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內(nèi)源和非內(nèi)源型人g蛋白偶聯(lián)受體的制作方法

文檔序號:389605閱讀:392來源:國知局
專利名稱:內(nèi)源和非內(nèi)源型人g蛋白偶聯(lián)受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及跨膜受體,在一些實(shí)施方案中涉及G蛋白偶聯(lián)受體,在一些優(yōu)選實(shí)施方案中涉及受到改變以建立或增強(qiáng)所述受體的組成型活性的內(nèi)源GPCR。在一些實(shí)施方案中,使用組成型活化的GPCR直接鑒定候選化合物中具有治療劑應(yīng)用性的受體激動劑或反激動劑(inverse agonist)。
背景技術(shù)
雖然人體內(nèi)存在許多受體家族,但目前最豐富并且與治療最相關(guān)的是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族。據(jù)估計(jì),人類基因組中有約30,000-40,000個基因,估計(jì)其中約2%編碼GPCR。已經(jīng)鑒定其內(nèi)源配體的受體(包括GPCR)稱為“已知”受體,而未鑒定內(nèi)源配體的受體稱為“孤獨(dú)”受體。
GPCR是發(fā)展醫(yī)藥產(chǎn)品的重要領(lǐng)域從100種已知GPCR中的約20種發(fā)展出全部處方藥中約60%的藥品。例如,在1999年,在頭100個品牌的處方藥中,下面藥物與GPCR相互作用(圓括號內(nèi)指所治療的疾病和/或紊亂)Claritin(變態(tài)反應(yīng)) Prozac(抑郁) Vasotec(高血壓)Paxil(抑郁) Zoloft(抑郁) Zyprexa(精神病)Cozaar(高血壓) Imitrex(偏頭痛) Zantac(反流)Propulsid(反流病) Risperdal(精神分裂Serevent(哮喘)癥)Pepcid(反流)Gaster(潰瘍) Atrovent(支氣管痙攣)Effexor(抑郁) Depakote(癲癇)Cardura(前列腺肥大)Allegra(變態(tài)反應(yīng)) Lupron(前列腺癌) Zoladex(前列腺癌)Diprivan(感覺缺 BuSpar(焦慮) Ventolin(支氣管痙失) 攣)Hytrin(高血壓) Wellbutrin(抑郁) Zyrtec(鼻炎)Plavix(MI/中風(fēng)) Toprol-XL(高血壓) Tenormin(咽峽炎)Xalatan(青光眼) Singulair(哮喘) Diovan(高血壓)Harnal(前列腺增生)
(Med Ad News 1999年數(shù)據(jù))。
GPCR共同具有一個共有結(jié)構(gòu)基序,該基序包含七個由22到24個疏水氨基酸組成的序列,這七個序列形成七個α螺旋,每個α螺旋都跨膜(用數(shù)字標(biāo)示跨膜數(shù),即跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。所述跨膜螺旋由細(xì)胞膜外面或“外側(cè)”的在跨膜-2和跨膜-3、跨膜-4和跨膜-5、以及跨膜-6和跨膜-7之間的氨基酸鏈連接(這些氨基酸鏈分別稱為“胞外”區(qū)1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))。所述跨膜螺旋也由細(xì)胞膜里面或“內(nèi)側(cè)”的在跨膜-1和跨膜-2、跨膜-3和跨膜-4、以及跨膜-5和跨膜-6之間的氨基酸鏈連接(這些氨基酸鏈分別稱為“胞內(nèi)”區(qū)1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))。所述受體的“羧基”(“C”)末端在細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)間隙,所述受體的“氨基”(“N”)末端在細(xì)胞外的胞外間隙。
一般地說,當(dāng)內(nèi)源配體結(jié)合所述受體時(通常稱為所述受體的“活化”),在胞內(nèi)區(qū)發(fā)生構(gòu)象改變,允許在所述胞內(nèi)區(qū)和胞內(nèi)“G-蛋白”間發(fā)生偶聯(lián)。據(jù)報(bào)道,GPCR與G蛋白是“濫交的”,即GPCR能夠與一種以上的G蛋白相互作用。見Kenakin,T.,43 Life Sciences 1095(1988)。雖然存在其它G蛋白,但目前已經(jīng)鑒定的G蛋白是Gq、Gs、Gi、Gz和Go。與G蛋白偶聯(lián)的配體活化的GPCR起始信號級聯(lián)過程(稱為“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”)。在正常條件下,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞抑制。雖然不希望受到理論的限制,但認(rèn)為IC-3回環(huán)以及所述受體的羧基末端與所述G蛋白相互作用。
在生理?xiàng)l件下,GPCR存在于細(xì)胞膜上,處于兩種不同構(gòu)象間的平衡“失活”狀態(tài)和“活性”狀態(tài)。失活狀態(tài)的受體不能進(jìn)入信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以起始導(dǎo)致生物學(xué)反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。改變所述受體構(gòu)象到活性狀態(tài)使得能夠進(jìn)入轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(通過G蛋白)并產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)。
可以通過配體或化合物如藥物將受體穩(wěn)定于活性狀態(tài)。最近的發(fā)現(xiàn)提供了除配體或藥物以外促進(jìn)和穩(wěn)定所述受體于活性構(gòu)象的方法,所述最近的發(fā)現(xiàn)包括但不只限于修飾所述受體的氨基酸序列。這些方法通過刺激配體結(jié)合所述受體的效應(yīng),有效穩(wěn)定所述受體于活性狀態(tài)。通過所述獨(dú)立于配體的方式獲得的穩(wěn)定稱為“組成型受體活化”。
發(fā)明簡述本文公開人GPCR的內(nèi)源形式和非內(nèi)源形式以及它們的應(yīng)用。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.1的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.3的cDNA的質(zhì)粒、所述質(zhì)粒的非內(nèi)源組成型活化形式、以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.6的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.5的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.8的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.7的cDNA的質(zhì)粒、所述質(zhì)粒的非內(nèi)源組成型活化形式、以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.10的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.9的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.12的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.11的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.14的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.13的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.16的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.15的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.18的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.17的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及由SEQ.ID.NO.20的氨基酸序列編碼的G蛋白偶聯(lián)受體、所述受體的非內(nèi)源組成型活化形式以及包含它們的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含載體以及SEQ.ID.NO.19的cDNA的質(zhì)粒,以及包含所述質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
附圖簡述

圖1圖示使用293細(xì)胞在測量肌醇磷酸(IP3)積累的第二信使測定中,RUP32、Gq(del)/Gi、與Gq(del)/Gi共轉(zhuǎn)染的RUP32以及CMV(對照;表達(dá)載體)的活化。
圖2圖示內(nèi)源形式RUP35和RUP36與對照(“CMV”)相比引起的第二信使IP3產(chǎn)生。
發(fā)明詳述圍繞受體發(fā)展的科學(xué)文獻(xiàn)已經(jīng)應(yīng)用許多術(shù)語來命名對受體有各種效應(yīng)的配體。為清楚和一致性,在整個本專利文件中將使用下面定義。當(dāng)這些定義與這些術(shù)語的其它定義矛盾時,以下面定義為準(zhǔn)激動劑應(yīng)當(dāng)指這樣的物質(zhì)(如配體、候選化合物)當(dāng)所述物質(zhì)結(jié)合受體時,活化細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)或增加GTP與膜結(jié)合。在一些實(shí)施方案中,激動劑是那些以前未知當(dāng)結(jié)合受體時活化細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)或增加GTP結(jié)合膜的物質(zhì)。
本文使用的氨基酸縮寫在表A中陳述
表A
拮抗劑應(yīng)當(dāng)指這樣的物質(zhì)(如配體、候選化合物)所述物質(zhì)與激動劑競爭結(jié)合受體的同一位點(diǎn),但不活化所述受體的活性形式所起始的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),因此能夠抑制激動劑的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。拮抗劑不減少在缺乏激動劑時的基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中,拮抗劑是那些以前未知當(dāng)結(jié)合受體時活化細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)或增加GTP結(jié)合膜的物質(zhì)。
候選化合物應(yīng)當(dāng)指應(yīng)用篩選技術(shù)進(jìn)行篩選的分子(例如但不限于化合物)。優(yōu)選詞組“候選化合物”不包括公眾已知的選自以下的化合物以前根據(jù)間接鑒定方法確定的受體的反激動劑、激動劑或拮抗劑(“間接鑒定的化合物”);更優(yōu)選不包括以前已經(jīng)確定在至少一種哺乳動物中具有治療功效的間接鑒定的化合物;最優(yōu)選不包括以前已經(jīng)確定在人體內(nèi)有治療應(yīng)用的間接鑒定的化合物。
組合物指包括至少一種成份的物質(zhì);“藥用組合物”是組合物的一個例子。
化合物功效應(yīng)當(dāng)指與受體結(jié)合親和力相比,化合物抑制或刺激受體功能的能力(即活化/抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)的度量。檢測化合物功效的示例性方法在本專利文件的實(shí)施例部分公開。
密碼子應(yīng)當(dāng)指三個核苷酸(或核苷酸的等同物)的組合,所述核苷酸一般包括與磷酸基團(tuán)偶聯(lián)的核苷(腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)),所述核苷酸的組合在翻譯時編碼一個氨基酸。
組成型活化的受體應(yīng)當(dāng)指受到組成型受體活化作用的受體。組成型活化的受體可以是內(nèi)源或非內(nèi)源的。
組成型受體活化應(yīng)當(dāng)指穩(wěn)定所述受體于活性狀態(tài),所述穩(wěn)定使用除以下方法以外的方法完成受體與配體或其化學(xué)等同物結(jié)合。
接觸應(yīng)當(dāng)指不論在體外系統(tǒng)或體內(nèi)系統(tǒng)中,使至少兩個部分接近。
直接鑒定或直接鑒定的就詞組“候選化合物”而言,應(yīng)當(dāng)指針對組成型活化的受體篩選候選化合物并評價所述化合物的功效,所述組成型活化的受體優(yōu)選是組成型活化的孤獨(dú)受體,最優(yōu)選是組成型活化的G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞表面孤獨(dú)受體。該詞組在任何情況下都不應(yīng)解釋或理解為包括或包括于詞組“間接鑒定”或“間接鑒定的”。
內(nèi)源應(yīng)當(dāng)指哺乳動物天然產(chǎn)生的物質(zhì)。內(nèi)源就例如但不限于術(shù)語“受體”而言,應(yīng)當(dāng)指由哺乳動物(例如但不限于人)或病毒天然生產(chǎn)。與此不同,本文中的非內(nèi)源應(yīng)當(dāng)指不是由哺乳動物(例如但不限于人)或病毒天然生產(chǎn)。例如但不限于此實(shí)例,當(dāng)一種受體處于內(nèi)源形式時并非組成型有活性,但經(jīng)過操作后成為組成型有活性的受體,則所述受體最優(yōu)選在本文中稱為“非內(nèi)源組成型活化的受體”。這兩個術(shù)語都可以用于描述“體內(nèi)”和“體外”系統(tǒng)。例如但不限于此實(shí)例,在篩選方法中,內(nèi)源或非內(nèi)源的受體可以指體外篩選系統(tǒng)。作為另一個例子但不限于此實(shí)例,當(dāng)已經(jīng)操作哺乳動物的基因組以包括非內(nèi)源組成型活化的受體時,通過體內(nèi)系統(tǒng)篩選候選化合物是可行的。
G蛋白偶聯(lián)受體融合蛋白和GPCR融合蛋白在本文公開的上下文中,都指非內(nèi)源蛋白,所述非內(nèi)源蛋白包括與至少一種G蛋白、最好所述G蛋白的α亞單位(該亞單位是結(jié)合GTP的亞單位)融合的內(nèi)源組成型活化的GPCR或非內(nèi)源組成型活化的GPCR,所述G蛋白最好與天然偶聯(lián)所述內(nèi)源孤獨(dú)GPCR的G蛋白同一類型。例如但不限于此實(shí)例,在內(nèi)源狀態(tài),假如G蛋白“Gsα”是與GPCR偶聯(lián)的主要G蛋白,那么基于特定GPCR的GPCR融合蛋白是包含與Gsα融合的GPCR的非內(nèi)源蛋白;在一些情況下,如下文陳述,可以將非主要G蛋白與所述GPCR融合。所述G蛋白可以直接與所述組成型活化GPCR融合,或者在二者之間有間隔區(qū)。
宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)指能夠在其中加入質(zhì)粒和/或載體的細(xì)胞。在原核宿主細(xì)胞的情況下,質(zhì)粒通常在宿主細(xì)胞復(fù)制時作為自主分子復(fù)制(一般隨后分離所述質(zhì)粒以引入真核宿主細(xì)胞);在真核宿主細(xì)胞的情況下,將質(zhì)粒整合進(jìn)所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞DNA,以便當(dāng)所述真核宿主細(xì)胞復(fù)制時,所述質(zhì)粒復(fù)制。在一些實(shí)施方案中,所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞,更優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞,最優(yōu)選選自293、293T和COS-7細(xì)胞。
間接鑒定或間接鑒定的指藥物發(fā)現(xiàn)過程的傳統(tǒng)方法,所述傳統(tǒng)方法涉及鑒定特異性針對內(nèi)源受體的內(nèi)源配體,針對所述受體篩選候選化合物以確定那些干擾和/或競爭所述配體-受體相互作用的化合物,以及評價所述化合物影響與所述活化受體有關(guān)的至少一種第二信使途徑的功效。
抑制就術(shù)語“反應(yīng)”而言,應(yīng)當(dāng)指與不存在化合物的情況相比,所述化合物的存在降低或預(yù)防反應(yīng)。
反激動劑應(yīng)當(dāng)指這樣的物質(zhì)(如配體、候選化合物)所述化合物結(jié)合所述受體的內(nèi)源形式或所述受體的組成型活化形式,并抑制由所述受體的活化形式起始的基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),使其降到在不存在激動劑的情況下所觀察到的正?;A(chǔ)活性水平以下,或者減少GTP結(jié)合膜。優(yōu)選與不存在所述反激動劑的情況下的基礎(chǔ)反應(yīng)相比,存在所述反激動劑抑制所述基礎(chǔ)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)至少30%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、最優(yōu)選至少99%。
已知受體應(yīng)當(dāng)指這樣的內(nèi)源受體已經(jīng)鑒定特異性針對所述受體的內(nèi)源配體。
配體應(yīng)當(dāng)指特異性針對天然受體的分子。
突變的或突變就內(nèi)源受體的核酸序列和/或氨基酸序列而言,應(yīng)當(dāng)指對所述內(nèi)源序列作出的特定一個改變或多個改變,以便所述內(nèi)源非組成型活化的受體表現(xiàn)所述受體的組成型活化。就特定序列的等同物而言,在以下情況下人受體的隨后突變形式被認(rèn)為是所述人受體第一個突變的等同物(a)人受體的隨后突變形式的組成型活化水平基本與所述受體第一個突變表現(xiàn)的水平相同;和(b)所述受體的隨后突變形式與所述受體的第一個突變之間的序列(氨基酸和/或核酸)同一性百分率是至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%和最優(yōu)選至少99%。在一些實(shí)施方案中,考慮到本文公開的用于獲得組成型活化的一些優(yōu)選盒在所述GPCR的內(nèi)源形式和非內(nèi)源形式之間包括單氨基酸和/或密碼子改變,優(yōu)選序列同一性百分率應(yīng)當(dāng)至少98%。
非孤獨(dú)受體應(yīng)當(dāng)指特異性針對已鑒定配體的內(nèi)源天然分子,其中配體與受體的結(jié)合活化細(xì)胞內(nèi)信號途徑。
孤獨(dú)受體應(yīng)當(dāng)指這樣的內(nèi)源受體未鑒定特異性針對所述受體的內(nèi)源配體,或者所述配體是未知的。
藥用組合物應(yīng)當(dāng)指包括至少一種活性成份的組合物,因此組合物適合在哺乳動物(例如但不限于人)中研究特定有效效果。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠理解和評價根據(jù)技術(shù)人員的需要適于檢測活性成份是否具有所需要的效果的技術(shù)。
質(zhì)粒應(yīng)當(dāng)指載體和cDNA的組合。一般地說,將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞以便復(fù)制所述cDNA和/或表達(dá)所述cDNA成為蛋白。
第二信使應(yīng)當(dāng)指作為受體活化結(jié)果而產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。第二信使可以包括,例如,肌醇三磷酸(IP3)、二酰甘油(DAG)、環(huán)狀A(yù)MP(cAMP)和環(huán)狀GMP(cGMP)??梢詼y量第二信使反應(yīng)以確定受體活化。此外,可以測量第二信使反應(yīng)以直接鑒定候選化合物,所述候選化合物包括,例如,反激動劑、激動劑和拮抗劑。
信噪比應(yīng)當(dāng)指響應(yīng)活化、增強(qiáng)或刺激而產(chǎn)生的信號,其中所述信號比在無活化、無增強(qiáng)或無刺激的情況下的背景噪音或基礎(chǔ)水平強(qiáng)。
間隔區(qū)應(yīng)當(dāng)指位于基因(例如目的GPCR)最后一個密碼子或最后一個氨基酸之后、但在目的G蛋白起始密碼子或開始區(qū)之前的翻譯的數(shù)個氨基酸,其中所述翻譯的數(shù)個氨基酸符合讀框地置于所述目的G蛋白的開始區(qū)內(nèi)??梢愿鶕?jù)技術(shù)人員的需要定制所述翻譯的氨基酸的數(shù)量,該數(shù)量一般從約一個氨基酸、優(yōu)選二個氨基酸、更優(yōu)選三個氨基酸、更優(yōu)選四個氨基酸、更優(yōu)選五個氨基酸、更優(yōu)選六個氨基酸、更優(yōu)選七個氨基酸、更優(yōu)選八個氨基酸、更優(yōu)選九個氨基酸、更優(yōu)選十個氨基酸、更優(yōu)選十一個氨基酸、甚至更優(yōu)選十二個氨基酸。
刺激就術(shù)語“反應(yīng)”而言,應(yīng)當(dāng)指與不存在化合物的情況相比,所述化合物的存在增強(qiáng)反應(yīng)。
實(shí)質(zhì)上應(yīng)當(dāng)指結(jié)果在對照結(jié)果的40%以內(nèi)、優(yōu)選35%以內(nèi)、更優(yōu)選30%以內(nèi)、更優(yōu)選25%以內(nèi)、更優(yōu)選20%以內(nèi)、更優(yōu)選15%以內(nèi)、更優(yōu)選10%以內(nèi)、更優(yōu)選5%以內(nèi)、更優(yōu)選2%以內(nèi)、最優(yōu)選1%以內(nèi)。例如,在受體功能性情況下,假如根據(jù)本文教導(dǎo)的方法或技術(shù)人員已知的相似方法測量,所轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號在對照信號產(chǎn)生的信號40%以內(nèi),則測試受體可能表現(xiàn)與對照受體實(shí)質(zhì)上相似的結(jié)果。
載體就cDNA而言,應(yīng)當(dāng)指能夠在其中加入至少一種cDNA并且本身能夠摻入宿主細(xì)胞的環(huán)狀DNA。
下面部分的順序是為了陳述方便,不是并且不應(yīng)解釋為限制下面的公開內(nèi)容或權(quán)利要求。
A.介紹受體的傳統(tǒng)研究一般根據(jù)一個先驗(yàn)假設(shè)(基于歷史)進(jìn)行必須首先鑒定內(nèi)源配體,然后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)可能影響所述受體的拮抗劑和其它分子。甚至在首先已知拮抗劑的情況下,研究也立即延伸到尋找內(nèi)源配體。甚至在發(fā)現(xiàn)組成型活化的受體后,該思維模式仍然在受體研究中持續(xù)。因此,以前沒有認(rèn)識到的是受體的活性狀態(tài)對于發(fā)現(xiàn)所述受體的激動劑和反激動劑是最有用的。對于那些由過度活性的受體或活性不足的受體引起的疾病,治療藥物的需要是分別減少受體活性狀態(tài)或增強(qiáng)受體活性的化合物,而不一定是內(nèi)源配體的拮抗劑藥物。這是因?yàn)闇p少或增強(qiáng)活性受體狀態(tài)活性的化合物不一定與內(nèi)源配體結(jié)合同一位點(diǎn)。因此,根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的方法,任何尋找治療化合物的研究應(yīng)當(dāng)從篩選對獨(dú)立于配體的活性狀態(tài)的化合物開始。
B.鑒定人GPCR人類基因組計(jì)劃的實(shí)施已經(jīng)鑒定位于人基因組內(nèi)關(guān)于核酸序列的過多信息;在該努力過程中,可以獲得遺傳序列信息而不理解或認(rèn)識任何特定基因組序列是否包含或可能包含翻譯成人蛋白質(zhì)的可讀框信息。鑒定人基因組內(nèi)核酸序列的幾種方法在本領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如但不限于此實(shí)例,本文公開的多種人GPCR是通過搜索GenBankTM數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)的。下面的表B列出我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的幾種內(nèi)源GPCR,以及與所公開的GPCR同源的其它GPCR。
表B
受體同一性用于獲得所述受體在人體內(nèi)作用的認(rèn)識。隨著本專利文件的進(jìn)一步說明,將會討論突變這些受體以建立這些受體的非內(nèi)源組成型活化形式的技術(shù)。
本文公開的技術(shù)也可應(yīng)用于本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它人GPCR,這對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員是顯而易見的。
C.篩選受體針對本文公開的GPCR的非內(nèi)源組成型活化形式篩選候選化合物允許直接鑒定作用于細(xì)胞表面受體的候選化合物,而不要求應(yīng)用所述受體的內(nèi)源配體。人們使用常規(guī)的通常商業(yè)化可得的技術(shù),能夠確定本文公開的人GPCR的所述內(nèi)源形式在體內(nèi)表達(dá)和/或過量表達(dá)的部位。受體表達(dá)定位于特定組織使科學(xué)家能夠確定所述受體的生理功能。也有可能使用這些技術(shù)確定與所述受體的表達(dá)和/或過量表達(dá)有關(guān)的相關(guān)疾病/紊亂狀態(tài);本專利文件公開這樣的方法。此外,受體在疾病器官中的表達(dá)能夠幫助人們確定所述受體臨床相關(guān)性的重要性。
本文公開的組成型表達(dá)的GPCR基于距假定位于GPCR的TM6內(nèi)的脯氨酸殘基的距離;該算法技術(shù)在共同未決及共同轉(zhuǎn)讓的專利文件PCT申請?zhí)朠CT/US99/23938中公開,該專利文件在2000年4月20日作為WO 00/22129公開,與本文列出的其它專利文件一起通過引用結(jié)合到本文中。所述算法技術(shù)不基于傳統(tǒng)的序列“排列對比”,而是基于距前述TM6脯氨酸殘基的特定距離(當(dāng)然,或者是所述脯氨酸殘基的內(nèi)源組成型取代)。通過突變從該殘基(假設(shè)位于所述受體的IC3區(qū))開始的位于16氨基酸殘基的氨基酸殘基到最優(yōu)選賴氨酸殘基,可以組成型活化所述受體??梢栽谠撐稽c(diǎn)的突變中使用其它氨基酸殘基以達(dá)到該目的,這將在下文詳細(xì)討論。
D.鑒定和/或篩選疾病/紊亂如下文所述,可以通過本發(fā)明的方法鑒定所述非內(nèi)源組成型活化GPCR的反激動劑和激動劑。所述反激動劑和激動劑是用作前驅(qū)化合物的理想候選物,用于尋找治療與該受體有關(guān)的疾病的藥物發(fā)現(xiàn)程序。因?yàn)槟軌蛑苯予b定針對所述GPCR的反激動劑并因此允許發(fā)展藥用組合物,相應(yīng)地尋找與所述GPCR相關(guān)的疾病和紊亂。將受體表達(dá)定位于特定組織為科學(xué)家提供分配所述受體生理功能的能力。例如,掃描疾病組織樣品和正常組織樣品中GPCR的存在目前不僅僅是學(xué)術(shù)運(yùn)用,人們可以使用該方法鑒定針對特定GPCR的內(nèi)源配體。可以對廣泛范圍的健康組織和疾病組織進(jìn)行組織掃描。所述組織掃描為將特定受體與疾病和/或紊亂聯(lián)系提供潛在的第一步。此外,在疾病器官中表達(dá)受體能夠幫助人們確定所述受體臨床相關(guān)性的重要性。
可以使用GPCR的DNA序列制造探針/引物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中,使用所述DNA序列制造探針用于(a)針對組織mRNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交分析,和/或(b)RT-PCR鑒定所述受體在組織樣品中的表達(dá)。受體在源組織或疾病組織中的存在、或者所述受體在疾病組織中以比正常組織更高的濃度存在可以用于將定位與功能聯(lián)系起來,指出所述受體的生理作用/功能,并創(chuàng)建治療療法,用于治療包括但不限于與所述功能/作用相關(guān)的疾病。用該技術(shù)也可以將受體定位于器官的區(qū)。根據(jù)所述受體定位的特定組織的已知或假定作用/功能,可以推導(dǎo)所述受體的推定生理功能。例如但不限于此實(shí)例,在丘腦區(qū)域內(nèi)定位/表達(dá)的蛋白與感覺運(yùn)動處理和覺醒有關(guān)(見Goodman &Gilman’s,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第9版,第465頁(1996))。在海馬或許旺細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白分別與學(xué)習(xí)和記憶以及外周神經(jīng)的髓鞘形成有關(guān)(見Kandel,E.等,Essentials of Neural Scienceand Behavior分別在第657、680和28頁(1995))。
E.篩選候選化合物1.GPCR類篩選測定技術(shù)當(dāng)G蛋白受體組成型活化時,它結(jié)合G蛋白(如Gq、Gs、Gi、Gz、Go)并刺激GTP結(jié)合所述G蛋白。所述G蛋白隨后作為GTP酶起作用,水解GTP成為GDP,由此所述受體在正常條件下失活。然而,組成型活化的受體繼續(xù)轉(zhuǎn)化GDP成為GTP。一種GTP的不可水解的類似物[35S]GTPγS可以用于監(jiān)測表達(dá)組成型活化受體的膜的增強(qiáng)結(jié)合。據(jù)報(bào)道,[35S]GTPγS可用于在配體存在和不存在的情況下監(jiān)測G蛋白偶聯(lián)膜。在其它眾所周知并且本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員使用的例子中,該監(jiān)測的一個例子由Traynor和Nahorski在1995年報(bào)道。該測定系統(tǒng)的應(yīng)用一般是用于候選化合物的初步篩選,因?yàn)樵撓到y(tǒng)可普遍應(yīng)用于所有G蛋白偶聯(lián)受體,包括與受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的特定G蛋白。
