專利名稱：光電子探測(cè)系統(tǒng)的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)
本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2004年12月1日的美國(guó)申請(qǐng)NO.11001583的優(yōu)選權(quán)，該申請(qǐng)是2004年1月16日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)NO.10467242的部分連續(xù)案，該申請(qǐng)是英語(yǔ)公開(kāi)的申請(qǐng)日為2002年2月6日的國(guó)際申請(qǐng)NO.PCT/US0203606的美國(guó)國(guó)家階段，其要求了申請(qǐng)日為2001年2月7日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO.60266977的權(quán)利。
政府支持
本發(fā)明依靠由美國(guó)空軍提供的合約號(hào)為F19628-00-C-0002的政府基金而完成。政府享有本發(fā)明的一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
“窮人的核武器”這類生物武器、化學(xué)武器的增加強(qiáng)調(diào)了對(duì)于能長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)環(huán)境的小型、快速、敏銳的生物制劑探測(cè)器的需求。在戰(zhàn)爭(zhēng)環(huán)境中，有效的探測(cè)器在探測(cè)到特異性生物制劑或化學(xué)制劑后能快速向士兵發(fā)出警報(bào)，使其快速履行抵制手段。
這樣的探測(cè)器在非軍事領(lǐng)域中的應(yīng)用也同樣有效。快速探測(cè)病人體內(nèi)的抗抗菌素細(xì)菌能夠幫助醫(yī)生選擇更加有效的治療方法。連續(xù)檢測(cè)城市飲用水源供應(yīng)能提供對(duì)潛在病原體的早期預(yù)告，給予公共事業(yè)部門(mén)更多的時(shí)間來(lái)抑制潛在的公共健康隱患。除此之外，將這類探測(cè)器應(yīng)用于對(duì)肉類及家禽類的檢疫，是對(duì)現(xiàn)行使用的“戳和聞氣味”的檢疫程序的重要改進(jìn)?？傊?，這種探測(cè)器迫切的需要在醫(yī)藥(例如獸藥)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)(例如用于診斷病態(tài)建筑物綜合癥)、食品加工或標(biāo)準(zhǔn)制訂等領(lǐng)域中進(jìn)行分析和診斷上的應(yīng)用。
所有的脊椎動(dòng)物都是通過(guò)產(chǎn)生高度變化的抗體分子，以在某種程度上獲得對(duì)外來(lái)制劑(抗原)的特異性免疫應(yīng)答?？贵w分子以高度特異性與抗原結(jié)合，例如，它們能夠特異性的結(jié)合兩種高度相關(guān)的細(xì)菌菌株、病毒、蛋白質(zhì)、核酸、真菌、原生動(dòng)物、多細(xì)胞寄生蟲(chóng)、朊病毒，以及這些物質(zhì)的生成產(chǎn)物或者誘導(dǎo)產(chǎn)物。
抗體由免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分——B細(xì)胞產(chǎn)生?？乖ㄟ^(guò)在其表面結(jié)合抗體以刺激B細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生生化反應(yīng)的級(jí)聯(lián)，使鈣離子流入B細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中。
對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)和功能、B細(xì)胞活性的回顧，可參見(jiàn)Paul編輯的《免疫學(xué)基礎(chǔ)》，第3版，Raven出版社，紐約(1993)。
利用抗體的差異性來(lái)探測(cè)多重目標(biāo)顆粒和稀有目標(biāo)顆?；蚩乖难b置已經(jīng)在美國(guó)專利NO.6087114和美國(guó)專利NO.6248542中描述。
這類裝置通常包括一種用于容納傳感細(xì)胞(例如，B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或纖維組織原細(xì)胞)的液體介質(zhì)，一種光學(xué)探測(cè)器，傳感細(xì)胞也包含這里所說(shuō)的淡黃色細(xì)胞(CANARY)或發(fā)光細(xì)胞。該液體介質(zhì)用于接收要被探測(cè)的目標(biāo)顆粒。每個(gè)傳感細(xì)胞都擁有受體(例如，嵌合抗體或單鏈抗體)，它們能在細(xì)胞表面表達(dá)并且對(duì)要探測(cè)的抗原有專一性。抗原與受體的結(jié)合會(huì)引發(fā)包括化學(xué)變化或生化變化的信號(hào)途徑(例如，鈣濃度的增加)。這些傳感細(xì)胞在其細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)也包含發(fā)光分子(例如發(fā)光蛋白質(zhì)或吲哚-1(indo-1))，這些發(fā)光分子能發(fā)射光子以應(yīng)答信號(hào)途徑(例如增加細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)鈣的濃度)。探測(cè)器可以通過(guò)一個(gè)覆蓋物(例如玻璃)與包含細(xì)胞的介質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，所述的覆蓋物對(duì)于光子來(lái)說(shuō)是透明的。這種覆蓋物能用以支撐介質(zhì)，保護(hù)探測(cè)器的易碎表面，或起到透鏡的作用。這種光學(xué)探測(cè)器，例如電荷耦合裝置(CCD)，能夠探測(cè)出細(xì)胞作為對(duì)受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑的應(yīng)答而發(fā)射的光子，提示使用者被探測(cè)的抗原已經(jīng)出現(xiàn)。能夠應(yīng)用于該裝置的其他光學(xué)探測(cè)器包括光電倍增管，光電二極管，互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)成像器，雪崩光電二極管，和成像增強(qiáng)電荷耦合裝置(ICCD)(例如可從Photek有限公司獲得，東薩西克斯郡，英國(guó))。在一些實(shí)施方案中，所述光學(xué)探測(cè)器能夠識(shí)別各個(gè)單個(gè)細(xì)胞。


發(fā)明內(nèi)容
在此描述的本發(fā)明是對(duì)美國(guó)專利NO.6087114和美國(guó)專利NO.6248542中描述的裝置的修正和改進(jìn)，以提供一種探測(cè)可溶性抗原的方法。特別的，本發(fā)明提供了一種探測(cè)可溶性蛋白質(zhì)和化學(xué)制劑的方法。除此之外，本發(fā)明還提供了一種探測(cè)樣品中核酸序列的方法。并且，還提供了一種包含F(xiàn)c受體和發(fā)光分子的發(fā)光細(xì)胞，可用以探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒，該被探測(cè)到的目標(biāo)顆粒與一個(gè)或一個(gè)以上抗體結(jié)合。本發(fā)明還提供了一種光電子傳感裝置，該裝置可通過(guò)使用光子探測(cè)器來(lái)探測(cè)眾多樣品中的目標(biāo)顆粒。
對(duì)于目標(biāo)顆粒的探測(cè)(例如可溶性抗原或者核酸)，由目標(biāo)顆粒與受體的直接結(jié)合或間接結(jié)合、于發(fā)光細(xì)胞表面的表達(dá)來(lái)進(jìn)行部分介導(dǎo)。直接結(jié)合可通過(guò)受體，例如能直接的、特異性結(jié)合目標(biāo)顆粒的抗體來(lái)完成。目標(biāo)顆粒的間接結(jié)合可以通過(guò)Fc受體與已連接了(結(jié)合了)目標(biāo)顆粒的抗體間的結(jié)合來(lái)完成。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中核酸序列的方法，包括下述步驟a)在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸(即已經(jīng)結(jié)合了抗原的寡核苷酸)與核酸序列雜交的條件下使樣品與至少一個(gè)抗原結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合，b)加入發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)或一個(gè)以上受體，這些受體與抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，能發(fā)射光子的發(fā)光分子應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的核酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中核酸序列的方法，包括下述步驟a)在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下使樣品與眾多抗原結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合，b)加入發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)或一個(gè)以上受體，這些受體與抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，能發(fā)射光子的發(fā)光分子應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的核酸序列。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中核酸序列的方法，包括下述步驟a)結(jié)合i)待測(cè)樣品，ii)至少一種與被探測(cè)的核酸序列相互補(bǔ)的抗原結(jié)合的寡核苷酸，和iii)一種固體底物，它含有至少一個(gè)結(jié)合于其上的、與所述核酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸，在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸及結(jié)合于底物的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下，獲得包含雜交了至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸的核酸序列的固體底物，b)向包含雜交了至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸的核酸序列的固體底物中添加發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)或一個(gè)以上受體，這些受體與抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述的發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的核酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中核酸序列的方法，包括下述步驟a)在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下使樣品與至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合，以獲得一種抗原結(jié)合型雜交復(fù)合體，b)添加一個(gè)或一個(gè)以上與抗原結(jié)合型雜交復(fù)合體中的抗原有特異性的抗體；c)添加包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與一個(gè)或一個(gè)以上抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述的發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，d)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中目標(biāo)顆粒的方法，包括下述步驟a)將樣品與下述物質(zhì)混合i)與目標(biāo)顆粒有特異性的抗體；ii)包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，b)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中可溶性抗原的方法，包括下述步驟a)將樣品與下述物質(zhì)混合i)一個(gè)或一個(gè)以上能與可溶性抗原的兩個(gè)不同抗原決定簇結(jié)合的抗體；ii)包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與一個(gè)或一個(gè)以上抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，b)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒。
本發(fā)明還描述了一種利用光子探測(cè)器來(lái)探測(cè)眾多樣品中的目標(biāo)顆粒的光電子傳感裝置，包括a)具有多個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載眾多樣品的轉(zhuǎn)子，b)一個(gè)或一個(gè)以上含有下述混合物的樣品i)用于探測(cè)目標(biāo)顆粒的樣品；和ii)含有能接受目標(biāo)顆粒的受體的細(xì)胞，其中所述受體與目標(biāo)顆粒的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)定位于一個(gè)位置上的光子探測(cè)器，用以探測(cè)在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)置于其上的一個(gè)或一個(gè)以上樣品發(fā)射出的光子。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了一種利用光子探測(cè)器來(lái)探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上樣品中的目標(biāo)顆粒的光電子傳感裝置，包括a)具有多個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載眾多樣品的轉(zhuǎn)子，b)一個(gè)或一個(gè)以上含有下述混合物的樣品i)用于探測(cè)目標(biāo)顆粒的樣品；和ii)對(duì)目標(biāo)顆粒有特異性的抗體；和iii)包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)定位于一個(gè)位置上的光子探測(cè)器，用以探測(cè)在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)置于其上的一個(gè)或一個(gè)以上樣品發(fā)射出的光子。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種利用光子探測(cè)器來(lái)一個(gè)或一個(gè)以上樣品中的核酸序列的光電子傳感裝置，包括a)具有多個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載眾多樣品的轉(zhuǎn)子，b)一個(gè)或一個(gè)以上含有下述混合物的樣品i)用于探測(cè)核酸序列的樣品；ii)至少一個(gè)與該核酸序列雜交的抗原結(jié)合的寡核苷酸；和iii)包含一個(gè)或一個(gè)以上受體的發(fā)光細(xì)胞，其中所述受體與雜交了核酸序列的抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，并且所述一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)定位于一個(gè)位置上的光子探測(cè)器，用以探測(cè)在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)置于其上的一個(gè)或一個(gè)以上樣品發(fā)射出的光子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，這種轉(zhuǎn)子包含16個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載16個(gè)樣品。
進(jìn)一步的，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中可溶性抗原的方法，包括a)將樣品與含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體的發(fā)光細(xì)胞結(jié)合，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上抗體與可溶性抗原的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合，并且該可溶性抗原與一個(gè)或一個(gè)以上抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，b)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中可溶性抗原的方法，包括下述步驟a)交聯(lián)該可溶性抗原，從而獲得交聯(lián)抗原，b)將含有抗體的發(fā)光細(xì)胞與所述交聯(lián)抗原混合，其中所述抗體與該交聯(lián)抗原相結(jié)合，并且抗體與交聯(lián)抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中可溶性抗原的方法，包括下述步驟a)將可溶性抗原與一種固體底物交聯(lián)，從而獲得結(jié)合于固體底物的交聯(lián)可溶性抗原，b)向結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原中添加發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)結(jié)合了該可溶性抗原的抗原決定簇的抗體，并且該抗體與結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中可溶性抗原的方法，包括下述步驟a)將樣品與固體底物結(jié)合，該固體底物包含與可溶性抗原的第一抗原決定簇結(jié)合的第一抗體，從而獲得結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原，b)向結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原中添加發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含與可溶性抗原的第二抗原決定簇結(jié)合的第二抗體，并且該第二抗體與結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟a)將該化學(xué)制劑與肽混合，從而獲得該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體，b)添加含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體的發(fā)光細(xì)胞，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上抗體與該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體中的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合，并且一個(gè)或一個(gè)以上抗體與化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
在本發(fā)明的另一進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟a)將該化學(xué)制劑與肽結(jié)合，從而獲得一種化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體，b)交聯(lián)該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體，從而獲得化學(xué)制劑-肽的交聯(lián)復(fù)合體，c)將化學(xué)制劑-肽的交聯(lián)復(fù)合體與發(fā)光細(xì)胞混合，所述發(fā)光細(xì)胞含有一種與該化學(xué)制劑-肽交聯(lián)復(fù)合體相結(jié)合的抗體，這種抗體與化學(xué)制劑-肽交聯(lián)復(fù)合體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，d)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
在一種另外的實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟a)將該化學(xué)制劑與一種抗原結(jié)合肽結(jié)合，從而獲得一種化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的復(fù)合體，b)添加發(fā)光細(xì)胞，該發(fā)光細(xì)胞含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體，這些抗體與該化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽復(fù)合體的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合，這種一個(gè)或一個(gè)以上抗體與化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽復(fù)合體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)其他的實(shí)施方案中，提供了一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟a)將該化學(xué)制劑與一種抗原結(jié)合肽結(jié)合，從而獲得一種化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的復(fù)合體，b)交聯(lián)該化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的復(fù)合體，從而獲得一種化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的交聯(lián)復(fù)合體，c)添加發(fā)光細(xì)胞，該發(fā)光細(xì)胞含有一種抗體，該抗體與該化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽交聯(lián)復(fù)合體相結(jié)合，這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，d)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
本發(fā)明所述的系統(tǒng)在醫(yī)藥(例如獸藥)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)(例如用于診斷病態(tài)建筑物綜合癥)、食品加工或標(biāo)準(zhǔn)制訂領(lǐng)域中做分析和診斷上的應(yīng)用是十分有效的。
前述的及前述未提及的本發(fā)明的其他性質(zhì)、特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中明顯體現(xiàn)，并且在隨后的附圖中舉例說(shuō)明。



專利文件或?qū)＠暾?qǐng)文件包含至少一幅彩色附圖，在提交了請(qǐng)求及支付必要費(fèi)用的基礎(chǔ)上，公開(kāi)的專利文件或?qū)＠暾?qǐng)文件的復(fù)印件的彩色附圖將由政府部門(mén)提供。
圖1是光電子傳感細(xì)胞概念的示意圖 圖2是說(shuō)明含有對(duì)可疑物質(zhì)進(jìn)行初步探測(cè)的采樣器(觸發(fā)器)的光電子傳感器的一般結(jié)構(gòu)體系的示意圖 圖3是說(shuō)明建立用于光電子傳感器的細(xì)胞系的示意圖 圖4是生物學(xué)氣溶膠告警傳感器(BAWS)/光電子傳感器集成系統(tǒng)的示意圖 圖5表示的是光電子傳感器中B細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒的應(yīng)答 圖6表示的是光電子傳感器的干式撞擊器模塊 圖7是說(shuō)明定位化核混合的效果的示意圖 圖8表示的是利用土拉熱氏菌細(xì)胞定位化的效果 圖9表示的是光電子傳感器的自動(dòng)化細(xì)胞運(yùn)送模塊 圖10表示的是使用光電子傳感器時(shí)一個(gè)土拉熱氏菌細(xì)胞樣品的劑量應(yīng)答關(guān)系 圖11表示的是B細(xì)胞對(duì)化學(xué)污染和生物污染的抵抗能力 圖12表示的是光電子傳感器的自動(dòng)離心模塊 圖13是空氣撞擊器/光電子傳感器的示意圖 圖14是光電子傳感器的示意圖 圖15表示的是光電子傳感器的光學(xué)/光電倍增管(PMT)模塊 圖16是空氣撞擊器/光電子傳感器的示意圖 圖17是光電子傳感器的多通道離心機(jī)的示意圖 圖18是光電子傳感器的濕法離心機(jī)/撞擊器概念的示意圖 圖19是光電子傳感器的濕法離心機(jī)/撞擊器概念的示意圖 圖20是光電子傳感器的專用管(custom tube)的示意圖 圖21表示的是集成的干式撞擊器/光電子傳感器 圖22表示的是細(xì)胞處理對(duì)特異于鼠疫桿菌的B細(xì)胞的應(yīng)答的影響 圖23表示的是可以收集氣溶膠樣品的撞擊器 圖24是CANARY傳感器概念的概括示意圖。B細(xì)胞被經(jīng)過(guò)修飾，能在細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)水母發(fā)光蛋白，并在細(xì)胞表面表達(dá)病原體抗體。當(dāng)病原體出現(xiàn)時(shí)，抗體交聯(lián)在(固定在，聚積在)細(xì)胞表面，刺激產(chǎn)生信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。水母發(fā)光蛋白分子通過(guò)氧化水母發(fā)光蛋白來(lái)應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并發(fā)出光子。光子的輸出可以由PMT監(jiān)測(cè)。
