專利名稱：編碼乙酰乳酸合酶基因的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼乙酰乳酸合酶的基因，乙酰乳酸合酶是支鏈氨基酸生物合成途徑中的一種限速酶。
背景技術(shù)：
乙酰乳酸合酶(下文稱為“ALS”)是支鏈氨基酸例如亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中的一種限速酶，被認(rèn)為是植物生長的必需酶。另外，已知ALS存在于各種各樣的高等植物中。另外，ALS存在于各種微生物例如酶母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、大腸桿菌(Escherichia coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurlum)中。
已知在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中存在三種類型的ALS同工酶。這些同工酶中的每種是一種由控制酶催化活性的大分子量催化亞基和通過結(jié)合支鏈氨基酸而作為調(diào)節(jié)蛋白起作用的小分子量調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異寡聚體(Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998)。催化亞基分別位于Ilv IH、Ilv GM和Ilv BN操縱子上。另一方面，酵母ALS是單酶，包含一個(gè)催化亞基和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，在細(xì)菌中的情況也是如此(Pang等，Biochemistry，38，5222-5231)。所述催化蛋白亞基位于基因座ILV2上。
在植物中，已知ALS包含催化亞基和調(diào)節(jié)亞基，在上述微生物中的情況也是如此(Hershey等，Plant Molecular Biology，40，795-806，1999)。例如，煙草(雙子葉植物)中ALS的催化亞基由兩個(gè)基因座-SuRA和SuRB編碼(Lee等，EMBO J.7，1241-1248，1988)；玉米中ALS的催化亞基由兩個(gè)基因座-als1和als2編碼(Burr等，Trendsin Genetics7，55-61，1991；Lawrence等，Plant Mol.Biol.18，1185-1187，1992)。已完全測定了雙子葉植物包括煙草、擬南芥屬(Arabidopsis)、油菜、棉花、蒼耳屬(Xanthium)、莧屬(Amaranthus)和地膚(Kochia)的編碼催化亞基的基因的核苷酸序列(參見Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998和專利申請WO97/08327的PCT國際出版物的國內(nèi)再版)。然而，玉米是其核苷酸序列已被完全確定的唯一單子葉植物。
已知除草劑例如磺脲除草劑、咪唑啉酮除草劑、三唑并嘧啶除草劑和嘧啶基羧基除草劑(下文稱為“PC”除草劑)通過抑制ALS而抑制植物生長(Ray，Plant Physiol.75，827-831，1984；Shaner等，Plant Physiol.76，545-546，1984；Subramanian等，Plant Physiol.96，310-313，1991；Shimizu等，J.Pestic.Sci.19，59-67，1994)。
已知對這些除草劑具有抗性的植物含有一種編碼ALS的基因，該基因包括在不同物種中保守的區(qū)域內(nèi)誘導(dǎo)一個(gè)或兩個(gè)氨基酸取代的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸取代。這種基因的實(shí)例包括編碼對磺脲除草劑具有特異性抗性的ALS的基因(參見Kathleen等，EMBO J.7，1241-1248，1988；Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Guttieri等，Weed Sci.43，175-178，1995；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995和日本專利申請?zhí)亻_昭63-71184號)；編碼對咪唑啉酮除草劑具有特異性抗性的ALS的基因(Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Lee等，F(xiàn)EBS Lett.452，341-345，1999和日本專利申請?zhí)亻_平5-227964號)；和編碼對磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑兩者均具有抗性的ALS的基因(參見Kathleen等，EMBO J.7，1241-1248，1988；Bemasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；Hattori等，Mol.Gen.Genet.246，419-425，1995；Alison等，Plant Physiol.111，1353，1996；Rajasekarau等，Plant Sci.119，115-124，1996，日本專利申請?zhí)亻_昭63-71184號，日本專利申請?zhí)亻_平4-311392號和Bemasconi等，美國專利5633437，1997)。還已知顯示抗磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑兩者的ALS，顯示對PC除草劑和三唑并嘧啶除草劑有交叉抗性(Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995)。此外，已經(jīng)嘗試通過將具有顯示特異性地抗磺脲除草劑的ALS的植物與具有顯示特異性地抗咪唑啉酮除草劑的ALS的植物雜交，產(chǎn)生顯示抗磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑兩者的植物體(Mourad等，Mol.Gen.Genet，243，178-184，1994)。而且，已經(jīng)嘗試將編碼ALS的基因人工改變成除草劑抗性基因(Ott等，J.Mol.Biol.263，359-368，1996，日本專利申請?zhí)亻_昭63-71184號，日本專利申請?zhí)亻_平5-227964號，日本專利申請?zhí)乇砥?1-504213號)，致使已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單個(gè)氨基酸缺失可使ALS顯示既抗磺脲除草劑又抗咪唑啉酮除草劑(日本專利申請?zhí)亻_平5-227964號)。
如上所述，對具有除草劑抗性的ALS和編碼ALS的基因已經(jīng)進(jìn)行了積極的研究。然而，針對抗PC除草劑抗性和涉及對PC除草劑具有特異性抗性的突變型ALS基因尚未見報(bào)道。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供編碼對PC除草劑顯示極高抗性的ALS蛋白的基因、由所述基因編碼的ALS蛋白、具有所述基因的重組載體、具有所述重組載體的轉(zhuǎn)化體、具有所述基因的植物、培育所述植物的方法以及使用所述基因作為選擇標(biāo)記來選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
作為進(jìn)行透徹的研究以達(dá)到上述目的的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)用某種氨基酸取代野生型ALS的某個(gè)氨基酸殘基而從所述野生型ALS獲得的突變型ALS對PC除草劑顯示極高的抗性，從而完成了本發(fā)明。
(1)本發(fā)明是一種編碼以下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)一種包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)一種包含從SEQ ID NO1的氨基酸序列由于取代、缺失或添加至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有對嘧啶基羧基除草劑的抗性以及具有乙酰乳酸合酶活性。
(2)此外，本發(fā)明是一種由(1)的基因編碼的乙酰乳酸合酶蛋白。
(3)此外，本發(fā)明是一種具有(1)的基因的重組載體。
(4)此外，本發(fā)明是一種具有(3)的重組載體的轉(zhuǎn)化體。
(5)此外，本發(fā)明是一種具有(1)的基因并且對嘧啶基羧基除草劑具有抗性的植物。
(6)本發(fā)明是一種培育(5)的植物的方法，所述方法包括在嘧啶基羧基除草劑存在下培育所述植物。
(7)本發(fā)明是一種使用(1)的基因作為選擇標(biāo)記來選擇具有該基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
附圖簡述

圖1顯示突變型ALS蛋白的氨基酸序列和野生型ALS蛋白的氨基酸序列之間的比較。
圖2顯示突變型ALS基因的核苷酸序列和野生型ALS基因的核苷酸序列之間的比較。
圖3是顯示抗性突變體對雙草醚(bispyribac-sodium)敏感性的特征圖。
圖4是顯示野生型對雙草醚敏感性的特征圖。
圖5是顯示野生型對氯磺隆(chlorsulfuron)敏感性的特征圖。
圖6是顯示抗性突變體對氯磺隆敏感性的特征圖。
圖7是顯示從野生型提取的粗制ALS蛋白的陰離子交換色譜的特征圖。
圖8是顯示野生型ALS蛋白和突變蛋白對雙草醚敏感性的特征圖。
圖9是顯示野生型ALS蛋白和突變蛋白對氯磺隆敏感性的特征圖。
圖10是顯示野生型ALS蛋白和突變蛋白對咪唑喹啉酸(imazaquin)敏感性的特征圖。
圖11顯示水稻(Nippon-bare)EST和玉米ALS基因之間核苷酸序列的比較。
圖12是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特征圖。
圖13是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對氯磺隆所觀察到的敏感性的特征圖。
圖14是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對嘧草硫醚(pyrithiobac-sodium)所觀察到的敏感性的特征圖。
圖15是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對pyriminobac所觀察到的敏感性的特征圖。
圖16是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl)所觀察到的敏感性的特征圖。
圖17是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對乙基吡磺隆(pyrazosulfuron-ethyl)所觀察到的敏感性的特征圖。
圖18是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)所觀察到的敏感性的特征圖。
圖19是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對咪唑喹啉酸所觀察到的敏感性的特征圖。
圖20是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制ALS對咪唑煙酸(imazapyr)所觀察到的敏感性的特征圖。
圖21是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制野生型ALS、純化野生型GST-ALS和野生型無GST ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特征圖。
圖22是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制突變型ALS和純化突變型GST-ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特征圖。
圖23是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制突變型ALS和純化突變型GST-ALS對氯磺隆所觀察到的敏感性的特征圖。
圖24是顯示實(shí)施例4中獲得的粗制突變型ALS和純化突變型GST-ALS對咪唑喹啉酸所觀察到的敏感性的特征圖。
圖25顯示產(chǎn)生僅具有W548L突變的ALS基因的構(gòu)思。
圖26是圖25的續(xù)圖，顯示產(chǎn)生僅具有W548L突變的ALS基因的構(gòu)思。
圖27是顯示實(shí)施例6(2)中獲得的粗制ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特征圖。
圖28是顯示實(shí)施例6(2)中獲得的粗制ALS對氯磺隆所觀察到的敏感性的特征圖。