2.特異性GPCR篩選測定技術(shù)一旦使用“類”G蛋白偶聯(lián)受體測定(用于選擇成為激動劑或反激動劑的化合物的測定)鑒定候選化合物,優(yōu)選進(jìn)行進(jìn)一步的篩選,確認(rèn)所述化合物在所述受體位點(diǎn)有相互作用。例如,通過所述“類”測定鑒定的化合物不一定結(jié)合所述受體,但可能僅使所述G蛋白從所述細(xì)胞內(nèi)域上“解偶聯(lián)”。
a.Gs、Gz和Gi。
Gs刺激腺苷酸環(huán)化酶。另一方面,Gi(以及Gz和Go)抑制腺苷酸環(huán)化酶。腺苷酸環(huán)化酶催化ATP到cAMP的轉(zhuǎn)化;因此,偶聯(lián)Gs蛋白的組成型活化GPCR與cAMP細(xì)胞內(nèi)水平增加有關(guān)。另一方面,偶聯(lián)GI(或Gz、Go)蛋白的組成型活化GPCR與cAMP細(xì)胞內(nèi)水平降低有關(guān)。一般可見,”突觸傳遞的間接機(jī)制”,第8章,F(xiàn)rom Neuron toBrain(第3版)Nichols,J.G.等編輯,Sinauer Associates,Inc.(1992)。因此,可以利用檢測cAMP的測定確定候選化合物是否是例如所述受體的反激動劑(即所述化合物會降低cAMP的水平)??梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的測量cAMP的多種方法;最優(yōu)選的方法依賴于應(yīng)用基于ELISA模式的抗cAMP抗體。可以利用的其它類型測定是全細(xì)胞第二信使報(bào)道系統(tǒng)測定?;騿幼域?qū)動特定基因編碼的蛋白的表達(dá)。環(huán)狀A(yù)MP通過如下機(jī)制驅(qū)動基因表達(dá)環(huán)狀A(yù)MP促進(jìn)cAMP反應(yīng)性DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合,所述cAMP反應(yīng)性DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子隨后結(jié)合特定位點(diǎn)的啟動子(cAMP反應(yīng)元件)并驅(qū)動所述基因表達(dá)??梢詷?gòu)建報(bào)道系統(tǒng),所述報(bào)道系統(tǒng)在報(bào)道基因(如β-半乳糖苷酶或螢光素酶)之前具有包含多個cAMP反應(yīng)元件的啟動子。因此,組成型活化Gs偶聯(lián)的受體導(dǎo)致cAMP的積累,而cAMP的積累隨后活化基因,導(dǎo)致所述報(bào)道基因的表達(dá)。隨后使用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)測定(Chen等1995)檢測報(bào)道蛋白如β-半乳糖苷酶或螢光素酶。
b.Go和Gq。
Gq和Go與磷脂酶C的活化有關(guān),而磷脂酶C隨后水解磷脂PIP2,釋放兩種細(xì)胞內(nèi)信使二酰甘油(DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)。IP3積累的增加與Gq和Go相關(guān)受體的活化有關(guān)。一般可見,”突觸傳遞的間接機(jī)制”,第8章,F(xiàn)rom Neuron to Brain(第3版)Nichols,J.G.等編輯Sinauer Associates,Inc.(1992)。可以利用檢測IP3積累的測定來確定候選化合物是否是例如Gq和Go相關(guān)受體的反激動劑(即所述化合物降低IP3的水平)。也可以使用AP1報(bào)道測定檢查Gq相關(guān)受體,其中依賴于Gq的磷脂酶導(dǎo)致包含AP1元件的基因活化;因此,活化的Gq相關(guān)受體將表現(xiàn)所述基因的表達(dá)增加,由此其反激動劑將表現(xiàn)所述基因表達(dá)的降低,而激動劑將表現(xiàn)所述表達(dá)的增加??梢垣@得這種檢測的商業(yè)化測試。
3.GPCR融合蛋白應(yīng)用內(nèi)源組成型活化GPCR或非內(nèi)源組成型活化GPCR進(jìn)行篩選候選化合物以直接鑒定反激動劑造成一個有趣的篩選難題,因?yàn)楦鶕?jù)定義,受體甚至在缺乏與其結(jié)合的內(nèi)源配體時也是有活性的。因此,為了區(qū)分如在存在候選化合物情況下的非內(nèi)源受體以及在不存在候選化合物情況下的非內(nèi)源受體,這種區(qū)分的目的在于了解所述化合物是否是反激動劑或激動劑或?qū)λ鍪荏w沒有影響,優(yōu)選利用能夠增強(qiáng)所述區(qū)分的方法。優(yōu)選方法是應(yīng)用GPCR融合蛋白。
一般地說,一旦使用上文所述測定技術(shù)(以及其它的技術(shù))確定非內(nèi)源GPCR已經(jīng)組成型活化,就有可能確定偶聯(lián)所述內(nèi)源GPCR的主要G蛋白。偶聯(lián)所述G蛋白到所述GPCR提供能夠評價的信號途徑。在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行篩選,預(yù)期所述系統(tǒng)將在其中包括內(nèi)源G蛋白。因此,根據(jù)定義,在所述系統(tǒng)中,所述非內(nèi)源組成型活化GPCR將持續(xù)給出信號。在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選增強(qiáng)所述信號,以便在例如所述受體的反激動劑存在下,更有可能更容易地在篩選情況下區(qū)分與所述反激動劑接觸的受體。
所述GPCR融合蛋白將增強(qiáng)與所述非內(nèi)源GPCR偶聯(lián)的G蛋白的功效。所述GPCR融合蛋白優(yōu)選用于內(nèi)源組成型活化GPCR或非內(nèi)源組成型活化GPCR的篩選,因?yàn)樗龇椒ㄔ鰪?qiáng)在所述篩選技術(shù)中利用的信號。這對于獲得有效的“信噪”比是重要的;篩選如本文公開的候選化合物優(yōu)選所述信噪比。
構(gòu)建用于表達(dá)GPCR融合蛋白的構(gòu)建物在本領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。商業(yè)化表達(dá)載體和系統(tǒng)提供適合研究者具體需要的各種方法。構(gòu)建所述GPCR融合蛋白構(gòu)建物的重要標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于所述內(nèi)源GPCR序列和所述G蛋白序列都符合讀框(最好所述內(nèi)源GPCR的序列在所述G蛋白序列上游),并且所述GPCR的“終止”密碼子缺失或受到取代,以便表達(dá)所述GPCR時也能夠表達(dá)所述G蛋白。其它實(shí)施方案包括這樣的構(gòu)建物在所述構(gòu)建物中所述內(nèi)源GPCR序列和所述G蛋白序列不符合讀框和/或所述“終止”密碼子沒有缺失或受到取代。所述GPCR可以直接連接所述G蛋白,或者在二者之間有間隔區(qū)殘基(雖然殘基數(shù)量可以容易地由本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員確定,但最好不超過約12)。從方便的需要考慮,優(yōu)選使用間隔區(qū)。偶聯(lián)所述非內(nèi)源GPCR的所述G蛋白已經(jīng)在制造所述GPCR融合蛋白構(gòu)建物前得到鑒定。因?yàn)閮H有少數(shù)G蛋白得到鑒定,所以優(yōu)選獲取包含所述G蛋白序列的構(gòu)建物(即通用G蛋白構(gòu)建物(見實(shí)施例))以在其中插入內(nèi)源GPCR序列;這使大規(guī)模篩選多種具有不同序列的不同內(nèi)源GPCR的效率更高。
如上文所述,預(yù)期偶聯(lián)Gi、Gz和Go的組成型活化GPCR抑制cAMP的形成,這使得基于這些GPCR類型的測定成為可能(即cAMP信號在活化時降低,因此使得直接鑒定如反激動劑(反激動劑將進(jìn)一步降低該信號)成為可能)。如下文公開,我們已經(jīng)確定對于這些類型受體,有可能創(chuàng)造不基于所述GPCR內(nèi)源G蛋白的GPCR融合蛋白,以便建立可行的基于環(huán)化酶的測定。因此,例如,內(nèi)源Gi偶聯(lián)受體可以與Gs蛋白融合-所述融合構(gòu)建物表達(dá)時“驅(qū)動”或“驅(qū)使”所述內(nèi)源GPCR偶聯(lián)如Gs而不是“天然”Gi蛋白,以便可以建立基于環(huán)化酶的測定。因此,對于Gi、Gz和Go偶聯(lián)受體,在一些實(shí)施方案中,當(dāng)使用GPCR融合蛋白并且所述測定基于對腺苷酸環(huán)化酶的檢測時,優(yōu)選使用Gs(或者刺激腺苷酸環(huán)化酶形成的等同G蛋白)建立所述融合構(gòu)建物。
同等有效的是利用與Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合的Gq蛋白的G蛋白融合構(gòu)建物。在一些實(shí)施方案中,可以使用Gq蛋白獲得優(yōu)選的融合構(gòu)建物,所述Gq蛋白缺失G蛋白α亞單位(“Gαq”)的頭六(6)個氨基酸,并且Gαq的C末端的最后五(5)個氨基酸被目的G蛋白Gα的對應(yīng)氨基酸取代。例如,融合構(gòu)建物可以具有與Gi蛋白融合的Gq(缺失6個氨基酸),產(chǎn)生“Gq/Gi融合構(gòu)建物”。該融合構(gòu)建物將驅(qū)使內(nèi)源Gi偶聯(lián)受體與其非內(nèi)源G蛋白Gq偶聯(lián),以便可以測量第二信使(例如肌醇三磷酸或二酰甘油)以替代測量cAMP產(chǎn)生。
4.靶Gi偶聯(lián)GPCR與信號增強(qiáng)劑Gs偶聯(lián)GPCR的共轉(zhuǎn)染(基于cAMP的測定)已知Gi偶聯(lián)受體抑制腺苷酸環(huán)化酶,并因此降低cAMP產(chǎn)量的水平,這使得評價cAMP的水平成為可能。測量cAMP產(chǎn)量降低(在活化時主要偶聯(lián)Gi的受體組成型活化的指標(biāo))的有效技術(shù)能夠如下完成共轉(zhuǎn)染信號增強(qiáng)劑和與Gi連接的GPCR,所述信號增強(qiáng)劑例如是活化時主要偶聯(lián)Gs的非內(nèi)源組成型活化受體(如下文公開的TSHR-A623I)。明顯的是,可以根據(jù)cAMP產(chǎn)量的增加測定Gs偶聯(lián)受體的組成型活化。Gi偶聯(lián)受體的組成型活化導(dǎo)致cAMP產(chǎn)量減少。因此,所述共轉(zhuǎn)染方法將有利地利用這些“對立”效應(yīng)。例如共轉(zhuǎn)染非內(nèi)源組成型活化的Gs偶聯(lián)受體(所述“信號增強(qiáng)劑”)以及所述內(nèi)源Gi偶聯(lián)受體(所述“靶受體”),提供基礎(chǔ)cAMP信號(即雖然所述Gi偶聯(lián)受體會降低cAMP水平,但該“增加”對于組成型活化的Gs偶聯(lián)信號增強(qiáng)劑建立的cAMP水平實(shí)質(zhì)性增加是相對的)。然后通過共轉(zhuǎn)染所述信號增強(qiáng)劑與所述靶受體的組成型活化形式,預(yù)期cAMP將由于所述Gi靶的活性增加(即降低cAMP)而相對于基礎(chǔ)進(jìn)一步降低。
然后可以使用基于cAMP的測定篩選候選化合物,其中相對于應(yīng)用所述內(nèi)源受體/G蛋白融合體有兩個“改變”首先,相對所述Gi偶聯(lián)的靶受體,將會產(chǎn)生“對立”效應(yīng),即所述Gi偶聯(lián)靶受體的反激動劑會增加測量的cAMP信號,而所述Ci偶聯(lián)靶受體的激動劑將降低該信號;第二,明顯的是,應(yīng)該獨(dú)立評價使用該方法直接鑒定的候選化合物,以保證它們并不靶向所述信號增強(qiáng)受體(這可以在針對所述共轉(zhuǎn)染受體進(jìn)行篩選之前或之后完成)。
F.藥物化學(xué)一般而言,但并不是在所有情況下,將通過組合化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生化合物與直接鑒定候選化合物結(jié)合起來進(jìn)行,由此隨機(jī)制備用于所述分析的幾千種化合物。一般地說,所述篩選將產(chǎn)生具有獨(dú)特核心結(jié)構(gòu)的化合物;此后,圍繞優(yōu)選核心結(jié)構(gòu)對這些化合物進(jìn)行其它化學(xué)修飾,進(jìn)一步增強(qiáng)它們的藥物特性。所述技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的,并且將不在本專利文件中詳細(xì)說明。
G.藥用組合物可以將選出用于進(jìn)一步發(fā)展的候選化合物使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)配制成藥用組合物。合適的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員知道的;例如,見Remington’s PharmaceuticalSciences,第16版,1980,Mack Publishing Co.,(Osol等編輯)。
H.其它應(yīng)用雖然本文公開的GPCR的非內(nèi)源形式的優(yōu)選應(yīng)用是直接鑒定用作反激動劑或激動劑(最好用作藥物)的候選化合物,但這些形式的GPCR有其它應(yīng)用。例如,可以利用加入GPCR的體外系統(tǒng)和體內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)一步闡明和了解這些受體在人體狀況(正?;蚣膊?中的作用,以及了解當(dāng)其應(yīng)用于信號級聯(lián)時組成型活化的作用。在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選所述內(nèi)源受體是“孤獨(dú)受體”,即未鑒定針對所述受體的內(nèi)源配體。因此,在一些實(shí)施方案中,可以使用所述修飾的非內(nèi)源GPCR了解內(nèi)源受體在人體內(nèi)的作用,然后因此鑒定內(nèi)源配體。也可以使用所述內(nèi)源配體進(jìn)一步闡明已知受體以及通過所述受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的途徑。特別是研究本專利文件后,所述公開受體的其它應(yīng)用對于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將變得明顯。