圖25是DNA探測(cè)的示意圖?；パa(bǔ)于目標(biāo)DNA序列、并含有末端地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交。與目標(biāo)DNA結(jié)合的多個(gè)地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸同CANARY細(xì)胞(發(fā)光細(xì)胞)表面的地高辛配基抗體的結(jié)合，刺激了光子的發(fā)射。
圖26A-C是一組曲線圖。CANARY細(xì)胞(發(fā)光細(xì)胞)對(duì)針對(duì)地高辛配基的抗體的表達(dá)可以由地高辛配基標(biāo)記的DNA來(lái)刺激。將能表達(dá)針對(duì)地高辛配基的抗體的發(fā)光細(xì)胞加入到離心管中，所述離心管中還含有50微升指示濃度的地高辛配基標(biāo)記的DNA標(biāo)準(zhǔn)劑。對(duì)該管進(jìn)行短暫離心，迫使細(xì)胞聚積在管的底部，離PMT距離最近，將光子的發(fā)射作為時(shí)間記錄功能，使用三種不同類型的地高辛配基標(biāo)記的DNA來(lái)刺激細(xì)胞，每種達(dá)到成功的靈敏度都不同。圖26A中，由地高辛配基密集標(biāo)記的質(zhì)粒DNA(約4000個(gè)堿基對(duì)與200個(gè)地高辛配基分子相連接)的探測(cè)極限是大約1納克/毫升(50匹克絕對(duì)含量)。圖26B中，由地高辛配基稀疏標(biāo)記的不同長(zhǎng)短(81-8576個(gè)堿基對(duì))的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)劑的探測(cè)極限是1微克/毫升(50納克絕對(duì)含量)。圖26C中，每個(gè)端點(diǎn)都使用地高辛配基標(biāo)記的不同長(zhǎng)短(8-587個(gè)堿基對(duì))的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)劑(DNA分子的每個(gè)端點(diǎn)都有一個(gè)地高辛配基)的探測(cè)極限是100納克/毫升(5納克絕對(duì)含量)。
圖27A-B是一組曲線圖。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心可能降低其對(duì)可溶性抗原的靈敏度。將能表達(dá)針對(duì)地高辛配基的抗體的發(fā)光細(xì)胞加入到離心管中，所述離心管中還含有50微升指示濃度的地高辛配基標(biāo)記的質(zhì)粒DNA。圖27A中，對(duì)該管進(jìn)行短暫離心，迫使細(xì)胞聚積到管的底部，離PMT距離最近，將光子的發(fā)射作為時(shí)間記錄功能。圖27B中，將細(xì)胞與DNA進(jìn)行人工混合，在不經(jīng)離心的狀態(tài)下放置于PMT前。
圖28是曲線圖。在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，雜交兩個(gè)互補(bǔ)的地高辛配基標(biāo)記過(guò)的寡核苷酸(3號(hào)寡核苷酸和NEG3號(hào)寡核苷酸)。用CO2-I介質(zhì)以1∶10的用量稀釋樣品至總體積達(dá)到100微升，并加入20微升的細(xì)胞，測(cè)量光子發(fā)射。地高辛配基細(xì)胞表達(dá)地高辛配基抗體，而對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行表達(dá)。
圖29是曲線圖?？焖匐s交地高辛配基標(biāo)記的單鏈DNA寡核苷酸。向8微升的雜交溶液中(50毫摩NaCl，40毫摩Tris，PH7.5)加入指示含量的寡核苷酸NEG3，并在加入90微升CO2-I介質(zhì)和20微升地高辛配基CANARY細(xì)胞后迅速加入1微升的3號(hào)寡核苷酸(oligo 3)。迅速將管內(nèi)物質(zhì)混合，并將管迅速置于測(cè)光計(jì)中監(jiān)測(cè)光子的輸出。從第二種寡核苷酸的加入到將管置于測(cè)光計(jì)中(x軸的0點(diǎn))的總的用時(shí)約為15秒。
圖30是一個(gè)曲線圖。單鏈DNA從pBluescript噬菌體質(zhì)粒中獲得，并與全部10個(gè)地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸雜交。雜交以后，反應(yīng)液在100微升CO2-I介質(zhì)中被稀釋，并加入20微升地高辛配基細(xì)胞，然后測(cè)量光子的發(fā)射。圖中所示的摩爾比是寡核苷酸與目標(biāo)單鏈DNA的比。該實(shí)驗(yàn)的理想比率在1.2到1.4之間。
圖31是一個(gè)曲線圖。對(duì)單鏈DNA的序列特異性探測(cè)。10個(gè)地高辛配基標(biāo)記過(guò)的寡核苷酸與給定量的單鏈?zhǔn)删w質(zhì)粒DNA進(jìn)行雜交，其中所述的10個(gè)地高辛配基標(biāo)記過(guò)的寡核苷酸與噬菌體質(zhì)粒pBluescript的(+)鏈互補(bǔ)。加入能表達(dá)針對(duì)地高辛配基的抗體的發(fā)光細(xì)胞，由細(xì)胞發(fā)出的光被光電倍增管監(jiān)測(cè)。只能探測(cè)到噬菌體質(zhì)粒的(+)鏈，這表明，識(shí)別反應(yīng)是存在序列特異性的。當(dāng)寡核苷酸探針不存在時(shí)，單鏈DNA無(wú)法刺激細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)中的探測(cè)極限是50納克。
圖32A-B是一組柱形圖。在核酸探測(cè)反應(yīng)中溫度帶來(lái)的影響。在幾個(gè)不同溫度下將單鏈?zhǔn)删w質(zhì)粒DNA與給定濃度的探針進(jìn)行雜交，出現(xiàn)了最大RLU。圖32A中，在PBS中，當(dāng)雜交溫度51℃時(shí)，出現(xiàn)最大信號(hào)，但類似的信號(hào)還出現(xiàn)在雜交溫度為47℃和42℃的時(shí)候。圖32B中，在42℃條件下進(jìn)行雜交，比使用低濃度寡核苷酸探針的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出增強(qiáng)的信號(hào)，0.16pmoles的寡核苷酸與0.63pmoles的寡核苷酸的作用效果相當(dāng)。在寡核苷酸濃度為0.04pmoles的時(shí)候信號(hào)加倍。
圖33是DNA沉降方法的一個(gè)示意圖。捕獲寡核苷酸連接在沉降顆粒的表面上，這類寡核苷酸不與地高辛配基標(biāo)記過(guò)的寡核苷酸結(jié)合相同的區(qū)域。目標(biāo)核酸與捕獲寡核苷酸相結(jié)合，地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸與目標(biāo)顆粒相結(jié)合。整個(gè)復(fù)合物通過(guò)離心(或者磁場(chǎng)作用)被沉降，并由表達(dá)針對(duì)地高辛配基的抗體的發(fā)光細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)。
圖34是一個(gè)曲線圖。目標(biāo)DNA的沉降能提高靈敏度。使用生物素標(biāo)記的寡核苷酸飽和與鏈霉抗生素蛋白結(jié)合的珠，通過(guò)洗滌除去過(guò)量的寡核苷酸。在47℃條件下使用所述的珠培養(yǎng)pBluescript單鏈DNA(+鏈)5分鐘，然后洗滌。加入地高辛配基標(biāo)記的探測(cè)寡核苷酸，在47℃條件下雜交20分鐘，通過(guò)洗滌除去過(guò)量的寡核苷酸。將所述珠重新懸浮于200微升CO2-I介質(zhì)中，每次試驗(yàn)使用40微升。
圖35是一個(gè)柱形圖。在指示濃度的阻塞劑的存在下，在47℃條件下使用生物素標(biāo)記的寡核苷酸培養(yǎng)PBS噬菌體質(zhì)粒單鏈DNA20分鐘，其中所述生物素標(biāo)記的寡核苷酸與鏈霉抗生素蛋白包被的聚苯乙烯珠相結(jié)合，并與地高辛配基標(biāo)記過(guò)的寡核苷酸相結(jié)合。在室溫下，在TBS(50毫摩Tris，130毫摩NaCl)中洗滌與珠結(jié)合的、由地高辛配基標(biāo)記的目標(biāo)物質(zhì)3次。將珠重新懸浮于CO2-I介質(zhì)中，并加入發(fā)光細(xì)胞，然后離心所述反應(yīng)液，并使用測(cè)光計(jì)監(jiān)測(cè)光子的輸出。
圖36A-C是一組曲線圖。圖36A中，當(dāng)使用IFNγ處理U937細(xì)胞時(shí)，其表現(xiàn)出對(duì)FcγRI表達(dá)的增加。用免疫熒光檢驗(yàn)法測(cè)量使用IFNγ處理過(guò)(200納克/毫升，空心的綠色峰值)的U937細(xì)胞或未經(jīng)處理(實(shí)心紫色峰值)的U937細(xì)胞對(duì)FcγRI的相關(guān)表達(dá)。圖36B中，U937細(xì)胞表達(dá)功能性水母發(fā)光蛋白。當(dāng)使用ionomycin處理時(shí)(50M)，經(jīng)過(guò)鈣敏感的發(fā)光蛋白水母發(fā)光分子轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞會(huì)發(fā)射光子。圖36C中，當(dāng)將Fc受體交聯(lián)到具有穩(wěn)定表達(dá)水母發(fā)光蛋白能力的U937細(xì)胞中后，進(jìn)行光子的探測(cè)。使用10微克/毫升的人類免疫球蛋白G預(yù)培養(yǎng)U937細(xì)胞，然后進(jìn)行洗滌并且使用山羊抗人類免疫球蛋白G進(jìn)行處理(2’段)。
圖37A-D是一組曲線圖。U937細(xì)胞可以被加工成能夠快速應(yīng)答于幾種不同病原體或其類似物。使用IFNγ(200納克/毫升)處理U937細(xì)胞24小時(shí)，以增強(qiáng)其對(duì)內(nèi)源性FcγRI的表達(dá)，并為CANARY試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。然后，使用下述抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)圖37A中，鼠類抗炭疽桿菌孢子，圖37B中，兔類多克隆抗炭疽桿菌孢子，圖37C中，鼠類抗土拉熱弗朗西絲氏菌，或者圖37D中，鼠類抗枯草桿菌雜交瘤上清液。然后將細(xì)胞應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)CANARY試驗(yàn)，在試驗(yàn)中，使用單克隆抗體探測(cè)1000cfu炭疽桿菌孢子，使用兔多克隆抗體探測(cè)10000cfu孢子，同樣還探測(cè)到10000cfu土拉熱弗朗西絲氏菌和1000cfu枯草桿菌孢子。
圖38A-C是一組曲線圖。經(jīng)過(guò)快速加工的U937是具備特異性的，并且所述特異性取決于抗體。在圖38A中，使用鼠類抗土拉熱弗朗西絲氏菌抗體培養(yǎng)的U937細(xì)胞沒(méi)有對(duì)105cfu炭疽桿菌孢子產(chǎn)生應(yīng)答，但是對(duì)106cfu土拉熱弗朗西絲氏菌產(chǎn)生應(yīng)答。在圖38B中，用鼠類抗炭疽桿菌孢子抗體加載的細(xì)胞沒(méi)有對(duì)土拉熱弗朗西絲氏菌產(chǎn)生應(yīng)答，但是對(duì)106cfu炭疽桿菌孢子產(chǎn)生應(yīng)答。在圖38C中，當(dāng)抗土拉熱弗朗西絲氏菌抗體不存在時(shí)(106cfu土拉熱弗朗西絲氏菌，沒(méi)有ab)，細(xì)胞對(duì)106cfu土拉熱弗朗西絲氏菌沒(méi)有產(chǎn)生任何應(yīng)答。
圖39描述了一種16通道傳感器。這個(gè)傳感器被設(shè)計(jì)成能夠使用單個(gè)的光收集通道同時(shí)進(jìn)行對(duì)16種樣品的測(cè)量。所述傳感器包括一個(gè)能夠水平承載16根1.5毫升管的轉(zhuǎn)子，這些管平均分布在轉(zhuǎn)子的圓周上，在可變速馬達(dá)的驅(qū)動(dòng)下繞垂直軸運(yùn)動(dòng)。一個(gè)單獨(dú)固定的光子探測(cè)元件(例如，一個(gè)PMT)為定位于轉(zhuǎn)子的平面上，其位置剛好超過(guò)管子旋轉(zhuǎn)時(shí)經(jīng)過(guò)的路徑。通過(guò)這種方式，每根管子都按順序的、反復(fù)的運(yùn)動(dòng)至緊密接近PMT，使得管子每次經(jīng)過(guò)時(shí)其輸出的光子都能被采樣。最后，使用一個(gè)由光源(紅外線LED)和探測(cè)器(光電晶體管)組成的光學(xué)轉(zhuǎn)換器來(lái)控制被探測(cè)光子的計(jì)數(shù)，并將其重組于16個(gè)字段中，每個(gè)字段對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的樣品。
圖40是一個(gè)曲線圖。從16通道傳感器獲得的數(shù)據(jù)證明，其LOD值與使用單個(gè)通道儀器獲得的值相同，只是16種樣品進(jìn)行了同時(shí)的測(cè)量。單獨(dú)的測(cè)量包括下述步驟在分別的1.5毫升管中準(zhǔn)備16種樣品(和/或?qū)φ瘴?，向每根管中導(dǎo)入等量的發(fā)光細(xì)胞，將管子置于放置在暗箱中的轉(zhuǎn)子上，在高RCF(約2000g)條件下對(duì)管進(jìn)行短暫離心(5秒)，從而將發(fā)光細(xì)胞定位至管子的底部，在測(cè)量的過(guò)程中，將轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速降至60rpm(每根管每秒被采樣一次)，為每種樣品建立一個(gè)光子計(jì)數(shù)的時(shí)間數(shù)列，用于顯示和/或輸入到計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則程序用于評(píng)估。
圖41是一個(gè)便攜式16通道傳感器設(shè)計(jì)的示意圖。
圖42是一個(gè)集成有氣溶膠收集器和發(fā)光細(xì)胞運(yùn)送系統(tǒng)的CANARY圓盤(pán)(CD)。
圖43是一個(gè)被撞擊器噴嘴和透明管切掉一部分的氣溶膠收集模塊的示意圖。
圖44是一個(gè)帶有閥門(mén)運(yùn)送系統(tǒng)的發(fā)光細(xì)胞運(yùn)送模塊示意圖。
圖45是一個(gè)16通道傳感器及其功效的概括圖。
圖46是一個(gè)毒性探測(cè)的概括圖。
圖47是一個(gè)表達(dá)水母發(fā)光蛋白的傳感細(xì)胞和一個(gè)普遍的抗體受體的概括圖。
圖48是一個(gè)探測(cè)可溶性單體抗原的方法1的示意圖。一個(gè)單個(gè)的發(fā)光細(xì)胞被加工成能夠在同一個(gè)單體抗原中表達(dá)兩種針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體?？乖瓕?duì)抗體的交聯(lián)，刺激了發(fā)光細(xì)胞發(fā)射光子。
圖49是一個(gè)曲線圖，描述了分別用炭疽桿菌和鼠疫桿菌處理細(xì)胞系所產(chǎn)生的結(jié)果，其中所述細(xì)胞系能表達(dá)針對(duì)炭疽桿菌和鼠疫桿菌的抗體。這個(gè)單克隆細(xì)胞系能夠探測(cè)到少至50cfu的炭疽桿菌或者鼠疫桿菌，這表明兩個(gè)抗體上的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)都被表達(dá)并且都是起作用的。
圖50是探測(cè)可溶性蛋白的方法的示意圖。使用兩個(gè)抗體來(lái)探測(cè)包含兩個(gè)或者更多抗原決定簇的抗原，一個(gè)抗體與珠(或者與其他任何與多個(gè)抗體分子相結(jié)合的支持物)結(jié)合，而另一個(gè)抗體由發(fā)光細(xì)胞表達(dá)。用抗體包被的珠培養(yǎng)抗原，并在珠的表面用多個(gè)抗原進(jìn)行修飾。然后將珠導(dǎo)入發(fā)光細(xì)胞。由于抗原與珠進(jìn)行了交聯(lián)，所以發(fā)光細(xì)胞抗體也交聯(lián)其上并且刺激了光子的發(fā)射。
圖51是一個(gè)曲線圖，描述了交聯(lián)于G蛋白磁性珠的抗體6E10-10在4℃下使用不同量的BoNT/A Hc培養(yǎng)3小時(shí)所產(chǎn)生的結(jié)果。使用CO2-I介質(zhì)洗滌所述珠三次。加入能表達(dá)6B2-2抗體的發(fā)光細(xì)胞，將反應(yīng)液離心5秒，然后使用測(cè)光計(jì)監(jiān)測(cè)輸出的光子。
圖52是一個(gè)探測(cè)化學(xué)制劑的示意圖。將一個(gè)分離的肽特異性結(jié)合到感興趣的化學(xué)制劑上，產(chǎn)生了一個(gè)特異性結(jié)合于肽-化學(xué)制劑復(fù)合體的抗體。如果所述肽-化學(xué)制劑僅僅形成一個(gè)單個(gè)的功能性抗原決定簇，可以向所述肽中導(dǎo)入一個(gè)額外的抗原決定簇。如圖所示，這個(gè)抗原決定簇是一個(gè)地高辛配基分子，但是其他特異性抗原決定簇也是完全可以的。當(dāng)化學(xué)制劑存在時(shí)，該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體可以包括兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)，并且可以通過(guò)與蛋白質(zhì)毒性探測(cè)相類似的方法進(jìn)行探測(cè)。
圖53是一個(gè)描述另外一種探測(cè)化學(xué)制劑的方法的示意圖。分離兩種肽，并將其串聯(lián)(按一縱列)結(jié)合到感興趣的化學(xué)制劑上。這些肽的結(jié)合可以通過(guò)下列方式進(jìn)行探測(cè)形成針對(duì)每個(gè)肽-化學(xué)制劑復(fù)合體的抗體；或者使用如圖所示的抗體結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記所述的肽。
圖54是另外一種探測(cè)化學(xué)制劑的方法的示意圖。將一種肽與兩種感興趣的化學(xué)制劑相結(jié)合，從而形成一個(gè)化學(xué)制劑-肽的二聚物復(fù)合體。將一個(gè)抗體特異性結(jié)合到這種化學(xué)制劑-肽的二聚物復(fù)合體上。所述化學(xué)制劑-肽的二聚物復(fù)合體可以含有兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)，足夠用來(lái)刺激發(fā)光細(xì)胞，以增加細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度，因而導(dǎo)致發(fā)光細(xì)胞發(fā)射光子。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明在此描述了一種探測(cè)可溶性抗原的方法。舉例說(shuō)明，這里的可溶性抗原可以是可溶性蛋白質(zhì)或者化學(xué)制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該可溶性抗原只包含一個(gè)或者兩個(gè)抗原決定簇。對(duì)可溶性抗原的探測(cè)需要使用在細(xì)胞表面表達(dá)的抗體，所述抗體與抗原的結(jié)合引發(fā)鈣濃度的增加，鈣濃度的增加刺激了發(fā)光分子發(fā)射光子來(lái)應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，這取決于抗原與細(xì)胞表面的抗體交聯(lián)(或聚集，從而將抗體固定于細(xì)胞表面)的能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加?？扇苄钥乖c在細(xì)胞表面表達(dá)的抗體的交聯(lián)能力低，其激活細(xì)胞內(nèi)鈣的增加的能力就低。本發(fā)明所述的探測(cè)可溶性抗原的方法，已經(jīng)按照方法描述的步驟完成了抗體的交聯(lián)，即能夠激活細(xì)胞內(nèi)鈣的增加并導(dǎo)致發(fā)光分子發(fā)射光子來(lái)應(yīng)答這種鈣濃度的增加。
希望被探測(cè)的可溶性抗原和化學(xué)制劑可以是很多種類的制劑。舉例說(shuō)明，但并非限制，本發(fā)明所述的方法可以用于探測(cè)蛋白毒素，例如肉毒毒素，血清型A、B、C、D、E、F、G，葡萄球菌腸毒素-B(SEB)和其他超抗原，蓖麻毒素，志賀氏細(xì)菌性痢疾毒素，芋螺毒素，梭菌perfringensε毒素，志賀氏細(xì)菌狀核糖體滅活蛋白，和其他可溶性細(xì)菌產(chǎn)品，例如來(lái)自鼠疫桿菌的F1抗原，保護(hù)性抗原，致死因子，來(lái)自炭疽桿菌的水腫因子。希望被探測(cè)的其他分子包括細(xì)菌定數(shù)傳感分子，例如同型絲氨酸內(nèi)酯。可用于本發(fā)明的方法探測(cè)的化學(xué)戰(zhàn)爭(zhēng)制劑或它們水解后的分解產(chǎn)物的例子包括，但并非限制，氰化物(氫氰酸)，碳酰氯(二氯化碳)，CK(氯化氰)，CL(氯氣)，CX(二氯碳亞胺，羥基)，DP(二氯碳酸，三氯甲基酯)，GA，Tabun(二甲氨基氰磷酸乙酯)，GB，沙林9-甲基磷酰基氟酸，(1-甲基乙基酯)，GD，梭曼(甲基磷?；幔?，2，2-三甲基丙基酯)，GF(甲基磷?；幔h(huán)乙基酯)，芥末(1，1-叔代雙2-氯乙烷)，HN-1，氮芥末(2-氯-N-2-氯乙基-N-乙基乙醇胺)，HN-2，氮芥末(2-氯-N-2-氯乙基-N-甲基乙醇胺)，路易斯毒氣(2-氯乙烯亞胂酸二氯化物，PFIB(1，1，3，3，3-五氟-2-三氟甲基-1-丙烯)，三光氣(碳酸，三氯甲基酯)，V-氣體(甲基硫代磷酸，S-2-二乙氨基乙基O-2-甲基丙基酯)，VX(甲基硫代磷酸，S-2-二1-甲基乙基氨基乙基O-乙酯)，VX的二元組分(O-乙基，O-2二異丙基氨基乙基甲基磷酸鹽和硫)，GD的二元組分(二氟(DF)磷酰甲烷與2-叔乙基醇和胺的混合物)，GB的二元組分(二氟(DF)磷酰甲烷與異丙醇和異丙胺的混合物。除此之外，可使用本發(fā)明所述的方法進(jìn)行探測(cè)的其他生物衍生化學(xué)制劑包括，毒枝菌素，特別是單端孢霉烯(T2)毒枝菌素，蛇形菌素異基，蛤蚌毒素，或者其他dinoflagellage產(chǎn)物，微囊藻素(各種類型)，珊瑚蟲(chóng)毒素，沙曲毒素H，黃曲霉毒素，和河豚毒。
其他希望被探測(cè)的蛋白質(zhì)包括，APP(淀粉狀前體蛋白)，與CJD結(jié)合的朊病毒蛋白，與BSE結(jié)合的朊病毒蛋白，與羊癢病結(jié)合的朊病毒蛋白，與庫(kù)魯病結(jié)合的朊病毒蛋白，和PSA(前列腺特異性抗原)。并且，對(duì)適當(dāng)?shù)目扇苄钥乖蚧瘜W(xué)制劑的探測(cè)在很多應(yīng)用領(lǐng)域都是十分有效的，例如在臨床應(yīng)用，舉例說(shuō)明，甲狀腺機(jī)能，腎上腺機(jī)能，骨代謝，可生育性，不可生育性，IVF，妊娠，生長(zhǎng)和生長(zhǎng)激素缺乏，糖尿病，血液學(xué)，心臟機(jī)能，癌癥，過(guò)敏，自體免疫，治療性藥物監(jiān)測(cè)，藥物的濫用，研究免疫分析應(yīng)用，遺傳工程蛋白，乳狀藥物殘留，肝功能，抗生素和抗生素合成途徑。這些領(lǐng)域中被用來(lái)分析的合適的可溶性抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的(例如可參見(jiàn)《免疫分析手冊(cè)》第2版，David Wild編輯，自然出版集團(tuán)2001NY NY)。
本發(fā)明還提供了探測(cè)和識(shí)別特異性核酸(NA)序列的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用寡核苷酸探針使抗原與目標(biāo)核酸接觸。這些探針用抗原修飾特異性核酸序列。這種抗原修飾的(也指這里所說(shuō)的抗原共軛型)寡核苷酸能夠刺激發(fā)光細(xì)胞表達(dá)抗體來(lái)抑制抗原。游離探針，如果存在的話，是一種單體，因而不會(huì)刺激發(fā)光細(xì)胞。同樣的，標(biāo)記的寡核苷酸與核酸上的非特異位點(diǎn)的背景結(jié)合不會(huì)顯著刺激發(fā)光細(xì)胞，因?yàn)橛蛇@種稀有的背景結(jié)合而產(chǎn)生的抗原太過(guò)分散，以至于不能有效的交聯(lián)抗體。
抗原的選擇依賴于很多因素，包括相應(yīng)抗體的有效性和特性，被探測(cè)樣品中可交叉反應(yīng)的抗原的缺乏，及抗原與寡核苷酸共軛物的可溶性、穩(wěn)定性和成本，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的。這里所使用的寡核苷酸可以是DNA，RNA，肽核酸(PNA)，鎖定核酸，或者其他任何種類具有專門(mén)的、獨(dú)特特性的、本領(lǐng)域熟知的修飾核酸替代品。除此之外，向這類探針中添加陽(yáng)離子氨基酸(以肽或蛋白的形式)能增加雜交率。如果需要，這種陽(yáng)離子肽或陽(yáng)離子蛋白可以提供雙倍職能使發(fā)光細(xì)胞探測(cè)出抗原。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，基于發(fā)光細(xì)胞的探測(cè)系統(tǒng)含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體在其表面，并且包括一個(gè)在抗原受目標(biāo)核酸刺激時(shí)能發(fā)射光子的化合物(發(fā)光分子)。特別的，光子的發(fā)射由細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加來(lái)激活。