圖29是顯示實(shí)施例6(2)中獲得的粗制ALS對咪唑喹啉酸所觀察到的敏感性的特征圖。
圖30顯示構(gòu)建實(shí)施例7中構(gòu)建的雙元載體的構(gòu)思。
圖31是一張電泳照片，藉此證實(shí)在從大腸桿菌(E.coli)(JM109)的單個(gè)菌落中分離的質(zhì)粒中有所述ALS基因插入片段，其中第1泳道表λHind III/100bp DNA標(biāo)記，第2泳道表示來源于已經(jīng)用保留突變型ALS基因的pMLH7133轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的質(zhì)粒，第3泳道表示來源于已經(jīng)用保留野生型ALS基因的pMLH7133轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的質(zhì)粒，第4泳道表示保留GUS基因的pMLH7133(對照組)，箭頭指示插入DNA。
圖32是一張電泳照片，顯示用質(zhì)粒DNA作為模板的PCR結(jié)果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA標(biāo)記，第2泳道和第5泳道表示保留野生型ALS基因的pBI 121質(zhì)粒(對照組)，第3泳道和第6泳道表示被認(rèn)為保留突變型ALS基因的pMLH7133，第4泳道和第7泳道表示被認(rèn)為保留野生型ALS基因的pMLH7133，箭頭指示PCR產(chǎn)物。
圖33是一張電泳照片，顯示證明ALS基因插入方向的結(jié)果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA標(biāo)記，第2泳道表示保留突變型ALS基因的pMLH7133，第3泳道表示保留野生型ALS基因的pMLH7133，第4泳道表示保留GUS基因的pMLH7133(對照組)，箭頭指示PCR產(chǎn)物。
圖34是一幅流程圖，說明用土壤桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化水稻植株(Nippon-bare)的方法。
圖35是一張照片，顯示由愈傷組織正進(jìn)行再分化的水稻植株(Nippon-bare)。
圖36是顯示用突變型ALS基因轉(zhuǎn)化的水稻植株(Nippon-bare)愈傷組織的雙草醚敏感性的特征圖。
圖37是顯示野生型水稻植株(Nippon-bare)愈傷組織的雙草醚敏感性的特征圖。
圖38是一張電泳照片，顯示使用從轉(zhuǎn)化愈傷組織制備的基因組DNA進(jìn)行的PCR結(jié)果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA標(biāo)記，第2-7泳道表示使用來源于不同愈傷組織的基因組DNA的相應(yīng)PCR結(jié)果，箭頭指示PCR產(chǎn)物。
圖39是顯示使用從轉(zhuǎn)化愈傷組織制備的基因組DNA作為模板通過PCR產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果的特征圖，其中A表示使用有義引物(3-1-4)對氨基酸殘基548周圍進(jìn)行分析的結(jié)果，B表示使用反義引物(ALS-Rsp2)對氨基酸殘基548周圍進(jìn)行分析的結(jié)果，C表示使用有義引物(3-1-4)對氨基酸殘基627周圍進(jìn)行分析的結(jié)果，D表示使用反義引物(ALS-Rsp2)對氨基酸殘基627周圍進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖40是一張照片，顯示用突變型ALS基因轉(zhuǎn)化的水稻植株(Nippon-bare)的雙草醚敏感性的測量結(jié)果，其中A表示用突變型ALS基因轉(zhuǎn)化的水稻植株，而B表示用野生型ALS基因轉(zhuǎn)化的水稻植株。
發(fā)明詳述將給出對本發(fā)明更加詳細(xì)的解釋。
本發(fā)明的乙酰乳酸合酶蛋白(下文稱為“突變型ALS蛋白”)可以通過使在水稻植株中表達(dá)的野生型ALS蛋白中的某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變而獲得。本發(fā)明突變型ALS蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO1表示。編碼本發(fā)明ALS蛋白的基因的核苷酸序列以SEQ ID NO2表示。
所述突變型ALS蛋白通過色氨酸548被亮氨酸取代、絲氨酸627被異亮氨酸取代而從野生型ALS蛋白衍生。圖1顯示突變型ALS蛋白的氨基酸序列和野生型ALS蛋白的氨基酸序列的比較結(jié)果。在圖1中，第1行的氨基酸序列表示突變型ALS蛋白，而第2行的氨基酸序列表示野生型ALS蛋白。
與編碼野生型ALS蛋白的基因相比，編碼突變型ALS蛋白的基因(SEQ ID NO2)含有取代，即編碼色氨酸548的密碼子被編碼亮氨酸的密碼子取代以及編碼絲氨酸627的密碼子被編碼異亮氨酸的密碼子取代。圖2顯示編碼突變型ALS蛋白的基因的核苷酸序列和編碼野生型ALS蛋白的基因的核苷酸序列的比較結(jié)果。在圖2中，第1行的核苷酸序列表示突變型ALS蛋白，而第2行的核苷酸序列表示野生型ALS蛋白。
可以通過將如上所述的突變引入在日本型水稻變種Kinmaze基因組DNA中存在的編碼野生型ALS蛋白的基因中，獲得編碼突變型ALS蛋白的基因。為了引入突變，可以使用已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，可以使用定點(diǎn)誘變?？梢圆捎蒙虡I(yè)試劑盒例如Mutan-K(Takara Shuzo)、Gene Editor(Promega)或Exsite(Stratagene)進(jìn)行定點(diǎn)誘變。
另外，在PC除草劑存在下通過培養(yǎng)對PC除草劑敏感的野生型培養(yǎng)細(xì)胞，然后選擇出現(xiàn)并顯示對所述PC除草劑有抗性的突變培養(yǎng)細(xì)胞，可以獲得編碼突變型ALS蛋白的基因。
首先，從對PC除草劑有抗性的突變培養(yǎng)細(xì)胞制備mRNA，合成cDNA，然后產(chǎn)生λgt 11噬菌體的cDNA文庫(該文庫被認(rèn)為具有抗性特性雜合性)。然后，使用含有編碼野生型ALS蛋白的基因的一部分的核酸探針[EST(Expression Sequence Tag(已表達(dá)序列標(biāo)志)，Genband，DDBJ和EMBL登記號C72411)，得自日本型水稻變種Nippon-bare]，對所述文庫進(jìn)行篩選。接著，將所得的陽性克隆的插入DNA亞克隆到pBluescript II SK+中，以測定核苷酸序列。選擇具有編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列的插入DNA的克隆，使得能夠獲得編碼突變型ALS蛋白的基因。另外，將包含已摻入了編碼突變型ALS蛋白的基因的pBluescript II SK+的質(zhì)粒根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2000年11月2日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(Patent and Bio-Resource Center，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(Chuo-6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，JAPAN)，作為pBluescript II SK+中的突變型ALS cDNA保藏(FERM BP-7348)。
與野生型ALS蛋白相比，所述突變型ALS蛋白不僅對PC除草劑具有良好的抗性，而且對磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑也具有良好的抗性。特別是，所述突變型ALS蛋白對PC除草劑具有高水平的抗性。這可以通過將編碼突變型ALS蛋白的基因摻入到例如大腸桿菌的表達(dá)載體中，然后檢查用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌對所述除草劑的敏感性來確定。
PC除草劑的實(shí)例包括由以下化學(xué)式1表示的雙草醚、嘧草硫醚和pyriminobac。
雙草醚 嘧草硫醚 pyriminobac
磺脲除草劑的實(shí)例包括由以下化學(xué)式2表示的氯磺隆、芐嘧磺隆、乙基吡磺隆和唑吡嘧磺隆。
氯磺隆芐嘧磺隆 乙基吡磺隆唑吡嘧磺隆咪唑啉酮除草劑的實(shí)例包括由以下化學(xué)式3表示的咪唑喹啉酸和咪唑煙酸。
咪唑喹啉酸 咪唑煙酸用編碼突變型ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化靶植物，可以給所述植物賦予對PC除草劑的抗性?？梢杂靡阎臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來轉(zhuǎn)化植物。例如，可以用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)將外源基因?qū)氚兄参锛?xì)胞中。
更具體地講，將編碼突變型ALS蛋白的基因插入到含有土壤桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA序列的雙元載體中。將Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等中。然后，將由例如大腸桿菌復(fù)制的含有編碼突變型ALS蛋白的基因的雙元載體轉(zhuǎn)化到含有輔助質(zhì)粒的土壤桿菌中。用所述土壤桿菌感染靶植物，然后鑒定轉(zhuǎn)化植物。當(dāng)經(jīng)鑒定的轉(zhuǎn)化植物是培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，則可以用已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將所述植物細(xì)胞再生為完整的植株。
為了用編碼突變型ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化靶植物，可以用已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)直接導(dǎo)入所述基因。用含有編碼突變型ALS蛋白的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的方法的實(shí)例包括聚乙二醇法、電穿孔法和粒子槍法(particlegun method)。
可以將編碼突變型ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化到任何類型的植物例如單子葉植物和雙子葉植物中。用編碼突變型ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化的靶作物的實(shí)例包括水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、棉花、油菜、甜菜和煙草。另外，草坪草、樹等也可以通過導(dǎo)入編碼突變型ALS蛋白的基因而被轉(zhuǎn)化。
在任一上述情況下，用編碼突變型ALS蛋白的基因轉(zhuǎn)化植物可以給所述植物賦予對PC除草劑、磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑的抗性。
此外，編碼突變型ALS蛋白的基因也可在植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中作為選擇標(biāo)記使用。例如為了用目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化植物，可以將含有編碼突變型ALS蛋白的基因和目標(biāo)基因的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，然后在PC除草劑存在下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。因此，在PC除草劑存在下存活下來的植物細(xì)胞指示其含有其中導(dǎo)入的編碼突變型ALS蛋白的基因和目標(biāo)基因。此外，目標(biāo)基因和編碼突變型ALS蛋白的基因是否摻入到植物細(xì)胞染色體中，可以先通過觀察植物的表型，然后通過基因組DNA雜交或PCR檢查基因組上的這些基因存在與否而得到證實(shí)。
實(shí)施例現(xiàn)在，通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1抗PC除草劑的水稻(Kinmaze)培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)生除去水稻種子(變種；Kinmaze，學(xué)名Oryza sativa var.Kinmaze)的谷殼。將種子浸泡在70％乙醇中達(dá)5分鐘，然后浸泡在約5％安替佛民中達(dá)20分鐘，接著用無菌蒸餾水洗滌數(shù)次。然后，將種子在具有表1