實(shí)施例為闡明本發(fā)明提供下面的實(shí)施例,而不是限制本發(fā)明。雖然本文公開了具體的核酸序列和氨基酸序列,但本領(lǐng)域內(nèi)一般技術(shù)人員能夠?qū)@些序列做小的修飾并獲得與下文報(bào)道結(jié)果相同或基本相似的結(jié)果。從一種序列到另一種序列(如從大鼠受體到人受體或從人受體A到人受體B)應(yīng)用或了解序列盒的傳統(tǒng)方法一般建立在序列排列對比技術(shù)的基礎(chǔ)上,使用所述技術(shù)排列對比所述序列,以確定共有區(qū)域。本文公開的突變方法并不依賴于該技術(shù),而是建立在算法方法以及距人GPCR的TM6區(qū)內(nèi)保守脯氨酸殘基的位置距離。一旦掌握該方法,本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員就有能力對此做出小的修飾并獲得與本文公開的結(jié)果實(shí)質(zhì)上相同的結(jié)果(即組成型活化)。所述修飾方法被認(rèn)為在本公開物的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1內(nèi)源性人GPCR1.鑒定人GPCR在搜索GenBankTM數(shù)據(jù)庫信息的基礎(chǔ)上鑒定所公開的內(nèi)源性人GPCR。在搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定得到下表(表C)所示的cDNA克隆表C
2.全長克隆a.hRUP28(Seq.Id.Nos.1&2)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP28。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AC073957的cDNA克隆,該克隆是來自染色體7的人基因組序列。
使用成人肝Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP285′-CAGAGCTCTGGTGGCCACCTCTGTCC-3′(SEQ.ID.NO.21;有義鏈,5′的起始密碼子),5′-CTGCGTCCACCAGAGTCACGTCTCC-3′(SEQ.ID.NO.22;反義鏈,3′的終止密碼子)。
使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech)在50μl反應(yīng)物中按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次95℃5分鐘;94℃30秒鐘;58℃30秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.16kb的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.1的核酸序列和SEQ.ID.NO.2推定的氨基酸序列。
b.hRUP29(Seq.Id.Nos.3&4)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP29。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AC0083865的cDNA克隆,該克隆是來自染色體7的人基因組序列。
使用人基因組DNA作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP295′-GTATGCCTGGCCACAATACCTCCAGG-3′(SEQ.ID.NO.23;有義鏈,包含起始密碼子),5′-GTTTGTGGCTAACGGCACAAAACACAATTCC-3′(SEQ.ID.NO.24;反義鏈,包含終止密碼子)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)在50μl反應(yīng)物中按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次95℃5分鐘;94℃30秒鐘;54℃30秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個930bp的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.EBiosystems)測序。
使用人白細(xì)胞和卵巢Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE),確定RUP29 cDNA的精確5′末端。使用具有下面序列的RUP29特異性引物(1)5′-GGTACCACAATGACAATCACCAGCGTCC-3′(SEQ.ID.NO.25)和AP1引物(Clontech)進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng),具有下面序列的RUP29特異性引物(2)5′-GGAACGTGAGGTACATGTGGATGTGCAGC-3′(SEQ.ID.NO.26)和AP2引物(Clontech)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。分離所述RACE反應(yīng)的產(chǎn)物,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen)并測序。見SEQ.ID.NO.3的核酸序列和SEQ.ID.NO.4的推定氨基酸序列。
c.hRUP30(Seq.Id.Nos.5&6)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP30。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AC055863的cDNA克隆,該克隆是來自染色體17的人基因組序列。
如下通過5′RACE-PCR克隆全長RUP30使用人胰腺M(fèi)arathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作為模板,用下面寡核苷酸5′-GCAGTGTAGCGGTCAACCGTGAGCAGG-3′(SEQ.ID.NO.27;有義鏈,包含起始密碼子)和AP1引物(Clontech)進(jìn)行第一輪RT-PCR,使用寡核苷酸5′-TGAGCAGGATGGCGATCCAGACTGAGGCGTGG-3′(SEQ.ID.NO.28;反義鏈,包含終止密碼子)和AP2引物(Clontech)進(jìn)行第二輪PCR。將通過所述5′RACE-PCR產(chǎn)生的DNA片段克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用SP6/T7引物(Stratagene)測序。
根據(jù)所述5′RACE產(chǎn)物的序列,使用人胰腺M(fèi)arathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作為模板,用下面引物通過RT-PCR克隆全長RUP305′-GAGGTACAGCTGGCGATGCTGACAG-3′(SEQ.ID.NO.29;有義鏈,ATG為起始密碼子),5′-GTGGCCATGAGCCACCCTGAGCTCC-3′(SEQ.ID.NO.30;反義鏈,3′的終止密碼子)。
使用Taq DNA聚合酶(Stratagene)在50μl反應(yīng)物中按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次94℃40秒鐘;94℃20秒鐘;64℃20秒鐘;72℃2分鐘;和72℃5分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.2kp的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序幾個克隆。見SEQ.ID.NO.5的核酸序列和SEQ.ID.NO.6的推定氨基酸序列。
d.hRUP31(Seq.Id.Nos.7&8)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP31。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AL356214的cDNA克隆,該克隆是來自染色體10的人基因組序列。
使用人乳腺M(fèi)arathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過RT-PCR克隆全長RUP315′-GGAATGTCCACTGAATGCGCGCGG-3′(SEQ.ID.NO.31;有義鏈,包含起始密碼子),5′-AGCTCGCCAGGTGTGAGAAACTCGG-3′(SEQ.ID.NO.32;反義鏈,3′的終止密碼子)。
使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech)在50μl反應(yīng)物中按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次94℃40秒鐘;94℃20秒鐘;66℃20秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃5分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.1kb的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.7的核酸序列和SEQ.ID.NO.8推定的氨基酸序列。
e.hRUP32(Seq.Id.Nos.9&10)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP32。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AL513524的cDNA克隆,該克隆是來自染色體6的人基因組序列。
使用人基因組DNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP325′-GCGTTATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3′(SEQ.ID.NO.33;有義鏈,包含起始密碼子),5′-GTATCCTGAACTTCGTCTATACAACTGC-3′(SEQ.ID.NO.34;反義鏈)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次94℃3分鐘;94℃20秒鐘;58℃20秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.06kb的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.9的核酸序列和SEQ.ID.NO.10推定的氨基酸序列。
f.hRUP33(Seq.Id.Nos.11&12)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP33。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AL513524的cDNA克隆,該克隆是來自染色體6的人基因組序列。
使用人基因組DNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP335′-CCCTCAGGAATGATGCCCTTTTGCCACAA-3′(SEQ.ID.NO.35;有義鏈,包含起始密碼子),
5′-ATCCATGTGGTTGGTGCATGTGGTTCGT-3′(SEQ.ID.NO.36;反義鏈)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次94℃3分鐘;94℃20秒鐘;56℃20秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.1kb的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.11的核酸序列和SEQ.ID.NO.12推定的氨基酸序列。
g.hRUP32(Seq.Id.Nos.13&14)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP34。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AL513524的cDNA克隆,該克隆是來自染色體6的人基因組序列。
使用人基因組DNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP325′-AAACAACAAACAGCAGAACCATGACCAGC-3′(SEQ.ID.NO.37;有義鏈,包含起始密碼子),5′-ACATAGAGACAAGTGACATGTGTGAACCAC-3′(SEQ.ID.NO.38;反義鏈)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次94℃3分鐘;94℃20秒鐘;60℃20秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.27kb的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.13的核酸序列和SEQ.ID.NO.14推定的氨基酸序列。
h.hRUP35(Seq.Id.Nos.15&16)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP35。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AC021089的cDNA克隆,該克隆是來自染色體16的人基因組序列。
使用人胎兒腦Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作為模板,通過5′RACE-PCR確定RUP35的5′序列。用寡核苷酸5′-GGTATGAGACCGTGTGGTACTTGAGC-3′(SEQ.ID.NO.39;有義鏈)和AP1引物(Clontech)進(jìn)行第一輪RT-PCR,使用寡核苷酸5′-GTGGCAGACAGCGATATACTGTCAATGG-3′(SEQ.ID.NO.40;反義鏈)和AP2引物(Clontech)進(jìn)行第二輪PCR。將通過所述5′RACE-PCR產(chǎn)生的DNA片段克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用SP6/T7引物(Stratagene)測序。
根據(jù)所述5′RACE產(chǎn)物的序列,使用人腦Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作為模板,用下面引物通過RT-PCR克隆全長RUP305′-GCGCTCATGGAGCACACGCACGCCCAC-3′(SEQ.ID.NO.41;有義鏈,ATG是起始密碼子),5′-GAGGCAGTAGTTGCCACACCTATGG-3′(SEQ.ID.NO.42;反義鏈,3′的終止密碼子)。使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech),在100μl反應(yīng)物中按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)45次95℃2分鐘;95℃20秒鐘;60℃20秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃5分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.0kp的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.15的核酸序列和SEQ.ID.NO.16的推定氨基酸序列。
i.hRUP36(Seq.Id.Nos.17&18)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP36。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AC090099的cDNA克隆,該克隆是來自染色體11的人基因組序列。