本發(fā)明還提供了一種能探測(cè)與一個(gè)或一個(gè)以上抗體相結(jié)合的目標(biāo)顆粒的傳感細(xì)胞。特別的，這種傳感細(xì)胞含有一個(gè)發(fā)光分子和一個(gè)與抗體相結(jié)合的Fc受體，其中該抗體與目標(biāo)制劑或者目標(biāo)顆粒相結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含F(xiàn)c受體的傳感細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，例如人類巨噬細(xì)胞系U937。其他合適的細(xì)胞或者細(xì)胞系是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的。所述Fc受體是一個(gè)與抗體或者抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合的膜表達(dá)蛋白質(zhì)家族。它們?cè)诶鐔魏?白)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞這樣的幾種造血細(xì)胞中表達(dá)。Fc受體的幾種小類包括Fcγ受體(FcγRI)，是一種可溶性抗體的高親和結(jié)合體。FcγRI與免疫球蛋白(IgG)的恒定區(qū)域(Fc段)結(jié)合，而將抗體的抗原結(jié)合區(qū)域留出?？贵w結(jié)合Fc受體與特異性抗原的交聯(lián)引發(fā)信號(hào)途徑，刺激鈣的釋放。因此，F(xiàn)c受體交聯(lián)到傳感細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加，發(fā)光分子從而發(fā)射光子來(lái)應(yīng)答這種鈣濃度的增加。
本發(fā)明還在此描述了一種16通道傳感器。在它的最簡(jiǎn)單的形式中，發(fā)光細(xì)胞的試驗(yàn)包括準(zhǔn)備一種置于透明管中的樣品，向透明管中導(dǎo)入一部分事先準(zhǔn)備好的發(fā)光細(xì)胞，用快速離心螺旋將發(fā)光細(xì)胞送至透明管底部，用光子計(jì)量傳感器測(cè)量從透明管中輸出的光。在實(shí)驗(yàn)室里，大多數(shù)發(fā)光細(xì)胞的測(cè)定是連續(xù)進(jìn)行的，一次使用一種樣品，在自動(dòng)化BAWS/CANARY儀器中，同時(shí)測(cè)量四種樣品，每種樣品都有自己?jiǎn)为?dú)的光線收集通道。前一個(gè)體系需要更多的時(shí)間，而后一個(gè)體系則需要更加復(fù)雜(和昂貴)的硬件。
在此描述了一種能減少多種樣品的測(cè)量時(shí)間(且對(duì)硬件的需求最小)的特殊方法。傳感器被設(shè)計(jì)成能夠通過(guò)單一的光線收集通道來(lái)同時(shí)測(cè)量多種樣品。這種傳感器包含一個(gè)能夠水平承載16只1.5毫升管的轉(zhuǎn)子，這些管子平均分布在轉(zhuǎn)子的圓周上，在可變速馬達(dá)的驅(qū)動(dòng)下繞垂直軸運(yùn)動(dòng)(附圖39)。一個(gè)單獨(dú)固定的光子探測(cè)元件(例如PMT)被安置在轉(zhuǎn)子的平面上，其位置剛好超過(guò)管子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的軌道。在這個(gè)設(shè)計(jì)中，每根管子都能按順序的、反復(fù)的緊密接近光子探測(cè)元件，以便在每次通過(guò)時(shí)使其輸出的光能被采樣。最后，使用一個(gè)包含光源(紅外線LED)和探測(cè)器(光電晶體管)的光學(xué)轉(zhuǎn)換器來(lái)控制被探測(cè)光子的計(jì)數(shù)，并將數(shù)據(jù)重組于16個(gè)字段中，每個(gè)字段對(duì)應(yīng)一個(gè)樣品。
這種16通道的設(shè)計(jì)的另外一種實(shí)施方案被稱為T(mén)CAN傳感器。這種TCAN(觸發(fā)式CANARY)生物傳感器是一種自動(dòng)化生物傳感器，它將氣溶膠的收集和發(fā)光細(xì)胞液體流的運(yùn)送集成到一個(gè)放射狀圓盤(pán)中。這個(gè)TCANCANARY圓盤(pán)(CD)(附圖42)上結(jié)合了管道，用以將空氣流分送至不同的通道。收集的氣溶膠(附圖43)使用干法撞擊技術(shù)，使顆粒順著氣流定位于空塑料管底部。
在對(duì)氣溶膠顆粒進(jìn)行撞擊后，CD與管道結(jié)合以開(kāi)啟位于圓盤(pán)上的電子管。圓盤(pán)的快速旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致發(fā)光細(xì)胞液體在離心力的作用下依次進(jìn)入各自的管中(附圖44)。接著利用一個(gè)光學(xué)探測(cè)器，通過(guò)發(fā)光細(xì)胞發(fā)出的光子與氣溶膠顆粒的相互作用來(lái)識(shí)別可能存在的生物制劑。氣溶膠的收集和發(fā)光細(xì)胞的運(yùn)輸這一反應(yīng)可以在一個(gè)圓盤(pán)中重復(fù)多次。這個(gè)特性使其可以在不更換CD的情況下在幾次觸發(fā)事件下對(duì)多個(gè)發(fā)光細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
適用于本發(fā)明的這些材料和方法將在后面的細(xì)節(jié)中描述。
發(fā)光細(xì)胞 這里所述的發(fā)光細(xì)胞(這里也叫做傳感細(xì)胞或CANARY細(xì)胞)可以是任意的具有合適受體、信號(hào)途徑和信號(hào)輸出方法的原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，或者是自然的或經(jīng)過(guò)了遺傳工程、化學(xué)添加的細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是具有功能受體、信號(hào)途徑和信號(hào)輸出方法的人造單元或者無(wú)生命的單元。通過(guò)與抗原受體的結(jié)合，例如與抗體的結(jié)合，這些細(xì)胞促使鈣離子流入細(xì)胞溶質(zhì)中。能有效應(yīng)用于本發(fā)明所述的裝置和方法的細(xì)胞的一個(gè)例子是B細(xì)胞(即，從冷血?jiǎng)游锘蛘吆卸喙穷M(bony jaw)熱血脊椎動(dòng)物中分離的B細(xì)胞)，它可以借助基因工程來(lái)表達(dá)一種或多種表面結(jié)合型的單克隆抗體。能有效應(yīng)用于本發(fā)明所述的裝置的細(xì)胞的另一個(gè)例子是巨噬細(xì)胞，例如人類巨噬細(xì)胞系U937，可以在細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體?？梢酝ㄟ^(guò)將抗體與目標(biāo)接觸的方式使抗原與抗體結(jié)合，之后這種抗原抗體復(fù)合物將與細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合，刺激信號(hào)途徑最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。
單克隆抗體可以經(jīng)由例如下述方法獲得用待測(cè)抗原免疫一種動(dòng)物，從獲得免疫的動(dòng)物中采集B細(xì)胞。然后，將編碼所述單克隆抗體的DNA提取分離并插入到一種無(wú)限增殖細(xì)胞系中，然后篩選出對(duì)待測(cè)抗原具有特異性的表面單克隆抗體的的細(xì)胞。B細(xì)胞被有效用于定性分析和定量分析，主要原因不僅僅是B細(xì)胞發(fā)射的信號(hào)典型的并不隨著暴露于其的另外的目標(biāo)樣品而顯著降低，并且還因?yàn)樗l(fā)射的信號(hào)是線性的。
可選擇的，這種細(xì)胞還可以是纖維原細(xì)胞。然而，纖維原細(xì)胞不具備將表面抗體的細(xì)胞質(zhì)部分轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的鈣儲(chǔ)備所必需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。為了解決這個(gè)問(wèn)題，可以在該纖維原細(xì)胞中表達(dá)一種嵌合的表面抗體。這種嵌合表面抗體含有一個(gè)衍生自多肽(例如纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體)的細(xì)胞質(zhì)氨基酸序列，可以將信號(hào)從纖維原細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)表面轉(zhuǎn)換至細(xì)胞內(nèi)的鈣儲(chǔ)備。因此，當(dāng)抗原與嵌合抗體的胞外部分結(jié)合并導(dǎo)致表面上的抗體聚積時(shí)，鈣的遷移也被激活了。使用嵌合抗體的類似的策略也可以被應(yīng)用于除B細(xì)胞以外的其他任何細(xì)胞類型中，使該細(xì)胞可以適用于本發(fā)明所述的方法和裝置中。
本發(fā)明所述的方法和裝置中所使用的細(xì)胞是那些被設(shè)計(jì)成能識(shí)別特異性物質(zhì)的細(xì)胞，包括那些在其表面上含有受體使其能特異性結(jié)合物質(zhì)的細(xì)胞。雖然優(yōu)選的受體是抗體或者單鏈抗體，但是其他適合的受體，包括分裂素(例如脂多糖(LPS)受體)，巨噬細(xì)胞清除受體，T細(xì)胞受體，細(xì)胞黏著分子，DNA結(jié)合蛋白如部分的序列特異性限制酶或者轉(zhuǎn)錄因子，單鏈RNA結(jié)合蛋白或雙鏈RNA結(jié)合蛋白，與待識(shí)別的DNA或者RNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸，或其他配位體受體(例如甲脒亞磺酸，細(xì)胞活素，白細(xì)胞介素，或者激素受體，神經(jīng)傳遞素受體，氣味受體，趨化因子受體等等)也能與被識(shí)別的物質(zhì)特異性結(jié)合。所述受體可以經(jīng)由跨膜結(jié)構(gòu)域、對(duì)受體有結(jié)合特異性的膜結(jié)合分子(例如結(jié)合抗體的Fc受體)，或者與膜結(jié)合分子的共價(jià)結(jié)合或者非共價(jià)結(jié)合(例如，生物素-鏈霉抗生物素蛋白，二硫鍵等等)來(lái)結(jié)合到細(xì)胞表面上。所述受體還可以是嵌合分子，例如，它可以含有一個(gè)胞外功能區(qū)，例如抗體，單鏈抗體，植物凝集素或者其他對(duì)待識(shí)別物質(zhì)有特異性結(jié)合的區(qū)域或肽，和一個(gè)胞內(nèi)功能區(qū)，例如來(lái)自胰島素受體，纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子，或者其他可以引發(fā)第二信使級(jí)聯(lián)的蛋白等等。受體除了直接結(jié)合于待識(shí)別物質(zhì)以外，也可以是特異性結(jié)合于另外一個(gè)分子或者對(duì)象，再由后者特異性的結(jié)合于待識(shí)別的物質(zhì)，例如第二抗體，標(biāo)記粒，與抗原結(jié)合的寡核苷酸等。
或者，這些結(jié)合步驟中只需要有一個(gè)步驟是特異性的。例如，可以用與一種抗原(或直接與一種?；蛟谝环N基質(zhì)上)相結(jié)合的寡核苷酸探針把含有特異性序列的DNA或者RNA從溶液中提取出來(lái)，然后可以用與目標(biāo)DNA/RNA退火的第二組非特異性抗原結(jié)合的寡核苷酸探針來(lái)刺激對(duì)該第二抗原具有特異性的細(xì)胞。此外，以嵌合體形式在細(xì)胞表面表達(dá)的非特異性核酸結(jié)合蛋白(組織蛋白，精蛋白，RNA結(jié)合蛋白)或者這些結(jié)合蛋白的抗體也可以在經(jīng)過(guò)特異性序列選擇步驟后用來(lái)探測(cè)核酸的存在。
抗體 無(wú)論來(lái)源于何種類型的細(xì)胞，單克隆抗體的抗原結(jié)合可變區(qū)都可以從公開(kāi)的DNA序列中獲得，或者由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞系通過(guò)RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)克隆得到。RT-PCR可以利用幾組設(shè)計(jì)為在5’端與可變區(qū)的前導(dǎo)區(qū)或者構(gòu)架區(qū)退火以及在3’端與恒定區(qū)退火的引物來(lái)完成。
然后，抗體可變區(qū)被克隆成已經(jīng)包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體。Persic等人在《基因》(Gene)1879-18，1997的著作中描述的輕鏈表達(dá)載體就特別適合于這一目的。Persic等人描述的VK表達(dá)含有EF-1α啟動(dòng)子，一個(gè)引導(dǎo)序列，多個(gè)克隆位點(diǎn)，人類Ig k(κ)恒定區(qū)和聚腺苷酸信號(hào)。重鏈表達(dá)載體是從Invitrogen的pDisplay中獲得的。所述載體包含一個(gè)巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，一個(gè)引導(dǎo)序列，一個(gè)HA標(biāo)記，多個(gè)克隆位點(diǎn)，霉菌(myc)標(biāo)記，以及其后的PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸信號(hào)。
PDisplay可以采用如下方法進(jìn)行改進(jìn)以用來(lái)重鏈表達(dá)。用不含有分泌所需的外顯子的小鼠IgM恒定區(qū)代替pDisplay的PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域。這樣確保了蛋白可以結(jié)合在膜上。新霉素抵抗基因可以由下述任意一種抗生素抵抗基因取代，這些抵抗基因包括，但不局限于，潮霉素，博來(lái)霉素，嘌呤霉素，卡那霉素，和殺稻瘟菌素基因。重鏈(或者輕鏈)可變區(qū)可以用一個(gè)兩步法插入利用重疊延伸PCR除去存在于pDisplay的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的HA標(biāo)記和myc標(biāo)記。也可以建立一個(gè)載體，以允許插入含有融合了約300個(gè)堿基對(duì)的IgM恒定區(qū)的可變區(qū)的重疊延伸產(chǎn)物，從而使克隆只通過(guò)一個(gè)步驟就完成。
下面的例子就是通過(guò)上述抗體載體構(gòu)建步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
能特異性結(jié)合待測(cè)抗原的抗體是一個(gè)能結(jié)合在抗原或者抗原決定基，但基本不能結(jié)合在樣品中其他抗原或抗原決定基的分子。所述抗體可以是嵌合的(例如含有非抗體氨基酸序列)或者是單鏈的(例如抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)域是由一個(gè)連續(xù)的多肽序列形成的)。
可選擇的，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從動(dòng)物中獲得產(chǎn)生表面抗體的細(xì)胞，并且用來(lái)制備產(chǎn)生表面抗體的單克隆細(xì)胞群體，所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以使用例如Kohler等人在《自然》(Nature)256 495-497(1975)；Kozbor等人在《今日免疫》(Immunol Today)472(1983)；或者Cole等人在《單克隆抗體與腫瘤治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)Alan R Liss Inc，77-96(1985)中描述的雜交瘤技術(shù)。生產(chǎn)表達(dá)單克隆抗體細(xì)胞的技術(shù)是眾所周知的(例如可參見(jiàn)Coligan等人編著的《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Current Protocols inImmunology)(1994)，John Wiley和Sons，Inc，紐約，NY，1994)，只是需要選擇對(duì)表面抗體的改進(jìn)而不是對(duì)分泌抗體的改進(jìn)。
眾多的用來(lái)融合淋巴細(xì)胞和無(wú)限增殖細(xì)胞系的公知方案中的任意一種都可以應(yīng)用于生成產(chǎn)生表面單克隆抗體的細(xì)胞的目的(例如可參見(jiàn)上述的《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Current Protocols in Immunology)，Galfre等人在《自然》(Nature)26655052，1977的文章，Kenneth在《單克隆抗體》中的題名為“生物分析中的新維度”(Dimension In Biological Ananlyses，Plenum出版社，紐約，NY，1980)的文章，以及Lemer在耶魯生物醫(yī)學(xué)虛報(bào)54387-402(1981)中的文章)。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠欣喜的發(fā)現(xiàn)，這些方法的許多改良或變形也同樣有效。
表達(dá)抗體的多克隆細(xì)胞可以通過(guò)用待測(cè)抗原免疫適合的動(dòng)物來(lái)制備。產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體分子的細(xì)胞可以從免疫過(guò)的動(dòng)物身上(例如從血液中)分離出來(lái)，并借助包被有抗原的皮氏培養(yǎng)皿進(jìn)行淘選等公知技術(shù)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的純化。作為制備單克隆細(xì)胞的一種替代形式，可以通過(guò)用抗原篩選一個(gè)重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如抗體噬菌體展示文庫(kù))來(lái)識(shí)別和分離出編碼單克隆抗體的核酸，由此分離出免疫球蛋白文庫(kù)中那些能結(jié)合抗原的成員。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒是可以商業(yè)購(gòu)買的(例如藥物重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)NO.27-9400-01，以及Stratagene Surf ZAP噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)NO.240612)。此外，例如可在下述文獻(xiàn)中找到特別適用于生成和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的例子美國(guó)專利NO.5223409，PCT公開(kāi)文本NO.WO92/18619，PCT公開(kāi)文本NO.WO91/17271，PCT公開(kāi)文本NO.WO92/20791，PCT公開(kāi)文本NO.WO92/15679，PCT公開(kāi)文本NO.WO93/01288，PCT公開(kāi)文本NO.WO92/01047，PCT公開(kāi)文本NO.WO92/09690，PCT公開(kāi)文本NO.WO90/02809，F(xiàn)uchs等人在《生物技術(shù)》9 1370-1372(1991)中的文章，Hay等人在《人類抗體雜交瘤》381-85(1992)中的文章，Huse等人在《科學(xué)》246 1275-1281(1989)中的文章，以及Griffiths等人在EMBO學(xué)報(bào)12 725-734(1993)中的文章。
當(dāng)文庫(kù)中所希望的成員被識(shí)別出后，特定序列可以被克隆成任何合適的核酸表達(dá)子(例如，載體)并轉(zhuǎn)染到例如纖維原細(xì)胞這樣的細(xì)胞中。表達(dá)子同樣可以編碼可操作連接于抗體序列的氨基酸序列，以適合于細(xì)胞表達(dá)抗體。正如上面所討論的，纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的胞質(zhì)跨膜序列能被連接到對(duì)待測(cè)抗原具有特異性的單鏈抗體上，使得當(dāng)與抗原接觸時(shí)，細(xì)胞能停止住鈣的遷移。雖然在纖維原細(xì)胞中可以表達(dá)分離的重組重鏈和輕鏈以形成嵌合體，但是單鏈抗體也是同樣適用的(例如可參見(jiàn)Bird等人在《生物技術(shù)動(dòng)態(tài)》(Trends Biotechnol)9.132-137，1991中的文章，以及Huston等人在IntRev Immunol 10 195-217，1993中的文章)。
光子發(fā)射分子 希望的物質(zhì)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合將引發(fā)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑。一種優(yōu)選的信號(hào)途徑是從B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第二信使級(jí)聯(lián)途徑，其中，細(xì)胞表面受體的交聯(lián)會(huì)激活酪氨酸激酶，這種酪氨酸激酶能使磷脂酶C磷酸化，磷脂酶C又能把磷脂酰肌醇4，5-二磷酸脂(PIP2)裂解成為肌醇1，4，5-三磷酸酯(IP3)和甘油二酯，然后，IP3打開(kāi)鈣通道，使例如細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的胞內(nèi)鈣釋放或者使細(xì)胞外的鈣進(jìn)入細(xì)胞，由此提高細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度。根據(jù)受體的類型，細(xì)胞的類型和所需的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，也可以選擇另外的第二信使級(jí)聯(lián)，例如G蛋白腺嘌呤環(huán)c-AMP蛋白激酶A級(jí)聯(lián)。
需要提供一種方法，用以檢測(cè)細(xì)胞對(duì)待識(shí)別物質(zhì)的應(yīng)答時(shí)其內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如果內(nèi)部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括胞質(zhì)中鈣的增加，那么優(yōu)選的探測(cè)方法是鈣敏感發(fā)光分子或者鈣敏感熒光分子，例如水母蛋白，奧貝林(obelin)，thalassicolin，mitrocomin(halistaurin)，clytin(phialidin)，mnemopsin，berovin，吲哚-1(Indo-1)，呋喃-2(Fura-2)，喹啉-2(Quin-2)，F(xiàn)luo-3，Rhod-2，calciumgreen，BAPTA，cameleons(參見(jiàn)A.Miyawaki等人在Proc Natl Acad Sci 96，213540，1999上的文章)，或者類似的分子。可以預(yù)料，利用鈣敏感分子產(chǎn)生的相對(duì)光強(qiáng)度和傳感器細(xì)胞的存儲(chǔ)特性可能隨特定發(fā)光分子而改變，激活發(fā)光分子的半衰期——在某些情況下具有顯著的優(yōu)勢(shì)(例如提高的靈敏度、定量探測(cè)或者定性探測(cè))。利用光蛋白發(fā)光分子的天然輔助因子的結(jié)構(gòu)類似物可能還會(huì)導(dǎo)致其他的性能增強(qiáng)。各種能被激活細(xì)胞接納的鈣敏感熒光染料可以從商業(yè)途徑獲得，例如分子探針I(yè)nc，Eugene，例如水母蛋白，奧貝林，thalassicolin，mitrocomin(halistaurin)，clytin(phialidin)，mnemopsin，berovin或者cameleons之類的Oreg蛋白可以用遺傳學(xué)方法注入到細(xì)胞內(nèi)，或者由來(lái)自HIV TAT(約47-57個(gè)氨基酸殘基，A.Ho等人在《腫瘤研究》(CancerResearch)61，474-477，2001中的文章)的蛋白攝取標(biāo)記來(lái)運(yùn)送，或者通過(guò)其他方式運(yùn)送。如果需要，這種報(bào)告分子可以包括目標(biāo)信號(hào)，使這些分子導(dǎo)向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)表面上、線粒體的內(nèi)部或者那些局部鈣濃度變化可能非常大的位置上。也可以使用探測(cè)信號(hào)通路中其他位置的活性的光學(xué)方法，例如附著在信號(hào)途徑組分上的熒光基因的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)(參見(jiàn)S.R.Adams等人在《自然》349，694-697，1991中的文章)。關(guān)于內(nèi)部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及活氧分子(例如超氧陰離子，羥自由基，辣根過(guò)氧化物酶化合物I或II)的增加的情形，優(yōu)選的探測(cè)方法是活性氧敏感性發(fā)光分子或者熒光分子，例如光蛋白pholasin(一種來(lái)自生物發(fā)光軟體動(dòng)物Pholas dactylus的34-k Da糖蛋白)或者類似的分子。可選擇的，任何熒光素酶的報(bào)告基因都可以與經(jīng)信號(hào)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生的啟動(dòng)子連接。在例如T細(xì)胞和肥大細(xì)胞這類的細(xì)胞中，信號(hào)途徑將觸發(fā)出含有諸如粒酶、類胰蛋白酶或者chymases等蛋白酶的胞吐(exocytosis)顆粒。這些蛋白酶的胞吐可以采用色度或者熒光度量的方法進(jìn)行探測(cè)(例如，連接在被蛋白酶裂解的肽鏈上的p-硝基苯胺(p-nitroaniline)或者7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)上，(可以參見(jiàn)以下文章S.E.Lavens等人在《免疫學(xué)方法學(xué)報(bào)》166，93，1993中的文章；D.Masson等人在FEBS Letters 208，84，R&D Systems中的文章)。同時(shí)，用微電極或者其他方法來(lái)探測(cè)與鈣離子流或者其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)離子流相關(guān)的電活動(dòng)也適用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答。
