專利名稱：桑黃4.6302菌株菌質(zhì)多糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物活性成分及其制備方法，特別涉及一種藥用真菌活性成分及其制備方法，確切地說是一種桑黃4.6302菌株菌質(zhì)多糖及其制備方法。
背景技術(shù)：
桑黃(Phellinus igniarius)屬擔(dān)子菌門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科的藥用真菌。因通常生長在桑屬(Morus.L.)植物上，且子實(shí)體為黃褐色的緣故而得名。桑黃具有極高的藥用價(jià)值，在增強(qiáng)人體免疫力、抗肝纖維化、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎等方面有顯著作用，尤其在抗腫瘤方面效果極為顯著，是目前已知的抗癌效果最好的真菌。
桑黃多糖可以應(yīng)用于抗腫瘤、抗突變、抗氧化、抗肝纖維化、抗衰老和抑制HepG-2、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和Hela、SMMC-7721等細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)，且在一定濃度范圍內(nèi)成劑量效應(yīng)關(guān)系，對(duì)化療物環(huán)磷酰胺(CP)有明顯的增效減毒作用，而且對(duì)CP造成的小鼠細(xì)胞免疫功能下降有一定的改善作用，如促進(jìn)小鼠白細(xì)胞數(shù)增加，增加脾細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力；能明顯提高細(xì)胞因子IL-2、TNF-a的水平；并可以延長果蠅壽命，提高衰老小鼠血清、腦、肝組織中超氧物歧化酶(SOD)活性，降低小鼠血清、腦、肝中丙二醛(MDA)的含量，增加胸腺的重量和改善小鼠學(xué)習(xí)記憶行為，具有抗脂質(zhì)過氧化和抗衰老等方面的作用。
桑黃主要分布在我國西北、東北和西南等地區(qū)，子實(shí)體在野外一般要2～3年才能長成。目前桑黃野生資源已遭滅絕性開采，價(jià)格昂貴，供不應(yīng)求。由于受到氣候、環(huán)境等諸多因素的影響，人工栽培桑黃周期長成功率低。
桑黃菌絲體可以采用液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)，但此方法生產(chǎn)桑黃菌絲體投資巨大，短時(shí)間難以實(shí)現(xiàn)。
野生桑黃菌因品種、寄主、產(chǎn)地等不同導(dǎo)致其藥用效果差異顯著。為避免開發(fā)這一珍稀藥用真菌的盲目性，申請(qǐng)人從全國各地采集的十幾種桑黃子實(shí)體中分離、篩選、馴化出具有較好藥理活性的桑黃4.6302菌株，其與野生桑黃子實(shí)體藥理活性相同，比液態(tài)發(fā)酵得到的菌絲體有更高的多糖產(chǎn)量和更好的藥理活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在挽救這一瀕危的藥用真菌并滿足市場需求，所要解決的技術(shù)問題是由出發(fā)菌株培養(yǎng)得到桑黃菌質(zhì)，然后提取多糖。
本發(fā)明所稱的桑黃菌質(zhì)多糖以是桑黃菌株4.6302菌株為出發(fā)菌株、經(jīng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備桑黃菌質(zhì)，再自該桑黃菌質(zhì)中提取得到的多糖類化合物。
所述的桑黃4.6302菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)就是桑黃4.6302菌種接種在滅菌的pH5～9的固態(tài)培養(yǎng)基上于22～30℃條件下培養(yǎng)10～20天。所述的固態(tài)培養(yǎng)基各組分有以下重量份數(shù)米糠 60～80份，玉米粉8～12份，大豆粉8～12份，葡萄糖0.8～2.2份，牛肉膏0.8～2.2份，硫酸錳0.04～0.06份，水80～120份。
優(yōu)選培養(yǎng)基各組份重量份數(shù)為米糠 70份，玉米粉10份，大豆粉10份，葡萄糖1.5份，牛肉膏1.5份，硫酸錳0.05份，水100份。
固態(tài)培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選pH6～8，最佳pH7。