使用人基因組DNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP365′-CATCTGGTTTGTGTTCCCAGGGGCACCAG-3′(SEQ.ID.NO.43;義鏈,5′的起始密碼子),5′-GACAGTGTTGCTCTCAAAGTCCCGTCTGACTG-3′(SEQ.ID.NO.44;反義鏈,3′的終止密碼子)。使用TaqPlusPrecisionDNA聚合酶(Stratagene)在50μl反應(yīng)物中按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)30次95℃,5分鐘;95℃30秒鐘;70℃30秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個1.0kb的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.17的核酸序列和SEQ.ID.NO.18推定的氨基酸序列。
j.hRUP37(Seq.Id.Nos.19&20)在應(yīng)用GenBank數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上鑒定公開的人RUP37。當(dāng)搜索所述數(shù)據(jù)庫時,鑒定出登記號AC090099的cDNA克隆,該克隆是來自染色體11的人基因組序列。
使用人基因組DNA(Clontech)作為模板,用下列引物通過PCR克隆全長RUP375′-CTGTTTCCAGGGTCATCAGACTGGG-3′(SEQ.ID.NO.45;有義鏈),5′-GCAGCATTGCTCTCAAAGTCCTGTCTG-3′(SEQ.ID.NO.46;反義鏈)。使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次95℃5分鐘;95℃30秒鐘;62℃30秒鐘;72℃1分鐘30秒;和72℃7分鐘。
從1%瓊脂糖凝膠分離出一個969堿基對的PCR片段,克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big染料終止試劑盒(P.E.Biosystems)測序。見SEQ.ID.NO.19的核酸序列和SEQ.ID.NO.20推定的氨基酸序列。
實(shí)施例2制備非內(nèi)源組成型活化的GPCR本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠選擇用于突變核酸序列的技術(shù)。下文是用于生產(chǎn)上文公開的幾種人GPCR的非內(nèi)源形式的方法。下文公開的突變基于算法方法,由此距保守脯氨酸(或因此內(nèi)源保守取代)殘基開始的第16個氨基酸(位于所述GPCR的IC3區(qū)內(nèi))優(yōu)選突變?yōu)楸彼?、組氨酸、精氨酸或賴氨酸殘基,最優(yōu)選突變?yōu)橘嚢彼釟埢?br> 1.Transformer Site-DirectedTM誘變可以使用例如Transformer Site-DirectedTM誘變試劑盒(Clontech),按照生產(chǎn)商的指導(dǎo),從人GPCR制備非內(nèi)源性人GPCR。在一些實(shí)施方案中,使用兩種誘變引物,最好是一種產(chǎn)生賴氨酸突變的賴氨酸誘變寡核苷酸以及一種選擇標(biāo)記寡核苷酸。為方便,以標(biāo)準(zhǔn)形式(表D)標(biāo)出加入所述人GPCR的密碼子突變表D
實(shí)施例3受體表達(dá)雖然本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以使用多種細(xì)胞表達(dá)蛋白,但優(yōu)選利用哺乳動物細(xì)胞。主要原因在于實(shí)用性,即雖然利用例如酵母細(xì)胞表達(dá)GPCR是可能的,但這在方法中引入不包含哺乳動物系統(tǒng)進(jìn)化出的受體偶聯(lián)、遺傳機(jī)制和分泌途徑(在酵母的情況下確實(shí)不包括這些)的非哺乳動物細(xì)胞,因此,在非哺乳動物細(xì)胞內(nèi)獲得的結(jié)果雖然可能是有用的,但更優(yōu)選使用哺乳動物細(xì)胞獲得的結(jié)果。在哺乳動物細(xì)胞中,雖然可以根據(jù)技術(shù)人員的需要選擇所利用的特定哺乳動物細(xì)胞,但尤其優(yōu)選COS-7、293和293T細(xì)胞。
a.瞬間轉(zhuǎn)染第一天,接種293細(xì)胞,6×106細(xì)胞/10cm碟。第二天,制備兩個反應(yīng)管(每管含一碟的用量)管A在0.5ml無血清DMEM(GibcoBRL)中含4μg DNA(如pCMV載體;攜帶受體cDNA的pCMV載體等);管B在0.5ml無血清DMEM中含24μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(GibcoBRL)。顛倒幾次,混合管A和管B,然后在室溫下溫育30-45分鐘。該混合物稱為“轉(zhuǎn)染混合物”。用1XPBS洗滌接種的293細(xì)胞,然后加入5ml無血清DMEM。在細(xì)胞中加入1ml所述轉(zhuǎn)染混合物,然后在37℃/5%CO2溫育4小時。吸走除去所述轉(zhuǎn)染混合物,隨后加入10ml DMEM/10%胎牛血清。在37℃/5%CO2溫育細(xì)胞。溫育48小時后,收獲細(xì)胞用于分析。
b.穩(wěn)定的細(xì)胞系將約12×106293細(xì)胞接種到15cm組織培養(yǎng)板,在含10%胎牛血清和百分之一丙酮酸鈉、L-谷氨酸和抗生素的DME High Glucose培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種293細(xì)胞二十四小時后(達(dá)到約80%匯合),用12μg DNA轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。將所述12μg DNA與60μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑和2mL無血清DME High Glucose培養(yǎng)基混合。從所述平板吸走除去所述培養(yǎng)基,用無血清培養(yǎng)基洗所述細(xì)胞一次。將所述DNA、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑和培養(yǎng)基混合物以及10mL無血清培養(yǎng)基加入所述平板。在37℃溫育四到五小時后,洗走除去所述培養(yǎng)基,然后加入25ml含血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后二十四小時,再次吸走除去培養(yǎng)基,然后加入含血清的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后四十八小時,吸走除去培養(yǎng)基,然后加入含終濃度500μg/mL遺傳霉素(G418藥物)的含血清培養(yǎng)基。然后選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞中含G418抗性基因的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。選擇過程中每四到五天更換一次培養(yǎng)基。選擇過程中,培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生穩(wěn)定的集合體,或傳代以選擇穩(wěn)定的克隆。
實(shí)施例4確定非內(nèi)源GPCR組成型活性的測定可以使用各種方法評價非內(nèi)源性人GPCR的組成型活性。下面是說明性的;本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員能夠確定最適合技術(shù)人員需要的那些技術(shù)。
1.膜結(jié)合測定[35S]GTPγS測定當(dāng)G蛋白偶聯(lián)受體由于配體結(jié)合或組成型活化而處于活性狀態(tài)時,所述受體偶聯(lián)G蛋白,刺激GDP釋放以及GTP隨后結(jié)合所述G蛋白。所述G蛋白受體復(fù)合物α亞單位作為GTP酶起作用,緩慢水解GTP成為GDP,一般在此之后所述受體失活。組成型活化的受體繼續(xù)轉(zhuǎn)換GTP與GDP??梢岳肎TP的不可水解類似物[35S]GTPγS證明[35S]GTPγS增強(qiáng)與膜表達(dá)的組成型活化受體的結(jié)合。使用[35S]GTPγS結(jié)合來測量組成型活化的好處包括但不限于以下(i)它可普遍應(yīng)用于所有G蛋白偶聯(lián)受體;(b)它接近膜表面,這使它較不可能拾起(pick-up)影響細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)的分子。
所述測定利用G蛋白偶聯(lián)受體刺激[35S]GTPγS結(jié)合表達(dá)相關(guān)受體的膜。因此,所述測定可以用于直接鑒定方法中,篩選針對組成型活化的G蛋白偶聯(lián)受體的候選化合物。所述測定是通用的,可應(yīng)用于所有G蛋白偶聯(lián)受體的藥物發(fā)現(xiàn)。
所述[35S]GTPγS測定在下面組合物中溫育1小時20mM HEPES和1到約20mM MgCl2(雖然優(yōu)選20mM,但為針對優(yōu)化結(jié)果而調(diào)整該量)pH7.4、含約0.3到約1.2nM[35S]GTPγS的結(jié)合緩沖液(雖然優(yōu)選1.2,但可以為優(yōu)化結(jié)果而調(diào)整該量)和12.5到75μg膜蛋白(如表達(dá)所述Gs融合蛋白的293細(xì)胞;可以為優(yōu)化而調(diào)整該量)以及10μMGDP(可以為優(yōu)化改變量)。隨后加入麥胚凝集素珠(25μl;Amersham),所述混合物在室溫下繼續(xù)溫育30分鐘。所述管隨后在室溫下于1500xg離心5分鐘,然后用閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
2.腺苷酸環(huán)化酶改造設(shè)計(jì)用于基于細(xì)胞測定的Flash PlateTM腺苷酸環(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear;Cat.No.SMP004A),將其用于粗質(zhì)膜。FlashPlate孔可以包含閃爍包被物,所述包被物也包含識別cAMP的特異性抗體。通過與放射性cAMP示蹤物直接競爭與所述cAMP抗體的結(jié)合,定量在孔內(nèi)產(chǎn)生的cAMP。下面是測量表達(dá)所述受體的全細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化的方法的簡短描述。
瞬間轉(zhuǎn)染約二十四小時后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞。小心地吸出并棄去培養(yǎng)基。在每碟細(xì)胞中溫和加入10ml PBS,然后小心吸出。每平板加入1ml Sigma細(xì)胞解離緩沖液和3ml PBS。用移液管將細(xì)胞吸出平板,將所述細(xì)胞懸浮液收集入50ml圓錐形離心管。細(xì)胞在室溫下于1,100rpm離心5分鐘。小心地重懸浮細(xì)胞沉淀于合適體積的PBS(約3ml/平板)。然后使用血細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞,補(bǔ)充加入PBS,獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞(達(dá)到約50μl/孔的終體積)。
按照廠家指導(dǎo)制備和維持cAMP標(biāo)準(zhǔn)和檢測緩沖液(在11ml檢測緩沖液內(nèi)含1μCi示蹤物[125I cAMP(50μl)])。新鮮制備用于篩選的測定緩沖液,所述測定緩沖液含50μl刺激緩沖液、3μl測試化合物(12μM最終測定濃度)和50μl細(xì)胞,將所述測定緩沖液保存在冰上直到使用。在合適孔內(nèi)加入50μl cAMP標(biāo)準(zhǔn),然后在H-11和H12孔加入50μl PBSA,開始測定。在所有孔內(nèi)加入50μl刺激緩沖液。使用能夠分配3μl化合物溶液的加樣工具(pin tool),在合適孔內(nèi)加入DMSO(或選定候選化合物),達(dá)到12μM測定化合物的終濃度和100μl總測定體積。然后在孔內(nèi)加入細(xì)胞,在室溫下溫育60分鐘。然后在孔內(nèi)加入100μl含示蹤cAMP的檢測混合物。繼續(xù)溫育平板2小時,然后使用Wallac MicroBetaTM閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。每塊測定平板都制作標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線,根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線外推cAMP/孔的值。
3.用于Gi偶聯(lián)靶GPCR的基于細(xì)胞的cAMPTSHR是Gs偶聯(lián)GPCR,在活化時引起cAMP積累。通過突變氨基酸殘基623(即將丙氨酸殘基改變?yōu)楫惲涟彼釟埢?組成型活化TSHR。預(yù)期Gi偶聯(lián)受體抑制腺苷酸環(huán)化酶,并因此降低cAMP產(chǎn)量水平,這使得測定cAMP水平成為可能。測量cAMP產(chǎn)量降低(Gi偶聯(lián)受體組成型活化的指標(biāo))的有效技術(shù)是共轉(zhuǎn)染作為“信號增強(qiáng)劑”的最優(yōu)選非內(nèi)源組成型活化TSHR(TSHR-A623I)(或內(nèi)源組成型活化Gs偶聯(lián)受體)以及Gi連接的靶GPCR,建立基礎(chǔ)cAMP水平。在創(chuàng)造所述Gi偶聯(lián)受體的非內(nèi)源形式后,使用所述靶GPCR的該非內(nèi)源形式與所述信號增強(qiáng)劑共轉(zhuǎn)染,可以使用所述物質(zhì)進(jìn)行篩選。當(dāng)使用cAMP測定時,可以使用該方法有效產(chǎn)生信號;最好使用該方法針對Gi偶聯(lián)受體直接鑒定候選化合物。注意到對于Gi偶聯(lián)GPCR,當(dāng)使用該方法時,所述靶GPCR的反激動劑增加cAMP信號,而激動劑降低cAMP信號。
第一天,接種2×104293細(xì)胞/孔。第二天,制備兩個反應(yīng)管(每管含一碟的用量)管A如下制備混合轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動物細(xì)胞的每種受體2ug DNA,在1.2ml無血清DMEM(Irvine Scientific,Irvine,CA)中總量含4μg DNA(如pCMV載體;攜帶突變THSR(TSHR-A623I)的pCMV載體;TSHR-A623I和GPCR等);管B如下制備在1.2ml無血清DMEM中混合120μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco BRL)。顛倒幾次,混合管A和管B,然后在室溫下溫育30-45分鐘。該混合物稱為“轉(zhuǎn)染混合物”。用1XPBS洗滌接種的293細(xì)胞,然后加入10ml無血清DMEM。在細(xì)胞中加入2.4ml所述轉(zhuǎn)染混合物,然后在37℃/5%CO2溫育4小時。吸走除去所述轉(zhuǎn)染混合物,隨后加入25mlDMEM/10%胎牛血清。在37℃/5%CO2溫育細(xì)胞。溫育24小時后,收獲細(xì)胞用于分析。
