專利名稱：一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法。
背景技術(shù)：
阿魏酸是一種芳香族有機酸，廣泛存在于植物細胞壁中，是很多中草藥如阿 魏、當(dāng)歸等的有效成分之一?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等各行業(yè)。但 是阿魏酸在植物細胞壁中含量相對較低，且大多以單體或者聚體的形式結(jié)合在木 質(zhì)素和多糖之間，使細胞壁的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜致密，增加了纖維素酶水解的難度。 其提取工藝多為采用化學(xué)方法，產(chǎn)生大量有機試劑廢水，同時成本相對較高。
阿魏酸酯酶是近年來才分離純化出來的一種羧酸酯酶，它是一種胞外酶。阿 魏酸酯酶的來源比較廣泛，目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶微生物主要有黑曲霉(A m'g^)、鏈
霉菌(如5frej^ow少ces mw/m'"fo)、梭菌(如C7oWnWwm //jeA7woce//wm)、桿菌(如 5ac/〃M ^p)、孚L酸桿菌(7a"oZwc///0、假單胞菌(女口 i^ewt/oAwo"osy/wz-escem1 )等。 它可以將阿魏酸甲酯、多糖阿魏酸酯等中的阿魏酸游離出來。當(dāng)阿魏酸酯酶作用 于細胞壁時，可以將其中的阿魏酸單體或者聚體釋放出來。且阿魏酸酯酶與其它 細胞壁多糖水解酶之間存在協(xié)同作用，當(dāng)酯酶與植物細胞壁的降解酶同時作用 時，將大大提高細胞壁的降解率。同時研究了將木聚糖酶、阿魏酸酯酶及纖維素 酶同時作用于燕麥麩，還原糖的含量最高提高了近30%。但研究中均用純化酶， 成本高。
目前阿魏酸酯酶的生產(chǎn)方式以液態(tài)發(fā)酵為主，得到的阿魏酸酯酶的活性相對 較低，且廢水等造成很大的污染。
因此本發(fā)明旨在研究一種用汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，以克 服阿魏酸酯酶活性低的缺點，同時有效利用木質(zhì)纖維素資源，實現(xiàn)其生物量的全 利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在研究一種用汽爆秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下以汽爆植物秸稈為主要發(fā)酵培養(yǎng)基原料，以實驗室 篩選得到的高產(chǎn)阿魏酸酯酶的黑曲霉為菌種，用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方式生產(chǎn)阿魏酸酯
酶。所生產(chǎn)的阿魏酸酯酶酶活較高，最高達到450mU/g。
本發(fā)明生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，其特征在于該方法為向75-100% (質(zhì)量百 分比)汽爆處理的植物秸稈和0-25% (質(zhì)量百分比)麩皮中，加入水制成發(fā)酵培 養(yǎng)基，固液比l: 1-10，調(diào)pH值在3.0-11.0后滅菌，接入黑曲霉液體種子發(fā)酵 3-4d，發(fā)酵產(chǎn)物用水浸提2h后，離心除去固形物，上清液為阿魏酸酯酶液。
本發(fā)明中所用的滅菌方式為常規(guī)滅菌。
本發(fā)明中所述的汽爆處理是將秸稈粗切至3-15cm，按l: 1 (重量比)加入 水，混勻后裝入汽爆罐，于0.9-1.7MPa的蒸汽壓力下維壓4-12min后，瞬間減 壓釋放即得汽爆料；所述的秸稈是指稻草、麥草或者玉米秸稈。
本發(fā)明所用菌種為實驗室篩選得到的高產(chǎn)阿魏酸酯酶的黑曲霉，發(fā)酵基質(zhì)為 汽爆植物秸稈，所得到的阿魏酸酯酶酶活高，產(chǎn)率高，增大了酶法提取阿魏酸的 可行性。
本發(fā)明中阿魏酸酯酶酶活的測定中底物為去淀粉麥麩(DSWB)，按照 Johnson, K.G.的方法來制備。酶活測定方法為取稀釋一定倍數(shù)的酶液lml，用 pH6.0擰檬酸緩沖液補充至lOrnl， 50'C水浴保溫5min后，加入DSWS0.5g,反 應(yīng)20min，沸水浴3min終止反應(yīng)。酶解液過濾、離心，取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù) 后紫外測定阿魏酸的含量。
酶活力單位的定義在測定條件下每分鐘產(chǎn)生lpmol阿魏酸所需要的酶量為 一個酶活力單位。
本發(fā)明有以下優(yōu)點
1. 本發(fā)明采用的蒸汽爆破處理技術(shù)，使秸稈中的半纖維素和木質(zhì)素部分降解， 原料中糖含量較高，不僅為菌種生產(chǎn)提供的豐富、易利用的碳源，同時可作 為膨松劑，因此，利用汽爆處理的植物秸稈作為發(fā)酵底物使菌體長勢旺盛， 同時產(chǎn)酶酶活較高。
2. 該菌種適應(yīng)性強，在固液比1: 1-1: 10、 pH3.0-11.0之間均能生長良好，且
產(chǎn)酶酵活較高。有利于廉價原料的利用、降低生產(chǎn)成本。
3. 所生產(chǎn)的阿魏酸酯酶經(jīng)過進一步濃縮、分離純化，得到不同劑型的阿魏酸酯 酶制劑，可用作木質(zhì)纖維原料的纖維素酶解助劑、反芻動物粗纖維飼料的處 理，可以大大提高原料的利用率。


圖l.不同基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶時間曲線
圖2.初始pH值對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響
圖3.液固比對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的影響 隱汽爆稻草《汽爆麥草 A汽爆玉米秸稈
具體實施例方式
實施例l:汽爆麥草固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶
1. 汽爆麥草
將切至10-15cm長的麥草150g加水150ml，攪拌均勻，裝入汽爆罐中，通 入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.6MPa，維壓4min，打開 放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆麥草。
2. 發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌
在4g汽爆麥草中加入lg麩皮，加水至固液比l: 4，攪拌均勻，自然pH值， 于滅菌鍋中，12rC維持30min。
3. 接種
