專利名稱：傾斜式重力沉降活細胞截留裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種傾斜式重力沉降活細胞截流裝置，具體地說涉及一種用于在細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)過程中選擇性截留活細胞的傾斜式重力沉降裝置。
背景技術(shù)：
灌注培養(yǎng)方式是提高細胞密度的有效方法。這種培養(yǎng)方式的優(yōu)越性在于能夠在培養(yǎng)液體積不變的前提下不斷補入新鮮培養(yǎng)基，排出代謝物，使細胞快速生長并保持高活性，從而實現(xiàn)產(chǎn)物的高表達和高產(chǎn)率。開發(fā)細胞截流裝置、高效截留細胞是實施連續(xù)灌注培養(yǎng)的一個關(guān)鍵的技術(shù)問題。
在眾多的細胞截留裝置中，傾斜式重力沉降裝置因其結(jié)構(gòu)簡單，成本低，無堵塞，對細胞剪切小，易放大等優(yōu)點被認為是一種較好的細胞截留方法。目前，已有許多專利報道了用于細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)過程中的重力沉降細胞截留分離方法和裝置，如王兆偉，譚文松(ZL00116518.6)提出的一種下流傾斜式細胞重力沉降器，該沉降器為一含有多個入口的長方體槽，含有細胞的培養(yǎng)液由沉降器的上端的某一入口進入沉降器，其中大部分細胞首先沉降在沉降器的下表面上，通過回流口流出沉降器，返回反應(yīng)器，含有少量細胞碎片及死細胞的上清液由收液口流出。該專利主要存在的問題如下(1)沉降器的截留處理量小。使用該裝置時，因為回流口開在沉降器的下表面中間，為了使盡可能多的活細胞流回反應(yīng)器，大部分活細胞必須在回流口之前沉降到沉降器的下表面，否則將會由下端收液口流入上清液收集容器，而細胞沉降到下表面的時間，即細胞在沉降器內(nèi)的垂直運動時間很長，根據(jù)細胞在沉降器內(nèi)水平運動時間和垂直運動時間相等，必然導致沉降器的進口流量較慢，而收液口的流量小于進口流量，即沉降器的截留處理量就會受到限制。該專利中提到沉降器上設(shè)有多個培養(yǎng)液進口，通過調(diào)整進口的位置即加長進口到回流口的距離達到增大截留處理量的目的，這也從另一個角度反映出它的局限性，截留處理量和沉降器的長度成正比，這顯然是個治標不治本的方法。
(2)細胞在沉降器內(nèi)的停留時間長，導致反應(yīng)器環(huán)境惡化。為了使大部分活細胞能從回流口返回反應(yīng)器中，只能通過減慢沉降器的進口流量，讓細胞沉降至下底面，再隨主體液滑向回流口。這就帶來了兩個問題一是減慢了沉降器的進口流量后，細胞從反應(yīng)器流出通過沉降器被截留住再經(jīng)回流口返回反應(yīng)器的時間就延長，而沉降器中保持常溫，過高或過低的環(huán)境溫度容易造成細胞損傷；二是細胞先沉降至下表面，然后隨主體液滑向回流口，為了保證大部分活細胞都能沉降到底面，必須減慢主體流速，那么沉降到下表面的細胞只能緩慢地隨主體液下滑至回流口，甚至部分細胞會沉積在沉降器底面，難于回流至反應(yīng)器，最終沉降器內(nèi)積累了大量細胞。這兩個問題使得細胞在沉降器內(nèi)停留時間過長，導致細胞活性和產(chǎn)物表達能力下降，代謝廢物積累增多，惡化反應(yīng)器中的培養(yǎng)環(huán)境。
(3)沉降器的橫截面形狀不合理。該專利中提出的沉降器為一傾斜長方體槽，發(fā)明人通過大量實驗和計算機模擬，發(fā)現(xiàn)采用矩形橫截面的沉降器內(nèi)的流場不合理，由于主體流速不快，沉降器的四周壁面附近存在流場死區(qū)，大量細胞懸滯在死區(qū)內(nèi)，導致細胞在反應(yīng)器外平均停留時間過長，引起細胞損傷。