適合的發(fā)光分子是那種任何能在應(yīng)答增加的細(xì)胞質(zhì)鈣濃度時(shí)能夠發(fā)射光子的分子，包括生物發(fā)光分子和熒光分子。在Button等人在《細(xì)胞鈣》(CellCalcium)14 663-671(1993)；Shimomura等人在《細(xì)胞鈣》(Cell Calcium)14 373-378(1993)，和Shimomura等人在《自然》227 1356-1357(1970)中發(fā)表的這些文章中，描述了一種發(fā)光分子生物發(fā)光水母發(fā)光蛋白。這種水母發(fā)光蛋白通過(guò)氧化一種小化學(xué)分子腔腸素(coelenterazine)來(lái)產(chǎn)生光子。腔腸素通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行擴(kuò)散，因此，腔腸素或其類似的分子可以加入到細(xì)胞周圍的培養(yǎng)介質(zhì)中?；蛘撸梢詫⒕幋a能制造腔腸素的酶的基因?qū)爰?xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用生物發(fā)光綠色熒光蛋白(GFP)(可參見(jiàn)Chalfie，《Photochem Photobiol》62 651-656(1995)中的文章)或者黃色熒光蛋白(YFP)。在此種實(shí)施方案中，細(xì)胞質(zhì)中既有GFP也有水母發(fā)光蛋白。在應(yīng)答細(xì)胞液中鈣的增多時(shí)，水母發(fā)光蛋白以非發(fā)光(emissionless)能量轉(zhuǎn)移的形式向GFP提供能量。然后，GFP發(fā)射光子?？蛇x擇的，所述發(fā)光分子也可以是被適合于誘導(dǎo)熒光的波長(zhǎng)的光照明下的鈣敏感熒光分子(例如吲哚-1(indo-1))。
水母發(fā)光蛋白或者其他任何的發(fā)光分子，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法將其導(dǎo)入細(xì)胞中。如果所述發(fā)光分子是一種蛋白(例如水母發(fā)光蛋白的情形)，則該細(xì)胞可以含有一個(gè)編碼該蛋白的表達(dá)載體(例如，一種被導(dǎo)入細(xì)胞后會(huì)產(chǎn)生發(fā)光分子的核酸或者病毒)。表達(dá)載體可以存在于染色體外部，或者被整合到細(xì)胞基因中去。
結(jié)合抗原/結(jié)合標(biāo)記 一種或多種抗原或者標(biāo)記可以被加入(這里也可稱為結(jié)合)到分子中以提供一種熟知的抗原決定基。例如，一種或多種抗原可以被結(jié)合到一個(gè)寡核苷酸上以生成一個(gè)抗原結(jié)合型寡核苷酸，這是一種熟知的抗原決定基。一個(gè)抗原結(jié)合型分子可以包含一個(gè)或一個(gè)以上抗原，這些抗原可以是相同的也可以是不同的。舉例說(shuō)明，但不局限與此，與用于探測(cè)的分子相結(jié)合的抗原或者標(biāo)記包括小抗原，例如地高辛配基，地高辛，膽堿磷酸，熒光素或者其他fluorphores，還包括生物素和肽，例如HIS，VSV-G，F(xiàn)LAG，和C(AAKK)多聚體(例如Corey在J Am Chem Soc(1995)117 9373-4中所描述的)。
寡核苷酸 除了常規(guī)的DNA探針和RNA探針之外，各種經(jīng)修飾的核酸被表明可以以一種序列特異性的方式雜交到目標(biāo)核酸序列中。這些經(jīng)修飾的核酸包括肽核酸(PNA)(參見(jiàn)Nielsen等人在《科學(xué)》254 1497-1500，1991上發(fā)表的文章)、雙-PNA(參見(jiàn)Griffith等人在《J.Am.Chem Soc》117 831-832，1995上發(fā)表的文章)、Tail-clamp肽核酸(參見(jiàn)Bentin在《生物化學(xué)》(Biochemistry)42 13987-13995，2003上發(fā)表的文章、PD環(huán)(PD loops)(參見(jiàn)Bukanov等人在《肽核酸》95 5516-5520，1998上的文章)、結(jié)合了假互補(bǔ)堿基的肽核酸(參見(jiàn)Lohse等人在《肽核酸》96(21)11804-11808，1999上的文章)或者鎖定核酸(參見(jiàn)Braasch和Corey在《Chem Biol》81-7上的文章)。已經(jīng)表明，這些不同種類的修飾核酸在雜交特性、穩(wěn)定性、親和性和特異性方面存在差別，可以用以替代常規(guī)的DNA寡核苷酸(可參見(jiàn)Beck和Nielsen，91-114頁(yè)，《人工DNA方法和應(yīng)用》，CRC出版社，Y E Khudyakov和H.A Field eds)。已經(jīng)表明，與陽(yáng)離子蛋白質(zhì)、肽、或者結(jié)合了DNA的蛋白相結(jié)合會(huì)提升修飾核酸的雜交動(dòng)力學(xué)特性(參見(jiàn)Corey在《J Am Chem Soc》117 9373-9374，1995中的文章；或Zhang等人在《Nuc Ac Res》27(17)3332-3338，2000上的文章)。
已經(jīng)證明，輔助寡核苷酸的加入能夠促進(jìn)寡核苷酸的結(jié)合(可參見(jiàn)O’Meara等人在《Anal Biochem》225 195-203，1998中的文章；Barken等人在《生物技術(shù)》36 124-132，2004中的文章)。未標(biāo)記的發(fā)夾競(jìng)爭(zhēng)探針的加入可以提高其特異性(可參見(jiàn)Huang等人在《Nucleic Ac.Res》30(12)e55，2002上發(fā)表的文章)。
在與目的物雜交后，除去未結(jié)合的寡核苷酸的步驟對(duì)于核酸序列探測(cè)來(lái)說(shuō)不是必須的，但是是所希望的。那些未結(jié)合的標(biāo)記寡核苷酸可以使用各種常規(guī)的色譜技術(shù)進(jìn)行分離，包括分子篩，疏水作用色譜法，或者離子交換，依據(jù)使用的特定探針的化學(xué)性質(zhì)來(lái)選擇。
其他的核酸結(jié)合分子 寡核苷酸不是唯一能識(shí)別特異性核酸序列的分子。蛋白質(zhì)同樣具有識(shí)別能力，可以在發(fā)光細(xì)胞的表面進(jìn)行表達(dá)，并且與細(xì)胞質(zhì)功能區(qū)重組結(jié)合，通過(guò)結(jié)合來(lái)啟動(dòng)鈣的應(yīng)答，這類蛋白質(zhì)包括例如與抗體的Fc部位相結(jié)合的結(jié)合了核酸的蛋白。結(jié)合了核酸的蛋白在發(fā)光細(xì)胞表面的表達(dá)會(huì)消除寡核苷酸雜交前的雙鏈核酸的變性，并且，該體系將產(chǎn)生所有必須的組分，不需要添加額外的合成寡核苷酸?？赡艿男蛄刑禺愋訢NA結(jié)合蛋白包括(1)DNA限制酶(優(yōu)選已經(jīng)除去了或者滅活了DNA切割催化位點(diǎn)的DNA限制酶，例如L F Dornor和I Schildkraut在《Nucl Acids Res》22，1068-1074，1994中發(fā)表的文章)；(2)轉(zhuǎn)錄因子或者其他特異性DNA結(jié)合蛋白或RNA結(jié)合蛋白，特別是那些能夠識(shí)別感興趣的病原體或生物體中獨(dú)特的DNA序列或者RNA序列的蛋白(例如，HIVTAT轉(zhuǎn)錄因子，可參見(jiàn)C Brigati等人在《FEMSMicrobiology Letters》220，57-65，2003中的文章“痘病毒轉(zhuǎn)錄因子”；S SBroyles在《普通病毒學(xué)期刊》84，2293-2303，2003中發(fā)表的文章)。具有上述受體的發(fā)光細(xì)胞可以被設(shè)計(jì)用來(lái)通過(guò)一個(gè)特異性重復(fù)序列或者兩個(gè)或多個(gè)可選擇的獨(dú)特序列來(lái)與目標(biāo)DNA/RNA交聯(lián)。
捕獲寡核苷酸 盡管不是探測(cè)所必需的，在可沉淀的或固體支持物上捕獲目標(biāo)核酸序列能提高測(cè)定的敏感度。單鏈DNA目的物可以通過(guò)使用例如生物素標(biāo)記的、與抗生蛋白鏈菌素包備的聚苯乙烯或順磁性珠相結(jié)合的捕獲寡核苷酸進(jìn)行捕獲。經(jīng)捕獲的物質(zhì)可以通過(guò)適當(dāng)?shù)碾x心或者暴露于磁場(chǎng)中的方法與未結(jié)合的物質(zhì)分離。在寡核苷酸與珠的結(jié)合過(guò)程中不是必須使用中間結(jié)合反應(yīng)(抗生物素蛋白-生物素)，能將寡核苷酸連接到固體支持物上的任何相互作用都是可以使用的，包括直接綴合。另外，用于與捕獲寡核苷酸連接的任何固體支持物都應(yīng)該是足夠的。反應(yīng)可以是二維排列的形式，其中特異性捕獲寡核苷酸被置于該排列的特異性位置上?？蛇x擇的，目標(biāo)核酸序列的捕獲可以通過(guò)非特異性的方式進(jìn)行(例如，離子交換樹(shù)脂，沉淀析出，與組蛋白或魚(yú)精蛋白結(jié)合)。目標(biāo)捕獲還會(huì)濃縮目標(biāo)核酸序列和/或除去測(cè)定中的干擾物。
多價(jià)性 對(duì)發(fā)光細(xì)胞產(chǎn)生的刺激取決于對(duì)其來(lái)說(shuō)似乎是多化合價(jià)的抗原。通常的，這可以通過(guò)至少兩種方式完成。首先，抗原的多倍拷貝體可以連接到一個(gè)目標(biāo)分子上，例如，將多倍結(jié)合了抗原的寡核苷酸雜交到目標(biāo)核酸序列中。其次，每一個(gè)都連接了單獨(dú)抗原的目標(biāo)核酸序列的幾個(gè)拷貝體可以彼此結(jié)合，或者以彼此高度接近的方式結(jié)合(例如連接到珠上)。在這個(gè)方法中，單獨(dú)的目標(biāo)核酸序列不是多化合價(jià)的，但是與目標(biāo)核酸序列的多倍拷貝體相連接的珠應(yīng)該存在一個(gè)多價(jià)抗原。
反應(yīng)室 適用于本發(fā)明的反應(yīng)室可以是任何基質(zhì)或者容器，只要發(fā)光細(xì)胞和待測(cè)離子能在其中混合并相互接觸即可。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)容器是一個(gè)離心管(例如，微量離心管或者Eppendorf管)。正如這里所述，為了使待測(cè)顆?；蛘甙l(fā)光細(xì)胞中的一個(gè)先聚集成團(tuán)，然后再把另外一個(gè)驅(qū)入聚集成的團(tuán)中，離心是一種特別合適的方式。為了進(jìn)一步增強(qiáng)離子和細(xì)胞的成團(tuán)性，可以在管的側(cè)壁涂覆例如牛血清白蛋白之類的非粘性載體蛋白，以防止發(fā)光細(xì)胞粘到側(cè)壁上，并且可以在管的底部涂覆聚L-賴氨酸來(lái)幫助確保目標(biāo)粒子會(huì)被粘留在管底。其他能防止或者造成細(xì)胞黏著的蛋白或者分子是本領(lǐng)域熟知的，它們同樣適用于本發(fā)明。
具有特制樣品孔幾何形狀的離心管提供了又一種實(shí)施方案，它利用離心來(lái)增加發(fā)光細(xì)胞與不易沉淀粒子的相互作用，并降低對(duì)特定旋轉(zhuǎn)順序的要求。在這種實(shí)施方案中，含有粒子的待分析的樣品被放置在一個(gè)樣品室最大寬度近似等于發(fā)光細(xì)胞直徑的管子中。使?jié)饪s的發(fā)光細(xì)胞懸浮于樣品的上層，然后用離心來(lái)驅(qū)使大量密集在一起的發(fā)光細(xì)胞穿過(guò)較小的粒子，同時(shí)在幾何形狀的限制下增大了發(fā)光細(xì)胞抗體與粒子的相互作用。與細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的抗體同粒子的結(jié)合將捕獲不易沉降的粒子，并把它和發(fā)光細(xì)胞一起快速拉向管底，這時(shí)在管底發(fā)出的光可以用光電倍增裝置觀察到。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)室是一些二維排列的孔，例如，是一個(gè)微滴板，或者是一些沿一個(gè)帶子的點(diǎn)或者孔，如附圖所示的那樣。這種設(shè)計(jì)使得可以對(duì)多個(gè)樣品和/或多個(gè)目標(biāo)粒子進(jìn)行多重探測(cè)。為了自動(dòng)運(yùn)送待測(cè)粒子和/或發(fā)光細(xì)胞，反應(yīng)室或者樣品收集器和發(fā)光細(xì)胞容器可以設(shè)定在至少兩個(gè)方向上。陣列上的孔也可以使用在前述離心管中使用的那些粘性涂層或非粘性涂層處理，使發(fā)光細(xì)胞與待測(cè)粒子的接觸更加容易。
樣品收集器 可以使用不同的裝置從例如空氣中收集樣品。通常來(lái)說(shuō)，空氣采樣裝置有一個(gè)含有液體的收集室，空氣或者氣體可以從中或者從其邊上流過(guò)，或者有一個(gè)多孔過(guò)濾器，當(dāng)空氣或者氣體流經(jīng)該過(guò)濾器時(shí)粒子(例如目標(biāo)粒子)能被截獲。對(duì)于含有液體的收集室，收集的液體可以通過(guò)離心或者其他處理以使粒子從液體中分離出來(lái)。分離出的粒子然后被沉積在反應(yīng)室中。對(duì)于含有過(guò)濾器(例如硝化纖維素)的收集室，過(guò)濾器或者過(guò)濾器的一部分可以用來(lái)當(dāng)作反應(yīng)室。可選擇的，粒子可以從過(guò)濾器中洗出，或者可以使過(guò)濾器溶解或用其他方法從粒子中去除。過(guò)濾器收集室同樣可以用于從流經(jīng)它的液體(例如水樣樣品(water supply sample)或者腦脊液)中收集粒子。此外，如前所述，液體樣品可以通過(guò)離心來(lái)去除存在于其中的任何顆粒物質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明的各種采樣器都是已知的并且可以購(gòu)買得到的。參見(jiàn)SKC，Inc，該公司出售SKC BioSampler和其他采樣裝置。
也可以使用其他的空氣采樣器。例如一種可供選擇的裝置是Air-O-Cell采樣盒(SKC，Inc)。在該裝置中，空氣中的顆粒被加速并與一個(gè)粘性片相碰撞，這種粘性片可直接用于各種著色處理和顯微檢查。
氣溶膠顆?？梢栽谝环N被稱為撞擊器的裝置中使用慣性分離法收集。把一個(gè)含有被收集粒子的氣流從感興趣的環(huán)境中吸入到撞擊器內(nèi)，其中該氣流被導(dǎo)向一個(gè)撞擊表面。當(dāng)撞擊器的幾何參數(shù)和其內(nèi)的流速適當(dāng)時(shí)，具有足夠慣性的粒子將不會(huì)隨著氣流而流動(dòng)，而是撞擊到一個(gè)表面上。由于靜電作用和/或范德瓦爾力的作用，相當(dāng)一部分撞擊表面的粒子會(huì)被粘住，進(jìn)而被收集和濃縮。通過(guò)這種方式，利用包括上述裝置和方法在內(nèi)的各種可用的試驗(yàn)技術(shù)，含有蛋白(包括毒素)、病毒、細(xì)菌(植物型的和孢子型的)、寄生蟲(chóng)、花粉和其他可探測(cè)物質(zhì)的氣溶膠顆?？梢员皇占怨┨綔y(cè)。
使用空氣撞擊器收集生物試驗(yàn)所用的干樣品較之傳統(tǒng)的空氣至液體樣品收集具有一些通常的有點(diǎn)，即減少或免除了消耗物和轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，從而減少了試驗(yàn)成本，并降低了對(duì)自動(dòng)化的要求。本發(fā)明所述的裝置和方法的特殊優(yōu)點(diǎn)在于，使用干式撞擊進(jìn)行收集，從而保證了在添加本發(fā)明所述裝置和方法的傳感細(xì)胞之前所有收集到的樣品全部定位于一個(gè)表面上，無(wú)論單個(gè)待分析的粒子的大小如何。這樣，不論待分析粒子在液體中的沉降系數(shù)有多大，它們?nèi)繉?shí)現(xiàn)了定位化，從而使上述裝置和方法的靈敏度最大化并因?yàn)槊獬撕臅r(shí)的步驟而加速了許多試驗(yàn)進(jìn)程。
能夠保留撞擊到其上的一定比例的粒子并適用于后續(xù)生物測(cè)定的任何表面都可以用來(lái)做為收集表面。合適的材料包括生物兼容的金屬、塑料、玻璃、晶體、氣溶膠、水溶膠、紙張等等。這些材料的特別有用的形式包括微量離心管、用于高通過(guò)量篩選的多孔板、連續(xù)帶條、過(guò)濾器、側(cè)向流動(dòng)免疫試驗(yàn)中的綴合釋放墊等等?？梢酝ㄟ^(guò)修飾收集表面的方法來(lái)增加收集效率，這些方法包括添加能提升生物顆粒黏著性的涂層(這些涂層在性質(zhì)上可以是化學(xué)的或者生化的，例如聚賴氨酸)；增加表面粗糙度來(lái)增大收集表面積；特制表面幾何形狀，使顆粒沉積在規(guī)定的表面區(qū)域上。此外，可以通過(guò)操控收集表面的靜電荷和輸入顆粒從而產(chǎn)生附加的吸引力來(lái)進(jìn)一步改善收集效率。
對(duì)干式撞擊收集器的進(jìn)一步改進(jìn)可以這樣實(shí)現(xiàn)在收集器上逆流使用空氣-空氣濃縮器來(lái)增加撞擊到收集表面上的每個(gè)單位空氣樣品中的顆粒數(shù)。這可以大大減少為探測(cè)器能提供可靠結(jié)果所需的足夠數(shù)目的氣溶膠顆粒的收集時(shí)間。
在關(guān)于這個(gè)收集器概念的例子中，附圖23所示的撞擊器被設(shè)計(jì)成在一個(gè)可商業(yè)購(gòu)得的塑料管底部收集氣溶膠樣品。將噴嘴向下伸入管中，其出口位于管子內(nèi)表面的曲率半徑處。這樣的設(shè)置增大了顆粒撞擊到管子底部的可能性，以使在那里裝置的傳感細(xì)胞最可能與顆粒接觸。一旦收集完成，含有裝置傳感細(xì)胞的液滴會(huì)被直接加入到含有被收集的氣溶膠顆粒的管中，旋轉(zhuǎn)5秒鐘來(lái)加速細(xì)胞到管子表面的運(yùn)輸，并使用光子探測(cè)器(例如PMT，CCD，光二極管等等)測(cè)量發(fā)出的光。使用這個(gè)設(shè)備，可以在不到一分鐘的時(shí)間內(nèi)從氣溶膠顆粒中收集干細(xì)菌孢子并直接用光電子裝置識(shí)別出來(lái)。這個(gè)方法可用于多個(gè)收集樣品的管子和能控制后續(xù)試驗(yàn)的自動(dòng)化系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。系統(tǒng)如何能控制至少10個(gè)相互獨(dú)立的試驗(yàn)的例子示于圖4、6、9、12和15。通過(guò)實(shí)現(xiàn)一種能在一個(gè)管子內(nèi)(復(fù)用的)尋找多種待分析顆粒的方法，單個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)可探測(cè)的物質(zhì)數(shù)目可以大于管子的數(shù)目。這種方法可以這樣實(shí)現(xiàn)，生成表達(dá)了多個(gè)對(duì)不同待分析物有親和性的受體的各個(gè)光電子探測(cè)裝置細(xì)胞系，或者在單個(gè)管子內(nèi)組合多個(gè)有不同特異性的細(xì)胞系。
附圖4是一個(gè)完整的生物氣溶膠警告?zhèn)鞲衅?BAWS)/光電子傳感器系統(tǒng)示意圖。BAWS觸發(fā)模塊用來(lái)初步探測(cè)例如具有預(yù)定尺寸范圍的顆粒的存在。如果探測(cè)到了符合規(guī)定的顆粒，BAWS將觸發(fā)一個(gè)空氣-空氣濃縮器，使具有特定尺寸范圍的顆粒通過(guò)一個(gè)干式撞擊器模塊被收集和沉積到一個(gè)孔內(nèi)(例如反應(yīng)室，反應(yīng)管)。干式撞擊器模塊進(jìn)行干樣品收集，并與一個(gè)用來(lái)向反應(yīng)室(例如管)運(yùn)送細(xì)胞(例如發(fā)光細(xì)胞)的注射模塊相溝通。一個(gè)傳輸模塊用來(lái)把反應(yīng)室組件(含有一個(gè)或一個(gè)以上室或管)轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心模塊，在那里進(jìn)行樣品顆粒與細(xì)胞的沉積或者混合。離心模塊可以，但不必須與一個(gè)用于探測(cè)光子發(fā)射的光學(xué)/PMT模塊相溝通。一個(gè)控制器模塊用于控制系統(tǒng)的操作。
附圖6所示是一個(gè)干式撞擊器模塊概念的例子。在這個(gè)例子中，給出了一個(gè)單通道(例如原型系統(tǒng))和一個(gè)多通道裝置，包括各自獨(dú)立的樣品管(例如PCR管)和管座，它們與負(fù)責(zé)收集顆粒測(cè)試樣品的空氣-空氣濃縮器相溝通。
附圖9所示是一個(gè)可自動(dòng)化運(yùn)送細(xì)胞的粒子。傳感細(xì)胞(例如發(fā)光細(xì)胞)通過(guò)注射器或者注射器泵組件(其中還可以包含滴管或者其他運(yùn)送設(shè)備)導(dǎo)入到體系中。這種類型的組件使得可以把多種傳感細(xì)胞同時(shí)導(dǎo)向顆粒樣品(例如，反應(yīng)室(如管)中的樣品)。
附圖12所示是一個(gè)用于旋轉(zhuǎn)顆粒樣品或細(xì)胞樣品的離心模塊概念的例子。借助一個(gè)裝載機(jī)構(gòu)把帶有樣品管的管座導(dǎo)入一個(gè)適合接受該管座的旋轉(zhuǎn)組件上。旋轉(zhuǎn)組件使樣品旋轉(zhuǎn)。該旋轉(zhuǎn)組件與收集信號(hào)(例如光子發(fā)射)的光學(xué)模塊相溝通，可以用一個(gè)編碼馬達(dá)使樣品室對(duì)準(zhǔn)于探測(cè)器(例如光學(xué)模塊)。
附圖15所示是一個(gè)光學(xué)模塊的例子。由于精密的設(shè)計(jì)，該模塊能夠進(jìn)行多個(gè)樣品(例如在反應(yīng)室或管內(nèi)的樣品)的同時(shí)測(cè)定。其中管座和管子導(dǎo)入單元的方式使得它們能與必要時(shí)使用的透鏡組件(例如，集成的反射鏡、透鏡)相溝通，并且最終與一個(gè)光探測(cè)器(例如，一個(gè)PMT)相溝通。PMT將產(chǎn)生信號(hào)，該信號(hào)然后被傳送給一個(gè)處理器進(jìn)行處理和顯示。
附圖21所示是一個(gè)集成的干式撞擊器/光電子傳感器。在所述傳感器中，上述各種模塊被排成一列，其中有一個(gè)裝有30個(gè)管座的盒子可放置到一個(gè)帶式驅(qū)動(dòng)的管座傳送模塊上。所述傳送模塊將各個(gè)試驗(yàn)管按順序從收集器運(yùn)送到細(xì)胞運(yùn)送模塊，再送到離心模塊，最后在完成了光子探測(cè)以后送至確認(rèn)樣品存儲(chǔ)模塊。這個(gè)集成式傳感器的總體尺寸約為54英寸寬×33英寸高×22英寸深。
現(xiàn)實(shí)中的樣品可能會(huì)包含這樣一些物質(zhì)，它們或者會(huì)阻止試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)(結(jié)果造成假陰性)，或者會(huì)在并無(wú)特異性抗原的情況下引起應(yīng)答反應(yīng)(結(jié)果造成假陽(yáng)性)。在許多情況中，這些樣品可以在試驗(yàn)之前經(jīng)過(guò)處理，以出去這類物質(zhì)。例如，對(duì)于清潔劑或者血清因子這類可溶性物質(zhì)，可以通過(guò)一個(gè)預(yù)離心的步驟除去，試劑將在管底集中，可以用試驗(yàn)培養(yǎng)液(Portal Shield樣品)來(lái)置換管內(nèi)的液體。對(duì)于那些難溶的大顆粒物質(zhì)，可以使用可購(gòu)買得到的濾孔尺寸為例如3-5微米的過(guò)濾器把它們從樣品中去除，其中濾孔尺寸的選擇應(yīng)當(dāng)能讓試劑通過(guò)而擋住污染物質(zhì)(柴油或者煙垢樣品)。利用注入式過(guò)濾器可以快速處理樣品，僅使總的試驗(yàn)時(shí)間增加幾分鐘。
樣品定位化 作為樣品收集器或者反應(yīng)室的一部分，可以采用除離心以外的不同方法來(lái)使發(fā)光細(xì)胞與待測(cè)顆粒的接觸更加容易。例如，可以使用電泳、等電位聚焦、雙向電泳、磁性標(biāo)記粒，或者將與其相似的其他生物電子裝置集成到本發(fā)明所述的體系中。參見(jiàn)例如美國(guó)專利NO.6017696和授予Nanogen Inc的其他專利；Goater等人在《寄生蟲(chóng)學(xué)》117 S177-189，1998中的文章，美國(guó)專利NO.5512439，NO.4910148以及授予Dynal AS的其他專利。
把含有目標(biāo)顆粒(這里所說(shuō)的顆?？梢允悄鼙话l(fā)光細(xì)胞惜別的任何顆?！鞍踪|(zhì)/毒素、病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、核酸等等)的液體樣品與含有發(fā)光細(xì)胞的等量的培養(yǎng)液混合，會(huì)造成能導(dǎo)致光子發(fā)射率暫時(shí)增大的顆粒-細(xì)胞接觸。從混合步驟開(kāi)始到出現(xiàn)最大發(fā)光率的這一段時(shí)間取決于特定細(xì)胞對(duì)刺激的應(yīng)答特性、發(fā)生混合的時(shí)間長(zhǎng)度(混合時(shí)間)、以及混合后顆粒與細(xì)胞發(fā)生接觸的典型時(shí)間(擴(kuò)散時(shí)間)。
由于即使在目標(biāo)顆粒不存在的情況下探測(cè)光子的背景光子率依然存在(例如背景細(xì)胞發(fā)光和光子探測(cè)器及其電路的熱噪聲)，由單個(gè)目標(biāo)-細(xì)胞作用所發(fā)射的光子難以與背景區(qū)分開(kāi)。要得到一個(gè)有用的信號(hào)，必須大大增加相對(duì)于背景的探測(cè)光子率。對(duì)于一個(gè)給定的樣品，當(dāng)其混合時(shí)間和擴(kuò)散時(shí)間最小的時(shí)候，該探測(cè)光子率最大。樣品中存在的目標(biāo)顆粒的其他可能的信號(hào)包括增大一定時(shí)間內(nèi)探測(cè)光子多于僅有背景時(shí)的總數(shù)，改變探測(cè)光子的統(tǒng)計(jì)性質(zhì)，或者改變探測(cè)光子的光譜質(zhì)量。
擴(kuò)散時(shí)間可以通過(guò)減小混合顆粒與細(xì)胞之間的平均距離來(lái)達(dá)到最小化。這可以通過(guò)在較大的混合體積中使顆粒和/或細(xì)胞定位化到一個(gè)小體積(通常是一個(gè)層)內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，定位顆粒和/或細(xì)胞所需的時(shí)間也許會(huì)長(zhǎng)于細(xì)胞的特征性應(yīng)答時(shí)間。顆粒和細(xì)胞在這個(gè)較長(zhǎng)的定位化時(shí)間內(nèi)的混合可能會(huì)因?yàn)樵龃罅烁鞔伟l(fā)光之間的平均時(shí)間而造成較低的光子發(fā)射率從而導(dǎo)致較小的信號(hào)。為了避免這樣的情況發(fā)生，顆粒和細(xì)胞兩者中的一個(gè)或者兩個(gè)應(yīng)該在確保它們之間的接觸最小化的前提下分開(kāi)來(lái)定位化。這樣的定位化也可以縮短混合時(shí)間。
