專利名稱：產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌核酸純化血清鑒定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)食品中細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)裝置，特別涉及一種快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga Toxin-producing Escherichia coli，簡(jiǎn)稱STEC)為食源性致病菌，革蘭氏陰性，有周鞭毛，并有菌毛，不產(chǎn)生芽孢。STEC是世界上人類食品中毒的重要的致病因子，也是引起大規(guī)模食源性食物中毒的主要病原菌之一。STEC中有100余個(gè)血清型的致病性大腸桿菌可以致病，其中O157H7是主要的血清型。可引起非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎(haemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(haemolytic uraemicsyndrome，HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic throbocytopenicpurpura，TTP)。而非O157的STEC主要的血清型有O26、O111、O103和O145也嚴(yán)重威脅著人類的健康。
近年來(lái)STEC引起的大規(guī)模食源性食物中毒越來(lái)越受到高度重視，而且非O157H7STEC引起的HC、HUC在逐年增加。由于O157H7不發(fā)酵山梨醇比非O157H7STEC容易鑒定，所以非O157H7常被人們所忽視。
STEC的毒力是由多因子決定的。其致病的特征性毒力因子是I型志賀毒素(shiga toxin type1，stx1)和2型志賀毒素(shiga toxin type2，stx2)，分別由stx1基因和stx2基因編碼。其他毒力因子如由eaeA基因編碼的粘附因子(attachment and effacement factor)；由hlyA基因編碼的溶血素(hemolysin)等也是重要的毒力因素。采用多重PCR技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行STEC的毒力基因鑒定，不僅可作特征性鑒定，而且還可對(duì)其潛在的致病性作出前瞻性判斷，可快速檢測(cè)出樣品中STEC。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究人員檢測(cè)食品中STEC研究的較多，包括李詠梅等采用的PCR方法、Paton AW等采用的PCR方法。上述鑒定方法包括營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)、菌落選擇、生化反應(yīng)特性和志賀毒素的鑒定，需要幾天的時(shí)間才能完成STEC的鑒定。還沒有解決快速、準(zhǔn)確檢出該菌的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)樣品中STEC的試劑盒和使用方法，主要解決現(xiàn)有檢測(cè)方法存在的檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的技術(shù)問題，采用復(fù)合PCR可以快速、特異地篩選標(biāo)本中的STEC，以便可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢出食品中STEC，該試劑盒適合于各種樣品的檢測(cè)。
本發(fā)明的試劑盒主要由以下幾種試劑配方組成試劑ADNA提取液；試劑BPCR反應(yīng)液，其中含有特定四對(duì)引物stx1-F和stx1-R、stx2-F和stx2-R、eaeA-F和eaeA-R、hlyA-F和hlyA-R，其序列分別為5’ACACTGGATGATCTCAGTGG 3’和5’CTGAATCCCCCTCCATTATG 3’；5’CCATGACAACGGACAGCAGTT3’和5’CCTGTCAACTGAGCACTTTG 3’；5’AAGCGACTGAGGTCACT3’和5’ACGCTGCTCACTAGATGT 3’；5’CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA和AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT 3’試劑B中所含的特定引物stx1-F和stx1-R、stx2-F和stx2-R、eaeA-F和eaeA-R、hlyA-F和hlyA-R，每種含量應(yīng)不少于5pm。
試劑CSTEC分型血清O157、O26、O111、O103和O145。
本發(fā)明所提供的快速檢測(cè)樣品中STEC的試劑盒的使用方法如下一、樣品中DNA的提取1.取1mL樣品增菌液，12000g離心1分鐘，棄盡上清液；2.加入20μL溶菌酶，室溫放置5分鐘。
3.加入SDS(十二烷基硫酸鈉)12μL，4μL蛋白酶K，37℃水浴30分鐘。
裂解過(guò)程中上下混勻幾次，降解完全的樣品應(yīng)為半透明粘稠液體，否則應(yīng)繼續(xù)保溫處理。
4.加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1 236μL；混勻10分鐘，13800g離心5分鐘。
5.棄去有機(jī)層，加入等體積的氯仿∶異戊醇＝24∶1，輕輕混勻，棄去有機(jī)層。
6.加入1/10體積3mol/L醋酸鈉，2倍體積的冷無(wú)水乙醇(-20℃隔夜)，離心沉淀DNA。
7.600μL70％乙醇洗一次，倒置于干凈的濾紙上，室溫干燥。
8.待檢樣品DNA用50μL milliQ水溶解。
二、PCR反應(yīng)取10μL待檢樣品DNA加入反應(yīng)管B中，混勻后在PCR儀中進(jìn)行以下反應(yīng) 反應(yīng)結(jié)束后，取20μL PCR產(chǎn)物，加2μL溴酚藍(lán)混勻后進(jìn)行確定擴(kuò)增產(chǎn)物。如出現(xiàn)614bp和/或779bp的反應(yīng)產(chǎn)物，說(shuō)明待檢樣品中有產(chǎn)毒的STEC。
