專利名稱：一種從牛肺中提取抑肽酶和肝素鈉的聯(lián)產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種從牛肺中提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)的聯(lián)產(chǎn)工藝。
背景技術：
抑肽酶(Aprotinin)是一種堿性多肽，分子量6000，由58個氨基酸殘基組成。它的分子內(nèi)有3對雙硫鍵，其中一對雙硫鍵(14-38)位于分子表面，它使兩段肽鏈(32-42，9-21)連接在一起，這一對雙硫鍵被還原和重新氧化后不影響抑制劑活力。另外兩對雙硫鍵(5-55，30-51)位于分子內(nèi)部，一旦還原后即失活。整個分子呈梨形，長29A，中部圓形部位直徑19A。其活性中心為賴氨酸，位于分子的頂端。抑肽酶為非特異性蛋白酶抑制劑，能抑制多種含有絲氨酸活性基因的蛋白酶，主要抑制纖溶酶；抑肽酶能抑制中性白細胞激活和脫顆粒，減少補體激活，具有抗炎作用；因纖溶酶對血小板數(shù)量和功能有破壞作用，抑肽酶對血小板也有保護作用。在臨床上已廣泛的應用于治療急性胰腺炎、喘息性支氣管炎、燒傷性休克及癌癥手術、腦外科、骨科、預防腸粘連、治療急性胃黏膜出血、剖宮產(chǎn)術、鼻內(nèi)窺鏡術、產(chǎn)后大出血和心肺轉(zhuǎn)流(CPB)心臟等手術中；在體外循環(huán)心臟直觀手術中，可以減少出血和輸血量，可以保護肺損傷和心肌，減少體外循環(huán)心臟直觀手術所導致的機體炎癥反應。
肝素鈉(Heparin Sodium)是廣泛存在于動物器官(如牛、羊的小腸粘膜、肝、胰臟及肺組織等)的一種葡萄胺聚糖，和大多數(shù)粘多糖一樣在體內(nèi)作為蛋白質(zhì)結(jié)合的復合物存在，這種復合物抗凝活性隨著蛋白質(zhì)的去除其活性增加。肝素鈉具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學功能，臨床上廣泛應用于各種外科手術前后防止血栓的形成和栓塞，治療彌漫性血管內(nèi)凝血，防治血栓病和用于心臟手術體外循環(huán)，防治腫瘤病灶轉(zhuǎn)移和擴散、治療腎臟病患者的滲血、急性心肌梗塞癥、腦血管疾病、皮膚病、清除腎病形成的尿毒，配合治療暴發(fā)性流腦敗血癥、腎炎等；同時肝素鈉在降血脂和免疫方面也有較佳的作用。
本發(fā)明產(chǎn)品以清真宰牲場的牛肺為基礎原料，適合在中東及穆斯林國家銷售及使用，為穆斯林國家及世界各國醫(yī)藥、日化、食品生產(chǎn)行業(yè)十分需求的制品。
本發(fā)明在資料分析和發(fā)明者以往豐富工作經(jīng)驗的基礎上，廣泛的研究了各種制造抑肽酶和肝素鈉的工藝，結(jié)合超濾等新技術，現(xiàn)采用低溫提取、超濾除雜、離交層析、乙醇沉淀、真空干燥的工藝。該工藝路線優(yōu)點是同時提取兩種生化原料藥，極大的降低了原料成本，同時生產(chǎn)周期較短、處理量大、操作簡便、活性和效價回收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
目前國內(nèi)外在生產(chǎn)抑肽酶過程中，通過動物肺臟提取抑肽酶后，廢液和廢渣通常被丟棄，既污染環(huán)境，又浪費原料，本發(fā)明充分利用肺臟既含抑肽酶又含肝素鈉這一性質(zhì)，綜合利用生化提取分離方法，從動物肺臟中同時提取符合藥典要求的抑肽酶和肝素鈉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從牛肺中同時提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)。在工藝技術上，改進了常規(guī)技術原料利用不充分、生產(chǎn)周期長等缺陷。本發(fā)明通過新鮮牛肺，采用低溫提取、超濾除雜、離交層析、乙醇沉淀、真空干燥的工藝，從牛肺中制得符合中國藥典要求的抑肽酶和符合大多數(shù)肝素鈉生產(chǎn)廠家要求的肝素鈉粗品。