可以根據(jù)技術(shù)人員需要,改造設(shè)計(jì)用于基于細(xì)胞測定的FlashPlateTM腺苷酸環(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear;Cat.No.SMP004A),將其用于粗質(zhì)膜。Flash Plate孔可以包含閃爍包被物,所述包被物也包含識別cAMP的特異性抗體。通過與放射性cAMP示蹤物直接競爭與所述cAMP抗體的結(jié)合,定量在孔內(nèi)產(chǎn)生的cAMP。下面是測量表達(dá)所述受體的全細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化的方法的簡短描述。
瞬間轉(zhuǎn)染約二十四小時后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞。小心地吸出并棄去培養(yǎng)基。在每碟細(xì)胞中溫和加入10ml PBS,然后小心吸出。每平板加入1ml Sigma細(xì)胞解離緩沖液和3ml PBS。用移液管將細(xì)胞吸出平板,將所述細(xì)胞懸浮液收集入50ml圓錐形離心管。細(xì)胞在室溫下于1,100rpm離心5分鐘。小心地重懸浮細(xì)胞沉淀于合適體積的PBS(約3ml/平板)。然后使用血細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞,補(bǔ)充加入PBS,獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞(達(dá)到約50μl/孔的終體積)。
按照廠家指導(dǎo)制備和維持cAMP標(biāo)準(zhǔn)和檢測緩沖液(在11ml檢測緩沖液內(nèi)含1μCi示蹤物[125I cAMP(50μl)])。新鮮制備用于篩選的測定緩沖液,所述測定緩沖液含50μl刺激緩沖液、3μl測試化合物(12μM最終測定濃度)和50μl細(xì)胞,將所述測定緩沖液保存在冰上直到使用。在合適孔內(nèi)加入50μl cAMP標(biāo)準(zhǔn),然后在H-11和H12孔加入50μl PBSA,開始測定。在所有孔內(nèi)加入50μl刺激緩沖液。使用能夠分配3μl化合物溶液的加樣工具,在合適孔內(nèi)加入選定化合物(如TSH),達(dá)到12μM測定化合物的終濃度和100μl總測定體積。然后在孔內(nèi)加入細(xì)胞,在室溫下溫育60分鐘。然后在孔內(nèi)加入100μl含示蹤cAMP的檢測混合物。繼續(xù)溫育平板2小時,然后使用WallacMicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。每塊測定平板都制作標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線,根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線外推cAMP/孔的值。
4.基于報(bào)道物的測定a.CRE-LUC報(bào)道物測定(Gs-偶聯(lián)受體)將293細(xì)胞和293T細(xì)胞以每孔2×104細(xì)胞的密度接種在96孔板上,第二天按照生產(chǎn)廠家的指導(dǎo)用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(BRL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如下制備用于每6孔轉(zhuǎn)染的DNA/脂質(zhì)混合物將在100μl DMEM內(nèi)的260ng質(zhì)粒DNA與100μl DMEM內(nèi)的2μl脂質(zhì)溫和混合(所述260ng質(zhì)粒DNA包含200ng 8xCRE-Luc報(bào)道質(zhì)粒、50ng含內(nèi)源報(bào)道物或非內(nèi)源報(bào)道物的pCMV或單獨(dú)的pCMV、以及10ng GPRS表達(dá)質(zhì)粒(在pcDNA3(Invitrogen)內(nèi)的GPRS)。如下制備所述8XCRE-Luc報(bào)道質(zhì)粒將大鼠促生長素抑制素啟動子(-71/+51)克隆進(jìn)pβgal-Basic質(zhì)粒(Clontech)的BglV-HindIII位點(diǎn),獲得載體SRIF-β-gal。由腺病毒模板AdpCF126CCRE8(見7 Human Gene Therapy 1883(1996))通過PCR獲得cAMP反應(yīng)元件的八個(8)拷貝,克隆進(jìn)SRIF-β-gal載體的Kpn-BglV位點(diǎn),產(chǎn)生8xCRE-β-gal報(bào)道載體。用得自pGL3-基礎(chǔ)載體(Promega)HindIII-BamHI位點(diǎn)的螢光素酶基因取代8xCRE-β-gal報(bào)道載體的β-半乳糖苷酶基因,產(chǎn)生8xCRE-Luc報(bào)道質(zhì)粒。在室溫下溫育30分鐘后,用400μl DMEM稀釋所述DNA/脂質(zhì)混合物,每孔加入100μl所述稀釋物。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育4小時后,每孔加入100μl含10%FCS的DMEM。第二天所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換到200μl/孔含10%FCS的DMEM。八小時后,用PBS洗孔一次,然后更換為100μl/孔不含酚紅的DMEM。第二天使用LucLiteTM報(bào)道基因測定試劑盒(Packard)根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)測定螢光素酶活性,在1450 MicroBetaTM閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)上讀數(shù)。
b.AP1報(bào)道測定(Gq結(jié)合受體)檢測Gq刺激作用的方法是基于如下已知特性依賴于Gq的磷脂酶C引起在啟動子中含AP1元件的基因活化??梢岳肞athdetectTMAP-1順式報(bào)道系統(tǒng)(Stratagene,目錄號219073),采用上文關(guān)于CREB報(bào)道測定陳述的方法,只是磷酸鈣沉淀的成分是410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-受體表達(dá)質(zhì)粒和20ng CMV-SEAP。
c.SRF-LUC報(bào)道測定(Gq結(jié)合受體)檢測Gq刺激的方法是基于如下已知特性依賴于Gq的磷脂酶C引起在啟動子中含血清反應(yīng)因子的基因活化??梢岳肞athdetectTMSRF-Luc報(bào)道系統(tǒng)(Stratagene),在如COS7細(xì)胞內(nèi)測定Gq偶聯(lián)活性。使用Mammalian TransfectionTM試劑盒(Stratagene,目錄號200285),根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo),用所述系統(tǒng)的質(zhì)粒成分以及編碼內(nèi)源或非內(nèi)源GPCR的指定表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。簡要地說,按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)在磷酸鈣沉淀內(nèi)混合410ng SRF-Luc、80ng pCMV-受體表達(dá)質(zhì)粒和20ngCMV-SEAP(分泌型堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒;測量培養(yǎng)基內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與對照相比的堿性磷酸酶活性,檢查樣品間轉(zhuǎn)染效率的差異)。將一半所述沉淀平均分配到96孔板的3個孔,在無血清培養(yǎng)基內(nèi)與所述細(xì)胞保持接觸24小時。最后5小時,根據(jù)指示,用1μl血管緊張肽溫育細(xì)胞。然后裂解細(xì)胞,使用LucliteTM試劑盒(Packard,目錄號6016911)和“Trilux 1450 Microbeta”液體閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac),按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)測定螢光素酶活性。使用GraphPad PrismTM2.0a(GraphPadSoftware Inc.)分析數(shù)據(jù)。
d.細(xì)胞內(nèi)IP3積累測定(Gq結(jié)合受體)第1天,將包含所述受體(內(nèi)源和/或非內(nèi)源)的細(xì)胞接種到24孔板上,一般是1×105細(xì)胞/孔(可以優(yōu)化該值)。第2天,如下轉(zhuǎn)染細(xì)胞首先混合50μl無血清DMEM/孔內(nèi)的0.25ug DNA和50μl無血清DMEM/孔內(nèi)的2μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺。溫和混合所述溶液,然后在室溫下溫育15-30分鐘。隨后用0.5ml PBS和400μl無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞,然后與轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混合并加入所述細(xì)胞。所述細(xì)胞在37℃/5%CO2溫育3-4小時,然后除去所述轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,更換為1ml/孔常規(guī)培養(yǎng)基。第3天,用3H-肌醇標(biāo)記細(xì)胞。簡要地說,除去所述培養(yǎng)基,用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞。然后每孔加入0.5ml無肌醇/無血清培養(yǎng)基(GIBCO BRL)和0.25μCi3H-肌醇,將細(xì)胞在37℃/5%CO2溫育過夜16-18小時。第4天,用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞,加入0.45ml測定培養(yǎng)基,或加入0.4ml測定培養(yǎng)基以及50μl 10x ketanserin(ket)達(dá)到10μM的終濃度,所述0.45ml測定培養(yǎng)基含無肌醇/無血清培養(yǎng)基、10μMpargyline、10mM氯化鋰。所述細(xì)胞隨后在37℃溫育30分鐘。用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞,每孔加入200μl新鮮冰冷的終止溶液(1M KOH;18mM硼酸鈉;3.8mM EDTA)。所述溶液在冰上保持5-10分鐘(或直到細(xì)胞裂解),然后加入200μl新鮮冰冷的中和溶液(7.5%HCL)中和。隨后將所述裂解物轉(zhuǎn)移到1.5ml微量離心管,每管加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。渦流振蕩所述溶液15秒鐘,將上層相加載到Biorad AG1-X8TM陰離子交換樹脂(100-200目)。首先用水以1∶1.25 W/V洗所述樹脂,然后將0.9ml上層相加載到柱上。用10ml 5mM肌醇和10ml 5mM硼酸鈉/60mM甲酸鈉洗柱。用2ml 0.1M甲酸/1M甲酸銨將肌醇三磷酸洗脫入含10ml閃爍混合物的閃爍小管。如下再生柱子用10ml0.1M甲酸/3M甲酸銨洗滌,用雙蒸水清洗兩次,然后4℃下保存于水中。
參考圖1。在圖1中,用下面蛋白轉(zhuǎn)染293細(xì)胞六氨基酸缺失的Gq蛋白“Gq(del)”;與Gi蛋白融合的Gq蛋白“Gq(del)/Gi”;內(nèi)源RUP32;和具有Gq(del)的RUP32(“RUP32+Gq(del)/Gi”)。根據(jù)測量RUP32與Gq(del)/Gi共轉(zhuǎn)染的IP3積累,這些數(shù)據(jù)指出RUP32并不與Gq蛋白內(nèi)源偶聯(lián)。然而,當(dāng)RUP32與Gq(del)/Gi融合蛋白共轉(zhuǎn)染時,RUP32不得不與Gq蛋白偶聯(lián)。RUP27+Gq(del)/Gi與內(nèi)源RUP32相比IP3積累增加約九(9)倍。該數(shù)據(jù)表明所述Gq(del)/Gi融合構(gòu)建物可以與GPCR共轉(zhuǎn)染,并可用于篩選激動劑或反激動劑。
參見圖2。在圖2中,用RUP35和RUP36受體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,并與對照pCMV相比。這些數(shù)據(jù)指出RUP35和RUP36都是內(nèi)源組成型活化的。RUP35與pCMV相比細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇增加約六(6)倍,RUP36與pCMV相比增加約四(4)倍。
實(shí)施例5制備融合蛋白a.GPCRGs融合構(gòu)建物可以如下完成組成型活化GPCR-G蛋白融合構(gòu)建物的設(shè)計(jì)工程化大鼠G蛋白Gsα(長形式;Itoh,H.等,83 PNAS 3776(1986))的5′末端和3′末端,在其上包括HindIII(5′-AAGCTT-3′)序列。確認(rèn)正確序列(包括側(cè)翼HindIII序列)后,通過使用pcDNA3.1(-)(Invitrogen,目錄號V795-20)的HindIII限制位點(diǎn)進(jìn)行亞克隆,將所述完整序列穿梭進(jìn)所述載體。亞克隆進(jìn)pcDNA3.1(-)后,確認(rèn)所述Gsα序列的正確取向。然后確認(rèn)在HindIII序列包含所述大鼠Gsα基因的修飾pcDNA3.1(-);該載體以后用作“通用”Gsα蛋白載體。所述pcDNA3.1(-)載體在HindIII位點(diǎn)上游包含多種眾所周知的限制位點(diǎn),因此有利地提供在所述Gs蛋白上游插入內(nèi)源組成型有活性GPCR的編碼序列的能力。可以利用同樣方法制造其它“通用”G蛋白載體,當(dāng)然也可以利用技術(shù)人員已知的其它商業(yè)化載體或?qū)@d體。在一些實(shí)施方案中,重要的標(biāo)準(zhǔn)是所述GPCR的序列在所述G蛋白序列的上游并且與所述G蛋白序列符合讀框。
所述G蛋白和所述GPCR間限制位點(diǎn)內(nèi)的間隔區(qū)是可選的。有義引物和反義引物分別包括XbaI和EcoRV限制位點(diǎn),使得在所述G蛋白和所述GPCR之間存在間隔區(qū)(歸因于所述限制位點(diǎn))。