譚文松，姜華，蔡海波，遲占有(ZL200310109264.2)報道了一種用于造血細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的細胞重力沉降截留裝置，斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器，其一端的上部設(shè)有進料口，沉降器對應(yīng)于進料口位置的底部設(shè)有出料口，其另一端設(shè)有排氣口和排液口，進料口與排液口之間為傾斜沉降區(qū)，進料口與出料口之間為垂直沉降區(qū)。該沉降器除了具有上述專利中所具有的一些問題和缺點外，還存在的一些缺陷是(1)操作連續(xù)性不好。使用該裝置時，沉降器底部會沉積部分細胞，需要用培養(yǎng)液沖洗回收，這種方法是以破壞細胞在沉降器中的連續(xù)性為代價的，打破了系統(tǒng)進程的平衡。
(2)裝置復雜，成本高。該裝置同樣存在細胞在沉降器內(nèi)停留時間長的問題，提出采用水浴夾套使沉降器內(nèi)沉積細胞處于相對穩(wěn)定的環(huán)境，從而緩解沉積引起的細胞損傷，但這種方法提高了沉降裝置的成本，增加了操作的復雜性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種用于動物細胞連續(xù)長期灌注培養(yǎng)過程中下流傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，解決活細胞在沉降器內(nèi)平均停留時間長，造成細胞損傷、反應(yīng)器環(huán)境惡化的問題。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思發(fā)明人通過大量實驗和CFD計算機模擬，發(fā)現(xiàn)沉降器內(nèi)部存在一定厚度的邊界層，邊界層滯留細胞和壁面粘附細胞是導致細胞在沉降器中停留時間過長的主要原因。
解決邊界層滯留細胞的問題，就是要減小邊界層的作用范圍，主要從以下幾個方面進行(1)改進回流口和收液口的位置，減小沉降器上半部分邊界層的厚度，同時也提高了沉降裝置的處理量。在ZL00116518.6的專利中，回流口和收液口都開在沉降器的下方，細胞懸液只在沉降器的下半部分流動，上半部分基本全是死區(qū)，大量細胞懸滯在這一區(qū)域。并且為了將大部分進入沉降器的活細胞截留返回反應(yīng)器，采取的解決方案是在細胞流經(jīng)回流口前讓細胞沉積至沉降器的下表面，否則會由下端收液口流入上清液收集容器，而細胞在重力場中的沉降速度是一定的，這就帶來了一個矛盾要提高活細胞回流率，就需要降低主體流速，沉降器的處理量就會受到限制；同時在低主體流速下細胞會在沉降器的下底面大量沉積，細胞平均停留時間延長造成細胞損傷。
可以通過改變回流口和收液口的位置來解決這一矛盾，收液口位置由裝置末端底部變換到裝置中段背部，回流口位置由裝置中段底部變換到末端底部，這樣含有細胞的培養(yǎng)液進入沉降器后，細胞經(jīng)過一段時間的沉降，沉降速度低的死細胞和碎片從沉降器背部的收液口流入上清收集容器，沉降速度高的活細胞從底部的回流口返回反應(yīng)器，采用這種設(shè)計，不僅解決了沉降器上半部分邊界層過厚的問題，而且提高主體流速后，即使活細胞沒有全部沉降至下表面也可以從回流口返回，提高了沉降裝置的處理量的同時，活細胞的高回流率也能得到保證。
(2)改善沉降器的橫截面形狀。在上述專利中，沉降器的橫截面都采用矩形結(jié)構(gòu)，發(fā)明人通過大量實驗以及計算流體力學CFD技術(shù)進行計算機模擬，發(fā)現(xiàn)采用矩形橫截面的沉降器流場中低速區(qū)域范圍大，而界面結(jié)構(gòu)換成半圓弧形后，主體流動的影響區(qū)域增大，低速區(qū)范圍大大減小。
(3)裝置下底面細胞粘附量較多的地方加上肋條。肋條的作用是在壁面附近形成擬序渦，可將壁面附近的細胞卷離壁面，降低細胞與底部壁面的接觸幾率。同時該擬序渦作用范圍有限，不會影響整個裝置的效率。
解決壁面粘附細胞的問題，是通過對壁面改性使細胞不易粘附，主要有以下兩個方法一、壁面疏水化。由于沉降器的底面是由親水性玻璃制成，若對表面涂疏水膜修飾，能夠減少底面的細胞黏附量。二、壁面納米化。作為有生命的微粒物，細胞表面也帶有電荷。將壁面納米化處理后，壁面釋放靜電，以降低細胞與壁面的直接接觸。