一般來(lái)說(shuō)，移動(dòng)細(xì)胞或者顆粒有以下幾種方法沉降(通過(guò)重力或者離心力)；液體流動(dòng)(強(qiáng)迫的或者對(duì)流的)；電力(電泳和雙向電泳)；磁力(使用磁性珠)；聲波/超聲波(駐波或者行波)。
定位化要求一種移動(dòng)顆粒和/或細(xì)胞的手段并且結(jié)合一個(gè)可以收集顆粒和/或細(xì)胞的屏障，例如一個(gè)通道或者容器的固體表面，一個(gè)過(guò)濾器的表面，或者一個(gè)環(huán)繞著一個(gè)電場(chǎng)極小點(diǎn)的勢(shì)能屏障。它們的例子包括沉降(使細(xì)胞定位化于一個(gè)室的下表面處)；空氣撞擊(被撞擊的顆粒黏附于或者駐留于一個(gè)收集表面)；過(guò)濾(顆?；蛘呒?xì)胞被收集于過(guò)濾器表面或者進(jìn)入過(guò)濾器內(nèi)部)；親和力捕獲(通過(guò)特異性或者非特異性結(jié)合作用使顆?；蚣?xì)胞定位化)；磁力捕獲(通過(guò)定位化磁力使磁性珠停留在一個(gè)固體表面、過(guò)濾器表面上或者過(guò)濾器內(nèi)部；磁性珠可以具有也可以不具有能促使顆?；蚣?xì)胞黏附的表面化學(xué)活性)；電泳(僅適用于帶電顆粒，收集于電極表面)；和雙向電泳(正把顆粒或者細(xì)胞收集于一個(gè)電極的表面；負(fù)收集到一個(gè)最小電場(chǎng)區(qū)域內(nèi))。
顆粒和細(xì)胞的定位化和混合可以使用上述各種方法的結(jié)合或者與其他方法的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。在下面的表格中，給出了各種定位化/探測(cè)器組合的一些例子。其中某些代表性例子給出了二維的顆?；蛘呒?xì)胞定位化的方法，這使得在使用一個(gè)光子探測(cè)器陣列(包括CCD)而不是單個(gè)光子探測(cè)器(例如一個(gè)PMT)時(shí)能夠改善靈敏度或者對(duì)不同顆粒的甄別能力。
定位化實(shí)施例 在下述每一個(gè)實(shí)施例中，除了另有說(shuō)明外，都做了如下假設(shè)樣品是兼容于短期細(xì)胞壽命和功能的液態(tài)細(xì)胞溶液的一個(gè)等份，其中可能含有目標(biāo)顆粒(盡管在下面的說(shuō)明中假設(shè)存在這種顆粒)。液體樣品可以從環(huán)境、臨床、由空氣制備成的液體、洗滌的藥簽或者其他樣品中獲得?？諝鈽悠房梢詮谋或?qū)動(dòng)的空氣流(空氣采樣器或者表面取樣器)、靜電捕獲、或者制備的空降顆粒等獲得。細(xì)胞應(yīng)該被理解為位于兼容于細(xì)胞壽命和功能的培養(yǎng)液中的發(fā)光細(xì)胞。假定顆粒與細(xì)胞的接觸會(huì)導(dǎo)致一個(gè)或一個(gè)以上光子的發(fā)射。樣品與細(xì)胞在其中混合的室的外部有單個(gè)的或者排列的光子探測(cè)器陣列，而且在室的外部或者內(nèi)部還可能存在用于增強(qiáng)對(duì)發(fā)射光子的捕獲和探測(cè)的光學(xué)元件(例如反射鏡、透鏡、光導(dǎo)管等等)?；旌鲜壹俣ㄊ遣糠值幕蛘哒w透明的，或者有其他方式可以讓發(fā)射的光子到達(dá)探測(cè)器。
離心 樣品可以在一個(gè)室內(nèi)被離心足夠的時(shí)間以使顆粒沉降。細(xì)胞可以在不干擾顆粒的情況下被導(dǎo)入室內(nèi)并被短時(shí)間離心使其能沉降到顆粒上。光子探測(cè)可以在離心時(shí)、或者較典型的在離心后進(jìn)行。
親和力捕獲(表面捕獲) 樣品可以被導(dǎo)入一個(gè)微量離心管、多孔板、過(guò)濾器單元或者其他適當(dāng)?shù)难b置內(nèi)，這些裝置的某些與樣品接觸的部分被處理成能借助特異性或非特異性的結(jié)合作用來(lái)結(jié)合和留住可能存在的顆粒。非特異性結(jié)合可以通過(guò)靜電/離子交換作用、疏水作用、親水作用等等容易得以實(shí)現(xiàn)。特異性結(jié)合可以通過(guò)使那些結(jié)合在基質(zhì)上的成分停留在顆粒(例如抗體、受體、糖蛋白、蛋白質(zhì)、肽、碳?xì)浠衔?、寡核苷酸等?的表面上容易得以實(shí)現(xiàn)，或者可以通過(guò)使被受體結(jié)合的那些成分停留在顆粒(小分子、肽、蛋白質(zhì)、碳?xì)浠衔锏鹊?的表面上。
親和力捕獲(在移動(dòng)基質(zhì)上) 類似于在表面捕獲的親和力捕獲，只是顆粒是結(jié)合在可移動(dòng)的基質(zhì)上的(例如聚合珠，細(xì)胞，帶電分子，磁性珠，細(xì)菌等等)，這種可移動(dòng)基質(zhì)利用包括這里所說(shuō)的方法在內(nèi)的各種方法提供了移動(dòng)和/或定位化顆粒或者細(xì)胞的額外方式。
流動(dòng)細(xì)胞 發(fā)光細(xì)胞可以被導(dǎo)入一個(gè)淺流動(dòng)池中并附著于底部表面，再一次的流動(dòng)能去除未附著的細(xì)胞。樣品的導(dǎo)入使許多細(xì)胞培養(yǎng)液移動(dòng)，于是顆?？梢猿两档礁街募?xì)胞上。當(dāng)顆粒與細(xì)胞接觸時(shí)會(huì)發(fā)射出光子。
流動(dòng)細(xì)胞(多細(xì)胞系) 類似于上述流動(dòng)細(xì)胞，但是具有一些敏感于不同目標(biāo)顆粒的不同的發(fā)光細(xì)胞區(qū)域。圖像探測(cè)器探測(cè)到的光子使得可以判斷哪些類細(xì)胞被激活了，進(jìn)而可以判斷樣品中存在哪些種類的目標(biāo)顆粒。
流動(dòng)細(xì)胞(磁性珠) 類似于上述流動(dòng)細(xì)胞。適合的磁性珠與樣品混合，以使目標(biāo)顆粒附著在珠上。這些裝飾了目標(biāo)顆粒的磁性珠可以被導(dǎo)入到流動(dòng)池中，在這里一個(gè)強(qiáng)的局部磁場(chǎng)(由永久磁鐵或者電磁鐵產(chǎn)生)將把這些磁性珠捕獲在附著了細(xì)胞的表面的上方?；旌系倪^(guò)程可以通過(guò)消除磁力從而把磁性珠沉降在細(xì)胞上來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)移動(dòng)磁力以把磁性珠吸引到細(xì)胞所附著的表面上。
流動(dòng)細(xì)胞(電場(chǎng)) 類似于上面的流動(dòng)細(xì)胞，只是還包含一個(gè)供細(xì)胞附著的表面和一個(gè)平行于該表面的用作分離電極的表面(兩個(gè)表面之中至少有一個(gè)表面是透明的)。樣品可以被導(dǎo)入，置換大量的細(xì)胞培養(yǎng)液。在電極之間施加適當(dāng)?shù)闹绷麟妷?，使顆粒因?yàn)殡娪咀饔靡苿?dòng)到其附著的細(xì)胞處。
帶條/吸附芯 使一個(gè)可能含有目標(biāo)顆粒的空氣樣品撞擊一個(gè)透明表面，這個(gè)表面可以是剛性的或者柔性的(例如一個(gè)帶條)，可以是多孔的或者非多孔的。在撞擊區(qū)域的周圍可以黏著一個(gè)吸收材料，或者吸附芯，如果對(duì)于多孔表面，在該表面的另一側(cè)黏著吸收材料或者吸附芯。細(xì)胞可以被置于撞擊區(qū)域，由于吸附芯的作用，過(guò)量的培養(yǎng)液能夠被吸收，從而減小了含有細(xì)胞的培養(yǎng)液的體積和深度，使細(xì)胞更靠近于顆粒。細(xì)胞可以沉降出來(lái)到撞擊顆粒上，或者，如果是背面含有吸附材料的多孔表面的情況，還可以利用流動(dòng)使細(xì)胞被拉向顆粒。
空氣撞擊 使一個(gè)可能含有目標(biāo)顆粒的空氣樣品撞擊進(jìn)入一個(gè)適合于離心的室(被固定的，并且一開(kāi)始的時(shí)候是空的)內(nèi)。細(xì)胞能夠在不干擾顆粒的情況下被導(dǎo)入到室內(nèi)，并且經(jīng)過(guò)短暫的離心后沉降到顆粒上。光子探測(cè)可以在不經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)之中、或者更典型的在旋轉(zhuǎn)之后進(jìn)行。
過(guò)濾裝置/磁性珠 將細(xì)胞置入一個(gè)經(jīng)過(guò)改進(jìn)的、含有一個(gè)室和一個(gè)帶有合適的過(guò)濾器的活塞的無(wú)注射過(guò)濾裝置中(Whatman，Mini-UniprepTM或者類似產(chǎn)品)，其中細(xì)胞可以附著于室的底部表面上，沒(méi)有附著的細(xì)胞可以被洗脫除去。樣品可以和具有適當(dāng)?shù)谋砻嬗H和力的磁性珠一起被導(dǎo)入到室內(nèi)。在該室內(nèi)插入一個(gè)內(nèi)部含有一個(gè)固定于過(guò)濾器背面附近的合適的磁鐵的改進(jìn)型活塞，直到室內(nèi)的殘留空氣通過(guò)過(guò)濾器排除出去。這個(gè)組件可以被倒置過(guò)來(lái)，(在經(jīng)過(guò)可能讓磁性珠沉降到過(guò)濾器表面的一段時(shí)間以后)把該室向下推到活塞上。磁性珠和顆?？梢酝ㄟ^(guò)過(guò)濾、沉降和磁力吸引而聚積到過(guò)濾器的表面。顆粒可以附著在磁性珠上面，或者在磁性珠之間被捕獲。通過(guò)再次倒轉(zhuǎn)該組件，顆粒將被磁性珠帶離細(xì)胞，而磁性珠則被活塞內(nèi)的磁鐵吸住。除去磁鐵釋放磁性珠從而釋放顆粒，顆粒經(jīng)過(guò)一段短距離后將沉降到細(xì)胞上。
流經(jīng)細(xì)胞 可以讓一層或者幾層細(xì)胞沉降到位于室底的一個(gè)適合的過(guò)濾器或者膜的表面上。樣品可以被導(dǎo)入到室內(nèi)細(xì)胞的上方并對(duì)其施加壓力(例如可以使用活塞或者外部的泵)。當(dāng)樣品流經(jīng)相互間緊密接觸的細(xì)胞時(shí)，顆粒將被導(dǎo)入細(xì)胞的密集范圍內(nèi)，并發(fā)生接觸。
逆向流動(dòng) 可以讓一層或者多層細(xì)胞沉降到位于一個(gè)“細(xì)胞”室底部的適合的過(guò)濾器或者膜的表面上。樣品可以放置在一個(gè)被分離的“樣品”室內(nèi)，該“樣品”室通過(guò)某個(gè)流動(dòng)通道與位于過(guò)濾器下面某一點(diǎn)上的細(xì)胞室相連接。這兩個(gè)室的相互位置可以設(shè)定成使在一個(gè)離心管中樣品室更靠近于轉(zhuǎn)動(dòng)軸，并且樣品室中的液面高度比細(xì)胞室中的液面高度更靠近于轉(zhuǎn)動(dòng)軸。這樣，當(dāng)離心管旋轉(zhuǎn)的時(shí)候，液體將在各室間流動(dòng)，試圖保持一個(gè)離轉(zhuǎn)動(dòng)軸相同的距離。這樣能夠迫使一些樣品向上穿過(guò)支撐細(xì)胞的過(guò)濾器，并且經(jīng)過(guò)被向外的離心力作用而保持著抵抗流動(dòng)的細(xì)胞。當(dāng)樣品流經(jīng)相互間緊密接觸的細(xì)胞時(shí)，顆粒將被導(dǎo)入細(xì)胞的密集范圍內(nèi)，并發(fā)生接觸。
離心管過(guò)濾器 將樣品導(dǎo)入一個(gè)被切掉適當(dāng)大小的一塊離心管過(guò)濾器的過(guò)濾器筐(filterbasket)內(nèi)。在適當(dāng)?shù)碾x心條件下，樣品能夠被迫使穿過(guò)過(guò)濾器，并讓尺寸大于過(guò)濾器被切掉尺寸的顆粒聚積在過(guò)濾器的表面上?？梢詫⒓?xì)胞加入到過(guò)濾器筐中并給予一個(gè)短時(shí)間的離心，以使細(xì)胞被帶到過(guò)濾器的表面上和顆粒上。
雙向電泳捕獲 類似于上面所說(shuō)的流動(dòng)細(xì)胞，只是在任一表面上帶有合適的電極或者帶有伸入到流動(dòng)細(xì)胞中的電極。樣品可以通過(guò)連續(xù)流經(jīng)電極的方式被導(dǎo)入，這些電極連接于外部電源并受其電驅(qū)動(dòng)。當(dāng)流速、頻率、波形和振幅有一個(gè)合適的組合時(shí)，由于負(fù)雙向電泳顆?？杀粚?dǎo)向細(xì)胞上房的一個(gè)最小電場(chǎng)強(qiáng)度區(qū)域并在那里被捕獲。當(dāng)停止流動(dòng)并改變對(duì)電極的電驅(qū)動(dòng)(可能包括在一些電極間施加直流電壓以產(chǎn)生電泳力)之后，顆?？梢员怀两祷蚴球?qū)逐(通過(guò)電泳或者正雙向電泳)到附著的細(xì)胞上。
行波雙向電泳 在一個(gè)淺的柱狀室中，可以在一個(gè)或者兩個(gè)平行表面上制造一些適當(dāng)?shù)碾姌O(或許是透明的)，包括一個(gè)用于收集顆粒的中央平面電極，一個(gè)位于外圍的電極，以及一組螺旋狀電極(可以與中央電極位于同一表面，也可以在與其相反的表面上)。樣品可以被導(dǎo)入到室內(nèi)，在外圍電極和中央電極之間施加一個(gè)直流電壓，利用電泳將顆粒吸引到中央電極上。通過(guò)液體的交換，將細(xì)胞導(dǎo)入到室內(nèi)。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南嘁平涣麟妷候?qū)動(dòng)螺旋狀電極，可以借助行波雙向電泳把細(xì)胞掃(sweep)到中央，然后細(xì)胞在那里沉降顆粒。
可溶膜管 可以使用電激勵(lì)溶解金膜，在離心沉降顆粒使之定位化的時(shí)候隔離目標(biāo)顆粒和發(fā)光細(xì)胞?；蛘呖梢詫㈩w粒沉降到位于細(xì)胞上方的膜上(如附圖20所示)，也可以用鋪設(shè)在另外一個(gè)室(或許是插入到室內(nèi)的)的底部的膜使得細(xì)胞離開(kāi)原來(lái)室的底部。不論是哪種情況，當(dāng)膜在電激勵(lì)添加下被溶化以后，利用沉降法，或者可以是離心法，使顆粒與細(xì)胞混合。
聲波/超聲波 顆粒的濃縮可以使用聲波或者超聲波來(lái)完成。顆粒可以在一個(gè)駐波的節(jié)點(diǎn)處聚積，或者被一個(gè)行波所移動(dòng)。細(xì)胞也可以用這種方式移動(dòng)，或者用前面所述幾種方法的任意一種進(jìn)行運(yùn)送。
毒素探測(cè) 為了探測(cè)單價(jià)抗原，有必要使用兩種方案中的一種來(lái)誘導(dǎo)表面抗體的交聯(lián)。第一種方案是，在細(xì)胞表面表達(dá)兩個(gè)各自獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，這樣的話兩個(gè)受體分子能夠結(jié)合于一個(gè)配位體上。另一種方案是，如果配位體以多價(jià)的形式表達(dá)于細(xì)胞，則可以在細(xì)胞表面上表達(dá)一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。下面所述是利用抗體-抗原識(shí)別模型的一些具體的例子。
首先，可以在單個(gè)細(xì)胞系的表面表達(dá)兩種抗體，每種特異于一個(gè)分子的不同抗原決定簇(抗原決定簇1和2)。單個(gè)分子與兩種抗體的結(jié)合(一個(gè)抗體針對(duì)抗原決定簇1，而另外一個(gè)抗體針對(duì)抗原決定簇2)將導(dǎo)致交聯(lián)和發(fā)光。更具體的說(shuō)，單個(gè)B細(xì)胞系被調(diào)控成表達(dá)兩種獨(dú)立的抗體，每個(gè)抗體識(shí)別單個(gè)分子上的一個(gè)不同的抗原決定簇。單體抗原的出現(xiàn)將促使兩個(gè)表面抗體交聯(lián)，造成細(xì)胞內(nèi)鈣的增加和水母發(fā)光蛋白的發(fā)光。近來(lái)我們找到一種表達(dá)了能同時(shí)抵抗鼠疫桿菌和土拉熱弗朗西絲氏菌的功能性抗體(加上表達(dá)于基因內(nèi)的PC抗體)(參見(jiàn)實(shí)施例)的細(xì)胞系。這個(gè)細(xì)胞系能夠獨(dú)立的識(shí)別這兩種細(xì)菌中的每一種，這表明了這兩種抗體都是功能性的，并且證明了發(fā)光細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)兩種功能性抗體。
另一個(gè)潛在的問(wèn)題是，對(duì)于不能通過(guò)離心力被沉淀的抗原，此種光電子裝置和方法的敏感性如何。鼠疫桿菌F1抗原作為低分子量聚合物存在于溶液中，因此在我們的測(cè)試中是不可能被沉降的。然而，表達(dá)抗F1抗體的B細(xì)胞能夠探測(cè)到5ng/ml的可溶性F1抗原。這與現(xiàn)今的免疫分析方法相當(dāng)，因此證明了此種光電子裝置對(duì)于可溶性制劑而言是相當(dāng)敏感的。使用綴合了卵清蛋白的磷酸膽堿抗原進(jìn)行了補(bǔ)充試驗(yàn)。這種小抗原能夠刺激抗體在細(xì)胞表面進(jìn)行交聯(lián)的能力提示我們，這種含有多個(gè)拷貝數(shù)的PC抗原決定簇的小分子量抗原能夠有效交聯(lián)表面抗體并引起鈣的內(nèi)流和光子的發(fā)射。
第二種方案利用離心的方式能夠改善上述對(duì)單價(jià)抗原的探測(cè)限制。這種方法使一種毒素抗體在良性細(xì)菌表面表達(dá)，而另外一種毒素抗體在B細(xì)胞表面表達(dá)。然后，毒素可以通過(guò)離心方式被沉降，接著，加入表達(dá)第二抗體的B細(xì)胞。由于在細(xì)菌表面固定了多種抗原，因此對(duì)于B細(xì)胞來(lái)說(shuō)毒素實(shí)質(zhì)上表現(xiàn)為多價(jià)，因而引發(fā)交聯(lián)發(fā)生和光子的發(fā)射。更特別的，抗單體抗原(例如毒素)的抗原決定簇1的抗體表達(dá)于細(xì)菌表面?？扇苄远舅嘏c這些抗體結(jié)合，周毒素抗原將所述細(xì)菌包被。這些被毒素包被的細(xì)菌在加入表達(dá)抗抗原決定簇2的抗體的B細(xì)胞之前，通過(guò)離心方式被沉降。B細(xì)胞抗體的交聯(lián)導(dǎo)致水母發(fā)光蛋白發(fā)射光子。這一方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了對(duì)細(xì)菌表面抗原進(jìn)行探測(cè)的可行性，并且在加入B細(xì)胞之前先將細(xì)菌沉降可以增加探測(cè)的敏感性。相似的方法同樣可以被用于任何難以沉降的制劑以提高其對(duì)B細(xì)胞的呈遞。
交聯(lián) 目標(biāo)顆粒的交聯(lián)可以通過(guò)任何已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，交聯(lián)可以通過(guò)使用一種或者多種中間制劑或者分子來(lái)完成，這些中間制劑或者分子的例子包括肽、抗體、化合物、抗體、生物素、抗生蛋白鏈菌素。此外，交聯(lián)還可以通過(guò)共價(jià)結(jié)合或者非共價(jià)結(jié)合來(lái)完成。交聯(lián)的方法還可以包括沉淀或者通過(guò)配位體、抗體或者化學(xué)功能基團(tuán)等物質(zhì)結(jié)合在固相上，這些都是本領(lǐng)域公知的。
多重分析 下面將描述B細(xì)胞混合物是如何能夠用于在不增加探測(cè)通道(管等)的情況下而提高可探測(cè)到的抗原的數(shù)量的。探測(cè)多個(gè)待測(cè)物的最簡(jiǎn)單的方式是在每個(gè)探測(cè)通道使用單一的發(fā)光細(xì)胞類型，并通過(guò)增加探測(cè)通道的數(shù)量來(lái)增加細(xì)胞分析的數(shù)量。這種方法對(duì)于小數(shù)量的分析是可以接受的，但是，隨著待測(cè)物數(shù)量的增多，方法會(huì)變得越來(lái)越復(fù)雜，并且資源緊張。然而，如果需要的話，可以將多個(gè)不同B細(xì)胞系混合在一起，則可能在一個(gè)僅僅5通道的系統(tǒng)上使用同時(shí)的陰性對(duì)照來(lái)進(jìn)行多達(dá)31種測(cè)定。
舉個(gè)例子，如果只有一個(gè)單一的通道，則最多只能進(jìn)行一種B細(xì)胞的探測(cè)分析。然而，如果存在兩條通道，則可以進(jìn)行3種不同的探測(cè)分析，其中每條通道含有等量的3種不同的B細(xì)胞系種的兩種 例如，如果有3種B細(xì)胞系A(chǔ)，B，C 并將它們混合放入兩條通道，由此 通道1A，B通道2B，C 然后會(huì)有三種可能的陽(yáng)性讀數(shù) 相似的，如有有3條通道，通過(guò)將4種細(xì)胞系混合在一起，則可以進(jìn)行7種各自獨(dú)立的探測(cè)分析(在此簡(jiǎn)單的表示為，針對(duì)各個(gè)制劑的細(xì)胞系以字母A至相應(yīng)于細(xì)胞系數(shù)量的字母表示，并記錄通道數(shù)量以顯示哪些通道對(duì)于各個(gè)制劑進(jìn)行陽(yáng)性探測(cè)是必需的，記錄如下——123.F——表示通道1、2和3必須均記錄陽(yáng)性才能鑒定制劑F) 假定所有的分析都按照相等的比例進(jìn)行混合，則可以通過(guò)給定的通道數(shù)而得到獨(dú)立的分析數(shù)，簡(jiǎn)單描述此關(guān)系的公式為 #細(xì)胞分析＝2n-1，其中n指代通道數(shù)，而每個(gè)通道中需要混合的細(xì)胞分析數(shù)是2(n-1)。
因此，將16中不同的B細(xì)胞系混合在一起，需要5個(gè)通道以進(jìn)行31種變體的分析。一個(gè)10通道系統(tǒng)的設(shè)計(jì)實(shí)際上能夠用于通過(guò)使用同時(shí)的陰性對(duì)照(5-通道陽(yáng)性鑒定，5-通道陰性對(duì)照)而鑒定31種不同的制劑。
下面所示的是一個(gè)4-通道系統(tǒng)(15種不同的分析)的相應(yīng)的通道混合物和陽(yáng)性探測(cè) 可以確定，無(wú)需過(guò)多的努力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于以上的描述和以下的實(shí)施例，將本發(fā)明應(yīng)用至其最大的程度。下面的實(shí)施例應(yīng)當(dāng)被視為僅僅是舉例說(shuō)明本領(lǐng)域技術(shù)人員如何實(shí)施本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)說(shuō)明書(shū)其他內(nèi)容進(jìn)行的任何的限制。
實(shí)施例 附圖1是一種示意圖，表示出本發(fā)明的常規(guī)的細(xì)胞成分。細(xì)胞(在此為B細(xì)胞)含有一種發(fā)光分子(在此為水母發(fā)光蛋白)且在其表面具有抗體。這些抗體特異于目標(biāo)顆粒上的抗原，顆粒的例子例如生物武器制劑。目標(biāo)顆粒與B細(xì)胞上的抗體的結(jié)合將導(dǎo)致兩個(gè)或者多個(gè)抗體在細(xì)胞表面聚積，引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)將導(dǎo)致鈣從細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存處釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度的升高導(dǎo)致水母發(fā)光蛋白釋放光子。然后，光子被一個(gè)例如CCD的光電倍增裝置捕獲并且記錄。因此，使用具有功能性表面并且含有可應(yīng)答于鈣濃度升高的細(xì)胞質(zhì)發(fā)光分子的細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)一種細(xì)胞生物探測(cè)器。
這種基于細(xì)胞的探測(cè)系統(tǒng)提供了對(duì)任何目標(biāo)顆粒上的任何抗原的快速、靈敏、特異性、精確和靈活的探測(cè)。在靈活性方面，該系統(tǒng)能夠被改良成可以針對(duì)任何顆?；蛘哳w粒群。在一個(gè)實(shí)施例中，單個(gè)的發(fā)光細(xì)胞可以含有許多種抗體類型，每種類型都特異于目標(biāo)顆粒的一些非重疊群。于是，這種單個(gè)發(fā)光細(xì)胞可以用來(lái)同時(shí)識(shí)別同一類的不同目標(biāo)顆粒品種。
在第二個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)反應(yīng)室內(nèi)可含有兩種類型的發(fā)光細(xì)胞。一類發(fā)光細(xì)胞含有一些特異于一種類型的不同種目標(biāo)顆粒(例如，細(xì)菌)的抗體，并能在應(yīng)答于與該類中任何一種顆粒相接觸時(shí)發(fā)射一個(gè)具有第一波長(zhǎng)的光子。第二類發(fā)光細(xì)胞含有一些僅僅特異于該類中某特定種的顆粒(例如，鼠疫桿菌)的抗體，并能在應(yīng)答于與該種顆粒的結(jié)合時(shí)發(fā)射一個(gè)具有不同于第一波長(zhǎng)的第二波長(zhǎng)光子。這樣的設(shè)計(jì)通過(guò)減小或者排除虛假陽(yáng)性信號(hào)而提供了極高的準(zhǔn)確性。僅當(dāng)?shù)谝徊ㄩL(zhǎng)的光子和第二波長(zhǎng)的光子都被探測(cè)到時(shí)，才記錄為一個(gè)陽(yáng)性事件。為了進(jìn)一步減小或者排除虛假陽(yáng)性信號(hào)，必要時(shí)，還可以把發(fā)光分子具有的特異性擴(kuò)展到多于兩種。
附圖2是本發(fā)明的常規(guī)結(jié)構(gòu)和使用環(huán)境的示意圖。
附圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案所使用的分子生物學(xué)的示意圖。在這個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)了一種發(fā)光分子(例如水母發(fā)光蛋白分子)但不表達(dá)抗體的通用B細(xì)胞系被作為用來(lái)產(chǎn)生能表達(dá)任何特異于任何抗原的抗體的B細(xì)胞的基礎(chǔ)。一種抗體表達(dá)載體被導(dǎo)入到一個(gè)被選擇用于表達(dá)該載體并擴(kuò)展用于本發(fā)明系統(tǒng)的普通B細(xì)胞中。用這個(gè)方法，結(jié)合以pDisplay和VK表達(dá)(在前面“抗體”一節(jié)有所描述)，將產(chǎn)生對(duì)各種目標(biāo)具有目標(biāo)特異性的發(fā)光細(xì)胞。已經(jīng)生產(chǎn)了特異于口蹄疫病毒(FMDV)、委內(nèi)瑞拉馬腦髓炎(VEE)病毒、鼠疫桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、布魯氏菌、霍亂弧菌的O1和O139菌株，和正痘病毒等的發(fā)光細(xì)胞。在USDA獲得了FMDV抗體可變區(qū)域的cDNA和序列。NMRC的研究人員獲得了鼠疫桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、布魯氏菌、霍亂弧菌O1和O139菌株的抗體可變區(qū)域cDNA和序列。分別在CDC和USAMRIID獲得了由雜交克隆產(chǎn)生的VEE和正痘病毒抗體的可變區(qū)域?？谔阋卟《?FMDV)、鼠疫桿菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、委內(nèi)瑞拉馬腦髓炎病毒(VEEV)分別是口蹄疫、鼠疫、土拉熱病、腦髓炎的起因。通過(guò)聯(lián)合使用在一些公開(kāi)的論文中描述引物自雜交瘤進(jìn)行克隆。正在制造特異于Bacillus globigii的發(fā)光細(xì)胞，因?yàn)檫@種非病原性細(xì)菌被一些軍事人員用作生物武器物質(zhì)探測(cè)系統(tǒng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試中的測(cè)試生物。附圖5表示出一個(gè)說(shuō)明當(dāng)幾個(gè)特異于FMDV的發(fā)光分子的克隆與或FMDV目標(biāo)接觸時(shí)產(chǎn)生的光子發(fā)射應(yīng)答的曲線圖。在每種情況中，發(fā)光分子都在目標(biāo)與細(xì)胞發(fā)生接觸后約20-30秒內(nèi)發(fā)出光子。附圖中也顯示出的數(shù)據(jù)表明當(dāng)一個(gè)不期望會(huì)與發(fā)光分子結(jié)合的突變FMDV(在病毒衣殼蛋白中單個(gè)氨基酸的變異)與一個(gè)發(fā)光細(xì)胞克隆接觸時(shí)不會(huì)發(fā)光。這種陰性對(duì)照支持了導(dǎo)入探測(cè)系統(tǒng)的高度的特異性。