然后利用PCR保證各個受體序列融合入上文公開的所述Gsα通用載體,其中使用下面方法在各管內(nèi)加入100ng編碼GPCR的cDNA,各管包含2μl每種引物(有義和反義)、3μl 10mM dNTP、10μl10XTaqPlusTMPrecision緩沖液、1μl TaqPlusTMPrecision聚合酶(Stratagene#600211)和80μl水。針對所述GPCR的反應(yīng)溫度和循環(huán)時間如下,其中步驟2到步驟4重復(fù)35次94℃1分鐘;94℃30秒鐘;62℃20秒鐘;72℃1分鐘40秒;然后72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳,然后純化。用XbaI和EcoRV消化所述純化產(chǎn)物,純化所需插入片段,連接進(jìn)所述Gs通用載體的各個限制位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化后分離陽性克隆,然后通過限制酶消化確認(rèn);按照上文陳述的方法完成使用293細(xì)胞的表達(dá)。測序GPCR-Gs融合蛋白的各個陽性克隆,確認(rèn)其正確性。
b.Gq(6氨基酸缺失)/Gi融合構(gòu)建物如下完成Gq(del)/Gi融合構(gòu)建物的設(shè)計(jì)去除Gαq亞單位N末端六(6)個氨基酸(氨基酸2到7,序列TLESIM(SEQ.ID.NO.47),并Gαi蛋白的對應(yīng)氨基酸(序列DCGLF(SEQ.ID.NO.49))取代C末端五(5)個氨基酸(序列EYNLV(SEQ.ID.NO.48))。使用質(zhì)粒63313作為模板,使用下面引物通過PCR獲得該融合構(gòu)建物5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGG-3′(SEQ.ID.NO.50)和5′-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ.ID.NO.51),所述質(zhì)粒63313包含攜帶血凝素標(biāo)記的小鼠Gαq野生型形式。小寫字母表示的核苷酸是間隔區(qū)。
利用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)通過如下循環(huán)擴(kuò)增,其中步驟2到4重復(fù)35次95℃2分鐘;95℃20秒鐘;56℃20秒鐘;72℃2分鐘;然后72℃7分鐘。將所述PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pCRII-TOPO載體(Invitrogen),使用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystems)測序。通過2步驟克隆方法,將來自包含所述融合構(gòu)建物序列的TOPO克隆的插入片段穿梭入表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的HindIII/BamHI位點(diǎn)。
實(shí)施例6所公開的人GPCR的組織分布RT-PCR應(yīng)用RT-PCR證實(shí)表達(dá),確認(rèn)幾種新型人GPCR的組織分布。所利用的寡核苷酸是GPCR特異性的,使用人多組織cDNA組合(MTC,Clontech)作為模板。在40μl反應(yīng)物內(nèi),按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)使用TaqDNA聚合酶(Stratagene)。將20μl所述反應(yīng)物加載到1.5%瓊脂糖凝膠上,分析所述RT-PCR產(chǎn)物。下面的表E列出受體、循環(huán)條件和所利用的引物,并且列出與所述受體有關(guān)的典型疾病/紊亂。
表E
與位于這些組織或區(qū)域中的受體有關(guān)的疾病和紊亂包括但不限于心臟紊亂和疾病(如血栓形成、心肌梗死、動脈粥樣硬化、心肌病)、腎病/紊亂(如腎衰竭、腎小管性酸中毒、腎性糖尿、腎原性尿崩癥、胱氨酸尿、多囊腎病)、嗜酸粒細(xì)胞增多、白細(xì)胞增多、白細(xì)胞減少、卵巢癌、性功能障礙、多囊卵巢綜合征、胰腺炎和胰腺癌、過敏性腸綜合征、結(jié)腸癌、Crohn氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、憩室炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纖維變性、肺炎、肺動脈高血壓、肺結(jié)核和肺癌、Parkinson氏病、運(yùn)動障礙和運(yùn)動失調(diào)、學(xué)習(xí)記憶障礙、飲食障礙(如厭食、貪食癥等)、肥胖、癌癥、胸腺瘤、重癥肌無力、循環(huán)系統(tǒng)疾病、前列腺癌、前列腺炎、腎病/紊亂(如腎衰竭、腎小管性酸中毒、腎性糖尿、腎原性尿崩癥、胱氨酸尿、多囊腎病)、感覺運(yùn)動處理和喚醒障礙、強(qiáng)迫觀念與行為的障礙、睪丸癌、陰莖異常勃起、前列腺炎、疝、內(nèi)分泌紊亂、性功能障礙、變態(tài)反應(yīng)、抑郁、精神病、偏頭痛、反流、精神分裂癥、潰瘍、支氣管痙攣、癲癇、前列腺肥大、焦慮、鼻炎、咽峽炎和青光眼。因此,本發(fā)明的方法可以用于診斷和/或治療這些和其它疾病和紊亂。
實(shí)施例7方法直接鑒定反激動劑和激動劑A.[35S]GTPγS測定雖然已經(jīng)使用內(nèi)源組成型有活性的GPCR直接鑒定可用作例如反激動劑的候選化合物,但由于未曾完全理解的原因,可能加劇測定內(nèi)的差異。在一些實(shí)施方案中,上文公開的GPCR融合蛋白也與非內(nèi)源組成型活化的GPCR一起應(yīng)用。當(dāng)使用所述蛋白時,測定內(nèi)差異看起來基本穩(wěn)定,由此獲得有效的信噪比。其良好結(jié)果是允許更可靠地鑒定候選化合物。因此,在一些實(shí)施方案中,優(yōu)選在直接鑒定時使用GPCR融合蛋白,并且當(dāng)使用所述融合蛋白時,利用下面測定方法。
1.膜制備最好如下制備包含目標(biāo)組成型有活性的孤獨(dú)GPCR融合蛋白、并且用于直接鑒定可用作反激動劑或激動劑的候選化合物的膜a.材料“膜刮除緩沖液”包含20mM HEPES和10mM EDTA,pH 7.4;“膜洗滌緩沖液”包含20mM HEPES和0.1mM EDTA,pH 7.4;“結(jié)合緩沖液”包含20mM HEPES,100mM NaCl和10mM MgCl2,pH7.4。
b.方法整個方法過程中所有物質(zhì)都保存在冰上。首先從匯合的單層細(xì)胞上吸走培養(yǎng)基,用10ml冷PBS清洗,然后吸走PBS。此后,加入5ml膜刮除緩沖液脫落細(xì)胞;然后將細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml離心管(4℃下在20,000rpm離心17分鐘)。此后,吸走上清,將沉淀重懸浮于30ml膜洗滌緩沖液,4℃下在20,000rpm離心17分鐘。吸走上清,將沉淀重懸浮于結(jié)合緩沖液。然后使用Brinkman PolytronTM勻漿器勻漿所述重懸浮的沉淀(破碎15-20秒鐘,直到物質(zhì)形成懸浮液)。該物質(zhì)在本文中稱為“膜蛋白”。
2.Bradford蛋白測定勻漿后,測定所述膜的蛋白濃度,例如使用Bradford蛋白測定方法進(jìn)行測定(稀釋蛋白到約1.5mg/ml,等分并冰凍(-80℃)等待以后使用;冰凍時,使用方法如下測定那一天,室溫下解凍冰凍的膜蛋白,然后旋渦振蕩,用Polytron在約12×1,000rpm勻漿約5-10秒鐘;注意在多次制備時,所述勻漿器在勻漿不同制備物之間應(yīng)當(dāng)充分清潔)。
a.材料結(jié)合緩沖液(如上文所述);Bradford染料試劑;按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)使用Bradford蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Biorad,目錄號500-0006)。
b.方法制備兩份管,一份管包括膜,另一份管作為對照“空白”。每管包含800μl結(jié)合緩沖液。此后,每管加入10μl Bradford蛋白標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml),在其中一管加入10μl膜蛋白(不是空白管)。此后,每管加入200μl Bradford染料試劑,旋渦振蕩。五分鐘后,再次旋渦振蕩兩管,將其中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到比色杯。使用CECIL 3041分光光度計(jì)在波長595對所述比色杯讀數(shù)。
3.直接鑒定測定a.材料GDP緩沖液含37.5ml結(jié)合緩沖液和2mg GDP(Sigma,目錄號G-7127),在結(jié)合緩沖液中順序稀釋獲得0.2μM GDP的濃度(每孔中GDP的最終濃度是0.1μM GDP);每孔的最終體積是200μl,包含候選化合物、100μl GDP緩沖液(最終濃度0.1μM GDP)、50μl結(jié)合緩沖液中的膜蛋白和50μl結(jié)合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(每10ml結(jié)合緩沖液2.5μl[35S]GTPγS)。
b.方法最好使用96孔板篩選候選化合物(可以冰凍在-80℃)。簡單勻漿膜蛋白(或攜帶表達(dá)載體的膜作為對照,所述表達(dá)載體不合所述GPCR融合蛋白)直到成為懸浮液。然后使用例如上文所述的Bradford蛋白測定方法測定蛋白濃度。用結(jié)合緩沖液稀釋膜蛋白(和對照)到0.25mg/ml(最終測定濃度12.5μg/孔)。此后,每個Wallac ScintistripTM(Wallac)孔加入100μl GDP緩沖液。然后使用5μl加樣工具在所述孔中轉(zhuǎn)移5μl候選化合物(即在總測定體積200μl中占5μl,構(gòu)成1∶40的比例,使得所述候選化合物的最終篩選濃度是10μM)。此外,為避免污染,每個轉(zhuǎn)移步驟后都在三個池內(nèi)清洗加樣工具,所述三個池盛有水(1X)、乙醇(1X)和水(2X),每次清洗后從加樣工具甩去多余液體,用紙和Kim抹布擦干所述工具。此后,每孔加入50μl膜蛋白(也利用對照孔,該孔包含沒有所述GPCR融合蛋白的膜),室溫下溫育5-10分鐘。此后,每孔加入50μl結(jié)合緩沖液內(nèi)的[35S]GTPγS(0.6nM),然后在搖床內(nèi)室溫下溫育60分鐘(同樣,在本實(shí)施例中,用箔片覆蓋平板)。通過在22℃下以4000RPM離心所述平板15分鐘,終止測定。用8通道多支管吸走平板中的液體,用平板蓋封口。然后所述平板在Wallac 1450上使用設(shè)置“Prot.#37”讀數(shù)(根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo))。
B.環(huán)狀A(yù)MP測定直接鑒定候選化合物的另一種測定方法可以使用基于環(huán)化酶的測定完成。除直接鑒定外,可以利用本測定方法作為獨(dú)立性的方法,確認(rèn)根據(jù)上文所述[35S]GTPγS方法獲得的結(jié)果。
最好根據(jù)下面方法,利用改良Flash PlateTM腺苷酸環(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear;目錄號SMP004A)直接鑒定可用作GPCR反激動劑和激動劑的候選化合物。
轉(zhuǎn)染后約三天收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞。勻漿在含20mM HEPES,pH7.4和10mM MgCl2的緩沖液內(nèi)懸浮的細(xì)胞,制備膜。使用BrinkrnanPolytronTM在冰上勻漿約10秒鐘。得到的勻漿物在4℃下于49,000Xg離心15分鐘。得到的沉淀重懸浮于含20mM HEPES,pH 7.4和0.1mMEDTA的緩沖液內(nèi),勻漿10秒鐘,然后在4℃下于49,000Xg離心15分鐘。得到的沉淀保存在-80℃直到使用。在直接鑒定篩選的那一天,在室溫下緩慢融化所述膜沉淀,重懸浮于含20mM HEPES,pH 7.4和10mM MgCl2的緩沖液,使得最終蛋白濃度為0.60mg/ml(所述重懸浮的膜置于冰上直到使用)。
按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)制備和維持cAMP標(biāo)準(zhǔn)和檢測緩沖液(在11ml檢測緩沖液內(nèi)含2μCi示蹤物[125I cAMP(100μl)])。新鮮制備用于篩選的測定緩沖液,所述緩沖液含20mM HEPES,pH 7.4,10mM MgCl2,20mM磷酸肌酸(Sigma),0.1單位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma),50μMGTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma);測定緩沖液保存在冰上直到使用。
最好將如上文鑒定的候選化合物(如果冰凍,則在室溫下解凍)加入96孔板的孔內(nèi)(3μl/孔;最終測定濃度12μM),并且加入40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl測定緩沖液。所述混合物在室溫下溫和攪拌溫育30分鐘。
溫育后,每孔加入100μl測定緩沖液,然后溫育2-24小時。然后在Wallac MicroBetaTM讀板機(jī)上使用“Prot.#31”讀板(根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo))。
C.黑素細(xì)胞篩選測定可以如下進(jìn)行鑒定GPCR候選激動劑或反激動劑的方法引入色素細(xì)胞系的測試細(xì)胞,所述測試細(xì)胞能夠應(yīng)對特定刺激分散或聚集它們的色素,并表達(dá)編碼所述GPCR的外源克隆。假如所述GPCR的活化誘導(dǎo)色素分散,則刺激物(如光)設(shè)置色素處理的起始狀態(tài)為色素聚集在測試細(xì)胞內(nèi)。然而,假如所述GPCR的活化誘導(dǎo)色素聚集,則用刺激物刺激細(xì)胞設(shè)置色素沉積的起始狀態(tài)為色素分散。使所述測試細(xì)胞與所述化合物接觸,確定細(xì)胞內(nèi)的色素處理是否從色素處理的起始狀態(tài)改變。與所述GPCR偶聯(lián)候選化合物引起的色素細(xì)胞分散在培養(yǎng)皿上看起來較暗,而色素細(xì)胞的聚集看起來叫亮。
材料和方法根據(jù)美國專利號5,462,856和美國專利號6,051,386的公開內(nèi)容,這兩份公開物通過引用結(jié)合到本文中。
雖然為利用內(nèi)源和非內(nèi)源性人GPCR的目的,本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以利用各種表達(dá)載體,但在一些實(shí)施方案中優(yōu)選所利用的載體是pCMV。該載體按照國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約規(guī)定于1998年10月13日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209 USA)。所述DNA經(jīng)過ATCC測試,確認(rèn)是有活力的。ATCC已經(jīng)對pCMV給予如下保藏號ATCC#203351。
除專門指明外,本專利文件中引用的參考文獻(xiàn),包括共同未決和相關(guān)專利申請都通過引用完整地結(jié)合到本文中。上面的公開方案和下面的權(quán)利要求包括在技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的對所公開發(fā)明的修改和擴(kuò)展。
序列表<110>Arena Pharmaceuticals,Inc.