所示組成的培養(yǎng)基上靜止培養(yǎng)。
表1
在以上培養(yǎng)基組成中，2，4-D是合成植物生長素。為了制備所述培養(yǎng)基，首先，將具有以上組成的培養(yǎng)基置于1L號燒杯中，然后向燒杯中加入蒸餾水至1000ml。接著，將溶液調(diào)至pH 5.7，補(bǔ)充3g脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)。通過用微波爐加熱使Gelrite充分溶解，然后用移液管向培養(yǎng)瓶中每次加入30ml混合物。隨后，用三層鋁箔封上培養(yǎng)瓶，然后在高壓滅菌鍋中于121℃15-20分鐘加熱滅菌。最后，讓溶液冷卻至室溫，從而制備供靜止培養(yǎng)上述種子用的培養(yǎng)基。
接著，從在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織中取出胚乳部分，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。然后，將所得的愈傷組織的一部分傳代培養(yǎng)，也就是說，每兩周一次在補(bǔ)充1μM雙草醚(一種PC除草劑)的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成與表1中所示的組成相同，但不補(bǔ)充Gelrite)中連續(xù)培養(yǎng)。2-6周后，培養(yǎng)細(xì)胞開始凋亡。約2個(gè)月后，從其中大多數(shù)已經(jīng)死亡和變成褐色的培養(yǎng)細(xì)胞群體中獲得認(rèn)為正在進(jìn)行細(xì)胞分裂的多個(gè)不變色的細(xì)胞團(tuán)。分離這些細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得在2μM雙草醚存在下可以增殖的多個(gè)細(xì)胞系。
隨后，將所得的多個(gè)細(xì)胞系在雙草醚濃度依次升高的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果，獲得在100μM雙草醚存在下可以增殖的細(xì)胞系。將雙草醚抗性培養(yǎng)細(xì)胞(下文稱為抗性突變體)在補(bǔ)充100μM雙草醚的MS-2，4-D固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。取出一部分傳代培養(yǎng)抗性突變體作為樣品，將其加入到未補(bǔ)充雙草醚的MS-2，4-D液體培養(yǎng)基中，然后以8-10天的循環(huán)進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。
將約1.5g(濕重)抗性突變體移植到補(bǔ)充50ml MS-2，4-D液體培養(yǎng)基和適當(dāng)濃度的雙草醚的200ml錐形瓶中，然后在大約27℃下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。定期測量愈傷組織的濕重。根據(jù)移植抗性突變體的濕重確定增加的相對量。另外，用不同的雙草醚濃度進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3顯示雙草醚濃度變化和抗性突變體第8天相對重量之間的關(guān)系。作為對照，用野生型(Kinmaze)進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)。圖4顯示雙草醚濃度和第8天相對重量之間關(guān)系的測量結(jié)果。
如圖4所示，野生型的生長在補(bǔ)充1nM雙草醚的組中不受抑制，但在補(bǔ)充10nM或10nM以上雙草醚的組中受到抑制。然而，如圖3所示，抗性突變體的生長甚至在補(bǔ)充10μM雙草醚的組中也幾乎不受影響。
如上所述測定野生型和抗性突變體的生長率，只是用氯磺隆來代替雙草醚。圖5顯示氯磺隆濃度變化和野生型第9天相對重量之間的關(guān)系。圖6顯示氯磺隆濃度變化和抗性突變體第9天相對重量之間的關(guān)系。
如圖5所示，野生型的生長在加入1nM氯磺隆時(shí)受到抑制，表明野生型對氯磺隆比對雙草醚的敏感性更高。然而，如圖6所示，抗性突變體的生長在加入1μM氯磺隆時(shí)受到強(qiáng)抑制。對雙草醚和氯磺隆的敏感性在野生型和抗性突變體兩者間幾乎沒有變化，甚至經(jīng)歷較長的培養(yǎng)時(shí)間也是如此。野生型和抗性突變體的生長率幾乎相同。
這些結(jié)果表明，所述抗性突變體具有對雙草醚的特異性抗性。而且，與野生型相比，表明所述抗性突變體已改進(jìn)對氯磺隆的抗性。
實(shí)施例2從抗性突變體中部分純化的ALS酶的除草劑敏感性在本實(shí)施例中，從實(shí)施例1中獲得的抗性突變體中部分純化突變型ALS蛋白，然后檢查所得的突變型ALS蛋白的除草劑敏感性。如下部分純化突變型ALS蛋白。
首先，通過液體培養(yǎng)方法(不補(bǔ)充雙草醚)制備200g或200g以上的抗性突變體，培養(yǎng)基的組成與表1中所示的組成相同，但是不含Gelrite。然后，使用Hiscotron，在體積3倍于組織體積的緩沖液1[100mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)，含有20％(v/v)甘油、0.5mM焦磷酸硫胺素(TPP)、10μM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、0.5mM MgCl2和體積為組織體積的1/10的聚乙烯聚吡咯烷酮，將約150g抗性突變體勻漿。勻漿液通過尼龍網(wǎng)過濾，然后以15,000×g離心20分鐘。向經(jīng)離心的上清液中加入硫酸銨至50％飽和，然后讓其在冰中靜置約1小時(shí)。將混合物再次以15,000×g離心20分鐘，然后將沉淀部分溶于約30ml緩沖液2[10mM Tris鹽酸緩沖液(pH 7.5)，含有20％(v/v)甘油、0.5mMTPP和0.5mM MgCl2]中。將混合物再次以15,000×g離心20分鐘，然后將上清液部分上樣至Sephadex G-25(Amersham Pharmacia Biotec)上。收集通過該柱的約40ml流分作為粗制酶溶液。
接著，依照Bio-Rad Protein Assay手冊的Bradford方法，測定所述粗制酶溶液的蛋白質(zhì)濃度。然后將所述粗制酶溶液通過Whatman濾膜(Whatman)過濾，然后使用FPLC裝置(Amersham Pharmacia Biotec)，將所述含適量蛋白的粗制酶溶液(10-15ml)上樣至三個(gè)垂直連接的HiTrap Q柱(Amersham Pharmacia Biotec)上。用HiTrap Q吸附蛋白質(zhì)組分后，用體積3-5倍于床體積的緩沖液-2洗出非吸附流分。然后，用體積10倍于床體積的洗脫液(150ml)洗脫吸附蛋白質(zhì)組分。在此，通過將線性濃度梯度(0-0.4M)的KCl溶于緩沖液-2中，制備洗脫液。含有被洗脫的蛋白質(zhì)組分的洗出物以各5ml分配到多個(gè)分裝用試管中。此外，為了穩(wěn)定在洗脫的蛋白質(zhì)組分中所含有的ALS酶，向各個(gè)分裝用試管中預(yù)先加入了0.5ml含20mM丙酮酸鈉的緩沖液-2。
如下測定分配到各個(gè)分裝用試管的洗脫流分中所含有的突變型ALS蛋白所產(chǎn)生的ALS活性。通過將待測量的洗脫流分與包含20mM丙酮酸鈉、0.5mM TPP、0.5mM MgCl2、10μM FAD和20mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)的溶液混合，制備測定反應(yīng)中所用的反應(yīng)溶液。使用1ml該反應(yīng)溶液。在加入待測量的洗脫流分后，讓測定反應(yīng)于30℃進(jìn)行40-60分鐘。然后，通過加入0.1ml 6N硫酸(或0.25N氫氧化鈉)終止反應(yīng)。
終止反應(yīng)后，將反應(yīng)溶液于60℃保溫10分鐘，從而使反應(yīng)溶液中所含有的乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻。
然后，為了定量測定反應(yīng)溶液中所含有的乙偶姻，向反應(yīng)溶液中加入溶于2.5N氫氧化鈉中的1ml 0.5％(w/v)肌酸和1ml 5％(w/v)α-萘酚，然后于37℃保溫10分鐘。然后通過對反應(yīng)溶液吸光度(525 nm)的比色，對乙偶姻定量，從而評價(jià)ALS活性。另外，由于反應(yīng)溶液含有少量的丙酮酸鈉，因此用反應(yīng)時(shí)間0作為對照。
結(jié)果，OD525nm的吸光度每0.2ml反應(yīng)溶液高達(dá)約7。然而，當(dāng)上述測定反應(yīng)用氫氧化鈉終止，并且檢查由于除ALS活性以外的活性引起的乙偶姻產(chǎn)生活性時(shí)，接近80％的表觀ALS活性來自不是由于突變型ALS蛋白的活性所致的直接乙偶姻產(chǎn)生活性。因此，采用陰離子交換樹脂，通過FPLC，將突變型ALS蛋白和其它蛋白的乙偶姻產(chǎn)生活性分離開來。結(jié)果，如圖7所示，檢測到兩個(gè)活性峰。
為了確定這兩個(gè)活性峰的哪一個(gè)峰對應(yīng)于突變型ALS蛋白，檢查這兩個(gè)峰的乙偶姻產(chǎn)生活性。因而發(fā)現(xiàn)較早出現(xiàn)的峰所示流分對應(yīng)于突變型ALS蛋白。
應(yīng)用含有突變型ALS蛋白的酶溶液，檢查突變型ALS蛋白對雙草醚、氯磺隆和咪唑喹啉酸的敏感性。通過以與在上述測定反應(yīng)中相同的方式測定ALS活性，只是在加入酶溶液之前加入一定濃度的除草劑，評價(jià)對這些除草劑中每種的敏感性。為了進(jìn)行比較，以同樣的方式分離純化野生型ALS蛋白，然后用于實(shí)驗(yàn)。另外，將雙草醚制成水溶液，而將氯磺隆和咪唑喹啉酸制成丙酮溶液。反應(yīng)混合物中丙酮的終濃度為1％。
圖8顯示ALS活性抑制率和雙草醚濃度之間的關(guān)系。圖9顯示ALS活性抑制率和氯磺隆濃度之間的關(guān)系。圖10顯示ALS活性抑制率和咪唑喹啉酸濃度之間的關(guān)系。在圖8-10中，連接白色方塊的折線表示野生型ALS蛋白，連接黑色方塊的折線表示突變型ALS蛋白。
依照概率單位分析，計(jì)算抑制ALS活性的50％的除草劑濃度(I50)，從而計(jì)算突變型ALS蛋白的I50與野生型ALS蛋白的I50之比。
表2顯示該結(jié)果。
a)50％抑制的濃度b)根據(jù)表1中抑制活性計(jì)算I50(抗性突變體)/I50(野生型)如圖8-10和表2中所示，當(dāng)與野生型ALS蛋白相比時(shí)，突變型ALS蛋白甚至在所述除草劑存在下都顯示相對高的ALS活性。尤其是，在突變型ALS蛋白和野生型ALS蛋白之間的最顯著性差異是對雙草醚除草劑的敏感性。也就是說，突變型ALS蛋白具有對雙草醚的良好抗性。
實(shí)施例3突變型ALS基因的克隆如下制備克隆編碼來自抗性突變體的突變型ALS蛋白的基因(突變型ALS基因)所用的探針。在該實(shí)施例中用作探針的部分cDNA來源于顯示與玉米ALS基因有高度同源性的水稻(Nippon-bare)。
(1)來源于顯示與玉米ALS基因有高度同源性的水稻(Nippon-bare)的部分cDNA核苷酸序列的測定作為由the Society for Techno-inmovation of Agriculture，F(xiàn)orestry andFisheries和National Institute of Agrobiological Sciences進(jìn)行的the IneGenome Project(Ine基因組計(jì)劃)的一部分，已經(jīng)測定了水稻(Nippon-bare)cDNA的部分核苷酸序列，并且已經(jīng)建立cDNA的部分核苷酸序列數(shù)據(jù)庫。在該數(shù)據(jù)庫中所含有的已知約350bp的核苷酸序列的cDNA克隆(登記號C72411)顯示與玉米ALS基因有高度同源性。已對玉米ALS基因進(jìn)行了全測序。
該cDNA克隆(登記號C72411)得自National Institute ofAgrobiological Sciences，如下測定核苷酸序列。在此，所述cDNA克隆包含插入到pBluescript II SK+中的ALS同系物基因，并且在大腸桿菌(E.coli)中能夠自主復(fù)制。