本發(fā)明在原料選擇上，不采用豬肺等非清真原料，而是采用源于清真宰牲場的新鮮牛肺為主要原料，既適應了向穆斯林國家供應醫(yī)藥和日化原料的渠道，又降低了成本；并且采用超濾膜分離純化技術，縮短了工藝時間、加大了處理量、降低了原料成本、操作簡便、活性和效價回收率高、無殘留毒素、無三廢污染。
——本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明公開了從一種牛肺中同時提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)的聯(lián)產(chǎn)工藝。抑肽酶活性達到5400KIU/mg，肝素鈉效價達到70IU/mg。抑肽酶為非特異性蛋白酶抑制劑，能抑制多種含有絲氨酸活性基因的蛋白酶，主要抑制纖溶酶；在臨床上已廣泛的應用于治療急性胰腺炎、喘息性支氣管炎、燒傷性休克及癌癥手術、腦外科、骨科、預防腸粘連、治療急性胃黏膜出血、剖宮產(chǎn)術、鼻內(nèi)窺鏡術、產(chǎn)后大出血和心肺轉(zhuǎn)流(CPB)心臟等手術中。肝素鈉具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學功能，臨床上廣泛應用于各種外科手術前后防止血栓的形成和栓塞，治療彌漫性血管內(nèi)凝血，防治血栓病和用于心臟手術體外循環(huán)，防治腫瘤病灶轉(zhuǎn)移和擴散、治療腎臟病患者的滲血、急性心肌梗塞癥、防治血栓形成、腦血管疾病、皮膚病、清除腎病形成的尿毒，配合治療暴發(fā)性流腦敗血癥、腎炎等。本發(fā)明在原料選擇上，不采用豬肺等非清真原料，而是采用源于清真宰牲場的新鮮牛肺為主要原料，既適應了向穆斯林國家供應醫(yī)藥和日化原料的渠道，又降低了成本；并且采用超濾膜分離純化技術，縮短了工藝時間、加大了處理量、降低了原料成本、操作簡便、活性和效價回收率高、無殘留毒素、無三廢污染。
本發(fā)明公開的一種從牛肺中提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)的聯(lián)產(chǎn)工藝，依次包括如下步驟1.將清真宰牲場取出的牛肺剪去脂肪、氣管等雜物，稱重，切塊，絞碎。加入2倍量的水，降溫，鹽酸調(diào)節(jié)PH，浸提。
2.浸提液經(jīng)板筐過濾，收集濾渣①；濾液加三氯乙酸溶液沉淀蛋白，攪拌，過濾；收集濾渣②，濾液調(diào)節(jié)PH，低溫放置8小時；除去液面固形物，離心分離，上清液即為抑肽酶提取液。收集離心沉淀③。
3.超濾裝置去除熱源后，濾液調(diào)節(jié)PH，用3KD超濾膜去除熱源.然后用10KD過濾器對洗脫液進行超濾去熱源；超濾液再用3KD超濾膜進行脫鹽，并定時補加無熱源水，直至流出液用硝酸銀檢測無氯離子，繼續(xù)超濾濃縮到規(guī)定體積。
4.濃縮液調(diào)節(jié)PH，真空冷凍干燥，得抑肽酶成品。
5.上述收集的濾液和濾渣①②③混合后，加氯化鈉攪拌至溶解，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH，升溫，保溫攪拌后升溫至90℃后，降溫，開始過濾。
6.濾液加入D254樹脂吸附，過濾。
7.濾出的樹脂用氯化鈉洗脫，然后再洗滌2次。洗脫液與洗滌液合并。
8.溶液調(diào)節(jié)PH，加乙醇，攪拌均勻后靜置。傾去上清液，脫水，真空干燥，得肝素鈉粗品。
9.對產(chǎn)品進行活力或效價測定。
本發(fā)明采用源于清真宰牲場的新鮮牛肺為主要原料，并且采用超濾膜分離純化技術，分離出具有較高生物活性物質(zhì)的兩種重要的生化原料藥；其中抑肽酶活性達到5400KIU/mg，肝素鈉效價達到70IU/mg。
工藝路線牛肺→鹽酸溶液浸取→沉淀蛋白→離心分離→三次超濾→凍干→抑肽酶精品↓ ↓收集濾液濾渣→溶解→過濾→離交吸附→洗脫→乙醇醇析→過濾、脫水→真空干燥→肝素鈉(二)工藝過程(按以下次序進行)1.將清真宰牲場取出的牛肺剪去脂肪、氣管等雜物，稱重，切塊用絞肉機(孔徑2～3mm)絞碎成為肺漿。加入2倍量的水，降溫至2～5℃用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH2.0，浸提8小時。