<120>內(nèi)源和非內(nèi)源組成型活化人G蛋白偶聯(lián)受體<130>AREN-0309<150>09/170,496<151>1998-10-13<150>PCT/US99/23938<151>1998-10-13<150>60/253,404<151>2000-11-27<150>60/255,366<151>2000-12-12<150>60/270,286<151>2001-02-20<150>60/282,365<151>2001-04-06<150>60/270,266<151>2001-02-20<150>60/282,032<151>2001-04-06<150>60/282,358<151>2001-04-06<150>60/282,356<151>2001-04-06<150>60/290,917<151>2001-05-14<150>60/309,208<151>2001-07-31<160>67<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1002<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>1atgtggagct gcagctggtt caacggcaca gggctggtgg aggagctgcc tgcctgccag 60gacctgcagc tggggctgtc actgttgtcg ctgctgggcc tggtggtggg cgtgccagtg120ggcctgtgct acaacgccct gctggtgctg gccaacctac acagcaaggc cagcatgacc180atgccggacg tgtactttgt caacatggca gtggcaggcc tggtgctcag cgccctggcc240cctgtgcacc tgctcggccc cccgagctcc cggtgggcgc tgtggagtgt gggcggcgaa300gtccacgtgg cactgcagat ccccttcaat gtgtcctcac tggtggccat gtactccacc360gccctgctga gcctcgacca ctacatcgag cgtgcactgc cgcggaccta catggccagc420gtgtacaaca cgcggcacgt gtgcggcttc gtgtggggtg gcgcgctgct gaccagcttc480tcctcgctgc tcttctacat ctgcagccat gtgtccaccc gcgcgctaga gtgcgccaag540atgcagaacg cagaagctgc cgacgccacg ctggtgttca tcggctacgt ggtgccagca600ctggccaccc tctacgcgct ggtgctactc tcccgcgtcc gcagggagga cacgcccctg660gaccgggaca cgggccggct ggagccctcg gcacacaggc tgctggtggc caccgtgtgc720acgcagtttg ggctctggac gccacactat ctgatcctgc tggggcacac ggtcatcatc780tcgcgaggga agcccgtgga cgcacactac ctggggctac tgcactttgt gaaggatttc840tccaaactcc tggccttctc cagcagcttt gtgacaccac ttctctaccg ctacatgaac900cagagcttcc ccagcaagct ccaacggctg atgaaaaagc tgccctgcgg ggaccggcac960tgctccccgg accacatggg ggtgcagcag gtgctggcgt ag 1002<210>2<211>333<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>2Met Trp Ser Cys Ser Trp Phe Asn Gly Thr Gly Leu Val Glu Glu Leu1 5 10 15Pro Ala Cys Gln Asp Leu Gln Leu Gly Leu Ser Leu Leu Ser Leu Leu20 25 30Gly Leu Val Val Gly Val Pro Val Gly Leu Cys Tyr Asn Ala Leu Leu35 40 45Val Leu Ala Asn Leu His Ser Lys Ala Ser Met Thr Met Pro Asp Val50 55 60Tyr Phe Val Asn Met Ala Val Ala Gly Leu Val Leu Ser Ala Leu Ala65 70 75 80Pro Val His Leu Leu Gly Pro Pro Ser Ser Arg Trp Ala Leu Trp Ser85 90 95Val Gly Gly Glu Val His Val Ala Leu Gln Ile Pro Phe Asn Val Ser100 105 110Ser Leu Val Ala Met Tyr Ser Thr Ala Leu Leu Ser Leu Asp His Tyr
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<323>新型序列<400>8Met Ser Thr Glu Cys Ala Arg Ala Ala Gly Asp Ala Pro Leu Arg Ser1 5 10 15
Leu Glu Gln Ala Asn Arg Thr Arg Phe Pro Phe Phe Ser Asp Val Lys20 25 30Gly Asp His Arg Leu Val Leu Ala Ala Val Glu Thr Thr Val Leu Val35 40 45Leu Ile Phe Ala Val Ser Leu Leu Gly Asn Val Cys Ala Leu Val Leu50 55 60Val Ala Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ala Thr Ala Cys Leu Val Leu Asn65 70 75 80Leu Phe Cys Ala Asp Leu Leu Phe Ile Ser Ala Ile Pro Leu Val Leu85 90 95Ala Val Arg Trp Thr Glu Ala Trp Leu Leu Gly Pro Val Ala Cys His100 105 110Leu Leu Phe Tyr Val Met Thr Leu Ser Gly Ser Val Thr Ile Leu Thr115 120 125Leu Ala Ala Val Ser Leu Glu Arg Met Val Cys Ile Val His Leu Gln130 135 140Arg Gly Val Arg Gly Pro Gly Arg Arg Ala Arg Ala Val Leu Leu Ala145 150 155 160Leu Ile Trp Gly Tyr Ser Ala Val Ala Ala Leu Pro Leu Cys Val Phe165 170 175Phe Arg Val Val Pro Gln Arg Leu Pro Gly Ala Asp Gln Glu Ile Ser180 185 190Ile Cys Thr Leu Ile Trp Pro Thr Ile Pro Gly Glu Ile Ser Trp Asp195 200 205Val Ser Phe Val Thr Leu Asn Phe Leu Val Pro Gly Leu Val Ile Val210 215 220Ile Ser Tyr Ser Lys Ile Leu Gln Ile Thr Lys Ala Ser Arg Lys Arg225 230 235 240Leu Thr Val Ser Leu Ala Tyr Ser Glu Ser His Gln Ile Arg Val Ser245 250 255Gln Gln Asp Phe Arg Leu Phe Arg Thr Leu Phe Leu Leu Met Val Ser260 265 270Phe Phe Ile Met Trp Ser Pro Ile Ile Ile Thr Ile Leu Leu Ile Leu
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ttttctgaac atatataa 1038<210>10<211>345<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>10Met Ser Ser Asn Ser Ser Leu Leu Val Ala Val Gln Leu Cys Tyr Ala1 5 10 15Asn Val Asn Gly Ser Cys Val Lys Ile Pro Phe Ser Pro Gly Ser Arg20 25 30Val Ile Leu Tyr Ile Val Phe Gly Phe Gly Ala Val Leu Ala Val Phe35 40 45Gly Asn Leu Leu Val Met Ile Ser Ile Leu His Phe Lys Gln Leu His50 55 60Ser Pro Thr Asn Phe Leu Val Ala Ser Leu Ala Cys Ala Asp Phe Leu65 70 75 80Val Gly Val Thr Val Met Pro Phe Ser Met Val Arg Thr Val Glu Ser85 90 95Cys Trp Tyr Phe Gly Arg Ser Phe Cys Thr Phe His Thr Cys Cys Asp100 105 110Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Leu Phe His Leu Cys Phe Ile Ser Ile115 120 125Asp Arg Tyr Ile Ala Val Thr Asp Pro Leu Val Tyr Pro Thr Lys Phe130 135 140Thr Val Ser Val Ser Gly Ile Cys Ile Ser Val Ser Trp Ile Leu Pro145 150 155 160Leu Met Tyr Ser Gly Ala Val Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Asp Asp Gly165 170 175Leu Glu Glu Leu Ser Asp Ala Leu Asn Cys Ile Gly Gly Cys Gln Thr180 185 190Val Val Asn Gln Asn Trp Val Leu Thr Asp Phe Leu Ser Phe Phe Ile195 200 205Pro Thr Phe Ile Met Ile Ile Leu Tyr Gly Asn Ile Phe Leu Val Ala
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gcaagattaa ttagtgatgc caatcagaag ctccaaattg gattggaaat gaaaaatgga720atttcacaaa gcaaagaaag gaaagctgtg aagacattgg ggattgtgat gggagttttc780ctaatatgct ggtgcccttt ctttatctgt acagtcatgg acccttttct tcactacatt840attccaccta ctttgaatga tgtattgatt tggtttggct acttgaactc tacatttaat900ccaatggttt atgcattttt ctatccttgg tttagaaaag cactgaagat gatgctgttt960ggtaaaattt tccaaaaaga ttcatccagg tgtaaattat ttttggaatt gagttcatag 1020<210>12<211>339<212>PRT<213>人工序列<220>
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cacttgtgct tcatctgcat cgacaggtac attgtggtta ctgatcccct ggtctatgct420accaagttca ccgtgtctgt gtcgggaatt tgcatcagcg tgtcctggat tctgcctctc480acgtacagcg gtgctgtgtt ctacacaggt gtcaatgatg atgggctgga ggaattagta540agtgctctca actgcgtagg tggctgtcaa attattgtaa gtcaaggctg ggtgttgata600gattttctgt tattcttcat acctaccctt gttatgataa ttctttacag taagattttt660cttatagcta aacaacaagc tataaaaatt gaaactacta gtagcaaagt agaatcatcc720tcagagagtt ataaaatcag agtggccaag agagagagga aagcagctaa aaccctgggg780gtcacggtac tagcatttgt tatttcatgg ttaccgtata cagttgatat attaattgat840gcctttatgg gcttcctgac ccctgcctat atctatgaaa tttgctgttg gagtgcttat900tataactcag ccatgaatcc tttgatttat gctctatttt atccttggtt taggaaagcc960ataaaactta ttttaagtgg agatgtttta aaggctagtt catcaaccat tagtttattt 1020ttagaataa 1029<210>14<211>342<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>新型序列<400>26ggaacgtgag gtacatgtgg atgtgcagc 29<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>27gcagtgtagc ggtcaaccgt gagcagg 27<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>28tgagcaggat ggcgatccag actgaggcgtgg32<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>29gaggtacagc tggcgatgct gacag 25<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>30gtggccatga gccaccctga gctcc 25<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>31ggaatgtcca ctgaatgcgc gcgg24<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>32agctcgccag gtgtgagaaa ctcgg 25<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>33gcgttatgag cagcaattca tccctgctgg 30<210>34<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>34gtatcctgaa cttcgtctat acaactgc28<210>35<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>35ccctcaggaa tgatgccctt ttgccacaa 29<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>36atccatgtgg ttggtgcatg tggttcgt28<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>37aaacaacaaa cagcagaacc atgaccagc 29<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>38acatagagac aagtgacatg tgtgaaccac 30<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>39ggtatgagac cgtgtggtac ttgagc 26<210>40<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>40gtggcagaca gcgatatacc tgtcaatgg 29<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>41gcgctcatgg agcacacgca cgcccac 27<210>42<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>42gaggcagtag ttgccacacc tatgg 25<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>43catctggttt gtgttcccag gggcaccag 29<210>44<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>44gacagtgttg ctctcaaagt cccgtctgac tg 32<210>45<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>45ctgtttccag ggtcatcaga ctggg 25<210>46<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>46gcagcattgc tctcaaagtc ctgtctg 27
<210>47<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>47Thr Leu Glu Ser Ile Met1 5<210>48<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>48Glu Tyr Asn Leu Val1 5<210>49<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>49Asp Cys Gly Leu Phe1 5<210>50<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>50gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gagg 34<210>51<211>53<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>51gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg53<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>52gtcctcactg gtggccatgt actcc 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>53ctgcgtccac cagagtcacg tctcc 25<210>54<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>54cttggatgtt tgggctgccc ttctgc 26<210>55<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>55gtttgtggct aacggcacaa aacacaattc c31<210>56<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>56ctgctcacgg ttgaccgcta cactgc 26<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>57gtggccatga gccaccctga gctcc 25<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>58cttcttctcc gacgtcaagg 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>59cttcttctcc gacgtcaagg 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>60cttcttctcc gacgtcaagg 20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>61caacggtctg acaacctcct 20<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>62ttgctgtgat gtggcatttt g 21<210>63<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>63caggaagccc ataaaggcat caa 23<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>64acatcacctg cttcctgacc 20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>65ccagcatctt gatgcagtgt 20<210>66<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>66ccatctccaa aatcctcagt c 21<210>67<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>67gctgttaaga gcggacagga aa 2權(quán)利要求
1.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列編碼。
2.權(quán)利要求1的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
3.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.1的cDNA。
4.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求3的質(zhì)粒。
5.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列編碼。
6.權(quán)利要求5的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
7.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.3的cDNA。
8.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求7的質(zhì)粒。
9.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.6的氨基酸序列編碼。
10.權(quán)利要求9的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
11.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.5的cDNA。
12.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求11的質(zhì)粒。
13.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.8的氨基酸序列編碼。
14.權(quán)利要求13的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
15.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.7的cDNA。
16.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求15的質(zhì)粒。
17.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.10的氨基酸序列編碼。
18.權(quán)利要求17的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
19.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.9的cDNA。
20.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求19的質(zhì)粒。
21.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.12的氨基酸序列編碼。
22.權(quán)利要求21的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
23.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.11的cDNA。
24.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求23的質(zhì)粒。
25.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.14的氨基酸序列編碼。
26.權(quán)利要求25的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
27.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.13的cDNA。
28.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求27的質(zhì)粒,
29.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.16的氨基酸序列編碼。
30.權(quán)利要求29的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
31.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.15的cDNA。
32.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求31的質(zhì)粒。
33.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.18的氨基酸序列編碼。
34.權(quán)利要求33的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
35.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.17的cDNA。
36.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求35的質(zhì)粒。
37.一種G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體由SEQ.ID.NO.20的氨基酸序列編碼。
38.權(quán)利要求37的G蛋白偶聯(lián)受體,所述受體為非內(nèi)源組成活化型受體。
39.一種質(zhì)粒,所述質(zhì)粒包含一種載體以及SEQ.ID.NO.19的cDNA。
40.一種宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求39的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明在本專利文件中涉及跨膜受體,更具體地說涉及未知其內(nèi)源配體的人G蛋白偶聯(lián)受體,以及表現(xiàn)組成型活性的所述人GPCR的突變(非內(nèi)源)形式。
文檔編號C12N1/21GK1549858SQ01822271
公開日2004年11月24日 申請日期2001年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月27日
發(fā)明者R·陳, Z·L·楚, H·T·當(dāng), K·P·羅維茨, C·普里德, R 陳, 當(dāng), 楚, 羅維茨, 锏 申請人:阿倫納藥品公司
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