首先，將保留所述ALS同系物的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將從平板中獲得的白色菌落在液體中培養(yǎng)，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞中提取質(zhì)粒。由于已經(jīng)將所述插入DNA插入在SalI和NotI(質(zhì)粒載體中多克隆位點(diǎn)的限制性酶)之間，因此用這兩種酶消化載體。通過瓊脂糖電泳證實(shí)插入片段。然后，使用例如RNA酶A、PEG和LiCl，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化所得的保留所述ALS同系物的質(zhì)粒載體，然后采用引物和ABI BigDyeTerminator Cycle Sequencing Kit進(jìn)行測序反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件采用生產(chǎn)商的方案。此中所用的引物是M13引物和根據(jù)已測定的核苷酸序列設(shè)計(jì)的合成引物。通過乙醇沉淀純化所得的PCR產(chǎn)物，然后用ABI PRISM 310測序儀測定其核苷酸序列。
已知保留所述ALS同系物的質(zhì)粒載體含有長度為1.6kb的插入DNA。將所得的保留所述ALS同系物的質(zhì)粒載體用限制性酶SalI和NotI消化，然后進(jìn)行電泳。因此，檢測出一條對應(yīng)于pBluescript II SK+的約3kbp條帶和一條對應(yīng)于所述插入DNA片段的約1.6kbp條帶(未顯示)。測定所述插入DNA部分的完整的核苷酸序列，搜索其與玉米核苷酸序列的同源性。如圖11所示，發(fā)現(xiàn)有84.7％同源性。由于測定ALS同系物是所述Nippon-bare變種ALS基因的部分cDNA，因此，將用SalI和NotI消化的所述插入DNA用作探針。此外，在圖11中，第一行是所述Nippon-bare變種ALS基因的部分cDNA的核苷酸序列；第二行是玉米ALS基因的部分cDNA的核苷酸序列。
(2)從抗性突變體制備mRNA首先，將用液氮冷凍的抗性突變體用研缽和研棒壓碎，然后用攪拌機(jī)充分搗碎30秒。將搗碎的粉末懸浮于提取緩沖液[(100mM Tris-HCl pH9.0、100mM NaCl、1wt％SDS、5mM EDTA)∶(β-巰基乙醇)∶(Tris飽和的苯酚)＝15∶3∶20]，然后充分?jǐn)嚢琛⒃撊芤阂?2,000×g離心15分鐘，然后收集上清液。向上清液中加入200ml PCI[(Tris飽和的苯酚)∶(氯仿)∶(異戊醇)＝25∶24∶1]，于4℃振搖10分鐘，以12,000×g離心15分鐘，然后收集上清液。重復(fù)該程序兩次。加入1/20體積的5M NaCl和2.2倍體積的乙醇至所得的上清液中，然后讓混合物于-80℃靜置30分鐘。通過以12,000×g離心5分鐘收集沉淀。將沉淀用70％乙醇洗滌，干燥，然后溶于10mM β-巰基乙醇溶液中。接著，將溶液以27,000×g離心10分鐘，以除去不溶性部分。向溶液中加入1/4體積的10M LiCl，然后讓其在冰上靜置1小時(shí)。此外，將溶液以27,000×g離心10分鐘，以收集沉淀，溶于4ml H2O中，然后測量260nm的吸光度，以測定RNA的濃度。加入1/20體積的5M NaCl和2.2倍體積的乙醇至溶液中，然后讓其于-80℃靜置30分鐘。隨后，將溶液以27,000×g離心10分鐘，以收集沉淀，然后用70％乙醇洗滌，然后干燥。將所得的產(chǎn)物溶于適量的H2O中，以獲得總RNA溶液。在此，于4℃進(jìn)行離心。
用以下方法從總RNA中分離純化mRNA。加入相當(dāng)于所提取的總RNA溶液體積的2×結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl pH 7.5，10mMEDTA，1M NaCl)至所提取的總RNA溶液中。用1×結(jié)合緩沖液洗滌填充0.1g寡聚dT纖維素(Amersham Pharmacia Biotec)的柱子，然后將總RNA溶液上樣至該柱上。用1×結(jié)合緩沖液洗滌該柱后，加入洗脫緩沖液(10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM EDTA)，以一次0.5ml收集洗出物。將通過該柱的流分上樣至另一寡dT纖維素(Amersham PharmaciaBiotec)柱上，以同樣的方式處理。根據(jù)每個(gè)流分的吸光度計(jì)算洗脫mRNA的濃度后，加入1/10體積的10M LiCl和2.5倍體積的乙醇至產(chǎn)物中，然后讓混合物于-80℃靜置30分鐘。接著，將混合物離心，將沉淀的級分干燥，溶于100μl H2O中。如此獲得的mRNA通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)行大小分級分離。
將分離純化的mRNA加到裝有由25％蔗糖溶液和5％蔗糖溶液給出的密度梯度的離心管中，然后使用甩平式轉(zhuǎn)子于4℃以27,000rpm超離心15小時(shí)。離心后，以密度梯度順序以0.5ml收集各級分。測量各級分的吸光度，計(jì)算收集的mRNA的濃度，通過使用ECL試劑盒(ECL直接核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)，Amersham Pharmacia Biotec)證實(shí)ALSmRNA的存在。使用以上(1)中制備的探針于42℃雜交16小時(shí)。雜交后，用試劑盒提供的原始洗滌緩沖液于42℃洗滌兩次，每次5分鐘，然后用2×SSC溶液于42℃洗滌一次，洗滌5分鐘。用透明塑料膜包裹經(jīng)洗滌的膜，將其浸入試劑盒提供的所附發(fā)光試劑中，然后對X光膠片曝光。
從抗性突變體提取約35mg總RNA，并且通過上述方法可以提取約4mg mRNA。此外，在蔗糖密度梯度離心中，發(fā)現(xiàn)預(yù)期陽性的級分的雜交陽性點(diǎn)。
當(dāng)使用野生型時(shí)，除提取約7mg mRNA外，還提取了約95mg總RNA。當(dāng)從野生型中提取mRNA時(shí)，使用上述方法，只是用野生型來代替抗性突變體。
(3)來源于抗性突變體的cDNA文庫的構(gòu)建采用2μg以上(2)中純化的mRNA和cDNA合成試劑盒(AmershamPharmacia Biotec)，合成cDNA，致使構(gòu)建一個(gè)來源于抗性突變體的cDNA文庫。
首先，用試劑盒提供的RT酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；用試劑盒提供的T4 DNA聚合酶進(jìn)行后續(xù)互補(bǔ)鏈延伸反應(yīng)。在互補(bǔ)鏈延伸反應(yīng)時(shí)，加入32p-dCTP以計(jì)算cDNA合成的收率。在加入接頭后，通過體外包裝方法將合成cDNA摻入到λ噬菌體中。
加入到cDNA中的接頭是Eco Ri-Not I-Bam HI接頭(TakaraShuzo)。加入50倍于cDNA摩爾濃度的接頭至含有cDNA的溶液中。然后，加入T4 DNA連接酶(Pharmacia)至混合物中，然后于4℃進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。采用AsahiPak GS 710柱(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.)，將反應(yīng)溶液上樣至HPLC，然后用波長260nm的紫外線監(jiān)測洗出物。洗出物分別以0.5ml分級分離為25個(gè)流分。用Cerenkov計(jì)數(shù)器測定每個(gè)流分，收集3-4個(gè)高計(jì)數(shù)流分。用T4多核苷酸激酶(TakaraShuzo)將所述流分中所含有的接頭5’末端磷酸化，然后加入λgt 11 EcoRI臂，進(jìn)行連接反應(yīng)。加入GigaPack Gold III(Stratagene)至溶液中，然后在室溫下進(jìn)行連接反應(yīng)達(dá)2小時(shí)。反應(yīng)后，加入200μl SM緩沖液和8μl氯仿至反應(yīng)溶液中，從而制備噬菌體溶液。將該噬菌體溶液稀釋10倍。用1μl經(jīng)稀釋的溶液感染大腸桿菌(Y-1088)，向其中加入0.7％上層瓊脂，然后將該溶液接種到LB平板上。對4-8小時(shí)后在平板上出現(xiàn)的噬斑數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而測定滴度。
約74ng來源于抗性突變體的cDNA的合成通過DE 81紙和Cerenkov計(jì)數(shù)的結(jié)果得以證實(shí)。載體與加入其中的接頭連接后Cerenkov計(jì)數(shù)的結(jié)果揭示出，獲得抗性突變體的約22ng含有其中插入的插入片段的λDNA。將λDNA包裝成噬菌體，從而制備來源于抗性突變體細(xì)胞的cDNA文庫。該文庫溶液的滴度為16,600pfu/μl。
當(dāng)按照上述方法用從野生型中提取的mRNA來制備cDNA文庫時(shí)，合成約38ng來源于野生型的cDNA。此外，獲得野生型的約5ng含有其中插入的插入片段的λDNA。此外，來源于野生型的cDNA文庫溶液的滴度為18,160pfu/μl。
(4)含有所述ALS基因的cDNA的篩選為了在平板上形成約20,000個(gè)噬斑，將以上(3)中制備的文庫溶液稀釋，然后將平板上來源于野生型的噬菌體和來源于抗性突變體的噬菌體分別獨(dú)立地接種到10個(gè)平板上。將噬斑轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜(Schleicher & Schnell，PROTORAN BA85，孔徑0.45μm)上。將該硝化纖維素膜浸入變性溶液(0.5M NaCl，1.5M NaCl)，然后浸入中和溶液(0.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA)約20秒。用濾紙除去硝化纖維素膜中過量的水，然后將硝化纖維素膜于80℃烘烤2小時(shí)。另外，當(dāng)用Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotec)來代替硝化纖維素膜時(shí)可省去烘烤步驟，并且用0.4M NaOH進(jìn)行固定化達(dá)20分鐘。
用兩種不同的方法一RI和非RI，將以上(1)中制備的插入DNA標(biāo)記，然后用作探針DNA。用RI標(biāo)記和雜交通過以下方法來進(jìn)行。首先，將約200-500ng探針DNA熱變性，然后用BcabEST DNA標(biāo)記試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd)標(biāo)記。該標(biāo)記反應(yīng)后，加入試劑盒提供的緩沖液、隨機(jī)引物和32p-dCTP。隨后，加入BcaBEST，然后于65℃保溫30分鐘。隨后，加入EDTA以終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液上樣至硝化纖維素膜上，致使8片膜都含有約100ng探針。于42℃輕輕搖動(dòng)下雜交過夜。雜交后，用2×SSC、0.1％SDS溶液洗滌膜三次，然后對BAS 2000成像分析儀(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)的顯象板曝光約1小時(shí)。曝光后，用所述成像分析儀檢測陽性克隆。
用非RJ標(biāo)記通過以下方法來進(jìn)行。約200-500ng探針DNA熱變性后，加入ECL直接DNA/RNA標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotec)中提供的DNA標(biāo)記試劑(過氧化物酶)和戊二醛，然后于37℃保溫。在這種情況下，將標(biāo)記探針DNA上樣至硝化纖維素膜上，致使8片膜都含有約100ng標(biāo)記探針DNA。于42℃輕輕搖動(dòng)下雜交過夜。雜交后，用原始洗滌緩沖液在室溫下洗滌膜三次，每次10分鐘，然后用2×SSC在室溫下洗滌膜一次達(dá)10分鐘。將膜浸入ECL試劑盒提供的發(fā)光溶液中，然后對X光膠片曝光30分鐘至3小時(shí)。
用無菌牙簽將通過雜交獲得的陽性噬菌體(初次篩選)與上層瓊脂一起刮下來，然后懸浮于200μl SM緩沖液中，從而獲得噬菌體溶液。將每個(gè)克隆的噬菌體溶液適當(dāng)?shù)叵♂?，感染大腸桿菌菌株Y-1088，然后接種到LB平板上。用這些新制備的平板，同樣進(jìn)行雜交(第二次篩選)。將陽性噬斑懸浮于200μl SM緩沖液中，從而獲得單個(gè)噬菌體。如果通過第二次篩選沒有分離到單個(gè)噬菌體，則進(jìn)行再次稀釋，然后接種到LB平板上。隨后，進(jìn)行雜交(第三次篩選)，致使獲得單個(gè)噬菌體。