各種構(gòu)型的離心管和光電倍增管(PMT)的設(shè)定情況可用于本發(fā)明的系統(tǒng)。該設(shè)定包含個(gè)能使一個(gè)擺動(dòng)裝置的樣品微量離心管旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子(馬達(dá))和一個(gè)位于固定位置的平衡管。所述PMT位于底部，在其靜止時(shí)其向上對(duì)著樣品管的底部一端。在一個(gè)典型的試驗(yàn)中，對(duì)于比發(fā)光細(xì)胞小的目標(biāo)顆粒，含有顆粒的液體樣品被放置在樣品管中，并且在足以將大部分顆粒沉降于管底的條件下進(jìn)行離心(例如，對(duì)于土拉熱弗朗西絲氏菌為56xg，60秒)。然后將發(fā)光細(xì)胞懸浮液至于管中的樣品上層(這樣使其不會(huì)攪動(dòng)沉積的顆粒)，并且短暫離心，以使細(xì)胞與目標(biāo)顆粒相接觸。如果目標(biāo)顆粒存在于待測(cè)顆粒中，細(xì)胞將發(fā)射特定波長(zhǎng)的光子，并且由PMT捕獲并記錄。
在特定的實(shí)施方案中，PMT可以是斯坦福Research systems的SR400雙通道選通光子計(jì)數(shù)器系統(tǒng)相接口的Hamamatsu(公司)的HC125-08光電倍增管。離心機(jī)可以是帶有一個(gè)擺動(dòng)管構(gòu)型的Sapphire(藍(lán)寶石)17轉(zhuǎn)，18.5AWG，5安培馬達(dá)。
離心管(反應(yīng)室)可以根據(jù)需要進(jìn)行改造和升級(jí)，以幫助待測(cè)顆粒和發(fā)光細(xì)胞進(jìn)行接觸。在附圖20所示的一個(gè)實(shí)施方案中，離心管包含一個(gè)位于管底處的、含有預(yù)先安裝的發(fā)光細(xì)胞的封閉的間隔(小室)。這個(gè)間隔(小室)通過(guò)一個(gè)可溶性金陽(yáng)極膜與管子的其余部分隔離。在操作中，一個(gè)含有待測(cè)顆粒的樣品被置入管內(nèi)，并借助旋轉(zhuǎn)使待測(cè)顆粒在膜上聚積。然后將膜溶解，使管子進(jìn)行短暫的旋轉(zhuǎn)，以使顆粒與發(fā)光細(xì)胞相接觸。這個(gè)可溶性膜系統(tǒng)已經(jīng)由Langer及其同事在《Angewantde Chimie International Edition》392396-2407，2000以及《自然》397335-338，1999中描述。
離心過(guò)程的一些步驟可以是自動(dòng)化的，或者可以設(shè)計(jì)成使用者根本無(wú)需停止離心。例如，通過(guò)適配于Beckman Instrusments公司購(gòu)得的制備性離心機(jī)(例如，超速離心機(jī))的機(jī)構(gòu)特性，液體和樣品的加入和去除可以在不停止轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)的情況下完成。此外，有可能希望在向心力仍然存在的情況下來(lái)探測(cè)光子的發(fā)射(例如，對(duì)于發(fā)光細(xì)胞與目標(biāo)顆粒的接觸在不經(jīng)過(guò)離心就不穩(wěn)定的情況下)。為了探測(cè)從旋轉(zhuǎn)著的樣品管發(fā)出的光子，PMT可以安排在相對(duì)于轉(zhuǎn)軸的一個(gè)徑向位置處。在大多數(shù)情況下，這種設(shè)定下的PMT不需要與樣品管一同旋轉(zhuǎn)，取而代之的，PMT可以是靜止不動(dòng)的，當(dāng)樣品經(jīng)過(guò)PMT前方時(shí)簡(jiǎn)單的記錄光子的發(fā)射。如果發(fā)射的信號(hào)非常弱，可以把探測(cè)器(例如，PMT或者CCD芯片)連結(jié)到轉(zhuǎn)子上，與樣品管一同旋轉(zhuǎn)?？蛇x擇的，可以用設(shè)定在轉(zhuǎn)子周圍的多個(gè)PMT來(lái)探測(cè)光子的發(fā)射。
如果多個(gè)樣品在同一個(gè)轉(zhuǎn)子上轉(zhuǎn)動(dòng)，則必要時(shí)可以改變PMT的位置或者信號(hào)處理方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)轉(zhuǎn)子上承載了4個(gè)樣品管，每個(gè)樣品管含有能發(fā)射同樣波長(zhǎng)光子的細(xì)胞。為了區(qū)分來(lái)自每個(gè)樣品的發(fā)射，可以用一個(gè)徑向?qū)?zhǔn)的PMT連續(xù)的探測(cè)發(fā)射情況。然后利用一個(gè)來(lái)自轉(zhuǎn)子的監(jiān)視每個(gè)樣品在各個(gè)時(shí)刻的位置的時(shí)標(biāo)曲線來(lái)分解連續(xù)的發(fā)光數(shù)據(jù)，確定每個(gè)樣品的發(fā)光情況。可以理解，本發(fā)明還包括了一些其他的變化。
例如，附圖17是轉(zhuǎn)子上承載了2個(gè)反應(yīng)管，并且在管子下方有2個(gè)對(duì)準(zhǔn)著的PMT的示意圖。在停頓位置處，轉(zhuǎn)子利用轉(zhuǎn)子位置編碼器使每個(gè)管子向下對(duì)準(zhǔn)于相應(yīng)的PMT。在另一個(gè)例子中，附圖17中所示的離心體系可以和一個(gè)空氣采樣收集器集成在一起，構(gòu)成如附圖18所示的系統(tǒng)。徑向的氣溶膠撞擊管可以包括任何類型的顆粒監(jiān)視器，例如在美國(guó)專利NO.5932795及其引證文件中描述的監(jiān)視器。在另外一個(gè)例子中，附圖18所示的系統(tǒng)可以被改成只需要一個(gè)相對(duì)于轉(zhuǎn)子軸徑向?qū)?zhǔn)的PMT，正如附圖19所示。如上所述，被PMT記錄的發(fā)射情況可以用軸位編碼器分解成每個(gè)樣品管的發(fā)射。
返回到附圖17，其中液體成分包括，但不限制，被加工成可以識(shí)別特定生物制劑的B細(xì)胞懸浮液，緩沖溶液，防腐劑，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，它們可以被放置在幾個(gè)離心管中的每一個(gè)，并混合以懸浮著在另一個(gè)步驟中預(yù)先從氣溶膠樣品中收集到的樣品顆粒的液體，其中顆?？梢园ǖ痪窒抻诘鞍踪|(zhì)、肽、化學(xué)制劑、病毒、以植物形態(tài)或者孢子形態(tài)存在的細(xì)菌、真菌孢子、花粉粒子、原生動(dòng)物、血液或組織細(xì)胞以及它們的碎片，這些顆?？梢允菃为?dú)的，也可以是與例如灰塵等載體例子相結(jié)合的。當(dāng)馬達(dá)開(kāi)始旋轉(zhuǎn)時(shí)，離心管被甩出進(jìn)入徑向位置，B細(xì)胞和/或樣品顆粒將按照顆粒的大小和密度以不同的速率被驅(qū)趕到離心管的底部。細(xì)胞和含有樣品的液體的加入和離心的準(zhǔn)確順序可以根據(jù)它們的相對(duì)沉降速度，以得到最大信號(hào)為目的來(lái)設(shè)計(jì)。一般來(lái)說(shuō)，可以預(yù)期能夠通過(guò)選擇使這些樣品旋轉(zhuǎn)(預(yù)旋轉(zhuǎn))適當(dāng)時(shí)間，然后加入B細(xì)胞并使它們一起旋轉(zhuǎn)到互相接觸，來(lái)使比B細(xì)胞沉降的慢的顆粒能誘導(dǎo)出最大的光子輸出。對(duì)于以相似于或者快于B細(xì)胞的速度沉降的顆粒，對(duì)樣品與B細(xì)胞混合物的單次旋轉(zhuǎn)將誘導(dǎo)出系統(tǒng)的最大光子輸出?？梢岳眉捎陔x心裝置的上游的顆粒尺寸分析器(包括但不局限于BAWS單元，和液體顆粒分析器)所給出的數(shù)據(jù)來(lái)自動(dòng)化確定最優(yōu)的操作順序和啟動(dòng)恰當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)控制自動(dòng)樣品處理。
當(dāng)“旋轉(zhuǎn)周期”結(jié)束，并且在旋轉(zhuǎn)馬達(dá)和軸位編碼器的控制之下轉(zhuǎn)子在一個(gè)預(yù)定位置上停下來(lái)時(shí)，擺臂將由于重力作用而下垂，使離心管的底部面對(duì)于光電倍增管的光敏面，然后記錄任何光信號(hào)。在該實(shí)施例的一個(gè)改良型中，可以把單個(gè)光電倍增管放置在轉(zhuǎn)子/反應(yīng)管離心機(jī)的最大半徑處，以便在各個(gè)反應(yīng)管相繼經(jīng)過(guò)光電倍增管的光敏面時(shí)收集來(lái)自反應(yīng)管的光子。可以根據(jù)軸位編碼系統(tǒng)的監(jiān)視來(lái)區(qū)分和疊加來(lái)自每個(gè)反應(yīng)管的光子輸出。
返回到附圖18，其中對(duì)氣溶膠顆粒的收集處理和使氣溶膠顆粒與B細(xì)胞相接觸的處理被集成到一起。在這里，離心管被安裝在擺臂上，旋轉(zhuǎn)時(shí)擺臂將讓離心管能蓋住徑向撞擊管的端部，于是，由于作用在旋轉(zhuǎn)著徑向撞擊管內(nèi)的空氣上的離心力，氣溶膠樣品將被引導(dǎo)流進(jìn)離心管的樣品入口(如有必要，可輔之以另外的吹氣單元)。高速的流動(dòng)使氣溶膠顆粒被捕獲到離心管的內(nèi)表面上或者管內(nèi)所含液體的表面上，分別造成顆粒被捕獲于管子表面或者液體中。當(dāng)有液體存在時(shí)，作用在液體的離心壓力將能抵消為讓顆粒被捕獲于液體所需的高速空氣流所產(chǎn)生的力，并防止顆粒被撞擊空氣吹出。在與管子表面或者液體撞擊后，氣溶膠顆粒將被留住，對(duì)于液體收集的情況，顆粒將被迫沿徑向向外流動(dòng)，結(jié)果在最大半徑處(離心管底部)產(chǎn)生增大的局部顆粒濃度。在收集步驟之后加入B細(xì)胞將它們旋轉(zhuǎn)到局部濃縮的顆粒所處的同一區(qū)域?qū)⒃斐晒庾虞敵?。可選擇的，也可以時(shí)在收集步驟進(jìn)行時(shí)已在液體中加入了B細(xì)胞，并且單個(gè)光電倍增管在旋轉(zhuǎn)時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)輸出(附圖19)。這一實(shí)施例的一種修改是，在入口處加入液體組分(包括但不局限于通過(guò)其他手段例如生物氣溶膠顆粒收集器所收集的顆粒樣品，和已加工B細(xì)胞的懸浮液)并且離心力使它們分布到管中。
當(dāng)“旋轉(zhuǎn)周期”結(jié)束，并且在旋轉(zhuǎn)馬達(dá)和軸位編碼器的控制之下轉(zhuǎn)子在一個(gè)預(yù)定的位置上停下來(lái)時(shí)，擺臂將由于重力作用而下垂，使離心管的底部面對(duì)于光電倍增管的光敏面，然后記錄任何光信號(hào)。在該實(shí)施例的一個(gè)修改型中，可以把單個(gè)的光電倍增管放置在轉(zhuǎn)子/反應(yīng)管離心機(jī)的最大半徑處，以便在各個(gè)反應(yīng)管相繼經(jīng)過(guò)光電倍增管的光敏面時(shí)收集來(lái)自反應(yīng)管的光子?？梢愿鶕?jù)軸位編碼系統(tǒng)的監(jiān)視來(lái)區(qū)分和疊加來(lái)自每個(gè)反應(yīng)管的光子輸出。
附圖7是順序離心結(jié)果的代表性示意圖。對(duì)于小于發(fā)光細(xì)胞、但具有與發(fā)光細(xì)胞相同密度的目標(biāo)顆粒，首先旋轉(zhuǎn)待測(cè)顆粒(例如，以高速)使其成團(tuán)是有益的。然后，可以加入發(fā)光細(xì)胞，再在能防止減小所需的細(xì)胞應(yīng)答特性的可能是較為溫和的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)(圖中最高一行的順序)。此外，這種離心順序?qū)⑵仁箮缀跛械拇郎y(cè)顆粒和發(fā)光細(xì)胞進(jìn)入離心管底部處的一個(gè)相對(duì)較小的體積內(nèi)。相反的，如果先混合待測(cè)顆粒和發(fā)光細(xì)胞，然后一次性的使它們旋轉(zhuǎn)將會(huì)導(dǎo)致顆粒與發(fā)光細(xì)胞的分離而不是接觸(圖中的中間行)。當(dāng)然，如果根本不作旋轉(zhuǎn)，則將大為減小反應(yīng)室中顆粒和發(fā)光細(xì)胞的有效濃度(圖中最下一行)。
附圖8給出了一個(gè)用實(shí)際試驗(yàn)驗(yàn)證了附圖7的順序結(jié)果的曲線圖。在附圖7所示的三種方法中，都使用了對(duì)土拉熱弗朗西絲氏菌具有特異性的發(fā)光細(xì)胞與已經(jīng)死亡的土拉熱弗朗西絲氏菌的混合。正如曲線圖中所看到的，順序旋轉(zhuǎn)方法造成了接觸以后的快速而高效的發(fā)光。相反的，單次旋轉(zhuǎn)方法的發(fā)光曲線在時(shí)間上和幅度上都要差的多。無(wú)旋轉(zhuǎn)的方法則難得產(chǎn)生幾次發(fā)光反應(yīng)。
在另外的一個(gè)試驗(yàn)中產(chǎn)生了類似的發(fā)光曲線，正如附圖8中的曲線圖所示。對(duì)這些發(fā)光曲線的觀察表明單次旋轉(zhuǎn)方法中的目標(biāo)特異性發(fā)光比兩次旋轉(zhuǎn)的方法稍微快了一些。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這一結(jié)果的產(chǎn)生主要是由于兩次旋轉(zhuǎn)方法需要較長(zhǎng)的旋轉(zhuǎn)時(shí)間所造成的，因此，并不能反映出B細(xì)胞的應(yīng)答時(shí)間在實(shí)際上有所改善。事實(shí)上，兩次旋轉(zhuǎn)方法的初始斜率明顯大于單次旋轉(zhuǎn)方法，這說(shuō)明兩次旋轉(zhuǎn)方法導(dǎo)致了健全的發(fā)光應(yīng)答。
附圖8中所示的探測(cè)系統(tǒng)的靈敏度可以使用滴定方法計(jì)數(shù)進(jìn)入到離心管里的土拉熱菌的數(shù)目來(lái)評(píng)估。附圖10所示的曲線圖總結(jié)了評(píng)估的結(jié)果?？梢钥闯觯?5000個(gè)發(fā)光細(xì)胞能在應(yīng)答于約5300個(gè)土拉熱病目標(biāo)顆粒時(shí)發(fā)出超過(guò)背景的可探測(cè)光子。可以期望，對(duì)反應(yīng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化將提高靈敏度。
經(jīng)過(guò)一次冷凍-解凍循環(huán)能提高細(xì)胞應(yīng)答(參見(jiàn)附圖22)。在這個(gè)試驗(yàn)中，對(duì)特異于鼠疫桿菌(YP)的細(xì)胞進(jìn)行管理信、再次懸浮于冷凍劑(含有10％DMSO的RPMI再加上10％的FBS)、在-80℃下冷凍，然后轉(zhuǎn)移到液態(tài)氮中。細(xì)胞在37℃下進(jìn)行解凍，把1ml(2×106個(gè))細(xì)胞稀釋在4ml的RPMI中，并在37℃下培育過(guò)夜。第二天，對(duì)細(xì)胞加載腔腸素等待2小時(shí)，然后洗入二氧化碳-獨(dú)立介質(zhì)(CO2-I)，恢復(fù)24小時(shí)。用5×105個(gè)YP(50ul深度的107/ml的YP)作用于10000個(gè)細(xì)胞。未經(jīng)處理的細(xì)胞表現(xiàn)為9500個(gè)光子每秒的應(yīng)答，而經(jīng)過(guò)冷凍解凍的細(xì)胞在應(yīng)答于YP時(shí)發(fā)出了6倍的光子。通過(guò)僅使細(xì)胞暴露于冷凍劑而不進(jìn)行凍結(jié)的手段，這一刺激作用可被大量復(fù)制(5倍刺激)。可以看出，冷凍劑中的刺激因子是DMSO。當(dāng)細(xì)胞用2％的DMSO處理時(shí)(是指DMSO的最終濃度，即讓1ml位于含有10％DMSO的冷凍劑的細(xì)胞稀釋到4ml的普通冷凍劑中)，可以探測(cè)到類似的刺激水平。DMSO的作用可以歸結(jié)到許多因素。已經(jīng)知道，DMSO可以實(shí)現(xiàn)造血細(xì)胞的分化，可能就是通過(guò)這個(gè)途徑刺激細(xì)胞。此外，在含甘油的介質(zhì)中冷凍細(xì)胞也顯示出相類似的刺激水平。因此，可以看出，該作用還部分的由于DMSO所誘導(dǎo)的應(yīng)激應(yīng)答，有可能可以利用任何一些能刺激“熱休克”應(yīng)答的條件來(lái)復(fù)制這一刺激。
細(xì)胞可以在充有腔腸素的冷凍狀態(tài)下儲(chǔ)存。先將細(xì)胞加載腔腸素，使其恢復(fù)24小時(shí)，然后再冷凍。解凍以后，細(xì)胞用10ml的CO2-I介質(zhì)洗滌，使細(xì)胞以5×105個(gè)/毫升的濃度重新懸浮于CO2-I介質(zhì)中。這些細(xì)胞能夠探測(cè)YP(在解凍后大約1小時(shí)，但較短的時(shí)間也是可能的)。如果在室溫(RT)下儲(chǔ)存，幾天以后這些細(xì)胞仍然能夠探測(cè)制劑。在對(duì)細(xì)胞加載腔腸素和冷凍之前，使用DMSO進(jìn)行預(yù)處理能夠提高解凍以后細(xì)胞對(duì)待測(cè)制劑的靈敏度。
在附圖22中所示的是經(jīng)過(guò)各種細(xì)胞處理以后，細(xì)胞對(duì)于稀釋于CO2-I中的50ul的濃度為10000000個(gè)YP/毫升的YP的應(yīng)答情況。未經(jīng)處理細(xì)胞在RPMI中生長(zhǎng)，使用腔腸素加載，洗滌，恢復(fù)24小時(shí)，然后加入YP。冷凍/解凍細(xì)胞在RPMI中生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移到冷凍介質(zhì)，并且冷凍。解凍的細(xì)胞(1ml)被放置于4mlRPMI中，在37℃下培育24小時(shí)，加載腔腸素，洗滌，恢復(fù)24小時(shí)，然后加入YP。冷凍介質(zhì)細(xì)胞在RPMI中生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移到冷凍介質(zhì)，在室溫下(RT)培育10分鐘。細(xì)胞(1ml)被放置于4mlRPMI中，在37℃下培育24小時(shí)，加載腔腸素，洗滌，恢復(fù)24小時(shí)，然后加入YP。2％DMSO細(xì)胞在RPMI中生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移到含有2％DMSO的RPMI中，在37℃下培育24小時(shí)，加載腔腸素，洗滌，恢復(fù)24小時(shí)，然后加入YP。
一個(gè)成功的生物武器探測(cè)系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)能夠抵抗來(lái)自戰(zhàn)場(chǎng)上一般環(huán)境物質(zhì)的污染。為了評(píng)估發(fā)光細(xì)胞能否在環(huán)境壓迫或污染下工作，在使發(fā)光細(xì)胞暴露于強(qiáng)柴油排放環(huán)境中1小時(shí)(參見(jiàn)附圖11中左邊的線形圖)或者使發(fā)光細(xì)胞被107個(gè)大腸桿菌(作為任何現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌的污染替代品)污染以后(參見(jiàn)附圖11中右邊的線形圖)，再讓其與目標(biāo)顆?；旌稀Ｆ浣Y(jié)果正如附圖11中所示，上述特定的化學(xué)污染和生物污染測(cè)試并不影響發(fā)光分子在應(yīng)答于目標(biāo)顆粒時(shí)的光子發(fā)射能力。
附圖13和附圖14描述了本發(fā)明的一個(gè)不同的實(shí)施例，其中不需要離心。附圖13的示意圖顯示了該實(shí)施例中的不同組合。生物氣溶膠警告?zhèn)鞲衅?BAWS)探測(cè)例如具有預(yù)定尺寸范圍的顆粒是否出現(xiàn)。Primmerman在《林肯實(shí)驗(yàn)室學(xué)報(bào)》123-32，2000中的文章描述了BAWS的一個(gè)例子。如果要探測(cè)某些符合一定規(guī)定的顆粒，BAWS將觸發(fā)一個(gè)空氣-空氣收集器(樣品收集器，如美國(guó)專利NO.5932795中描述的)，使得具有特定尺寸范圍的顆粒在第一站處就被收集和儲(chǔ)存在一個(gè)位于樣品帶條某一部分上的孔(反應(yīng)室)中，對(duì)此，附圖14給出了不同視角的視圖。當(dāng)待測(cè)顆粒儲(chǔ)存于所述孔中后，帶條將前進(jìn)到一個(gè)位于發(fā)光細(xì)胞池(reservoir)下方、PMT上方的第二站處。對(duì)目標(biāo)顆粒上的目標(biāo)抗原有特異性的發(fā)光細(xì)胞儲(chǔ)存在孔內(nèi)，從孔中發(fā)射的光子可以被很好的監(jiān)測(cè)到。
在待測(cè)顆粒被BAWS探測(cè)的過(guò)程中，隨著帶條穿越第一站，各個(gè)待測(cè)顆?？梢员粌?chǔ)存在一些相繼的孔中(附圖14)。在第二站處，多個(gè)分別含有不同目標(biāo)特異性發(fā)光分子的發(fā)光分子池被安裝在一個(gè)轉(zhuǎn)盤(pán)上，所述轉(zhuǎn)盤(pán)可以使某個(gè)特定池旋轉(zhuǎn)到指定位置上，以便讓不同的發(fā)光細(xì)胞儲(chǔ)存到孔中。通過(guò)這種方式，便可以探測(cè)到含有待測(cè)顆粒的不同目標(biāo)，正如附圖14中關(guān)于孔的頂部視角示意圖所示的。當(dāng)然，如果不同的發(fā)光細(xì)胞能發(fā)射不同波長(zhǎng)的光子，則只要位于第二站下方的PMT能夠區(qū)分不同的波長(zhǎng)，便有可能將不同的發(fā)光細(xì)胞儲(chǔ)存到同一個(gè)含有待測(cè)顆粒的孔內(nèi)。
附圖16是本發(fā)明系統(tǒng)的又一個(gè)實(shí)施例的示意圖。在該實(shí)施例中，空氣顆粒在第一站處被儲(chǔ)存在一個(gè)二維孔排列的一個(gè)含有6個(gè)孔的行中的每個(gè)孔內(nèi)(例如，一個(gè)帶條上含有6個(gè)行和幾百個(gè)欄)。這樣，每當(dāng)孔排列前進(jìn)一行，使這個(gè)行位于第二站處，向該行內(nèi)的每個(gè)孔內(nèi)儲(chǔ)存不同的發(fā)光細(xì)胞，便可以由設(shè)置在第二站下方的一行PMT同時(shí)探測(cè)出全部6個(gè)反應(yīng)的光發(fā)射。為了幫助顆粒黏著在帶條上的孔中，可以在孔中涂覆粘合劑或者液體。
細(xì)胞工程和試驗(yàn)方法實(shí)施例 A細(xì)胞加工方法 將M12g3R細(xì)胞在37℃下保持在含有5％CO2的RPMI1640潮濕環(huán)境中，RPMI中還添加了10％的胎牛血清、1mM的丙酮酸鈉、2mM的L-谷氨酸鹽、100μM的非必需氨基酸、50μM的2-巰基乙醇、50U/ml的青霉素、和250ng/ml的兩性霉素B(Life Technologies公司)。細(xì)胞通過(guò)電穿孔(270V、950μF)被轉(zhuǎn)染以Pcmv AEQ.IRES.NEO，并在1mg/ml的G418中選擇兩周。篩選出能應(yīng)答于抗-IgM的G418抵抗克隆。這些在交聯(lián)于表面IgM時(shí)能取得光子發(fā)射最大增強(qiáng)的克隆被用于隨后的轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生特異于特定病原體的B細(xì)胞系。通過(guò)(借助于電穿孔)與輕、重鏈以及一種對(duì)向嘌呤霉素傳遞抵抗性的基因編碼的鏈的共同轉(zhuǎn)染，具有加工獲得特異性的抗體的表面表達(dá)即可完成。嘌呤霉素抵抗物和克隆是根據(jù)它們對(duì)抗原的應(yīng)答來(lái)選擇的。在人類延長(zhǎng)因子1α(EF-1α)啟動(dòng)子的控制下，輕鏈表達(dá)載體，VK表達(dá)，將在多個(gè)克隆位點(diǎn)(MCS)的下游包含對(duì)于人類κ基因的恒定區(qū)。重鏈載體是通過(guò)改良的pDisplay(Invitrogen)來(lái)產(chǎn)生的保留巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和引導(dǎo)序列，但用小鼠IgM的結(jié)合于膜上的恒定區(qū)的基因來(lái)取代從血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)受體跨膜結(jié)構(gòu)域，并且去除MCS任意一側(cè)上的兩個(gè)標(biāo)記。使用PCR向抗體可變區(qū)加上一些合適的限制點(diǎn)，并在克隆成表達(dá)構(gòu)建體之前確認(rèn)所有PCR產(chǎn)物的序列。用來(lái)產(chǎn)生重組抗體的可變區(qū)是從以下兩條途徑克隆的從cDNA克隆或者由利用隨機(jī)寡核苷酸引物和PCR的逆轉(zhuǎn)錄(RT)從雜交瘤克隆。根據(jù)制造商的推薦，RNA可以用Trizol試劑(Life Technologies公司)提取，且第一鏈的合成使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)進(jìn)行。PCR用設(shè)計(jì)為與輕鏈或重鏈5’端的引導(dǎo)序列[S.T.Jones和M.M.Bendig《Bio/Technology》9，88，1991]以及小鼠κ或IgG2的3’端的恒定區(qū)退火的幾組引物進(jìn)行。