將已滅菌的培養(yǎng)基取出，于超凈臺上接入篩選得到的黑曲霉液體種子5ml， 攪拌均勻。于3(TC培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天得到發(fā)酵產(chǎn)物。
4. 酶液的制備
發(fā)酵產(chǎn)物加100ml蒸餾水，于搖床上28。C、 160rpm下震蕩2h。離心除去固 形物，上清液為阿魏酸酯酶酶液。
測定該酶液酶活在148.13-245.12mU/g。
實施例2:汽爆稻草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶
1. 汽爆稻草
將切至10-15cm長的稻草150g加水150ml，攪拌均勻，裝入汽爆罐中，通 入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.6MPa，維壓4min，打開 放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆稻草。
2. 發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌
在4g汽爆稻草中加入lg麩皮，加水至固液比l: 4，攪拌均勻，自然pH值， 于滅菌鍋中，12rC維持30min。
3. 接種
將已滅菌的培養(yǎng)基取出，于超凈臺上接入篩選得到的黑曲霉液體種子5ml， 攪拌均勻，于3(TC培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天得到發(fā)酵產(chǎn)物。
4. 酶液的制備
發(fā)酵產(chǎn)物加100ml蒸餾水，于搖床上28'C、 160rpm下震蕩2h。離心除去固 形物，上清液為阿魏酸酯酶酶液。
測定阿魏酸酯酶酶液酶活在151.82-273.18mU/g。
實施例3:汽爆玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶
1. 汽爆玉米秸稈
將切至3-5cm長的玉米秸稈150g加水150ml，將拌均勻，裝入汽爆罐中， 通入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.6MPa，維壓4min，打 開放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆玉米秸稈。
2. 發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌
在4g汽爆玉米秸稈中加入lg麩皮，加水至固液比l: 4,攪拌均勻，自然 pH值，于滅菌鍋中，12rC維持30min。
3. 接種
將已滅菌的培養(yǎng)基取出，于超凈臺上接入篩選得到的黑曲霉液體種子5ml， 攪拌均勻，于3(TC培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3天得到發(fā)酵產(chǎn)物。
4. 酶液的制備
發(fā)酵產(chǎn)物加100ml蒸餾水，于搖床上28i:、 160rpm下震蕩2h。離心除去固 形物，上清液為阿魏酸酯酶酶液。
測定阿魏酸酯酶酶液酶活在113.89-216.76mU/g。
實施例4:汽爆稻草不同溫度固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶
1. 汽爆稻草
將切至10-15cm長的稻草150g加水150ml，將拌均勻，裝入汽爆罐中，通 入蒸汽，待排出罐內(nèi)冷空氣后，關(guān)閉裝料閥，升壓到1.6MPa,維壓4min，打開 放料閥，瞬間減壓釋放即得汽爆稻草。
2. 發(fā)酵用培養(yǎng)基的制備及滅菌
在4g汽爆稻草中加入lg麩皮，加入水溶液，固液比l: 4，攪拌均勻，自 然pH值，于滅菌鍋中，12rC維持30min。
3. 接種
將己滅菌的培養(yǎng)基取出，于超凈臺上接入篩選得到的黑曲霉液體種子5ml， 攪拌均勻。分別與26'C、 28°C、 30°C、 32'C下培養(yǎng)3天得到發(fā)酵產(chǎn)物。
4. 酶液的制備
發(fā)酵產(chǎn)物加100ml蒸餾水，于搖床上28。C、 160rpm下震蕩2h。離心除去固 形物，上清液為阿魏酸酯酶酶液。
測定阿魏酸酯酶酶液酶活在258.41-333.31mU/g。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，該方法為向75-100％(質(zhì)量百分比)汽爆處理的植物秸稈和0-25％(質(zhì)量百分比)麩皮中，加入自來水制成發(fā)酵培養(yǎng)基，固液比1∶1-1∶10，調(diào)pH值在3.0-11.0后滅菌，接入黑曲霉液體種子發(fā)酵3-4d，發(fā)酵產(chǎn)物用水浸提，離心除去固形物，上清液為阿魏酸酯酶酶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，其特征在于汽爆處理是指在 汽爆罐中裝入粗切的植物秸稈，與0.9-1.7MPa的蒸汽壓力下對原料處理4- 12min，瞬間減壓釋放。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法中，其特征在于所述的植物 秸稈包括玉米秸稈、麥草或稻草。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法中，其特征在于所述的發(fā)酵用 菌種為黑曲霉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法中，其特征在于所說的黑曲霉 液體種子的接入量為相對固體料重的7-15%。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)酵工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法。該方法為向75-100％(質(zhì)量百分比)汽爆處理的植物秸稈和0-25％(質(zhì)量百分比)麩皮中，加水制成發(fā)酵培養(yǎng)基，固液比1∶1-10，調(diào)pH值在3.0-11.0后滅菌，接入液體種子發(fā)酵3-4d，發(fā)酵產(chǎn)物用水浸提，上清液為阿魏酸酯酶酶液。本發(fā)明所用發(fā)酵基質(zhì)資源豐富、價格低廉，發(fā)酵方式簡單，得到的阿魏酸酯酶活性高。
文檔編號C12N9/18GK101200712SQ200610165049
公開日2008年6月18日 申請日期2006年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日
發(fā)明者王洪川, 陳洪章 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所