2.浸提液經(jīng)板筐過濾，收集濾渣①；濾液加總質(zhì)量2.5％的三氯乙酸溶液(5％濃度)，攪拌10分鐘，過濾；收集濾渣②，濾液調(diào)節(jié)PH8.0，1～2℃以下放置8小時；除去液面固形物，離心分離，上清液即為抑肽酶提取液。收集離心沉淀③。
3.超濾裝置按使用說明安裝在無菌室內(nèi)，3KD和10KD的過濾器及連接管先用NaOH溶液處理去除熱源，壓力控制在0.03MPa；濾液調(diào)節(jié)至PH6.0，用3KD超濾膜去除熱源.然后用10KD過濾器對洗脫液進行超濾去熱源，壓力控制在0.03MPa；超濾液再用3KD超濾膜進行脫鹽，壓力控制在0.1MPa，并定時補加無熱源水，直至流出液用硝酸銀檢測無氯離子，繼續(xù)超濾濃縮到規(guī)定體積。
4.濃縮液加6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH5.5，真空冷凍干燥，得抑肽酶成品。
5.上述收集的濾液和濾渣混合后，加1％質(zhì)量的氯化鈉攪拌至溶解，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)至PH8.5，升溫至55℃，保溫攪拌2小時后升溫至90℃后，降溫至60℃時開始過濾。
6.濾液加入D254樹脂吸附，55℃吸附6～8小時，過濾。
7.濾出的樹脂用40℃、4mol/L的氯化鈉洗脫3小時，再用1.4mol/L的氯化鈉洗滌2次，每次15分鐘。洗脫液與洗滌液合并。
8.加6mol/L的鹽酸將溶液調(diào)節(jié)至PH6.5，加等體積的95％乙醇，攪拌均勻后靜置12Hr。傾去上清液，沉淀用無水乙醇脫水2次后用丙酮脫水一次，置于真空干燥箱，加五氧化二磷作干燥劑，真空干燥40小時，得肝素鈉粗品。
9.對產(chǎn)品進行活力或效價測定。
本發(fā)明采用源于清真宰牲場的新鮮牛肺為主要原料，并且采用截留分子量10KD和3KD的超濾膜和其他生化分離純化技術，從牛肺中同時分離出兩種具有較高生物活性的生化原料藥；其中抑肽酶活性達到5400KIU/mg，肝素鈉效價達到70IU/mg。
實際例1.
將清真宰牲場取出的牛肺1000kg剪去脂肪、氣管等雜物，稱重，切塊用絞肉機(孔徑2～3mm)絞碎成為肺漿。加入1860kg的水，降溫至2～5℃用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH2.0，浸提8小時。浸提液經(jīng)板筐過濾，收集濾渣①；濾液加95kg的5％濃度三氯乙酸溶液，攪拌10分鐘，過濾；收集濾渣②，濾液調(diào)節(jié)PH8.0，1～2℃以下放置8小時；除去液面固形物，離心分離，上清液即為抑肽酶提取液。收集離心沉淀③。超濾裝置按使用說明安裝在無菌室內(nèi)，3KD和10KD的過濾器及連接管先用NaOH溶液處理去除熱源，壓力控制在0.03MPa；濾液調(diào)節(jié)至PH6.0，用3KD超濾膜去除熱源.然后用10KD過濾器對洗脫液進行超濾去熱源，壓力控制在0.03MPa；超濾液再用3KD超濾膜進行脫鹽，壓力控制在0.1MPa，并定時補加無熱源水，直至流出液用硝酸銀檢測無氯離子，繼續(xù)超濾濃縮到48L。濃縮液加6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH5.5，真空冷凍干燥，得抑肽酶成品33g(酶活力5510KIU/mg)。
上述收集的濾液和濾渣混合后，加10.8kg的氯化鈉攪拌至溶解，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)至PH8.5，升溫至55℃，保溫攪拌2小時后升溫至90℃后，降溫至60℃時開始過濾。濾液加入32kg D254樹脂，55℃吸附6～8小時，過濾。濾出的樹脂用40℃、4mol/L的氯化鈉洗脫3小時，再用1.4mol/L的氯化鈉洗滌2次，每次15分鐘。洗脫液與洗滌液合并。加6mol/L的鹽酸將溶液調(diào)節(jié)至PH6.5，加260kg的95％乙醇，攪拌均勻后靜置12Hr。傾去上清液，沉淀用無水乙醇脫水2次后用丙酮脫水一次，置于真空干燥箱，加五氧化二磷作干燥劑，每次200g，每10小時更換1次，真空干燥40小時，得肝素鈉粗品220mg(效價76IU/mg)。
實際例2.