B生物發(fā)光B細(xì)胞對(duì)FMDV的應(yīng)答 用于發(fā)光試驗(yàn)的、以pCMV、AEQ、IRES、NEO質(zhì)粒和能識(shí)別FMDV A12菌株的重組抗體的表達(dá)載體穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染的M12g3R B細(xì)胞用下述方法進(jìn)行制備細(xì)胞在第一天進(jìn)行解凍。解凍后經(jīng)過(guò)24小時(shí)再制備細(xì)胞對(duì)于獲得最大活性和可靠性是至關(guān)重要的。冷凍/解凍步驟可以使B細(xì)胞的應(yīng)答提高多達(dá)100倍。在第二天，在覆蓋有箔片的情況下，在含有50μM腔腸素(MolecularProbes公司，Eugene，Oreg)的試驗(yàn)介質(zhì)中[無(wú)需CO2的介質(zhì)、10％的FBS、50μg/ml的鏈霉素、50U/ml的青霉素、250ng/ml的兩性霉素B(LifeTechnologies公司)]以室溫培育106個(gè)細(xì)胞2小時(shí)，洗滌兩次，并且以5×105個(gè)/毫升的最終濃度重新懸浮于試驗(yàn)介質(zhì)中。在1.5ml的微量離心管中在室溫下整夜旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，待15-20小時(shí)以后進(jìn)行試驗(yàn)。在試驗(yàn)中，用25μL的細(xì)胞與抗原混合(5μL濃度為14×108pfu/ml的wt A12pRMC35菌株，10μL濃度為7.5×107pfu/ml的A12突變體B2PD.3)，并用測(cè)光計(jì)(Lumat LB9507，Perkin Elmer)測(cè)量應(yīng)答。
C細(xì)菌和大病毒的生物發(fā)光試驗(yàn) 本傳感裝置和方法可以用于細(xì)菌和病毒的快速探測(cè)。細(xì)胞系被加工成能夠應(yīng)答于土拉熱弗朗西絲氏菌——土拉熱病的病源。然而，當(dāng)采用與FMD、VEE病毒相同的方法進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生緩慢并且?guī)缀鯚o(wú)法與背景分開(kāi)，這表面B細(xì)胞與抗原之間的相互作用率很低(0秒預(yù)旋轉(zhuǎn)/0秒旋轉(zhuǎn))。過(guò)去用抗原珠刺激劑所做的試驗(yàn)已經(jīng)證明，通過(guò)濃縮抗原和B細(xì)胞可以提高靈敏度和速度(數(shù)據(jù)未給出)，于是重新設(shè)計(jì)測(cè)光計(jì)，使其在光電倍增管(PMT)上方設(shè)置一個(gè)離心機(jī)。當(dāng)制劑與細(xì)胞混合在一起的時(shí)候，使用離心機(jī)濃縮5秒，發(fā)現(xiàn)信號(hào)改善并且應(yīng)答加快(0秒預(yù)旋轉(zhuǎn)/5秒旋轉(zhuǎn))。當(dāng)在加入細(xì)胞前預(yù)先使較慢沉降的土拉熱弗朗西絲氏菌離心時(shí)(60秒預(yù)旋轉(zhuǎn)/5秒旋轉(zhuǎn))，可以觀察到最理想的結(jié)果。這一方法保證了在短時(shí)間內(nèi)有大量細(xì)胞與抗原發(fā)生物理接觸，從而在靈敏度和速度方面有顯著的提升。在對(duì)試驗(yàn)方案進(jìn)行了額外的優(yōu)化以后，我們可以在不到三分鐘的時(shí)間愛(ài)你內(nèi)探測(cè)到60cfu(克隆形成單位)的土拉熱弗朗西絲氏菌，其中還包括了預(yù)旋轉(zhuǎn)的時(shí)間，但是沒(méi)有看到對(duì)滅活的鼠疫桿菌(鼠疫的致病桿菌)的應(yīng)答。這一探測(cè)限制已經(jīng)由另兩個(gè)滅活的土拉熱弗朗西絲氏菌來(lái)源和一個(gè)不同菌株的肯定(數(shù)據(jù)未給出)。而且，本傳感器裝置還具有寬廣的靈敏度范圍，可探測(cè)的濃度范圍達(dá)到7個(gè)數(shù)量級(jí)。
B細(xì)胞使用上述方法進(jìn)行制備。50μL含有上述數(shù)量的鼠疫桿菌或者土拉熱弗朗西絲氏菌的試驗(yàn)液以6500xg離心60秒，然后加入20μL的細(xì)胞，并且在離心測(cè)光計(jì)中再旋轉(zhuǎn)5秒。使用Hamamatsu HC-125光電倍增管探測(cè)光子，用Stanford Research Systems SR400選通光子計(jì)數(shù)器監(jiān)測(cè)信號(hào)。
核酸探測(cè)實(shí)施例 表達(dá)地高辛配基抗體的發(fā)光細(xì)胞的特性 將編碼針對(duì)地高新配基的抗體(Daugherty等人在《蛋白質(zhì)工程》11(9)825-832，1998中的文章有所描述)的質(zhì)粒導(dǎo)入發(fā)光細(xì)胞中，然后使用與地高辛配基化學(xué)綴合的蛋白(BSA)(Dig-BSA)篩選這些細(xì)胞。12個(gè)各自不同的池(pools)被選出來(lái)，意味著12-24個(gè)各自不同的細(xì)胞系。第一個(gè)試驗(yàn)測(cè)試這些細(xì)胞能否探測(cè)到交聯(lián)了DNA(Dig-DNA)的地高辛配基抗原。測(cè)試了三種不同類型的可購(gòu)買獲得的Dig-DNA，分別讓它們與下列物質(zhì)反應(yīng)表達(dá)地高辛配基抗體的淡黃色細(xì)胞(附圖26A-C)、通過(guò)每20個(gè)堿基對(duì)與地高辛配基連接的質(zhì)粒DNA(附圖26A)、通過(guò)每200個(gè)堿基與地高辛配基連接的DNA分子量標(biāo)記(附圖26B)、和每端都與一個(gè)地高辛配基相連接的DNA分子量標(biāo)記(附圖26C)。每樣標(biāo)準(zhǔn)制劑都能不同程度的刺激發(fā)光細(xì)胞，使用地高辛標(biāo)記的質(zhì)粒DNA表現(xiàn)出最高靈敏度的應(yīng)答。平均間隔20個(gè)堿基的抗原對(duì)細(xì)胞的刺激比平均間隔200個(gè)堿基的抗原對(duì)細(xì)胞的刺激要大100多倍(對(duì)于每個(gè)地高辛配基單位來(lái)說(shuō)，不是對(duì)于每微克DNA單位來(lái)說(shuō))，這個(gè)事實(shí)表明，對(duì)于想要刺激出一個(gè)理想的應(yīng)答來(lái)說(shuō)，200個(gè)堿基是個(gè)太長(zhǎng)的距離了。為了刺激導(dǎo)致鈣釋放的胞內(nèi)級(jí)聯(lián)和水母發(fā)光蛋白光子產(chǎn)生，相鄰的抗體必須被固定在與彼此足夠近的位置，以便激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)。
我們同樣注意到，在測(cè)量光子輸出之前進(jìn)行離心，這個(gè)在使用傳統(tǒng)淡黃色細(xì)胞探測(cè)可溶性抗原和不溶性抗原方法中的反應(yīng)順序，事實(shí)上能夠降低淡黃色細(xì)胞對(duì)可溶性Dig-DNA抗原的靈敏度。在該試驗(yàn)中顯示(附圖27A和27B)，在DNA溶液中離心細(xì)胞看起來(lái)似乎減少探測(cè)限制將近10倍。這個(gè)結(jié)果反映出對(duì)于DNA的探測(cè)和對(duì)于其他不能沉淀抗原的探測(cè)之間的區(qū)別。
使用發(fā)光細(xì)胞對(duì)雜交型寡核苷酸探針的探測(cè) 這個(gè)試驗(yàn)被設(shè)計(jì)用來(lái)探測(cè)地高辛配基標(biāo)記(Dig-labeled)探針與目標(biāo)DNA的雜交。所述實(shí)驗(yàn)中使用的目標(biāo)DNA來(lái)自于噬菌體質(zhì)粒pBluescript II。可以將這種3100個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的環(huán)形噬菌體質(zhì)粒導(dǎo)入以制備雙鏈DNA(dsDNA)或者兩條單鏈DNA(ssDNA)的任意一條。這兩條單鏈DNA鏈被稱為(+)鏈和(-)鏈。10個(gè)特異性結(jié)合于(+)鏈的地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)出來(lái) 利用寡核苷酸沿pBluescript噬菌體質(zhì)粒DNA上的位置順序?qū)押塑账徇M(jìn)行編號(hào)。上述每個(gè)顯示的是寡核苷酸的DNA序列，該序列在噬菌體質(zhì)粒上的位置，和寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)(結(jié)合吸引力的近似值)。這些寡核苷酸的解鏈溫度上的微小差別表明它們每個(gè)都具有相似的結(jié)合特性。
每一個(gè)寡核苷酸都有一個(gè)地高辛配基(Dig)連接在其第一殘基上，它們之間相似的解鏈溫度(Tm)反映了它們之間具有相似的結(jié)合目標(biāo)DNA的特性。這10個(gè)地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸雜交到目標(biāo)DNA的(+)鏈上，會(huì)導(dǎo)致雙鏈DNA有200個(gè)堿基的延長(zhǎng)，其中每20個(gè)堿基含有一個(gè)Dig分子。質(zhì)粒上剩余2900個(gè)堿基還保持單鏈狀態(tài)。這套固定化地高辛配基抗原與發(fā)光細(xì)胞表面上的地高辛配基抗體交聯(lián)，從而刺激光子產(chǎn)生。
第11號(hào)寡核苷酸(NEG3)是一個(gè)對(duì)照物。NEG3被設(shè)計(jì)成直接與3號(hào)寡核苷酸相結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)20個(gè)核苷長(zhǎng)的短小的雙鏈DNA，每個(gè)端點(diǎn)含有一個(gè)Dig。表達(dá)地高辛配基抗體的發(fā)光細(xì)胞能夠探測(cè)到80微摩(femptomoles)投入的寡核苷酸(附圖28)。這個(gè)對(duì)照證明了，對(duì)于雜交條件的選擇，應(yīng)當(dāng)是在解鏈溫度范圍內(nèi)并至少足夠使兩個(gè)寡核苷酸結(jié)合。更重要的，這個(gè)對(duì)照證明了，與互補(bǔ)DNA有20個(gè)堿基的結(jié)合已經(jīng)足夠有力的交聯(lián)抗體，并使發(fā)光細(xì)胞發(fā)出信號(hào)。
寡核苷酸與寡核苷酸的雜交發(fā)生的異常快速(附圖29)。將寡核苷酸NEG3在3號(hào)寡核苷酸之后加入到雜交溶液中。然后迅速將該溶液稀釋于介質(zhì)中，加入發(fā)光細(xì)胞，然后反應(yīng)在光度計(jì)中發(fā)生(從加入3號(hào)寡核苷酸開(kāi)始消耗的時(shí)間為15秒)。這個(gè)簡(jiǎn)化的雜交方法沒(méi)有戲劇性的影響試驗(yàn)的靈敏度(對(duì)比附圖29和28)。
接下來(lái)，將多個(gè)地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸雜交到單鏈DNA目標(biāo)上。檢測(cè)得到的復(fù)合物刺激發(fā)光細(xì)胞的能力。附圖30顯示出了對(duì)于給定數(shù)量的單鏈DNA而言，不同濃度的地高辛寡核苷酸探針的雜交情況。在該實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生最優(yōu)信號(hào)的單鏈DNA寡核苷酸探針的比率在1.2到1.4之間。當(dāng)探針濃度高時(shí)，未結(jié)合的地高辛標(biāo)記寡核苷酸看起來(lái)是抑制信號(hào)的。在這些實(shí)驗(yàn)中，0-63pmoles的寡核苷酸在很多測(cè)試條件下都表現(xiàn)的很好。一個(gè)劑量應(yīng)答曲線給出了單鏈DNA的探測(cè)極限約為50ng，或者50微摩(fmoles)(附圖31)。很值得注意的是，在任何這些實(shí)驗(yàn)中都無(wú)法探測(cè)到(-)鏈DNA，這表明地高辛標(biāo)記寡核苷酸的雜交以及隨后的發(fā)光細(xì)胞發(fā)射信號(hào)取決于目標(biāo)DNA上的序列。
溫度和緩沖液的組分影響著地高辛寡核苷酸(Dig-oligos)與目標(biāo)DNA的雜交。在47℃到51℃之間的溫度下，在PBS(附圖32A)或者TBS(附圖32B)中進(jìn)行的雜交都產(chǎn)生了最優(yōu)的應(yīng)答。高于或者低于該范圍溫度下的雜交都降低了信號(hào)的振幅。緩沖液中組分的變化將明顯的影響最理想的雜交溫度。
目標(biāo)DNA捕獲 生物素標(biāo)記的寡核苷酸被結(jié)合到有抗生蛋白鏈菌素涂覆的磁性珠和非磁性珠的表面上。這些“捕獲”寡核苷酸被設(shè)計(jì)成在一個(gè)位置孔中與目標(biāo)DNA結(jié)合，而不是與地高辛標(biāo)記的寡核苷酸在同一位置。在加入發(fā)光細(xì)胞之前將目標(biāo)DNA與一種沉降支撐物結(jié)合，能夠使DNA被更加廣泛的洗滌，并且提高試驗(yàn)的靈敏度。一種沉降目標(biāo)DNA的方法如附圖33所示。在這個(gè)示意圖中，一個(gè)生物素標(biāo)記的捕獲寡核苷酸可以與有抗生蛋白鏈霉素涂覆的聚苯乙烯或者磁性珠相連接。將地高辛配基標(biāo)記的寡核苷酸與目標(biāo)進(jìn)行雜交，將得到的雜交復(fù)合體利用離心或者使用磁性珠進(jìn)行沉降。然后，將發(fā)光細(xì)胞重新懸浮并使用磁性珠進(jìn)行沉降，并將反應(yīng)管置于光度計(jì)中。沉降對(duì)探測(cè)目標(biāo)DNA的影響如附圖34所示。在這種情況下，要將LOD提高到108數(shù)量級(jí)范圍，參照于DNA不發(fā)生沉降的典型數(shù)值。添加可購(gòu)買獲得的阻塞劑(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司，Cat#1 096 176)能夠進(jìn)一步加強(qiáng)信號(hào)。附圖35表示的是在雜交/捕獲過(guò)程中添加不同濃度的阻塞劑所產(chǎn)生的結(jié)果。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，添加1％到10％的阻塞劑能夠在任何目標(biāo)測(cè)試濃度下都能夠改善背景比率的信號(hào)。
Fc受體發(fā)光細(xì)胞 Fc受體是一個(gè)能結(jié)合抗體或者免疫復(fù)合體的膜表達(dá)蛋白的家族。它們能在一些例如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞這類的造血細(xì)胞中表達(dá)。一些存在的Fc受體的小類包括Fcγ受體I(FcγRI)，一種可溶性抗體的高親和性結(jié)合劑。FcγRI結(jié)合于免疫球蛋白G(IgG)的恒定區(qū)域(Fc部分)，而將抗體的抗原結(jié)合區(qū)域留出?？贵w結(jié)合型受體與特定抗原的交聯(lián)會(huì)激發(fā)信號(hào)途徑，從而刺激鈣的釋放。
人類巨噬細(xì)胞系U937中含有內(nèi)源性FcγRI。用IFNγ處理這類細(xì)胞能夠增強(qiáng)FcγRI的表達(dá)，正如附圖36A中所示。使用水母發(fā)光蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生功能性水母發(fā)光蛋白，正如使用鈣離子載體ionomycin處理細(xì)胞所證明的那樣。這會(huì)引起一個(gè)快速的、瞬時(shí)的鈣的增加，從而刺激水母發(fā)光蛋白發(fā)射光子，正如附圖36B中所示。接下來(lái)對(duì)U937進(jìn)行測(cè)試，以確定水母發(fā)光蛋白是否會(huì)被由Fc受體的交聯(lián)而引發(fā)的鈣的增加所刺激。在室溫下用人類IgG培養(yǎng)U937細(xì)胞15分鐘。洗滌除去細(xì)胞中未結(jié)合的IgG，然后用山羊抗人類IgG處理細(xì)胞。如附圖36C中所示，可以觀察到鈣的快速增加。
實(shí)驗(yàn)證明，U937細(xì)胞可以被“加工成”能迅速的應(yīng)答于幾種不同的病原體或類似物。用IFN(200ng/ml)處理U937細(xì)胞24小時(shí)，能夠增加內(nèi)源性FcγRI的表達(dá)，并為發(fā)光細(xì)胞試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。用下述抗體培養(yǎng)細(xì)胞鼠類抗炭疽桿菌孢子(附圖37A)，兔多克隆抗炭疽桿菌孢子(附圖37B)，鼠類抗土拉熱弗朗西絲氏菌(附圖37C)，或者鼠類抗枯草桿菌(附圖37D)。然后將細(xì)胞應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，在試驗(yàn)中，使用單克隆抗體探測(cè)1000cfu的炭疽桿菌孢子，使用兔多克隆體探測(cè)10000cfu的炭疽桿菌孢子，同樣的方法也應(yīng)用于探測(cè)10000cfu的土拉熱弗朗西絲氏菌以及1000cfu的枯草桿菌孢子。
接下來(lái)的一組實(shí)驗(yàn)證明，測(cè)驗(yàn)的特異性取決于使用的抗體。使用鼠類抗土拉熱弗朗西絲氏菌對(duì)U937細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并探測(cè)U937細(xì)胞對(duì)105cfu的炭疽桿菌孢子的應(yīng)答。如附圖38A所示，細(xì)胞對(duì)炭疽桿菌沒(méi)有應(yīng)答，但應(yīng)答于106cfu土拉熱弗朗西絲氏菌。相反的，加載了鼠類抗炭疽桿菌孢子抗體的細(xì)胞對(duì)土拉熱弗朗西絲氏菌沒(méi)有應(yīng)答，但應(yīng)答于106cfu炭疽桿菌孢子，如附圖38B中所示。而且，如附圖38C中所示，在抗土拉熱弗朗西絲氏菌抗體缺乏的狀態(tài)下，細(xì)胞絲毫沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)106cfu土拉熱弗朗西絲氏菌的應(yīng)答。
16通道傳感器實(shí)施例 已經(jīng)成功的測(cè)試出了一種能減少測(cè)量多種樣品(同時(shí)對(duì)硬件的要求最低)的時(shí)間的新的途徑。一個(gè)實(shí)驗(yàn)性的傳感器被設(shè)計(jì)成能通過(guò)單個(gè)的光收集通道來(lái)同時(shí)測(cè)量16種樣品。所述傳感器由一個(gè)能水平承載16根1.5ml的管的轉(zhuǎn)子構(gòu)成，這16根管平均分布在轉(zhuǎn)子的圓周上，由一個(gè)變速馬達(dá)驅(qū)動(dòng)，延垂直軸向轉(zhuǎn)動(dòng)(附圖39)。在轉(zhuǎn)子的平面上置有一個(gè)單獨(dú)固定的光子探測(cè)元件(在這個(gè)例子中，是一個(gè)PMT)，元件的位置剛好遠(yuǎn)于管子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)經(jīng)過(guò)的路徑。通過(guò)這種方式，每根管都能按順序的、重復(fù)的運(yùn)動(dòng)到密切接近PMT的位置，以便在每次經(jīng)過(guò)PMT時(shí)管內(nèi)發(fā)出的光都能被取樣。最后，使用一個(gè)光學(xué)轉(zhuǎn)換器來(lái)控制被探測(cè)光子的計(jì)數(shù)，這個(gè)光學(xué)轉(zhuǎn)換器由一個(gè)光源(一個(gè)紅外LED)和一個(gè)探測(cè)器(一個(gè)光電晶體管)構(gòu)成，并將得到的數(shù)據(jù)重新組織編入16個(gè)字段，每個(gè)字段對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定樣品。
一個(gè)測(cè)量過(guò)程由下列步驟組成 分別在不同的1.5ml管中準(zhǔn)備16種樣品(和/或?qū)φ瘴?， 向每個(gè)管中導(dǎo)入等量的發(fā)光細(xì)胞； 將管子放入置于一個(gè)暗箱中的轉(zhuǎn)子上， 在高RCF(～2000g)情況下短暫離心(5秒鐘)，使發(fā)光細(xì)胞定位于管底， 在測(cè)量過(guò)程中(1-2分鐘)降低轉(zhuǎn)動(dòng)速度至60rpm，每個(gè)管每秒鐘被取樣一次，并且 為每種樣品建立一個(gè)光子計(jì)數(shù)的時(shí)間序列，用來(lái)顯示和/或輸入到計(jì)算機(jī)運(yùn)算程序中以便用來(lái)評(píng)估。
附圖40是16通道測(cè)量數(shù)據(jù)的一個(gè)實(shí)施例，與單根管方法的數(shù)據(jù)相比顯示出LOD。由于這種16通道傳感器正如它被設(shè)計(jì)的那樣能測(cè)量16種樣品，通過(guò)增加通道數(shù)以便能夠測(cè)量更多數(shù)量的樣品也成為可能，盡管傳感器的尺寸和取樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)特性最終會(huì)限制實(shí)際的操作。類似的，可以通過(guò)減少放置在傳感器上的樣品的數(shù)量，或者通過(guò)減少傳感器上通道的數(shù)量，使測(cè)量較少數(shù)量的樣品成為可能。附圖41所示的是一個(gè)16通道便攜式傳感器設(shè)計(jì)的CAD圖。
這種16通道傳感器設(shè)計(jì)的另一個(gè)實(shí)施方案是被稱為T(mén)CAN的傳感器。這個(gè)TCAN(Triggered-CANARY)生物傳感器是一種自動(dòng)化生物傳感器，它將氣溶膠的收集和B細(xì)胞的運(yùn)送整合到一個(gè)放射狀圓盤(pán)形式。所述TCANCANARY圓盤(pán)(CD)(附圖42)上接合了一個(gè)管道，該管道能將空氣流分配到各個(gè)通道中。所述氣溶膠收集器(附圖43)利用干式撞擊技術(shù)將氣溶膠顆粒順著空氣流定位至空塑料管的底部。
當(dāng)氣溶膠顆粒完成撞擊以后，接合了管道的CD啟動(dòng)定位于圓盤(pán)上的電子管。圓盤(pán)快速旋轉(zhuǎn)，這使得發(fā)光細(xì)胞液體流在離心力的作用下依次被送入不同的管中(附圖44)。然后，根據(jù)能夠發(fā)射光子的發(fā)光細(xì)胞與氣溶膠顆粒之間的相互作用，使用一個(gè)光學(xué)探測(cè)器來(lái)識(shí)別可能存在的生物制劑。這個(gè)氣溶膠收集和發(fā)光細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程可以在一個(gè)圓盤(pán)中重復(fù)多次。這個(gè)特性使得能夠在不更換CD的情況下，在幾次觸發(fā)事件之下可以完成多個(gè)CANARY試驗(yàn)。
毒性探測(cè)實(shí)施例 可以使用多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的探測(cè)。例如，在一種方法中，將兩種抗體表達(dá)在同一個(gè)發(fā)光細(xì)胞中，其中兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)發(fā)光細(xì)胞的不同抗原決定簇。然后，將抗體與單體抗原交聯(lián)(附圖48)。應(yīng)當(dāng)指出的是，在分泌途徑中的抗體的種類在附圖48的示意中是被理想化了的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述抗體可以是雜和功能的(heterfunctional)，例如，一個(gè)抗體上可以含有兩個(gè)不同的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)抗體只能含有一個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)方法取決于兩個(gè)因素(1)多功能抗體在同一個(gè)發(fā)光細(xì)胞中表達(dá)，和(2)兩組相互連接的抗原決定簇足夠來(lái)刺激發(fā)光細(xì)胞(盡管這些組中不止一個(gè)可能被需要用來(lái)刺激一個(gè)給定細(xì)胞)。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，多功能抗體在同一個(gè)發(fā)光細(xì)胞系中表達(dá)(附圖49)。已經(jīng)產(chǎn)生了抗炭疽桿菌和鼠疫桿菌的單個(gè)細(xì)胞系表達(dá)抗體。這個(gè)克隆細(xì)胞系對(duì)抵抗兩種抗原都表現(xiàn)出很好的靈敏度?？梢岳斫猓槍?duì)同一個(gè)可溶性單體的兩個(gè)抗原決定簇的兩種抗體同樣可以被有效的表達(dá)。并且，兩個(gè)相互連接的抗原決定簇足夠來(lái)刺激發(fā)光細(xì)胞。
另一個(gè)探測(cè)可溶性單體抗原的方法是交聯(lián)該可溶性抗原，使其對(duì)發(fā)光細(xì)胞表現(xiàn)多價(jià)性(附圖50)。這種交聯(lián)可以通過(guò)將蛋白與珠接觸來(lái)完成，或者如果是重組蛋白的情況下，可以使用標(biāo)記，又或者利用抗體，如肉毒桿菌毒性Hc片段試驗(yàn)中證明的那樣。還有其他各種可能的方法，能有效的完成抗原的交聯(lián)，這些很容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，包括使用三氯乙酸(TCA)沉淀抗原，加熱或者使用乙醇，以及通過(guò)配合體、抗體或化學(xué)功能性基團(tuán)接觸所述抗原的方法。然后，可以使用發(fā)光細(xì)胞表達(dá)抗體探測(cè)交聯(lián)單體，所述抗體能夠識(shí)別交聯(lián)抗原上仍然可以結(jié)合的抗原決定簇。
這種方法已經(jīng)在實(shí)踐中被證明，使用肉毒桿菌毒性類型A(BoNT/A Hc)作為可溶性單體目標(biāo)蛋白(附圖51)，使用Pless等人在《傳染病與免疫學(xué)》(2001)570-574中的文章中所述的抗體。識(shí)別一個(gè)抗原決定簇的單克隆抗體(6E10-10)被交聯(lián)到G蛋白包被的珠上。將這些珠在4℃下用BoNT/A Hc培養(yǎng)3小時(shí)，洗滌，然后用其刺激發(fā)光細(xì)胞表達(dá)第二抗體(6B2-2)，所述第二抗體能識(shí)別一個(gè)不同的BoNT/A Hc抗原決定簇。被BoNT/A Hc修飾過(guò)的珠能夠有效刺激發(fā)光細(xì)胞，出現(xiàn)6ng的LOD。表達(dá)與幫助BoNT/A和珠結(jié)合的抗體相同的抗體的發(fā)光細(xì)胞不能被刺激，這表明發(fā)光反應(yīng)不是由目標(biāo)蛋白的聚積所引起的。