發(fā)酵培養(yǎng)的溫度優(yōu)選24～28℃，最佳25～27℃，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選12～18天，最佳15～16天。
固體發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后便得到桑黃菌質(zhì)。
所述的自桑黃菌質(zhì)中提取多糖就是將桑黃菌質(zhì)勻漿后用水提醇沉法進(jìn)行提取，首先用70～80℃的水浸提，分離得到水浸提液，濃縮水浸提液以提高多糖的濃度，然后在15～25℃條件下加入乙醇使多糖沉淀析出，當(dāng)無沉淀析出時(shí)，乙醇的終濃度約為70％，分離，將沉淀干燥即得桑黃菌質(zhì)多糖，無定形淡黃色粉末。優(yōu)選75℃水浸提，20℃時(shí)醇沉。
本桑黃多糖，無毒，安全性好。
急性毒性試驗(yàn)取健康昆明小鼠30只，雌雄各半，體重18～22g，禁食(自由飲水)12h，次日上午、下午各灌胃給藥一次，桑黃多糖濃度200mg/ml，容量0.25ml/10g體重，連續(xù)7d，正常飼養(yǎng)并觀察給藥間隔及給藥動(dòng)物反應(yīng)和死亡情況。給藥后小鼠在30min內(nèi)活動(dòng)減少，隨后恢復(fù)正常，攝食、糞便、毛發(fā)等均無明顯異常，亦無一小鼠死亡。結(jié)果顯示桑黃菌質(zhì)多糖給小鼠灌胃的最大耐受量＞10g/kg，提示桑黃菌質(zhì)多糖安全性良好。
長期毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組灌胃給藥，每天一次，連續(xù)180天。結(jié)果高(5g/kg)、中(2.5g/kg)、低(1g/kg)劑量組的大鼠健康狀況、生長發(fā)育、外圍血象、肝腎功能均無影響，病理檢查亦無明顯變化。這說明桑黃菌質(zhì)多糖在大于人臨床用藥劑量，連續(xù)給藥6個(gè)月時(shí)，對(duì)大白鼠安全可靠。
本培育方法得到的桑黃菌質(zhì)其藥理活性與長白山、大別山等地野生桑黃子實(shí)體相當(dāng)，與液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的菌絲體相比，有更高的桑黃多糖含量和顯著的抑制腫瘤、抗突變等藥理活性。自本桑黃菌質(zhì)提取的桑黃多糖具有以下藥理活性體外抑瘤實(shí)驗(yàn)證明桑黃菌質(zhì)多糖(60-300ug/ml)對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG-2和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7有明顯的抑制作用，抑制率達(dá)到60％以上，對(duì)Hela、SMMC-7721抑制率在50％以上，且在一定濃度范圍內(nèi)成劑量效應(yīng)關(guān)系；體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)(50-200mg/kg)證明對(duì)小鼠S180抑制率達(dá)60％以上。
實(shí)驗(yàn)還表明，桑黃菌質(zhì)多糖對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺(CP)有明顯的增效減毒作用，而且對(duì)CP造成的小鼠細(xì)胞免疫功能下降有一定的改善作用。50、100、200mg/kg PIIP-1與CP組聯(lián)合用藥對(duì)S180的抑制率分別為71.93％、79.51％、73.25％，較單純用CP有明顯增加(CP抑制率為67.98％)，且可明顯減少CP致死現(xiàn)象；50、100、200mg/kg PIIP-1與CP組聯(lián)合用藥組較CP組比較，白細(xì)胞數(shù)明顯增加。CP為4.90×109/ml，聯(lián)合用藥組分別為6.86×109/ml、7.98×109/ml、7.38×109/ml；聯(lián)合用藥組較CP組相比，脾細(xì)胞增殖能力也有顯著增加，OD值分別為0.075±0.026、，0.077±0.009、0.079±0.006，CP組為0.039±0.005；實(shí)驗(yàn)表明CP組小鼠IL-2，TNF-α的誘生水平均明顯下降，而桑黃菌質(zhì)多糖可明顯改變這一現(xiàn)象。CP組IL-2為29.78±7.63pg/ml，100、200mg/kg PIIP-1與CP組聯(lián)合用藥組的IL-2水平可達(dá)43.03±7.90、55.69±4.76pg/ml；CP組TNF-α為47.33±7.63pg/ml，而50、100、200mg/kg PIIP-1與CP組聯(lián)合用藥組的TNF-α水平分別達(dá)到111.61±18.57、146.86±27.97、123.69±14.61pg/ml，有明顯增加。
