專利名稱：一種檢測(cè)結(jié)核桿菌北京家族的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種通過(guò)檢測(cè)該基因的表達(dá)情況區(qū)分結(jié)核桿菌北京家族的方法。
背景技術(shù)：
目前結(jié)核病仍然是威脅人類健康的傳染病，據(jù)估計(jì)到2010年每年將有1200萬(wàn)新發(fā)病例，400萬(wàn)人死亡。結(jié)核病死灰復(fù)燃的一個(gè)重要原因是耐多藥菌株的流行和傳播。由于目前對(duì)耐藥結(jié)核桿菌沒(méi)有很好的治療藥物，因此使得人類對(duì)這一疾病的控制更加困難。
結(jié)核桿菌北京基因型是在1995年首次定義的，是結(jié)核桿菌中最大的一個(gè)家族。與其它家族相比這一家族有十分穩(wěn)定的間隔寡核苷酸圖譜(spoligotype)，并且在IS6110RFLP、多態(tài)性GC富集重復(fù)片段以及VNTR上具有高度相似性。自1990年以來(lái)美國(guó)CDC報(bào)道了12起耐多藥結(jié)核桿菌的爆發(fā)流行，后證實(shí)該耐多藥結(jié)核菌株屬于北京基因型的一個(gè)小分支。最近的研究發(fā)現(xiàn)由北京基因型結(jié)核桿菌引起的結(jié)核病在世界范圍內(nèi)所占比例超過(guò)四分之一。在中國(guó)這一基因型所占比例更是高達(dá)85％，并且這一基因型多與耐藥相關(guān)。還有研究推測(cè)BCG所引起的免疫反應(yīng)不能對(duì)北京基因型結(jié)核桿菌的感染起到保護(hù)作用。因此早期識(shí)別這一基因型的流行和傳播具有十分重要的意義。
結(jié)核桿菌的分子分型技術(shù)主要用于監(jiān)控引起這一疾病的菌株尤其是北京基因型的流行和傳播。Spoligotyping(Spacer Oligotyping)是目前區(qū)分北京基因型的金標(biāo)準(zhǔn)方法。但這一方法操作繁雜，費(fèi)用高不便于一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展及臨床快速檢測(cè)。因此結(jié)核桿菌北京基因型遺傳標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)可以使基因分型更加容易。有關(guān)快速方便檢測(cè)結(jié)核桿菌北京家族菌株的方法經(jīng)查新無(wú)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的區(qū)分結(jié)核桿菌北京基因型的方法。
本發(fā)明中，結(jié)核桿菌Rv0927c基因(NC_000962)在北京基因家族中表現(xiàn)為在第421-423位核苷酸有三個(gè)堿基AGC的缺失突變，并且這一基因在北京基因家族是不表達(dá)的。因此檢測(cè)分離株中該基因是否存在這一基因突變或者檢測(cè)這一蛋白是否表達(dá)即可明確該菌株是否為北京基因家族。
基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種鑒定結(jié)核桿菌北京基因家族的方法分離結(jié)核桿菌菌株中Rv0927c基因的編碼序列或者表達(dá)產(chǎn)物；檢測(cè)分離得到的Rv0927c基因序列或者其表達(dá)產(chǎn)物；Rv0927c基因不表達(dá)或者其編碼序列第421-423位有AGC(絲氨酸密碼子)缺失的待檢菌株為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
本發(fā)明中，鑒定結(jié)核桿菌的方法包括以下步驟(1)擴(kuò)增待檢結(jié)核桿菌菌株的Rv0927c基因；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析，分析該擴(kuò)增產(chǎn)物在核苷酸第421-423位是否有AGC的缺失；(3)如擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸在第421-423位有AGC的缺失者可判定為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
本發(fā)明中，擴(kuò)增序列可以采用序列分析、PCR-SSCP等方法來(lái)鑒定。
本發(fā)明中，步驟(1)中的擴(kuò)增引物為上游引物5’-ATAGAATTCATGATCCTGGATATGTTCCGT-3’；下游引物5’-AATAAGCTTTCACAGGTCCGGAATGGGAAG-3。
本發(fā)明中，所用引物也可以是對(duì)上述引物中的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸進(jìn)行改變、但是仍然能與Rv0927c基因相應(yīng)位置的序列結(jié)合的核苷酸序列。
本發(fā)明中，也可以通過(guò)檢測(cè)基因表達(dá)情況來(lái)鑒定菌株首先，裂解待檢結(jié)核桿菌菌體；然后，分析該裂解液中是否含有Rv0927c基因的表達(dá)產(chǎn)物；不含有Rv0927c基因表達(dá)產(chǎn)物的待檢菌株為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
本發(fā)明中，采用免疫印記法分析菌體裂解液中是否含有Rv0927c基因的表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明中所述的方法通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作完成。例如，菌體蛋白的獲得可以采用超聲波裂解、反復(fù)凍融等方法。分析裂解液中是否含有目標(biāo)蛋白，可以采用使蛋白與某種標(biāo)記物結(jié)合的方法，例如免疫方法、顯色劑標(biāo)記方法、同位素標(biāo)記方法等等。