根據(jù)上述的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明提出的技術(shù)方案如下一種用于連續(xù)灌注培養(yǎng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)的傾斜式重力沉降細胞截留裝置，包括沉降器主體、進料口、收液口和回流口，其特征在于，還包括肋條；所說的沉降器主體的橫截面為橢圓形；進料口設(shè)置在主體的上端；收液口設(shè)置在主體中段的背部；回流口設(shè)置在主體的下端；所說的肋條設(shè)置在主體內(nèi)表面底部；本發(fā)明的傾斜式重力沉降活細胞截留裝置是這樣使用的
生物反應(yīng)器來的細胞懸液從進料口進入沉降器，由于活細胞的沉降速度比死細胞和細胞碎片的沉降速度大，絕大部分活細胞會漸漸富集于沉降器的下半部分，沉降器的上半部分中主要是死細胞和細胞碎片，可由收液口流出；其余活細胞從回流口返回生物反應(yīng)器，達到截留活細胞的目的。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)沉降器的適用范圍廣。由于不存在大部分活細胞必須沉降至下表面才能回流回反應(yīng)器的問題，所以沉降器的進口流量可調(diào)節(jié)的范圍很廣，收液口流量(即生物反應(yīng)器的新鮮培養(yǎng)基灌注量)相應(yīng)可調(diào)節(jié)的范圍也很廣。
(2)沉降器內(nèi)的細胞沉積量少。一、將沉降器的橫截面改成橢圓形后，改善了沉降器內(nèi)的流場情況，死區(qū)大大減少；二、改變了回流口和收液口的位置后，可以加大主體流速減少細胞的停滯，保證沉降器的高活細胞回流率；三、沉降器下底面施加肋條，致使流體形成擬序渦，該擬序渦可以將壁面附近的細胞卷離壁面；四、對壁面進行疏水處理和納米化處理以減少細胞與壁面的接觸幾率。這些方法減少了細胞在沉降器底面的沉積與粘附，有效縮短了細胞在反應(yīng)器外的平均停留時間，緩解了因沉積細胞引起的整體活性下降，反應(yīng)器環(huán)境惡化的問題。
(3)使用周期長。通過結(jié)構(gòu)參數(shù)優(yōu)化、操作參數(shù)優(yōu)化、壁面疏水化和納米化改型、施加底面肋條等，避免細胞在沉降裝置中的滯留，可以保證整個連續(xù)灌注系統(tǒng)的長期穩(wěn)定運行。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為橢圓形沉降器橫截面圖。
具體實施例方式
參見圖1和圖2，本發(fā)明的傾斜式重力沉降細胞截留裝置，包括包括沉降器主體1、進料口2、收液口3和回流口4，其特征在于，還包括肋條6；所說的沉降器主體1的橫截面為橢圓形；進料口2設(shè)置在主體1的上端，數(shù)量為一個；收液口3設(shè)置在主體1中段的背部；回流口4設(shè)置在主體1的下端；所說的肋條6設(shè)置在主體1內(nèi)表面5的底部；收液口3與主體1底面的夾角α為40～50°，優(yōu)選45°；使用時，主體1斜置，與水平方向的夾角β為45-60°。
所說的主體的材質(zhì)最好為低毒生物玻璃，如上海嘉定泰和玻璃廠生產(chǎn)的牌號為95料(B-40)的產(chǎn)品，玻璃表面經(jīng)過疏水處理和納米化處理。
玻璃表面疏水處理的方法，可采用張慶勇，王浩在(溶膠—凝膠法制備有機/無機復合疏水薄膜的研究)文獻公開的方法，包括如下步驟將聚四氟乙烯乳液、蒸餾水和分散劑、表面活性劑混合磁力攪拌成白色乳液，加入硅溶膠磁力攪拌3小時，呈白色乳液后加入氨水磁力攪拌半小時后密封陳化24小時后得到溶膠。對玻璃表面鍍膜采用提拉法，速度為24cm/min。然后將玻璃放入烘箱中熱處理，直到表面溶膠固化為止。
玻璃表面的納米化處理的方法，可采用李玲在(納米SiO2/聚丙烯酸酯復合膜抗靜電性能研究)文獻公開的方法，包括如下步驟稱取納米SiO2粉末，按25％的質(zhì)量分數(shù)與聚丙烯酸酯乳液混合，加入少許消泡劑，放入球磨機中球磨5分鐘后，倒在玻璃板上(玻璃板經(jīng)過洗潔精清洗后烘干處理)，涂敷或流涎成膜，烘干或自然晾干后即可。