化學(xué)探測(cè)實(shí)施例 化學(xué)探測(cè)在軍事裝置和臨床裝置上都十分重要。某些化學(xué)物質(zhì)可能含有兩個(gè)抗原決定簇，可供抗體分別的結(jié)合。在這種情形下，化學(xué)探測(cè)方法應(yīng)該與前述概括的毒性探測(cè)方法一樣。然而，在很多情況下，在感興趣的化學(xué)物質(zhì)上不存在兩個(gè)各自獨(dú)立的抗原決定簇。在這種情形下，有必要對(duì)所述化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行修飾，使其可以刺激發(fā)光細(xì)胞。下述概括了四種不同的修飾方法 將感興趣的化學(xué)物質(zhì)固定于一個(gè)固體支持物上。制備發(fā)光細(xì)胞表達(dá)抗體，該抗體能夠識(shí)別所述化學(xué)物質(zhì)上仍然可以結(jié)合的部位。當(dāng)所述固定于固體支持物上的化學(xué)物質(zhì)的密度足夠高時(shí)，發(fā)光細(xì)胞表面的抗體會(huì)被固定的與彼此足夠近，以便刺激細(xì)胞。這個(gè)方法類似于附圖50中所示的毒性探測(cè)的方法。
首先，制備能夠特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的肽(肽鏈)。接著，制備能夠特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合體的抗體。如果該化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合體有兩個(gè)或兩個(gè)以上抗原決定簇，該復(fù)合體可以由在毒性探測(cè)部分描述過(guò)的兩種抗體任意之一的技術(shù)進(jìn)行探測(cè)。如果該復(fù)合體只有一個(gè)特異性抗原決定簇，那么，可以使用一個(gè)額外的抗原決定簇，例如地高辛配基，與肽合成(附圖52)，那么，所述復(fù)合體就包含兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)了，分別是(1)由肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合體形成的抗原決定簇，以及(2)地高辛配基抗原決定簇。只有在化學(xué)物質(zhì)存在的情況下兩個(gè)抗原決定簇才存在。隨后，這兩個(gè)抗原決定簇可以由在毒性探測(cè)部分描述過(guò)的兩種抗體任意之一的技術(shù)進(jìn)行探測(cè)。
制備兩種能特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的肽(或者是在化學(xué)物質(zhì)的存在下能互相結(jié)合的肽)。每種肽都可以被合成標(biāo)記，只有在化學(xué)物質(zhì)存在的情況下，兩個(gè)抗原決定簇才能互相結(jié)合，因此可以被發(fā)光細(xì)胞探測(cè)到(附圖53)?；蛘?，可以提供能針對(duì)肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合體的一種或者多種抗體，然后，使用針對(duì)該復(fù)合體的抗原的組合，或者一種針對(duì)復(fù)合體的抗原和一種針對(duì)肽標(biāo)記的抗原的組合，來(lái)探測(cè)上述化學(xué)物質(zhì)的存在。
如上所述，制備能夠特異性結(jié)合化學(xué)物質(zhì)的肽(肽鏈)，并且制備能特異性結(jié)合肽-化學(xué)物質(zhì)復(fù)合體的抗體。對(duì)所述與化學(xué)物質(zhì)結(jié)合的肽進(jìn)行二聚，如此以來(lái)，如果得到的二聚物結(jié)合兩種化學(xué)物質(zhì)，它就會(huì)含有兩個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)復(fù)合體可以由能夠表達(dá)針對(duì)化學(xué)物質(zhì)-肽復(fù)合體的抗體的發(fā)光細(xì)胞來(lái)進(jìn)行探測(cè)。
將與小分子結(jié)合的肽從組合文庫(kù)中分離出來(lái)。這些分子包括卟啉(Nakamura等人在《生物傳感器和生物電子學(xué)》2001，161095-1100中的文章所描述)、色氨酸(Sugimoto等人1999，677-678中的文章所描述)和鎘(Mejare等人在《蛋白質(zhì)工程》1998，11(6).489-494中的文章所描述)。然而，使用蛋白質(zhì)代替肽能夠獲得更高親和力的結(jié)合體。已經(jīng)建立了文庫(kù)，在所述文庫(kù)中對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了組合定義，這些被組合定義的結(jié)合位點(diǎn)可以被用來(lái)分離與小分子結(jié)合了的位點(diǎn)。像這樣使用lipocalin作為起始蛋白的文庫(kù)可以被用來(lái)分離能結(jié)合地高辛配基變體的結(jié)合體(Schlehuber和Skerra在《生物物理化學(xué)》96213-228，2002中的文章有所描述)?？梢允褂迷S多其他的蛋白作為起始蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)該方法，但是那些已經(jīng)對(duì)目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)具有某種結(jié)合活性的蛋白可能是尤其希望的(例如，乙酰膽堿酯酶，在針對(duì)VX和沙林病毒的情況下)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，雖然本發(fā)明僅對(duì)優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)的表示和說(shuō)明，但在不背離本發(fā)明主旨的情況下的各種形式上和細(xì)節(jié)上的改變都應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，在從屬權(quán)利要求中被包括。
這里引用的所有文獻(xiàn)、專利及專利申請(qǐng)文件的相關(guān)教導(dǎo)在此全部結(jié)合作為參考。
序列表
<110>麻省理工學(xué)院
埃里克·D·施沃貝爾
詹姆斯·D·哈柏
瑪莎·S·皮特羅維基
弗郎西絲·E·納吉
托德·H·瑞德
克里斯汀尼·E·霍根
理查德·H·馬修思
約瑟夫·萊西瑞格諾拉
馬克·漢尼斯
特瑞那·R.·維安
羅斯·M·約瑟夫
雷蒙德·尤塔羅
柏利省·沙安
伯納德特·約翰遜
馬克·A·霍利斯
<120>光電子探測(cè)系統(tǒng)
<130>0050.2068014
<150>11/001,583
<151>2004-12-01
<150>10/467,242
<151>2004-01-16
<150>PCT/US02/03606
<151>2002-02-06
<150>60/266,977
<151>2001-02-07
<160>11
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>1
gcaacgttgt tgccatt 17
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>2
tacaggcatc gtggtgt 17
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>3
gctcgtcgtt tggtatgg 18
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>4
tcattcaget ccggttc 17
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>5
acgatcaagg cgagttac 18
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>6
gatcccccat gttgtgc 17
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>7
aaagcggtta gctccttc 18
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>8
tcctccgatc gttgtca 17
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>9
gtaagttggc cgcagtg 17
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>10
tcactcatgg ttatggca 18
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>11
ccataccaaa cgacgagc 18
權(quán)利要求
1.一種探測(cè)樣品中的核酸序列的方法，包括下述步驟
a)在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下使樣品與至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合，
b)加入發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)或一個(gè)以上受體，這些受體與抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，同時(shí)，作為這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的應(yīng)答，產(chǎn)生能發(fā)射光子的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的核酸序列。
2.一種探測(cè)樣品中的核酸序列的方法，包括下述步驟
a)在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下使樣品與至少一個(gè)抗原結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合，
b)加入發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)或一個(gè)以上受體，這些受體與抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，同時(shí)，作為這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的應(yīng)答，產(chǎn)生能發(fā)射光子的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的核酸序列。
3.一種探測(cè)樣品中的核酸序列的方法，包括下述步驟
a)結(jié)合i)待測(cè)樣品，ii)至少一種與被探測(cè)的核酸序列相互補(bǔ)的抗原結(jié)合的寡核苷酸，和iii)一種固體底物，它含有至少一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸與結(jié)合于底物上的核酸序列互補(bǔ)，在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸及結(jié)合于底物的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下，獲得包含雜交了至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸的核酸序列的固體底物，
b)向包含雜交了至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸的核酸序列的固體底物中添加發(fā)光細(xì)胞，所述發(fā)光細(xì)胞包含一個(gè)或一個(gè)以上受體，這些受體與抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，其中一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述的發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，和
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的核酸序列。
4.一種探測(cè)樣品中的核酸序列的方法，包括下述步驟
a)在適宜抗原結(jié)合的寡核苷酸與核酸序列雜交的條件下使樣品與至少一種抗原結(jié)合的寡核苷酸結(jié)合，以獲得一種抗原結(jié)合型雜交復(fù)合體，
b)添加一個(gè)或一個(gè)以上與抗原結(jié)合型雜交復(fù)合體中的抗原有特異性的抗體；
c)添加包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，其中Fc受體與一個(gè)或一個(gè)以上抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且其中所述的發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
d)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒。
5.一種探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒的方法，包括下述步驟
a)將樣品與下述物質(zhì)結(jié)合i)與目標(biāo)顆粒有特異性的抗體；ii)包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
b)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒。
6.一種探測(cè)樣品中的可溶性抗原的方法，包括下述步驟
a)將樣品與下述物質(zhì)結(jié)合i)一個(gè)或一個(gè)以上能與可溶性抗原的兩個(gè)不同抗原決定簇結(jié)合的抗體；ii)包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與一個(gè)或一個(gè)以上抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
b)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒。
7.一種利用光子探測(cè)器來(lái)探測(cè)眾多樣品中的目標(biāo)顆粒的光電子傳感裝置，它包括
a)具有多個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載眾多樣品的轉(zhuǎn)子，
b)一個(gè)或一個(gè)以上含有下述混合物的樣品i)用于探測(cè)目標(biāo)顆粒的樣品；和ii)含有能接受目標(biāo)顆粒受體的細(xì)胞，其中所述受體與目標(biāo)顆粒的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)定位于一種位置上的光子探測(cè)器，用以探測(cè)在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)置于其上的一個(gè)或一個(gè)以上樣品發(fā)射出的光子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的光電子傳感裝置，其中所述的轉(zhuǎn)子包含16個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載16種樣品。
9.一種利用光子探測(cè)器來(lái)探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上樣品中的目標(biāo)顆粒的光電子傳感裝置，它包括
a)具有多個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載眾多樣品的轉(zhuǎn)子，
b)一個(gè)或一個(gè)以上含有下述混合物的樣品i)用于探測(cè)目標(biāo)顆粒的樣品；和ii)對(duì)目標(biāo)顆粒有特異性的抗體；和iii)包含F(xiàn)c受體的發(fā)光細(xì)胞，所述Fc受體與抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)定位于一個(gè)位置上的光子探測(cè)器，用以探測(cè)在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)置于其上的一個(gè)或一個(gè)以上樣品發(fā)射出的光子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的光電子傳感裝置，其中所述的轉(zhuǎn)子包含16個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載16種樣品。
11.一種利用光子探測(cè)器來(lái)探測(cè)一個(gè)或一個(gè)以上樣品中的核酸序列的光電子傳感裝置，它包括
a)具有多個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載眾多樣品的轉(zhuǎn)子，
b)一個(gè)或一個(gè)以上含有下述混合物的樣品i)用于探測(cè)核酸序列的樣品；ii)至少一個(gè)與該核酸序列雜交的抗原結(jié)合的寡核苷酸；和iii)包含一個(gè)或一個(gè)以上受體的發(fā)光細(xì)胞，其中所述受體與雜交了核酸序列的抗原結(jié)合的寡核苷酸的抗原相結(jié)合，并且所述一個(gè)或一個(gè)以上受體與抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)定位于一個(gè)位置上的光子探測(cè)器，用以探測(cè)在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)置于其上的一個(gè)或一個(gè)以上樣品發(fā)射出的光子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的光電子傳感裝置，其中所述的轉(zhuǎn)子包含16個(gè)位點(diǎn)來(lái)承載16種樣品。
13.一種探測(cè)樣品中的可溶性抗原的方法，包括下述步驟
a)將樣品與含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體的發(fā)光細(xì)胞混合，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上抗體與可溶性抗原的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合，并且該可溶性抗原與一個(gè)或一個(gè)以上抗體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
b)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中可溶性抗原是蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中可溶性抗原是化學(xué)制劑。
16.一種探測(cè)樣品中的可溶性抗原的方法，包括下述步驟
a)交聯(lián)該可溶性抗原，從而獲得交聯(lián)抗原，
b)將含有抗體的發(fā)光細(xì)胞與所述交聯(lián)抗原結(jié)合，其中所述抗體與該交聯(lián)抗原相結(jié)合，并且抗體與交聯(lián)抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
17.一種探測(cè)樣品中的可溶性抗原的方法，包括下述步驟
a)將可溶性抗原與一種固體底物交聯(lián)，從而獲得結(jié)合于固體底物的交聯(lián)可溶性抗原，
b)向結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原中添加發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含結(jié)合了該可溶性抗原的抗原決定簇的抗體，并且該抗體與結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中可溶性抗原是蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中可溶性抗原是化學(xué)制劑。
20.一種探測(cè)樣品中的可溶性抗原的方法，包括下述步驟
a)將樣品與一種固體底物混合，該固體底物包含一種與可溶性抗原的第一抗原決定簇結(jié)合的第一抗體，從而獲得一種結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原，
b)向結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原中添加發(fā)光細(xì)胞，其中所述發(fā)光細(xì)胞包含一種與可溶性抗原的第二抗原決定簇結(jié)合的第二抗體，并且該第二抗體與結(jié)合了固體底物的交聯(lián)可溶性抗原的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的可溶性抗原。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中可溶性抗原是蛋白質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中可溶性抗原是化學(xué)制劑。
23.一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟
a)將該化學(xué)制劑與肽混合，從而獲得該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體，
b)添加含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體的發(fā)光細(xì)胞，其中所述一個(gè)或一個(gè)以上抗體與該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體中的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合，并且一個(gè)或一個(gè)以上抗體與化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
24.一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟
a)將該化學(xué)制劑與肽混合，從而獲得一種化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體，
b)交聯(lián)該化學(xué)制劑-肽的復(fù)合體，從而獲得化學(xué)制劑-肽的交聯(lián)復(fù)合體，
c)將化學(xué)制劑-肽的交聯(lián)復(fù)合體與發(fā)光細(xì)胞混合，所述發(fā)光細(xì)胞含有一種與該化學(xué)制劑-肽交聯(lián)復(fù)合體相結(jié)合的抗體，這種抗體與化學(xué)制劑-肽交聯(lián)復(fù)合體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
d)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
25.一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟
a)將該化學(xué)制劑與一種抗原結(jié)合肽結(jié)合，從而獲得一種化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的復(fù)合體，
b)添加發(fā)光細(xì)胞，該發(fā)光細(xì)胞含有一個(gè)或一個(gè)以上抗體，這些抗體與該化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽復(fù)合體的兩個(gè)不同的抗原決定簇相結(jié)合，這種一個(gè)或一個(gè)以上抗體與化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽復(fù)合體的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
c)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
26.一種探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑的方法，包括下述步驟
a)將該化學(xué)制劑與一種抗原結(jié)合肽結(jié)合，從而獲得一種化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的復(fù)合體，
b)交聯(lián)該化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的復(fù)合體，從而獲得一種化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽的交聯(lián)復(fù)合體，
c)添加發(fā)光細(xì)胞，該發(fā)光細(xì)胞含有一種抗體，該抗體與該化學(xué)制劑-抗原結(jié)合肽交聯(lián)復(fù)合體相結(jié)合，這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，且所述發(fā)光細(xì)胞進(jìn)一步包含能發(fā)射光子以應(yīng)答這種細(xì)胞內(nèi)鈣增加的發(fā)光分子，
d)測(cè)量從發(fā)光細(xì)胞中發(fā)射的光子，從而探測(cè)樣品中的化學(xué)制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種探測(cè)可溶性抗原的方法。特別的，提供了一種探測(cè)可溶性蛋白質(zhì)和化學(xué)制劑的方法。此外，本發(fā)明還提供了一種探測(cè)樣品中核酸序列的方法，還描述了一種包含F(xiàn)c受體和發(fā)光分子的發(fā)光細(xì)胞，用以探測(cè)樣品中的目標(biāo)顆粒，其中被探測(cè)的目標(biāo)顆粒與一個(gè)或一個(gè)以上抗體結(jié)合。本發(fā)明還提供了一種用于探測(cè)眾多樣品中的目標(biāo)顆粒的光電子傳感裝置。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101111605SQ200580047362
公開(kāi)日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日
發(fā)明者埃里克·D·施沃貝爾, 詹姆斯·D·哈柏, 瑪莎·S·皮特羅維基, 弗郎西絲·E·納吉, 托德·H·瑞德, 克里斯汀尼·E·霍根, 理查德·H·馬修思, 約瑟夫·萊西瑞格諾拉, 馬克·漢尼斯, 特瑞那·R.·維安, 羅斯·M·約瑟夫, 雷蒙德·尤塔羅, 柏利省·沙安, 馬克·A·霍利斯, 伯納德特·約翰遜 申請(qǐng)人:麻省理工學(xué)院