接著，通過以下方法從單個(gè)噬菌體制備λDNA。將用竹簽和牙簽從陽性克隆噬斑收集的λ噬菌體接種到200μl含有5μl新宿主大腸桿菌(Y1088)懸浮液的2×YT培養(yǎng)基(含有10mM MgCl2和0.2％麥芽糖)中。讓產(chǎn)物于42℃靜置溫育過夜。然后，將培養(yǎng)基再次接種到1ml含有25μl宿主大腸桿菌(Y1088)懸浮液的2×YT培養(yǎng)基(含有10mMMgCl2和0.2％麥芽糖)中，然后振蕩培養(yǎng)過夜(這些步驟構(gòu)成預(yù)培養(yǎng)過程)。將預(yù)培養(yǎng)溶液(10-50μl)接種到12ml含有10mM MgCl2和0.5ml大腸桿菌Y1088懸浮液的2×YT培養(yǎng)基中。然后，于42℃相對強(qiáng)振蕩下溫育過夜，直至裂解后濁度增加。培養(yǎng)后，加入50μl氯仿和1.2ml5M NaCl，然后于42℃振蕩下保溫10分鐘。將產(chǎn)物以27,000×g離心10分鐘，然后上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入5ml 50％PEG至上清液中，然后在冰上保溫1小時(shí)或1小時(shí)以上。將產(chǎn)物以27,000×g離心10分鐘，然后棄去上清液。接著，再次以27,000×g離心，然后棄去液體部分。將沉淀部分懸浮于300μl含有4μgDNA酶I、20μg RNA酶A和10mM MgCl2的30mM Tris鹽酸緩沖液(pH 7.5)中。將懸浮液轉(zhuǎn)移至1.5ml試管中。將懸浮液于37℃保溫30分鐘后，加入7.5μl 20％SDS、3μl蛋白酶K(10mg/ml)和12μl 0.5M EDTA至懸浮液中，然后于55℃再保溫15分鐘。隨后，加入150μl苯酚至產(chǎn)物中，然后劇烈攪拌。然后用TOMY微量離心機(jī)MR-150(TOMY DIGITAL BIOLOGYCO.，LTD.)，將混合物以15,000rpm離心3分鐘，收集水層。加入800μl乙醚(向其中已加入蒸餾水，以除去過氧化物)至所收集的水層中。劇烈攪拌混合物，然后以15,000rpm離心10秒，棄去乙醚層。重復(fù)乙醚抽提步驟后，用氮?dú)獬ピ谒畬又袣埩舻囊颐?。加?0μl 5M NaCl和875μl乙醇至水層中，以便快速收集沉淀的λDNA。用約1ml 70％乙醇沖洗所收集的λDNA，然后減壓干燥約1分鐘，從而除去乙醇。將產(chǎn)物溶于20-50μl TE緩沖液(pH 8.0)中，從而制備λDNA溶液。
通過以下方法對所得的λDNA中的插入DNA進(jìn)行亞克隆和測序。將所得的λDNA溶液(1μl)用Not I消化，以便切下插入DNA。反應(yīng)溶液的組成(對于切割反應(yīng)而言)按照限制性酶所附的手冊。于37℃反應(yīng)約2小時(shí)后，通過用1％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)插入片段的大小。將含有插入DNA的λDNA(10-20μl)用Not I消化，以便切下插入DNA。用取樣用瓊脂糖凝膠分離插入DNA。從凝膠中切下相應(yīng)的條帶，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化插入DNA。將插入DNA在BAP處理(用來源于蝦的堿性磷酸酶去磷酸化)后與載體以1∶1的摩爾比混合，隨后用T4 DNA連接酶于16℃連接反應(yīng)2小時(shí)或2小時(shí)以上。在此，由于將用Not I切割的插入DNA用作材料，因此對用Not I切割的載體進(jìn)行BAP處理。連接后，將一部分溶液與感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)混合，然后讓其在冰上靜置30分鐘。接著，將混合物于42℃熱激30秒，然后讓其在冰上再靜置2分鐘。然后，加入SOC至混合物中，于37℃溫育1小時(shí)，接種到LB培養(yǎng)基平板上，在該平板上先前均勻加入100μl 2×YT(含有50μg/ml氨芐青霉素)、30μl 3％X-Gal和3μl 1M IPTG的混合物，然后于37℃培養(yǎng)10小時(shí)或10小時(shí)以上。將轉(zhuǎn)化白色菌落分別接種到2ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基或2×YT培養(yǎng)基上，然后于37℃培養(yǎng)過夜。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)溶液制備質(zhì)粒，并將其溶于H2O中。定量測定其DNA濃度，然后使質(zhì)粒經(jīng)過PCR反應(yīng)以供測序。用上述方法進(jìn)行PCR反應(yīng)和測序。
因此，通過上述實(shí)驗(yàn)獲得約2.2kb的非全長的所述ALS cDNA。由于在距該DNA 5’一側(cè)約250bp的位置存在一個(gè)Sma I位點(diǎn)，因此通過以下方法制備一種新探針。用宿主大腸桿菌JM109擴(kuò)增含有所述約2.2kbp的pBluescript II SK+，然后采自動(dòng)分離系統(tǒng)(KURABO PI-100)提取質(zhì)粒。用Sma I直接消化該質(zhì)粒。通過1％瓊脂糖電泳分離并純化所產(chǎn)生的約250bp片段，然后計(jì)算濃度，從而制備探針。使用該探針，再次通過使用RI的上述方法對文庫進(jìn)行篩選。從如此獲得的單個(gè)噬菌體制備λDNA，用Eco RI消化λDNA溶液(1μl)，然后通過電泳證實(shí)其大小，然后在硝化纖維素膜上固定化。電泳后，將凝膠浸入含有1.5MNaCl的0.5M NaOH溶液中，然后輕輕搖動(dòng)15分鐘。然后凝膠用水洗滌，浸入含有3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH 7.5)中，然后振搖下中和約15分鐘。將約5層厚的工業(yè)用濾紙疊在一起以制成底座。將該基底座置于覆蓋在不銹鋼片上的20×SSC中。隨后，將經(jīng)中和的凝膠、膜(已經(jīng)切成一定大小，先浸入蒸餾水達(dá)10分鐘中，然后再浸入20×SSC中達(dá)10分鐘)和兩疊濾紙按順序放在底座上，在其上再放置厚度為3-4cm紙巾。先將玻璃板，再將一個(gè)輕的重物放在產(chǎn)物上，然后轉(zhuǎn)印約5分鐘。在凝膠和膜之間證實(shí)沒有截留的氣泡后，進(jìn)行轉(zhuǎn)印約10分鐘。轉(zhuǎn)印后，將膜用透射儀進(jìn)行UV處理，然后于80℃烘烤約15-30分鐘。烘烤后，與用32p標(biāo)記的以上250bp探針DNA進(jìn)行雜交(雜交緩沖液組成5×SSPE、0.5％SDS、5×Denharlts、鮭精(solum sperm)DNA、50％甲酰胺)。將雜交帶的放射性轉(zhuǎn)移至顯象板中，用BAS-2000分析結(jié)果。在雜交陽性的插入片段中，大量的制備顯示大小相對大的那些插入片段，然后將其亞克隆(FERM BP-7348)到已用Eco RI消化的pBluescriptII SK+中，然后通過上述方法用BAP處理。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(JM105)中。所得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備質(zhì)粒。因而可用上述方法測定核苷酸序列。
結(jié)果，可以獲得含有全長突變型ALS基因的cDNA。所述cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO2中。此外，可以從來源于野生型的cDNA文庫獲得一種類型的含有全長ALS基因的cDNA。圖1顯示突變型ALS基因和野生型ALS基因之間同源性比較的結(jié)果。
實(shí)施例4突變型ALS蛋白的表達(dá)將實(shí)施例3(4)中獲得的質(zhì)粒用Eco RI消化，切下含有野生型ALS基因的cDNA和含有突變型ALS基因的cDNA，然后將其分別摻入到pGEX表達(dá)載體中。含有野生型ALS基因的cDNA具有一個(gè)比起始密碼子長47個(gè)核苷酸的5’非翻譯區(qū)，并將其摻入到pGEX-2T的Eco RI位點(diǎn)中。此外，含有突變型ALS基因的cDNA含有一個(gè)比起始密碼子長31個(gè)核苷酸的5’非翻譯區(qū)，并將其摻入到pGEX-4T-3的Eco RI位點(diǎn)中。
將這些載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(JM105)中。將通過轉(zhuǎn)化獲得的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，然后根據(jù)限制性酶切模式和測序證實(shí)插入DNA的插入方向。對其中插入DNA的方向是按預(yù)期的克隆分別進(jìn)行選擇，然后在2ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于27℃振蕩培養(yǎng)。使用1ml該預(yù)培養(yǎng)溶液，在50ml或250ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，加入1mM IPTG，然后誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)達(dá)3-4小時(shí)。
表3顯示在加入IPTG后進(jìn)行培養(yǎng)3-4小時(shí)后測定ALS活性的結(jié)果。
表3
如表3所示，具有野生型ALS基因的大腸桿菌和具有突變型ALS基因的大腸桿菌均顯示其比活是不含質(zhì)粒的對照組的比活的約3-4倍。在加入IPTG后將轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)3-4小時(shí)，然后于-80℃貯存。用轉(zhuǎn)化大腸桿菌純化GST ALS融合蛋白。
通過以下方法從大腸桿菌分離和純化ALS。首先，將于-80℃貯存的轉(zhuǎn)化大腸桿菌沉淀懸浮于ALS提取緩沖液(含30％甘油和0.5mMMgCl2的磷酸鉀緩沖液(pH 7.5))中。具體地說，加入2.5ml緩沖液至從50ml培養(yǎng)溶液獲得的沉淀中。將懸浮液進(jìn)行超聲處理(Heat Systems-Ultrasonics，Sonicator W-225R，微芯片(micro chip)，輸出控制(outputcontrol)8，約1秒間隔，兩次(每次40秒))，并且以15000×g于4℃離心20分鐘，從而獲得作為粗制酶溶液的上清液。
通過以下方法從所述粗制酶溶液中純化GST ALS融合蛋白(下文稱為GST-ALS)。將從沉淀(得自250ml培養(yǎng)溶液)中制備的粗制酶溶液(12.5ml)上樣至谷胱甘肽sepharose 4B親和柱(Amersham PharmaciaBiotec，床體積，約1ml，該柱先前已用10ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4pH7.3平衡))上。然后用10ml 1×PBS洗滌該柱，然后吸附的GST-ALS用2ml 10mM谷胱甘肽溶液洗脫(4次)。測量各個(gè)流分的GST活性和ALS活性，然后收集具有高活性的流分。另外，由于當(dāng)使用ALS提取緩沖液時(shí)，上述柱的吸附率低，因此也進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)用1×PBS提取酶，讓其吸附至上述柱。按照上述方法進(jìn)行ALS活性的測量和蛋白質(zhì)的定量。通過使用1-氯-2，4-二硝基苯(第二個(gè)名稱簡稱為2，4-二氯硝基苯(CDNB))作為底物的方法進(jìn)行GST活性的測量。使用3ml反應(yīng)溶液和一種反應(yīng)組成(1mMCDNB，1mM谷胱甘肽(還原型)，酶溶液，100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5))。在加入酶溶液后，于30℃進(jìn)行增加的340nm吸光度的速率測定。以濃縮100倍的乙醇溶液制備CDNB，然后將其加入到反應(yīng)溶液中。
明顯檢測不吸附到上述親和柱上的活性(ALS活性和GST活性)。然而，在用第一次和第二次谷胱甘肽洗脫洗脫出的流分中檢測出吸附到親和柱的活性中的大部分。合并得自第一次和第二次洗脫中的那些流分，以制備純化GST-ALS。
測定用凝血酶蛋白酶(25單位)于4℃消化過夜的GST-ALS作為不含GST的ALS。表4顯示用粗制酶溶液和上述親和柱在色譜分離后以及在凝血酶蛋白酶處理后的ALS活性、蛋白量和比活。
表4
所制備的ALS酶含有來源于大腸桿菌的ALS活性。然而，如表5所示，由于來源于大腸桿菌的ALS活性由ALS同工酶I產(chǎn)生，因此它可以通過加入1mM纈氨酸幾乎完全被抑制。
表5
*該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次。
實(shí)施例5突變型ALS蛋白的除草劑敏感性用實(shí)施例4中獲得的粗制酶溶液，檢查突變型ALS蛋白的除草劑敏感性。以與實(shí)施例2中所述的方法相同的方法進(jìn)行除草劑敏感性試驗(yàn)。在所述除草劑敏感性試驗(yàn)中，用三種除草劑-雙草醚、嘧草硫醚和pyriminobac作為PC除草劑；用四種藥物-氯磺隆、芐嘧磺隆、乙基吡磺隆和唑吡嘧磺隆作為磺脲除草劑；而用兩種藥物-咪唑喹啉酸和咪唑煙酸作為咪唑啉酮除草劑。