本發(fā)明對(duì)北京基因型菌株該基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果北京基因型菌株表現(xiàn)為Rv0927c基因在第421-423位點(diǎn)存在AGC三個(gè)堿基的缺失突變；同時(shí)對(duì)結(jié)核桿菌H37Rv的Rv0927c進(jìn)行了克隆表達(dá)，免疫動(dòng)物，獲得相應(yīng)的抗體，又通過(guò)Western blot的方法證實(shí)北京基因型結(jié)核桿菌Rv0927c不表達(dá)。因此通過(guò)PCR擴(kuò)增Rv0927c基因，再進(jìn)行序列分析，根據(jù)有否突變即可明確菌株的基因型別。另一方面還可以利用Western blot的方法檢測(cè)這一基因是否表達(dá)，無(wú)表達(dá)者即為北京基因型。本發(fā)明使用的北京株和非北京株結(jié)核桿菌均經(jīng)過(guò)間隔區(qū)寡核苷酸分型法(Spoligotyping)鑒定。
本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)Rv0927c基因的突變和表達(dá)情況來(lái)判定結(jié)核桿菌的基因型別。這一方法與其它區(qū)分北京基因型的方法相比具有操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用不高，在一般實(shí)驗(yàn)室就可完成的特點(diǎn)。同時(shí)也為今后開(kāi)發(fā)更方便快捷的方法(如PCR-SSCP)奠定基礎(chǔ)。


圖1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖。其中，5為DL2000分子量Marker，6為pET28a，7為pET28a-Rv0927c(912bp)酶切圖2重組蛋白在BL21(DE3)中的表達(dá)電泳圖。其中，1.SDS-PAGE低分子量Marker，2.含有pET28a質(zhì)粒的未誘導(dǎo)BL21(DE3)3.含有重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)，4.純化的重組蛋白。
圖3Western blot鑒定非北京基因型結(jié)果圖。其中，8為分子量標(biāo)準(zhǔn)，9為H37Rv，10-16是非北京基因型菌株(這些不同數(shù)字標(biāo)記的菌株是來(lái)自于不同的分離株，用以說(shuō)明這一現(xiàn)象不是從1株菌種得到的，而是普遍現(xiàn)象)。
圖4為Western blot鑒定北京基因型結(jié)果圖。其中，8為分子量標(biāo)準(zhǔn)，21是H37Rv，17-20以及22-24是北京基因型菌株(這些不同數(shù)字標(biāo)記的菌株是來(lái)自于不同的分離株，用以說(shuō)明這一現(xiàn)象不是從1株菌種得到的，而是普遍現(xiàn)象)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 Rv0927c基因的PCR擴(kuò)增及序列分析(1)結(jié)核分枝桿菌H37Rv及其臨床分離菌株基因組DNA的制備結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)在7H9Broth液體培養(yǎng)基中，37℃，靜置培養(yǎng)2周。80℃，2小時(shí)滅活。用細(xì)菌DNA(小量)抽提試劑盒抽提基因組DNA。其中因結(jié)核菌的壁厚，細(xì)菌的消化時(shí)間延長(zhǎng)至3-5小時(shí)。
(2)Rv0927c基因的擴(kuò)增Rv0927c引物如下(含有EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn))上游5’-ATAGAATTCATGATCCTGGATATGTTCCGT-3’下游5’-AATAAGCTTTCACAGGTCCGGAATGGGAAG-3’PCR反應(yīng)體系10×buffer 5μl，dNTPs 5μl，DNA模板1μl，引物各1μl，Tag酶0.25μl，水36.75μl。反應(yīng)條件94℃1min，66℃1min，72℃3min，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。產(chǎn)物用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
(3)序列分析采用ABI377自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行序列分析，分析該擴(kuò)增產(chǎn)物在核苷酸第421-423位是否是AGC(絲氨酸密碼子)。如擴(kuò)增產(chǎn)物在第421-423位核苷酸上缺失AGC，則可判定該結(jié)核桿菌為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
實(shí)施例2 Rv0927c基因的表達(dá)及其多克隆抗體的制備(1)結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA的制備及Rv0927c PCR擴(kuò)增同實(shí)施例1(2)載體pET28a、Rv0927c的酶切、連接及轉(zhuǎn)化載體pET28a質(zhì)粒、Rv0927c的PCR產(chǎn)物使用EcoRI和HindIII雙酶切，37℃，過(guò)夜。用膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。T4DNA連接酶連接，16℃，過(guò)夜。
制備E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞取DH5α單菌落于3mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接于30mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，0℃冷卻放置10min，5kr/min 4℃離心5min收集菌體，重懸于10ml0.1mol/LCaCl2中。冰浴20min，5kr/min 4℃離心5min收集菌體。加預(yù)冷0.1mlmol/LCaCl2冰浴放置1小時(shí)以上備用。
