于制造且成本低，第三是有令人滿意的穩(wěn)定性。另外，如下文將進(jìn)一步說明的，本發(fā)明的ALDC衍生物可以可溶性和固相化衍生物的形式存在。
因此，本發(fā)明的ALDC衍生物之特征在于是用濃度相當(dāng)于每克純ALDC蛋白質(zhì)約0.1至5克、較好是相當(dāng)于每克純ALDC蛋白質(zhì)0.25至2克的戊二醛處理含水介質(zhì)中的ALDC。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果不作進(jìn)一步處理，這種ALDC衍生物是可溶性的，而且能夠以高活性收率制得。
Biotechnology Letters，Vol.10.N0.5，PP.325-330(1988)中描述了β-葡糖苷酶與戊二醛交聯(lián)可提供一種改善了熱穩(wěn)定性的衍生物。Rolf D.Schmid(Adv.Biochem.Eng.12，PP.41-118.1979)述及可交聯(lián)木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和尿酸酶等不同的酶，以提供具有更好熱穩(wěn)定性的酶衍生物，但其中沒有交聯(lián)ALDC。因此，現(xiàn)有技術(shù)并沒有涉及用戊二醛作交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
應(yīng)明確的是，所有ALDC酶，即所有由微生物產(chǎn)生的ALDC，更好是由短芽孢桿菌(Bacillus brevis)和地衣形芽孢桿菌(S.licheniformis)產(chǎn)生的ALDC均可用于本發(fā)明。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的ALDC衍生物特征在于上文中指出的ALDC衍生物是被固相化的?？砂慈魏我环N已知方法，如吸附法進(jìn)行固相化，其優(yōu)點(diǎn)包括可得到不含ALDC的啤酒。
歐洲專利EP131125號(hào)介紹了一種借助吸附或與戊二醛交聯(lián)來固定酶(如ALDC)的特定無機(jī)載體。但該專利并沒有描述改變pH即可導(dǎo)致ALDC之pH-活性曲線的問題，而這一點(diǎn)正是本發(fā)明的一個(gè)主要特征。該EP專利中沒有述及的本發(fā)明的另一個(gè)特征是，先用有限的小濃度戊二醛處理ALDC，然后實(shí)現(xiàn)最佳固相化。
另外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的ALDC在啤酒發(fā)酵中的應(yīng)用。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選使用方案是將可溶ALDC衍生物與普通酵母一起用于批量發(fā)酵。這是使用本發(fā)明ALDC衍生物的一種最簡(jiǎn)單的方式。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選使用方案是將固相化ALDC衍生物與普通酵母一起用于批量發(fā)酵。其優(yōu)點(diǎn)是終產(chǎn)品不存在ALDC。
本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選使用方案是將固相化ALDC衍生物與固相化酵母一起用于連續(xù)發(fā)酵中。其優(yōu)點(diǎn)包括直接除去雙乙酰前體物a-乙酰乳酸。
下面借助實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例中使用的是培養(yǎng)枯草芽孢桿菌重組體菌株所產(chǎn)生的ALDC制劑；所說的菌株含有編碼并表達(dá)短芽孢桿菌ALDC、具有DK149335B中所述性質(zhì)的基因。
實(shí)施例1使100mlALDC溶液(批號(hào)EDF212，其為發(fā)酵液離心物，ALDC活性為1700ADU/ml)與2.5ml 2％戊二醛溶液(戊二醛終濃度0.05％(W/W，相當(dāng)于每克ALDC加0.5g戊二醛)混合。用冰將反應(yīng)混合物冷卻3小時(shí)。pH被調(diào)至7.5并維持之。
將底物中pH值調(diào)到3.6至6.0，用Novo分析法(AF278/1-GB，有關(guān)資料可從Novo Nordisk A/S，Novo Allé，DK-2880 Bagsvaerd得到)測(cè)定ALDC活性(ADU/ml)。所得pH-活性曲線如

圖1所示。
檢測(cè)ALDC和其衍生樣品在普通的、滅菌之丹麥啤酒(HOF)中的穩(wěn)定性。向pH分別調(diào)到4.0和6.0的每毫升啤酒中加入20ADU。每天取啤酒樣品檢測(cè)pH6.0時(shí)殘留的ALDC活性。結(jié)果示于圖2和3中。
結(jié)論是用戊二醛進(jìn)行處理可改善在pH4.0條件下ALDC的活性和穩(wěn)定性。
實(shí)施例2在傳統(tǒng)的分批發(fā)酵中檢測(cè)衍生的ALDC使用ALDC(批號(hào)EDF212，1700ADU/ml)(制劑1)和按實(shí)施例1中所述方法制備的戊二醛處理的ALDC(1100ADU/ml)(制劑2)。
用啤酒廠麥芽汁(FAXE)和加入不同量(10、20、30和40％W/W)輔料(蔗糖)的同樣麥芽汁進(jìn)行發(fā)酵。每升麥芽汁加入2.5g酵母。ALDC連同酵母一起加入(每升46ADU)。發(fā)酵于12℃下進(jìn)行7天。每天檢測(cè)pH值(圖4)、ALDC殘留活性(圖5)和總雙乙酰(α-乙酰乳酸十雙乙酰)(圖6-9)。
結(jié)果表明，當(dāng)使用衍生的ALDC(制劑2)時(shí)，總雙乙酰的降低量比使用未處理的ALDC時(shí)更大，而且衍生的制劑更為穩(wěn)定。
實(shí)施例3將3ml按實(shí)施例1制得的戊二醛處理的ALDC(1100ADU/ml)加到1g載體(得自Grace的硅載體，Grade500MP，詳見Biocatalyst Supports SG SC IE/June1987所述)。將pH調(diào)到4.5，并于5℃下將載體和ALDC溶液緩慢旋轉(zhuǎn)攪拌20小時(shí)，然后真空過濾。向吸附了ALDC的顆粒內(nèi)加入0.5ml聚氮雜環(huán)丁烷(Kymene，Hercules BV)的3％溶液，并真空干燥所得混合物。pH6.0條件下固相化ALDC的活性為589ADU/g，pH3.8條件下為331ADU/g。
權(quán)利要求
1.用戊二醛處理過的乙酰乳酸脫羧酶衍生物在啤酒發(fā)酵中的應(yīng)用，其中所述乙酰乳酸脫羧酶衍生物是通過用濃度相當(dāng)于每克純乙酰乳酸脫羧酶蛋白質(zhì)為0.1至5克的戊二醛處理含水介質(zhì)中的乙酰乳酸脫羧酶而得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述乙酰乳酸脫羧酶衍生物是通過用濃度相當(dāng)于每克純乙酰乳酸脫羧酶蛋白質(zhì)為0.25至2克的戊二醛處理含水介質(zhì)中的乙酰乳酸脫羧酶而得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述戊二醛處理過的乙酰乳酸脫羧酶衍生物是固相化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中將乙酰乳酸脫羧酶衍生物與普通酵母一起用于分批發(fā)酵中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中將乙酰乳酸脫羧酶衍生物與普通酵母一起用于分批發(fā)酵中。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中將乙酰乳酸脫羧酶衍生物與固相化酵母一起用于連續(xù)發(fā)酵中。
全文摘要
用限定比例的戊二醛處理含水介質(zhì)中的ALDC所產(chǎn)生的、且可在繼后固相化的ALDC衍生物。該用于啤酒發(fā)酵中的ALDC衍生物可在低pH條件下顯示出令人滿意的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1257913SQ9912134
公開日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1999年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1990年8月16日
發(fā)明者斯文·佩德森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司