三、鑒定用STEC分型血清對(duì)二中產(chǎn)毒的STEC進(jìn)行血清凝集。
本發(fā)明的有益效果是，使用本發(fā)明的試劑盒，采用復(fù)合PCR可以快速、特異地篩選標(biāo)本中的STEC，并能在24小時(shí)內(nèi)快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢出樣品中的STEC，靈敏度可達(dá)15CFU/mL。
具體實(shí)施例方式豬肉糜和果汁用快速檢測(cè)樣品中STEC的試劑盒檢測(cè)。試劑盒組成為試劑ADNA提取液。其組成為20％SDS，苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1；氯仿∶異戊醇＝24∶1；試劑BPCR反應(yīng)液，每管STEC的50μL擴(kuò)增反應(yīng)體系組成中含5μL0.025mol l-1MgCl25pmol 4對(duì)引物stx1-F和stx1-R、stx2-F和stx2-R、eaeA-F和eaeA-R、hlyA-F和hlyA-R各為2μL；PCR buffre 5μL；200μmol dNTP 1μL；Taq酶1.0μL；DNA 5μL(終濃度為2ng/ml)；ddH2O 22.0μL；試劑CSTEC分型血清O157、O26、O111、O103和O145。
按本發(fā)明所提供的快速檢測(cè)樣品中STEC試劑盒的使用方法，先用試劑A提取樣品中的DNA，之后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取20μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物加2μL溴酚藍(lán)混勻后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，即可發(fā)現(xiàn)樣品中是否含有產(chǎn)毒的STEC，最后用STEC分型血清進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明所提供的快速檢測(cè)樣品中STEC試劑盒特異性強(qiáng)，靈敏度高，能準(zhǔn)確檢測(cè)出食品中的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，靈敏度達(dá)到15CFU/mL。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌核酸純化血清鑒定試劑盒，其特征在于該試劑盒由以下試劑組成試劑ADNA提取液；試劑BPCR反應(yīng)液，其中含有特定四對(duì)引物stx1-F和stx1-R、stx2-F和stx2-R、eaeA-F和eaeA-R、hlyA-F和hlyA-R，其序列分別為5’ACACTGGATGATCTCAGTGG 3’和5’CTGAATCCCCCTCCATTATG 3’；5’CCATGACAACGGACAGCAGTT3’和5’CCTGTCAACTGAGCACTTTG 3’；5’AAGCGACTGAGGTCACT3’和5’ACGCTGCTCACTAGATGT 3’；5’CACACGGAGCTTATAATATTCTGTCA和AATGTTATCCCATTGACATCATTTGACT 3’；試劑CSTEC分型血清0157、026、0111、0103和0145。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌核酸純化血清鑒定試劑盒，其特征在于所說(shuō)的試劑B中所含的特定引物stx1-F和stx1-R、stx2-F和stx2-R、eaeA-F和eaeA-R、hlyA-F和hlyA-R，每種含量應(yīng)不少于5pm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌核酸純化血清鑒定試劑盒，其特征在于所說(shuō)的試劑BPCR反應(yīng)液，每管組成為每管STEC的50μL擴(kuò)增反應(yīng)體系組成中含5μL 0.025mol l-1MgCl2；5pmol 4對(duì)引物stx1-F和stx1-R、stx2-F和stx2-R、eaeA-F和eaeA-R、hlyA-F和hlyA-R各為2μL；PCR buffre5μL；200μmol dNTP 1μL；Taq酶1.0μL；DNA 5μL；ddH2O 22.0μL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)食品中細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)裝置，特別涉及一種快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的試劑盒。主要解決現(xiàn)有檢測(cè)方法存在的檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的技術(shù)問題，一種快速檢測(cè)食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的試劑盒，由以下試劑組成試劑ADNA提取液；試劑BPCR反應(yīng)液，其中含有特定四對(duì)引物stx1－F和stx1－R、stx2－F和stx2－R、eaeA－F和eaeA－R、hlyA－F和hlyA－R，其序列分別為5’ACACTGGATGATCTCAGTGG 3’和5’CTGAATCCCCC－T CCATTATG 3’；5’CCATGACAACGGACAGCAGTT3’和5’CCTGTCAACTGAGCACTTTG 3’；5’AAGCGACTGA－GG TCACT3’和5’ACGCTGCTCACTAGATGT 3’；5’CA－CAC GGAGCTTATAATATTCTGTCA和AATGTTAT CC－CATTGACATCATTTGACT 3’；試劑CSTEC分型血清0157、026、0111、0103和0145。用于對(duì)樣品中STEC檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1844924SQ200610024189
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者李曉虹, 蔣琴娣, 韓偉 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局