在加入突變型ALS蛋白之前，向反應(yīng)溶液中加入含有一定濃度的這些除草劑的溶液(雙草醚和嘧草硫醚是水溶液，其它的為丙酮溶液)。丙酮的終濃度為1％。另外，由于得自在大腸桿菌中表達(dá)的水稻cDNA的ALS蛋白對纈氨酸不敏感(Kil等，J.Biochem.Mol.Biol.31 287-295，1998)，因此在其中來源于大腸桿菌的ALS活性為纈氨酸所抑制的條件下進(jìn)行除草劑敏感性試驗(yàn)。
圖12顯示當(dāng)使用雙草醚時(shí)所得的敏感性。圖13顯示當(dāng)使用氯磺隆時(shí)所得的敏感性。如圖12所示，野生型ALS活性為雙草醚所抑制，而突變型ALS活性根本不受抑制。如圖13所示，對于氯磺隆，與野生型ALS蛋白的活性相比，突變型ALS蛋白對一定濃度保持較高水平的其活性，然而，當(dāng)與雙草醚的情況相比時(shí)，突變型ALS蛋白的抗性為中等水平。
圖14顯示當(dāng)使用嘧草硫醚作為除草劑時(shí)所得的敏感性；圖15顯示當(dāng)使用pyriminobac作為除草劑時(shí)所得的敏感性；圖16顯示當(dāng)使用芐嘧磺隆作為除草劑時(shí)所得的敏感性；圖17顯示當(dāng)使用乙基吡磺隆作為除草劑時(shí)所得的敏感性；圖18顯示當(dāng)使用唑吡嘧磺隆作為除草劑時(shí)所得的敏感性；圖19顯示當(dāng)使用咪唑喹啉酸作為除草劑時(shí)所得的敏感性；圖20顯示當(dāng)使用咪唑煙酸作為除草劑時(shí)所得的敏感性。在圖12-20的折線圖中，連接黑色三角的折線表示含有野生型ALS蛋白的粗制酶溶液，而連接黑色方塊的折線表示含有突變型ALS蛋白的粗制酶溶液。
如圖14-20所示，突變型ALS蛋白對每種所述除草劑都有良好的抗性，其抗性優(yōu)于野生型ALS蛋白的抗性。特別是突變型ALS蛋白對PC除草劑有良好的抗性。圖12、14和15的進(jìn)一步比較表明，突變型ALS蛋白對PC除草劑中的雙草醚的抗性最佳。
由于這些結(jié)果可以被認(rèn)為與實(shí)施例2的結(jié)果有關(guān)聯(lián)，因此提示實(shí)施例2中改進(jìn)對基于PC的除草劑的抗性的因子是所述突變型ALS基因。
此外，用實(shí)施例4中制備的純化GST-ALS和游離ALS進(jìn)行除草劑敏感性試驗(yàn)。圖21顯示表明野生型ALS蛋白對雙草醚抗性的結(jié)果。圖22顯示表明突變型ALS蛋白對雙草醚抗性的結(jié)果。另外，圖23顯示表明突變型ALS蛋白對氯磺隆抗性的結(jié)果。圖24顯示表明突變型ALS蛋白對咪唑喹啉酸抗性的結(jié)果。其結(jié)果示于圖21-24中的除草劑敏感性試驗(yàn)在不加纈氨酸的情況下進(jìn)行。此外，在圖21的折線圖中，連接黑色三角的折線表示含有野生型ALS蛋白的粗制酶溶液；連接黑色方塊的折線表示野生型GST-ALS；而連接黑色圓形的折線表示游離ALS蛋白。在圖22-24的折線圖中，連接黑色三角的折線表示含有突變型ALS蛋白的粗制酶溶液；而連接黑色方塊的折線表示突變型GST-ALS。
如圖21-24所示，純化GST-ALS也顯示與當(dāng)使用粗制酶溶液的情況相似的除草劑敏感性。
實(shí)施例6突變型ALS基因中的突變部分和藥物敏感性之間的關(guān)系如圖1所示，實(shí)施例3(4)中確定的突變型ALS基因中的突變部分是W548L突變和S627I突變，在W548L突變中，野生型位置548的色氨酸(W)已突變?yōu)橘嚢彼?L)，在S627I突變中，野生型位置627的絲氨酸(S)已突變?yōu)楫惲涟彼?I)。為了研究這些突變對除草劑敏感性的影響，制備僅含有W548L突變或S627I突變?nèi)我环N的突變型ALS基因，并且檢查具有任一種突變的ALS蛋白的除草劑敏感性。
(1)突變基因的制備如圖25和26所示，制備例如僅具有W548L突變的突變型ALS基因(下文稱為“W548L突變型ALS基因”)。首先，用名為ALS-Rsp6的有義引物(5’-CATCACCAACCACCTCTT-3’SEQ ID NO3)和名為ALS-RspF的反義引物(5’-ACACGGACTGCAGGAATA-3’SEQ ID NO4)以及用保留雙點(diǎn)突變型ALS基因的pBluescript II SK+(FERM BP-7348)作為模板，進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增具有W548L突變但不具有S627I突變的DNA片段(圖25)。同時(shí)，用名為ALS-RspE的有義引物(5’-TTACAAGGCGAATAGGGC-3’SEQ ID NO5)和M13R反義引物(5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’SEQ ID NO6)以及用保留野生型ALS基因的pBluescript II SK+作為模板，擴(kuò)增含有在位置627編碼絲氨酸的區(qū)域的DNA片段(圖25)。
接著，通過采用SPR方法(基因制備方法自身聚合酶反應(yīng)，其中兩個(gè)單鏈DNA在序列相互對應(yīng)的末端部分結(jié)合，相互利用DNA為模板，DNA聚合酶復(fù)制DNA，形成雙鏈DNA)，通過將兩個(gè)DNA片段連接在一起，從兩個(gè)DNA片段獲得一個(gè)大的DNA片段(圖26)。所得的DNA片段用Acc I和Eco RI消化，從而獲得Acc I-Eco RI片段。在含有其中摻入的野生型ALS基因的pGEX-2T質(zhì)粒(pGEX-2T-wALS)在Acc I位點(diǎn)消化后，用Eco RI于37℃部分消化1分鐘，從而獲得pGEX-2T質(zhì)粒的部分片段(圖26)。然后，將Acc I-Eco RI片段和pGEX-2T質(zhì)粒的所述部分片段連接在一起，產(chǎn)生具有W548L突變型ALS基因的質(zhì)粒。
另外，按照制備以上W548L突變型ALS基因的方法，可以獲得僅具有S627I突變的突變型ALS基因(下文稱為“S627I突變型ALS基因”)。也就是說，以與上述W548L突變型ALS基因所用方法相同的方法，可以獲得S627I突變型ALS基因，只是在用pBluescript II SK+(FERM BP-7348)作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，用ALS-RspE和M13R作為引物，而在用保留野生型ALS基因的pBluescript II SK+作為模板進(jìn)行PCR時(shí)，用ALS-Rsp6和ALS-RspF作為引物。
將具有W548L突變型ALS基因的質(zhì)粒和具有S627I突變型ALS基因的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109中。對所得的大腸桿菌菌落進(jìn)行ALS基因的全測序，致使可以證實(shí)W548L突變的單點(diǎn)突變和S627I突變的單點(diǎn)突變。
(2)各個(gè)突變蛋白的除草劑抗性將具有W548L突變型ALS基因的質(zhì)?；蚓哂蠸627I突變型ALS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM109中。對從轉(zhuǎn)化獲得的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，以與實(shí)施例4和實(shí)施例5中所述方法相同的方法誘導(dǎo)GST誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，制備粗制酶溶液，然后在1mM纈氨酸存在下檢查ALS的除草劑敏感性。
圖27顯示使用雙草醚的結(jié)果。圖28和圖29顯示使用氯磺隆和咪唑喹啉酸的結(jié)果。如圖27所示，對于雙草醚，W548L突變和S627I突變的每個(gè)單點(diǎn)突變都賦予針對雙草醚的抗性，并且在僅W548L突變的單點(diǎn)突變中的抗性程度高于在僅S627I突變的單點(diǎn)突變中的抗性程度。
然而，顯示在這些單點(diǎn)突變中的抗性程度都比實(shí)施例5中所示的雙點(diǎn)突變的抗性程度要低若干數(shù)量級。換句話說，W548L突變和S627I突變的共存導(dǎo)致對雙草醚的顯著強(qiáng)的抗性，根據(jù)單獨(dú)的或者W548L突變或者S627I突變的情況不能預(yù)見這一點(diǎn)。
當(dāng)使用氯磺隆時(shí)(圖28)，單獨(dú)的W548L突變賦予對氯磺隆的抗性，但單獨(dú)的S627I突變沒有賦予明顯的抗性。另外，單獨(dú)的W548L突變以及W548L突變和S627I突變兩者一起對氯磺隆抗性程度的比較揭示出，它們有相同的抗性程度。此外，當(dāng)使用咪唑喹啉酸時(shí)(圖29)，結(jié)果與雙草醚的結(jié)果相似。然而，在該實(shí)施例中所使用的濃度范圍內(nèi)，尚不能證實(shí)增加的抗性是由于兩個(gè)突變共存所致的延增效應(yīng)。
如上所述，顯示此時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新S627I突變顯著增強(qiáng)由于W548L突變所致的雙草醚抗性。總之，具有W548L突變和S627I突變的ALS基因是賦予對雙草醚特異性高抗性的基因。
實(shí)施例7轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)生用實(shí)施例3(4)中測定的突變型ALS基因轉(zhuǎn)化水稻植物(Nippon-bare)，然后檢查轉(zhuǎn)化水稻植物的雙草醚抗性。
(1)其中摻入突變型ALS基因的雙元質(zhì)粒的構(gòu)建將實(shí)施例3(4)中獲得的突變型ALS基因摻入雙元載體pMLH7133(Mitsuhara等，Plant Cell Physiol.37 49-59，1996)中，該載體已開發(fā)用于水稻植物的轉(zhuǎn)化。
首先，如圖30所示，利用多克隆位點(diǎn)的限制性酶切割位點(diǎn)和接頭的切割位點(diǎn)，切下在pBluescript II SK+(FERM BP-7348)中摻入的突變型ALS基因(用Sac I消化和用Bam HI部分消化)。然后，pMLH7133用Sac I和Ban HI消化。切下pMLH7133中的GUS區(qū)，然后將pMLH7133線性化。將含有突變型ALS基因的DNA片段和其形狀為直鏈的pMLH7133連接在一起，從而獲得pMLH7133-ALS。
將所得的pMLH7133-ALS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株JM105中。將所得的單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后制備質(zhì)粒。通過用Sac I和Bam HI消化所制備的質(zhì)粒，證實(shí)所述插入片段的存在與否(圖31)，以便選出具有突變型ALS基因的克隆。用顯示含有所述插入片段的質(zhì)粒作為模板并且用提供特異性擴(kuò)增突變型ALS基因的至少一部分的兩個(gè)引物組，進(jìn)行PCR。此中所用的引物組是ALS-Rsp1有義引物(5’-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3’SEQ ID NO7)和4-83-3反義引物(5’-GCTTTGCCAACATACAG-3’SEQ ID NO8)的引物組以及3-1-4有義引物(5’-AGGTGTCACAGTTGTTG-3’SEQ ID NO9)和3-1-1反義引物(5’-GCATCTTCTTGAATGGCG-3’SEQ ID NO10)的引物組。因此，檢測到特異性片段條帶(圖32)，表明在所述pMLH7133載體中摻入了實(shí)施例3(4)獲得的突變型ALS基因。
此外，通過PCR證實(shí)突變型ALS基因是否已被正常摻入，以確定所述插入片段的插入方向和測定其序列。如下所述通過PCR證實(shí)所述插入片段的插入方向。pMLH7133-ALS用Eco RI完全消化，從而取出TNOS部分并線性化。用所述產(chǎn)物作為模板以及用上述ALS-Res1和4-83-3引物組以及3-1-4和3-1-1引物組，進(jìn)行PCR。結(jié)果(圖33)，在預(yù)定位置證實(shí)有PCR產(chǎn)物的條帶，表明突變型ALS基因以正向插入。如果突變型ALS基因以反向插入，則不可能檢測到PCR產(chǎn)物，由于突變型ALS基因部分通過Eco RI消化從pMLH7133-ALS中被切下來，因此沒有DNA片段得到擴(kuò)增。
同時(shí)，用所制備的pMLH7133-ALS作為突變型ALS基因5’一側(cè)和pMLH7133連接區(qū)的模板，進(jìn)行測序。另外，由于pMLH7133-ALS導(dǎo)致在大腸桿菌中拷貝數(shù)低，因此，通過堿SDS法從體積20倍于標(biāo)準(zhǔn)體積的培養(yǎng)溶液(相當(dāng)于2ml培養(yǎng)溶液×20)進(jìn)行制備。因此，顯示突變型ALS基因已以正向插入。