轉(zhuǎn)化將10ml連接產(chǎn)物加入200ml E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，37℃熱休克5min，立即冰浴2min，加入LB培養(yǎng)液800ml，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，然后涂布于含50μg/ml Kana的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單菌落分別接種于3ml含50μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收菌，抽提質(zhì)粒DNA。用EcoRI和HindIII雙酶切鑒定。選取正確的重組子進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
(3)目的基因的表達(dá)轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的BL21(DE3)的大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。6 000r/min離心20min收集菌體，懸浮菌體，超聲裂解后，加入DNase(10μg/ml)，12 000r/min離心10min，收集沉淀即為粗包涵體。經(jīng)洗滌、溶解、透析，得到純化的蛋白。
(4)多克隆抗體的制備將重組目的蛋白免疫家兔，佐劑選用弗氏不完全佐劑(Sigma)，初始免疫劑量為200μg，加強(qiáng)免疫為100μg，共加強(qiáng)3次。并于加強(qiáng)免疫后7～10d試血，測(cè)定血清中抗體的效價(jià)。于最后1次免疫后8d心臟取血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)。
實(shí)施例3 北京基因型Western blot方法結(jié)核桿菌菌體經(jīng)超聲裂解后測(cè)定蛋白濃度，取樣品20μg蛋白與等體積的加樣緩沖液混合，煮沸3min，加樣，標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將SDS-PAGE應(yīng)用電轉(zhuǎn)法(電壓100V，時(shí)間1小時(shí))轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上后，將NC膜用5％脫脂奶粉封閉1h，依次加用封閉液稀釋的一抗(按照實(shí)施例2制備的多抗，稀釋度為1∶200)和二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG1∶30000，Sigma)后，最后用BCIP/NBT(Sigma)顯色，有特異性條帶后即刻用水沖洗終止反應(yīng)。將NC膜上的印跡結(jié)果掃描記錄。北京基因型菌株表現(xiàn)為不出現(xiàn)雜交條帶。非北京基因型表現(xiàn)為在30KDa處出現(xiàn)雜交條帶(見(jiàn)附圖3和4)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，其特征在于，分離結(jié)核桿菌菌株中Rv0927c基因的編碼序列或者表達(dá)產(chǎn)物；檢測(cè)分離得到的Rv0927c基因序列或者其表達(dá)產(chǎn)物；Rv0927c基因不表達(dá)或者其編碼序列第421-423位的三個(gè)堿基AGC缺失的待檢菌株為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)擴(kuò)增待檢結(jié)核桿菌菌株的Rv0927c基因；(2)測(cè)序分析擴(kuò)增產(chǎn)物，分析該擴(kuò)增產(chǎn)物在核苷酸第421-423位是否有AGC的缺失；(3)如擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸在第421-423位有AGC的缺失者可判定為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
3.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟(1)中的擴(kuò)增引物為上游引物5’-ATAGAATTCATGATCCTGGATATGTTCCGT-3’；下游引物5’-AATAAGCTTTCACAGGTCCGGAATGGGAAG-3。
4.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，首先，獲得待檢結(jié)核桿菌菌株的菌體蛋白；然后，分析得到的菌體蛋白中是否含有Rv0927c基因的表達(dá)產(chǎn)物；不含有Rv0927c基因表達(dá)產(chǎn)物的待檢菌株為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，采用免疫印記法分析得到的蛋白中是否含有Rv0927c基因的表達(dá)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種通過(guò)檢測(cè)該基因的表達(dá)情況區(qū)分結(jié)核桿菌北京家族的方法。本發(fā)明通過(guò)序列分析或Western blot方法檢測(cè)Rv0927c基因是否突變或者被表達(dá)；不能正常表達(dá)Rv0927c基因的待檢菌株即為結(jié)核桿菌北京基因型菌株。與其它區(qū)分北京基因型的方法相比，本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用不高，在一般實(shí)驗(yàn)室就可完成的特點(diǎn)，適于在臨床或者檢測(cè)研究中快速鑒定結(jié)核桿菌菌種。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1966721SQ20061011840
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月16日
發(fā)明者王洪海, 姜昕, 張文宏, 張穎 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)