將清真宰牲場取出的牛肺920kg剪去脂肪、氣管等雜物，稱重，切塊用絞肉機(孔徑2～3mm)絞碎成為肺漿。加入1700kg的水，降溫至2～5℃用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH2.0，浸提8小時。浸提液經(jīng)板筐過濾，收集濾渣①；濾液加86.5kg的5％濃度三氯乙酸溶液，攪拌10分鐘，過濾；收集濾渣②，濾液調(diào)節(jié)PH8.0，1～2℃以下放置8小時；除去液面固形物，離心分離，上清液即為抑肽酶提取液。收集離心沉淀③。超濾裝置按使用說明安裝在無菌室內(nèi)，3KD和10KD的過濾器及連接管先用NaOH溶液處理去除熱源，壓力控制在0.03MPa；濾液調(diào)節(jié)至PH6.0，用3KD超濾膜去除熱源.然后用10KD過濾器對洗脫液進行超濾去熱源，壓力控制在0.03MPa；超濾液再用3KD超濾膜進行脫鹽，壓力控制在0.1MPa，并定時補加無熱源水，直至流出液用硝酸銀檢測無氯離子，繼續(xù)超濾濃縮到46L。濃縮液加6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH5.5，真空冷凍干燥，得抑肽酶成品29g(酶活力5800KIU/mg)。
上述收集的濾液和濾渣混合后，加9.8kg的氯化鈉攪拌至溶解，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)至PH8.5，升溫至55℃，保溫攪拌2小時后升溫至90℃后，降溫至60℃時開始過濾。濾液加入29kg D254樹脂，55℃吸附6～8小時，過濾。濾出的樹脂用40℃、4mol/L的氯化鈉洗脫3小時，再用1.4mol/L的氯化鈉洗滌2次，每次15分鐘。洗脫液與洗滌液合并。加6mol/L的鹽酸將溶液調(diào)節(jié)至PH6.5，加237kg的95％乙醇，攪拌均勻后靜置12Hr。傾去上清液，沉淀用無水乙醇脫水2次后用丙酮脫水一次，置于真空干燥箱，加五氧化二磷作干燥劑，每次180g，每10小時更換1次，真空干燥40小時，得肝素鈉粗品190mg(效價80IU/mg)。
權利要求
1.一種從牛肺中同時提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)的聯(lián)產(chǎn)工藝。其特征在于從一種原料中同時提取了兩種重要的生化原料藥，其中抑肽酶活性達到5400KIU/mg，肝素鈉效價達到70IU/mg。抑肽酶為非特異性蛋白酶抑制劑，能抑制多種含有絲氨酸活性基因的蛋白酶，在臨床上應用于治療胰腺炎、喘息性支氣管炎、燒傷性休克及癌癥手術、腦外科、骨科和心肺轉(zhuǎn)流(CPB)等手術中。肝素鈉具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學功能。
2.本發(fā)明公開了一種從牛肺中同時提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)的聯(lián)產(chǎn)工藝。依次包括如下步驟1.將清真宰牲場取出的牛肺剪去脂肪、氣管等雜物，稱重，切塊用絞肉機(孔徑2～3mm)絞碎成為肺漿。加入2倍量的水，降溫至2～5℃用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH2.0，浸提8小時。2.浸提液經(jīng)板筐過濾，收集濾渣①；濾液加總質(zhì)量2.5％的三氯乙酸溶液(5％濃度)，攪拌10分鐘，過濾；收集濾渣②，濾液調(diào)節(jié)PH8.0，1～2℃以下放置8小時；除去液面固形物，離心分離，上清液即為抑肽酶提取液。收集離心沉淀③。3.超濾裝置按使用說明安裝在無菌室內(nèi)，3KD和10KD的過濾器及連接管先用NaOH溶液處理去除熱源，壓力控制在0.03MPa；濾液調(diào)節(jié)至PH6.0，用3KD超濾膜去除熱源。然后用10KD過濾器對洗脫液進行超濾去熱源，壓力控制在0.03MPa；超濾液再用3KD超濾膜進行脫鹽，壓力控制在0.1MPa，并定時補加無熱源水，直至流出液用硝酸銀檢測無氯離子，繼續(xù)超濾濃縮到規(guī)定體積。4.