實施例1本沉降器與1L攪拌式細胞培養(yǎng)反應(yīng)器組合用于雜交瘤細胞的灌注培養(yǎng)。
細胞細胞株為雜交瘤細胞HB-58，該細胞株保藏在ATCC(美國組織細胞庫)，保藏號為Hybridoma CELL Line 187.1(ATCC HB58)。細胞在300ml轉(zhuǎn)瓶中維持培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶置于37℃含5％CO2培養(yǎng)箱中，在對數(shù)培養(yǎng)期接種到反應(yīng)器中。
培養(yǎng)基為GIBCO公司的Hybridoma-SFM(1X)(雜交瘤細胞培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基)，商品序號為12045-035。
收液口3與主體1底面的夾角α為45°；使用時，主體1斜置，與水平方向的夾角β為50°連續(xù)灌注培養(yǎng)60天。使用葡萄糖限制的培養(yǎng)基(葡萄糖濃度7mM，谷胺酰氨8.5mM)，在灌注速率為1/天時，最大細胞濃度達到1.3×107cells/ml，活細胞截留率為99％，死細胞截留率為50％，反應(yīng)器內(nèi)細胞活性為95％。
細胞密度檢測方法通過血球計數(shù)器和臺盤藍染色法計算活細胞密度和細胞活性。實驗中每隔12小時檢測一次細胞培養(yǎng)反應(yīng)器中和由收液口流出的細胞密度和活性。
權(quán)利要求
1.一種傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，包括斜置的沉降器主體(1)、進料口(2)、收液口(3)和回流口(4)，其特征在于，還包括肋條(6)；所說的沉降器主體(1)的橫截面為橢圓形；進料口(2)設(shè)置在主體(1)的上端，數(shù)量為一個；收液口(3)設(shè)置在主體(1)中段的背部；回流口(4)設(shè)置在主體(1)的下端；所說的肋條(6)設(shè)置在主體(1)內(nèi)表面(5)的底部。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，其特征在于，收液口(3)與主體(1)底面的夾角α為40～50°。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，其特征在于，收液口(3)與主體(1)底面的夾角α為45°。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，其特征在于，使用時，主體(1)斜置，與水平方向的夾角β為45-60°。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項所述的傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，其特征在于，所說的主體(1)的材質(zhì)為低毒生物玻璃，玻璃表面經(jīng)過疏水處理和納米化處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種傾斜式重力沉降活細胞截留裝置，包括斜置的沉降器主體(1)、進料口(2)、收液口(3)和回流口(4)，其特征在于，還包括肋條(6)；所說的沉降器主體(1)的橫截面為橢圓形；進料口(2)設(shè)置在主體(1)的上端，收液口(3)設(shè)置在主體(1)中段的背部；回流口(4)設(shè)置在主體(1)的下端；所說的肋條(6)設(shè)置在主體(1)內(nèi)表面(5)的底部。本發(fā)明的截留裝置適用于不同反應(yīng)器，灌注速率為范圍很廣。本發(fā)明減少了細胞在沉降器底面的沉積，有效縮短了細胞在反應(yīng)器外的平均停留時間，緩解了因沉積細胞引起的整體活性下降，反應(yīng)器環(huán)境惡化的問題。
文檔編號C12N5/06GK1966659SQ20061011840
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月16日
發(fā)明者譚文松, 張璐, 張旭 申請人:華東理工大學