桑黃菌質(zhì)多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致?lián)p傷小鼠的血清和肝組織中SOD活性有明顯的增強(qiáng)作用，對(duì)MDA水平有明顯的降低作用。對(duì)照組小鼠血清和肝組織里的SOD分別為為219.56NU/ml、112.35NU/mg protein；MDA含量為15.33nmol/ml、26.38nmol/mg protein。而給予100mg/kg桑黃菌質(zhì)多糖之后，其血清和肝組織的SOD活力可達(dá)325.94NU/ml、155.63NU/mg protein；MDA含量分別降至12.09nmol/ml、16.94nmol/mg protein。200mg/kg和50mg/kg的劑量也有顯著增強(qiáng)SOD活力，降低對(duì)MDA水平的作用。
小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)證明50、100、200mg/kg劑量的桑黃菌質(zhì)多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘發(fā)的微核抑制率分別為25.37％、42.42％和52.61％，且成量效關(guān)系；小鼠精子畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CP所誘發(fā)的小鼠精子畸形率(CP為94.8‰，正常組為28‰)明顯升高，并出現(xiàn)了胖頭、雙頭、雙尾等嚴(yán)重畸形精子。當(dāng)桑黃菌質(zhì)多糖與CP同時(shí)給予小鼠時(shí)，可使CP誘發(fā)的小鼠精子畸形率顯著降低(50、100、200mg/kg劑量分別為49‰、56.5‰、64.5‰)，而且胖頭、雙頭、雙尾等嚴(yán)重畸形精子明顯減少，具有極顯著性差異(P＜0.01)。說明桑黃菌質(zhì)多糖對(duì)化療藥物所引起的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞誘變起保護(hù)作用。
桑黃菌質(zhì)多糖能顯著延長果蠅壽命(平均延長27.5％)，提高衰老小鼠血清、腦、肝組織中超氧物歧化酶(SOD)活性(均提高15％以上)，降低小鼠血清、腦、肝中丙二醛(MDA)的含量(50、100、200mg/kg劑量分別比模型組降低了21.3％、25.9％、46.6％)，增加胸腺的重量(平均增加了模型組的15.9％)和改善小鼠學(xué)習(xí)記憶行為(走迷津的時(shí)間平均比模型組縮短了73.5％)。這些說明桑黃菌質(zhì)多糖具有一定的抗氧化、抗衰老作用。
本培育方法實(shí)現(xiàn)了桑黃的人工繁殖，工藝簡單，操作穩(wěn)定，周期短，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，規(guī)?；?。用提取的桑黃多糖用于臨床，有利于質(zhì)量控制、穩(wěn)定療效，有力地推動(dòng)了桑黃應(yīng)用的現(xiàn)代化。
申請(qǐng)人選育的桑黃4.6302菌株已送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。
三具體實(shí)施例方式
(一)、固態(tài)培養(yǎng)基的配制表1 單位克 按表1配方量稱取各組分并混合均勻，用NaOH和HCl或有機(jī)酸、堿調(diào)pH6～8，滅菌備用。
(二)、桑黃菌株4.6302固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)1、桑黃4.6302菌株試管菌種斜面母種培養(yǎng)培養(yǎng)基PDA綜合培養(yǎng)基培養(yǎng)條件23～29℃于暗光照下培養(yǎng)6～9天，pH自然。
2、搖瓶種子培養(yǎng)將步驟(1)活化好的菌種用接種環(huán)挑出2～3塊大小為1cm×1cm菌種塊接種于500ml三角瓶液態(tài)種子培養(yǎng)基中，每瓶裝有下列培養(yǎng)基150ml，瓶口用棉塞塞住，外層用牛皮紙包扎。
培養(yǎng)基組分(重量)蔗糖20～30g，酵母膏3～4g，蛋白胨3～4g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.1g，水1000ml。