(2)將雙元載體導(dǎo)入土壤桿菌(Agrobacterium)中將以上(1)中獲得的雙元載體(pMLH7133-ALS)如下導(dǎo)入土壤桿菌中。將貯藏于-80℃的根癌土壤桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞在冰上解凍，然后使用。加入pMLH7133-ALS至含有根癌土壤桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞的溶液中，讓其在冰中靜置15分鐘，然后于37℃熱激5分鐘。然后，讓混合物在冰中靜置2分鐘，向其中加入1ml SOC液體培養(yǎng)基，然后于28℃輕輕振蕩2-4小時(shí)。接著，進(jìn)行離心，棄去大部分上清液。將經(jīng)沉淀的細(xì)胞懸浮于剩余的上清液中。將懸浮液涂布到含有卡那霉素和潮霉素各50ppm的LB平板上，然后于28℃溫育2-3天，從而獲得單菌落。
(3)用導(dǎo)入了pMLH7133-ALS的土壤桿菌轉(zhuǎn)化水稻植物用無菌微型刮刀刮下1/2匙(2)中獲得的土壤桿菌，然后在30ml補(bǔ)充10mg/l乙酰丁香酮的表6中所示的AAM培養(yǎng)基(Falcon試管)中充分懸浮。
表6MgSO4-7H2O 250CaCl2-2H2O 150NaH2PO4-2H2O 150KCl3000Fe-EDTA 40 MnSO4-6H2O 10ZnSO4-7H2O 2 CuSO4-5H2O 0.025CoCl2-6H2O 0.025 K1 0.75H3BO3 Na2MoO4-2H2O0.25肌醇 100煙酸 1鹽酸吡哆醇 1 鹽酸硫胺素 10水解酪蛋白氨基酸 500甘氨酸 7.5L-精氨酸 176.7 L-谷氨酰胺 900L-天冬氨酸 300蔗糖 68.5葡萄糖 36pH 5.2(數(shù)字按mg/l表示)用巴氏吸管進(jìn)行充分吸打，致使不含土壤桿菌塊。將所得的懸浮液置于9cm Schale中。
將由種子(Nippon-bare)誘導(dǎo)的并且在表7所示的N6D培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織置于不銹鋼網(wǎng)(或茶濾過器)中。然后將含有愈傷組織的網(wǎng)在土壤桿菌懸浮液中浸漬1.5-2分鐘。此時(shí)，浸漬網(wǎng)，致使愈傷組織完全浸入所述細(xì)菌溶液中，然后用刮刀輕輕攪拌。隨后，將不銹鋼網(wǎng)置于無菌濾紙上，以除去過量的細(xì)菌溶液。將如此處理的愈傷組織置于如表8所示的2N6AS固體培養(yǎng)基(10mg/l乙酰丁香酮，16個(gè)愈傷組織/培養(yǎng)皿)，用手術(shù)膠布密封，于28℃避光條件下培養(yǎng)2-3天，直至一薄層細(xì)胞覆蓋愈傷組織(由于細(xì)胞生長所致)。
表7CHU粉末 1包肌醇 100煙酸 0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫胺素 12，4-D 2水解酪蛋白氨基酸 300甘氨酸 2脯氨酸 2827蔗糖 30000gelrite 4000羧芐青霉素 500潮霉素 50pH 5.8(數(shù)字按mg/l表示)
表8CHU粉末 1包肌醇100煙酸0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫胺素 12，4-D 2水解酪蛋白氨基酸300甘氨酸 2蔗糖30g葡萄糖 10ggelrite 4000乙酰丁香酮 10pH 5.2(數(shù)字按mg/l表示)在由于共培養(yǎng)3天一薄層細(xì)胞覆蓋愈傷組織后，用以下方法洗滌愈傷組織，以除去所述土壤桿菌。將如上所述處理的愈傷組織置于不銹鋼網(wǎng)(或茶濾過器)，然后將含有愈傷組織的網(wǎng)浸漬在N6D液體培養(yǎng)基(含有500mg/l羧芐青霉素)中。連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)皿的交換，直至培養(yǎng)基不再混濁為止。通過該處理洗去附在愈傷組織上的土壤桿菌。然后，將該網(wǎng)置于無菌濾紙上，以除去過量的水分。將愈傷組織置于N6D固體培養(yǎng)基(含有500mg/l羧芐青霉素和50mg/l潮霉素)，然后在光照條件下于28℃培養(yǎng)2-3周。另外，在該步驟后土壤桿菌再增殖時(shí)，以相同的方法進(jìn)行洗滌，然后將愈傷組織置于新鮮培養(yǎng)基上。
通過在光照條件下于28℃培養(yǎng)2-3周進(jìn)行選擇后，將愈傷組織以9個(gè)愈傷組織/培養(yǎng)皿移植到再分化培養(yǎng)基(含有250mg/l羧芐青霉素和50mg/l潮霉素)上，然后在光照條件下于28℃培養(yǎng)2-3周。當(dāng)葉、莖和根部分分別分化1cm或更長時(shí)，將愈傷組織以2-3個(gè)愈傷組織/培養(yǎng)皿移植到無激素培養(yǎng)基(含有50mg/l潮霉素)上。隨后，當(dāng)所得的植物體繁殖足以覆蓋培養(yǎng)皿時(shí)，將植株盤載到培養(yǎng)土(bon sol)中，讓其適應(yīng)。移植時(shí)，將附在根上的培養(yǎng)基在水中全部洗去。圖34顯示上述步驟的流程。
進(jìn)行上述盆栽的同時(shí)，將尚未再分化的愈傷組織部分(9個(gè)愈傷組織)(圖35)在固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，以產(chǎn)生實(shí)施例1中所用的雙草醚抗性愈傷組織。所述固體培養(yǎng)基含有10μM雙草醚。因而，9個(gè)愈傷組織中的6個(gè)正常生長。將正常生長并且顯示雙草醚抗性的6個(gè)愈傷組織中的1個(gè)進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后詳細(xì)檢查對雙草醚的藥物敏感性。因此，如圖36所示，所述愈傷組織顯示的雙草醚抗性幾乎與雙點(diǎn)突變基因來源的雙草醚抗性Sr系相同。此外，如圖37所示，野生型水稻植株(Nippon-bare)的愈傷組織顯示雙草醚敏感性。因此，在含有10μM雙草醚的固體培養(yǎng)基上生長的6個(gè)愈傷組織都顯示具有強(qiáng)雙草醚抗性。
用DNeasy Plant Kit(QIAGEN)，從這些雙草醚抗性愈傷組織制備基因組DNA。然后，用基因組DNA作為模板，用其間鄰接所述雙點(diǎn)突變部分的有義引物(3-1-4SEQ ID NO9)和反義引物(4-83-3SEQ IDNO8)的引物組，進(jìn)行PCR。因而，如圖38所示，正如所預(yù)期的，擴(kuò)增了一種DNA片段。純化所擴(kuò)增的DNA片段，然后檢查其核苷酸序列(用引物(3-1-4SEQ ID NO9)讀出有義鏈；而用引物(ALS-Rsp25’-AGTCCTGCCATCACCATCCAG-3’SEQ ID NO11)讀出反義鏈)。
圖39A和圖39B顯示分析編碼ALS蛋白的位置548的氨基酸的核苷酸周圍的核苷酸序列的結(jié)果。圖39C和圖39D顯示分析編碼ALS蛋白的位置627的氨基酸的核苷酸周圍的核苷酸序列的結(jié)果。如圖39A-D所示，對于這些系的雙點(diǎn)突變而言，發(fā)現(xiàn)野生型和突變體的異源序列。因此，表明突變型ALS基因摻入所述基因組中。另外，9個(gè)愈傷組織中的3個(gè)在10μM雙草醚存在下生長不太好。然而，認(rèn)為這是由于所導(dǎo)入的雙點(diǎn)突變ALS基因的低表達(dá)量引起的。
在盆栽的80株潮霉素抗性轉(zhuǎn)化水稻植株中，在5葉期正常生長的那些水稻植株有27株已導(dǎo)入突變型ALS基因的植株，且有46株已導(dǎo)入野生型ALS基因的植株。含有其中導(dǎo)入的野生型ALS基因的植株往往比其中含有突變型ALS基因的那些植株生長更健壯。此時(shí)，對4株含有其中導(dǎo)入的突變型ALS基因的植株和5株含有其中導(dǎo)入的野生型ALS基因的植株進(jìn)行適當(dāng)選擇，并且將補(bǔ)充0.2％表面活性劑K的1kg a.i./ha雙草醚鹽噴灑到葉和莖上。噴灑后約40天進(jìn)行生長調(diào)查的結(jié)果示于圖40中。在圖40中，植株A的長度約90cm。
如圖40所示，含有其中導(dǎo)入的突變型ALS基因的單株的生長幾乎正常(A)，并且表明所述植株具有雙草醚抗性。用DNeasy Plant Kit(QIAGEN)，從雙草醚抗性轉(zhuǎn)化水稻植株制備基因組DNA。然后，用基因組DNA作為模板，用其間鄰接雙點(diǎn)突變部分的有義引物(3-1-4SEQ ID NO9)和反義引物(4-83-3SEQ ID NO8)的引物組，進(jìn)行PCR。以與上述愈傷組織相同的方式檢查所得的DNA片段的核苷酸序列。因此，證實(shí)了在所述轉(zhuǎn)化水稻植株中存在雙點(diǎn)突變。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用全部結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的效應(yīng)如上文詳細(xì)描述的，本發(fā)明可以提供編碼ALS酶的ALS基因，所述ALS酶對所有抑制ALS的除草劑都有良好的抗性并且顯示對PC除草劑有極高水平的抗性。
序列表<110>組合化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社(KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO.，LTD)<120>編碼乙酰乳酸合成酶的基因<130>PH-1273PCT<150>JP 2000-362630<151>2000-11-29<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>644<212>PRT<213>Oryza sativa var.Kinmaze<400>1Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro20 25 30Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser35 40 45Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro50 55 60Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala65 70 75 80Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala85 90 95Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn100 105 110
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr115 120 125Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser GlyPro130 135 140Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser145 150 155 160Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly165 170 175Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile180 185 190Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val195 200 205Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val210 215 220Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val225 230 235 240Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys245 250 255Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu260 265 270Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly275 280 285Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr290 295 300Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu305 310 315 320Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp325 330 335
Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val340 345 350Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile355 360 365Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser370 375 380Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu385 390 395 400Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn405 410 415Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe420 425 430Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu435 440 445Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met450 455 460Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser465 470 475 480Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly485 490 495Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp500 505 510Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu515 520 525Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met530 535 540Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr545 550 555 560
Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val565 570 575Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys580 585 590Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro595 600 605Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met610 615 620Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly625 630 635 640Arg Thr Val Tyr<210>2<211>2279<212>DNA<213>Oryza sativa var.Kinmaze<400>2ctcgccgccg ccgccgccgc caccacccac catggctacg accgccgcgg ccgcggccgc 60cgccctgtcc gccgccgcga cggccaagac cggccgtaag aaccaccagc gacaccacgt 120ccttcccgct cgaggccggg tgggggcggc ggcggtcagg tgctcggcgg tgtccccggt 180caccccgccg tccccggcgc cgccggccac gccgctccgg ccgtgggggc cggccgagcc 240ccgcaagggc gcggacatcc tcgtggaggc gctggagcgg tgcggcgtca gcgacgtgtt 300cgcctacccg ggcggcgcgt ccatggagat ccaccaggcg ctgacgcgct ccccggtcat 360caccaaccac ctcttccgcc acgagcaggg cgaggcgttc gcggcgtccg ggtacgcgcg 420cgcgtccggc cgcgtcgggg tctgcgtcgc cacctccggc cccggggcaa ccaacctcgt 480gtccgcgctc gccgacgcgc tgctcgactc cgtcccgatg gtcgccatca cgggccaggt 540cccccgccgc atgatcggca ccgacgcctt ccaggagacg cccatagtcg aggtcacccg 600ctccatcacc aagcacaatt accttgtcct tgatgtggag gacatccccc gcgtcataca 660ggaagccttc ttcctcgcgt cctcgggccg tcctggcccg gtgctggtcg acatccccaa 720ggacatccag cagcagatgg ccgtgccggt ctgggacacc tcgatgaatc taccagggta 780catcgcacgc ctgcccaagc cacccgcgac agaattgctt gagcaggtct tgcgtctggt 840Dtggcgagtca cggcgcccga ttctctatgt cggtggtggc tgctctgcat ctggtgacga 900attgcgctgg tttgttgagc tgactggtat cccagttaca accactctga tgggcctcgg 960
caatttcccc agtgacgacc cgttgtccct gcgcatgctt gggatgcatg gcacggtgta 1020cgcaaattat gccgtggata aggctgacct gttgcttgcg tttggtgtgc ggtttgatga 1080tcgtgtgaca gggaaaattg aggcttttgc aagcagggcc aagattgtgc acattgacat 1140tgatccagca gagattggaa agaacaagca accacatgtg tcaatttgcg cagatgttaa 1200gcttgcttta cagggcttga atgctctgct acaacagagc acaacaaaga caagttctga 1260ttttagtgca tggcacaatg agttggacca gcagaagagg gagtttcctc tggggtacaa 1320aacttttggt gaagagatcc caccgcaata tgccattcag gtgctggatg agctgacgaa 1380aggtgaggca atcatcgcta ctggtgttgg gcagcaccag atgtgggcgg cacaatatta 1440cacctacaag cggccacggc agtggctgtc ttcggctggt ctgggcgcaa tgggatttgg 1500gctgcctgct gcagctggtg cttctgtggc taacccaggt gtcacagttg ttgatattga 1560tggggatggt agcttcctca tgaacattca ggagctggca ttgatccgca ttgagaacct 1620ccctgtgaag gtgatggtgt tgaacaacca acatttgggt atggtggtgc aattggagga 1680taggttttac aaggcgaata gggcgcatac atacttgggc aacccggaat gtgagagcga 1740gatatatcca gattttgtga ctattgctaa ggggttcaat attcctgcag tccgtgtaac 1800aaagaagagt gaagtccgtg ccgccatcaa gaagatgctc gagactccag ggccatactt 1860gttggatatc atcgtcccgc accaggagca tgtgctgcct atgatcccaa ttgggggcgc 1920attcaaggac atgatcctgg atggtgatgg caggactgtg tattaatcta taatctgtat 1980gttggcaaag caccagcccg gcctatgttt gacctgaatg acccataaag agtggtatgc 2040ctatgatgtt tgtatgtgct ctatcaataa ctaaggtgtc aactatgaac catatgctct 2100tctgttttac ttgtttgatg tgcttggcat ggtaatccta attagcttcc tgctgtctag 2160gtttgtagtg tgttgttttc tgtaggcata tgcatcacaa gatatcatgt aagtttcttg 2220tcctacatat caataataag agaataaagt acttctatgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2279<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3CATCACCAAC CACCTCTT 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4ACACGGACTG CAGGAATA 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5TTACAAGGCG AATAGGGC 18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6GGAAACAGCT ATGACCATG19<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7GCTCTGCTAC AACAGAGCAC A 21
<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8GCTTTGCCAA CATACAG 17<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9AGGTGTCACA GTTGTTG 17<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10GCATCTTCTT GAATGGCG 18<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11AGTCCTGCCA TCACCATCCA G 2權(quán)利要求
1.一種編碼以下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)一種包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)一種包含從SEQ ID NO1的氨基酸序列通過取代、缺失或添加至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列、對嘧啶基羧基除草劑具有抗性以及具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)。
2.一種乙酰乳酸合酶蛋白，所述乙酰乳酸合酶蛋白由權(quán)利要求1的基因編碼。
3.一種重組載體，所述重組載體具有權(quán)利要求1的基因。
4.一種轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體具有權(quán)利要求3的重組載體。
5.一種植物，所述植物具有權(quán)利要求1的基因并且對嘧啶基羧基除草劑具有抗性。
6.一種培育權(quán)利要求5的植物的方法，所述方法包括在嘧啶基羧基除草劑的存在下培育所述植物。
7.一種應(yīng)用權(quán)利要求1的基因作為選擇標(biāo)記來選擇具有所述基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
全文摘要
一種編碼針對基于PC的除草劑顯示極高抗性的ALS蛋白的基因。即一種編碼以下蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因。(a)一種包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(b)一種包含從SEQ ID NO1所示的氨基酸序列通過取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列并且對嘧啶基羧基除草劑具有抗性以及具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/60GK1487998SQ01822268
公開日2004年4月7日 申請日期2001年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月29日
發(fā)明者清水力, 中山礎(chǔ), 永山孝三, 福田篤德, 田中喜之, 角康一郎, 三, 之, 德, 郎 申請人:組合化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社, 獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所