濃縮液加6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至PH5.5，真空冷凍干燥，得抑肽酶成品(活性≥5400KIU/mg)。5.上述收集的濾液和濾渣混合后，加1％質(zhì)量的氯化鈉攪拌至溶解，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)至PH8.5，升溫至55℃，保溫攪拌2小時后升溫至90℃后，降溫至60℃時開始過濾。6.濾液加入D254樹脂吸附，55℃吸附6～8小時，過濾。7.濾出的樹脂用40℃、4mol/L的氯化鈉洗脫3小時，再用1.4mol/L的氯化鈉洗滌2次，每次15分鐘。洗脫液與洗滌液合并。8.加6mol/L的鹽酸將溶液調(diào)節(jié)至PH6.5，加等體積的95％乙醇，攪拌均勻后靜置12Hr。傾去上清液，沉淀用無水乙醇脫水2次后用丙酮脫水一次，置于真空干燥箱，加五氧化二磷作干燥劑，真空干燥40小時，得肝素鈉粗品(效價≥70IU/mg)。9.對產(chǎn)品進行活力或效價測定。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟能從牛肺中同時提取抑肽酶(Aprotinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)，改進了常規(guī)技術原料利用不充分、生產(chǎn)成本高等缺陷。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的起始原料為來源于清真宰牲場的牛肺，既適應了向穆斯林國家醫(yī)藥界供應藥用原料的渠道，又降低了成本。
5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中采用低溫和強酸性環(huán)境，較好的提取了抑肽酶的有效成分，又很好的保護了肝素鈉不被破壞。
6.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用3KD和10KD的超濾膜三次處理，既有效的分離了雜質(zhì)與產(chǎn)品，又縮短了生產(chǎn)時間，使產(chǎn)品被細菌、熱源污染的機會大大減小。
7.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中采用前面分離的濾液與濾渣為原料提取肝素鈉，極大了降低了生產(chǎn)成本。
8.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所得到的為清真生化產(chǎn)品，其中抑肽酶活性達到5400KIU/mg，肝素鈉效價達到70IU/mg；可廣泛的用于醫(yī)藥、日化等行業(yè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從牛肺中提取抑肽酶(Apro-tinin)和肝素鈉(Heparin Sodium)的聯(lián)產(chǎn)工藝。抑肽酶活性達到5400KIU/mg，肝素鈉效價達到70IU/mg。在工藝技術上，改進了常規(guī)技術原料利用不充分、生產(chǎn)周期長等缺陷，從牛肺中制得符合中國藥典要求的抑肽酶和符合大多數(shù)肝素鈉生產(chǎn)廠家要求的肝素鈉粗品。抑肽酶為非特異性蛋白酶抑制劑，能抑制多種含有絲氨酸活性基因的蛋白酶，在臨床上應用于治療胰腺炎、喘息性支氣管炎、燒傷性休克及癌癥手術、腦外科、骨科和心肺轉(zhuǎn)流(CPB)等手術中。肝素鈉具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等多種生物學功能。本發(fā)明在原料選擇上，采用源于清真宰牲場的新鮮牛肺為主要原料，既適應了向穆斯林國家供應醫(yī)藥和日化原料的渠道，又降低了成本、操作簡便、活性和效價回收率高、無殘留毒素、無三廢污染。
文檔編號C12N9/00GK1803829SQ20061002358
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權日2006年1月24日
發(fā)明者蘇翰, 蘇有錄, 唐甜, 周鈺, 韓彬 申請人:上海阿敏生物技術有限公司