培養(yǎng)條件溫度25～28℃，pH6，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)7～8天。
3、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)好的菌種破碎后用吸取5ml接種到滅過菌的表1所示的任一固態(tài)培養(yǎng)基(500ml罐頭瓶，其中裝有2/3的固態(tài)培養(yǎng)基)中，瓶口用食用菌專用塑料膜包扎，外層用牛皮紙包扎。
培養(yǎng)條件溫度24～28℃，pH6～8，時(shí)間12～18天，培養(yǎng)結(jié)束后得到桑黃菌質(zhì)。
(三)、桑黃菌質(zhì)多糖的提取1、水提漿桑黃菌質(zhì)勻漿后加75℃熱水浸提3～4小時(shí)，水料比5～10∶1，浸提2～4次，分離合并水浸提液。
2、濃縮負(fù)壓脫水，濃縮至原體積的20～30％。
3、醇沉于20℃加入95％的乙醇使多糖沉淀至完全。分離、干燥沉淀即是桑黃菌質(zhì)多糖，無定形淡黃色粉末。
權(quán)利要求
1.一種桑黃4.6302菌株菌質(zhì)多糖，其特征在于本多糖是自桑黃4.6302菌株經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的桑黃菌質(zhì)中提取得到的多糖類化合物。
2.由權(quán)利要求1所述的桑黃菌質(zhì)多糖的制備方法，包括以桑黃4.6302菌株為出發(fā)菌株經(jīng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)制備桑黃菌質(zhì)和自桑黃菌質(zhì)中提取多糖，其特征在于(1)、所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)是桑黃4.6302菌種接種在滅菌的pH5～9的固態(tài)培養(yǎng)基上于22～30℃條件下培養(yǎng)10～20天，所述的固態(tài)培養(yǎng)基各組分有以下重量份數(shù)米糠60～80份，玉米粉8～12份，大豆粉 8～12份， 葡萄糖0.8～2.2份，牛肉膏 0.8～2.2份， 硫酸錳0.04～0.06份，水 80～120份；(2)、所述的自桑黃菌質(zhì)中提取多糖就是將菌質(zhì)勻漿后用70～80℃的水浸提，分離得到水浸提液，濃縮后于15～25℃條件下加入乙醇使多糖沉淀，分離后將沉淀干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于(1)、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各組份有以下重量份數(shù)米糠70份，玉米粉10份，大豆粉 10份，葡萄糖1.5份，牛肉膏 1.5份， 硫酸錳0.05份，水 100份；(2)、將菌質(zhì)勻漿后用70～80℃水浸提、15～25℃條件下醇沉得到多糖沉淀并干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于固態(tài)培養(yǎng)基pH6～8，培養(yǎng)溫度24～28℃，培養(yǎng)時(shí)間12～18天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于固態(tài)培養(yǎng)基pH7，培養(yǎng)溫度25～27℃，培養(yǎng)時(shí)間15～16天。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于菌質(zhì)勻漿后水提醇沉的工藝條件為75℃水浸提、20℃時(shí)醇沉。
全文摘要
一種桑黃4.6302菌株菌質(zhì)多糖是自桑黃菌質(zhì)中提取得到的多糖類化合物所述的桑黃菌質(zhì)是以桑黃4.6302菌株為出發(fā)菌株，在60～80份米糠、8～12份玉米粉、8～12份大豆粉、0.8～2.2份葡萄糖、0.8～2.2份牛肉膏、0.04～0.06份MnSO
文檔編號(hào)C12R1/645GK1908181SQ20061004097
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月16日
發(fā)明者沈業(yè)壽, 史新強(qiáng), 鄭立軍, 李宜明, 趙根海, 鄭媛 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)