專利名稱：：用于檢測甲基化dna的試劑盒和方法用于檢測曱基化DNA的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與含有甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括步驟(d)通過測序分析所檢測的甲基化DNA。本發(fā)明的另一方面是用于根據(jù)本發(fā)明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。產(chǎn)生所有活的生物的細胞的信息包含在它們的DNA中。DNA由簡寫為G、A、T和C的四種威基組成并iU象非常長的梯子一樣構(gòu)造，這些字母對組成梯子的每個"橫檔"。字母G與C配對，A與T配對。這些對的字符串將信息像編碼的信息一樣儲存，組成分組為區(qū)域的特定分子的信息稱作基因。二倍體動物的每個細胞含有每個基因的兩個拷貝，每個基因的一個拷貝來自母親并且一個拷貝來自父親。(該規(guī)則的唯一例外是染色體上決定生物發(fā)育成"雄性"還是"雌性"的基因)。DNA曱基化和基因調(diào)節(jié)除了"拼出"我們的基因組的四種^-腺噪呤、鳥噪呤、胞嘧啶和胸腺嘧咬之外，還存在第五種堿基，其通過復制后DNA的修飾產(chǎn)生.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)可以催化甲基從甲基供體S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧咬環(huán)的轉(zhuǎn)移，并從而產(chǎn)生堿基5-甲基胞嘧啶。特定胞嘧啶殘基在哺乳動物中被修飾，所述胞嘧啶殘基在DNA序列中鳥噪呤殘基之前(CpG二核苷酸)(Singal，Blood93(1999)，4059-4070);Robertson,Nat.Rev.Genet.1(2000)，11-19;Ng，Curr.Opin.Genet.Dev.(2000)，158-163;Razin，EMBOJ.17(1998),4905-4卯8)。CpG二核苷酸的甲基化通常與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)并且可能導致大部分非編碼基因組和潛在可能的序列如轉(zhuǎn)座子、重復或者病毒插入片段不轉(zhuǎn)錄這一事實。有趣的是CpG二核苷酸在基因組中分布非常不均(Singal(1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)?；蚪M的大部分含有比統(tǒng)計預期的少得多的CpG。這可能是由于5-甲基胞嘧啶比較容易地脫氨成胸苷，其在進化過程中導致CpG二核苷酸的數(shù)目相對減少。然而，再次，有更多數(shù)目的CpG分布在基因組中，即所稱作的CpG烏。這些區(qū)域通常含有轉(zhuǎn)錄起始點和基因啟動子并且通常不甲基化，相比之下，CpG不與CpG島有關(guān)。在正常細胞中，CpG島的甲基化僅在罕見的病例中觀察到，如雌性細胞的x染色體的第二個拷貝和親本印記基因組的失活(Singal(1999),在上述引文中，Robertson(2000),在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。DNA曱差〃化的調(diào)節(jié)僅僅部分理解DNA甲基化模式怎樣在胚胎發(fā)生過程中建立起來和CpG甲基化怎樣在基因組中保持和受到調(diào)節(jié)(Singal(1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。在哺乳動物物種中，已知有三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、3a和3b)，其催化DNA甲基化過程.然而，必須澄清每種DNMT對于CpG甲基化的維持和調(diào)節(jié)所做貢獻的對應份額。然而，所有三種酶顯然對于胚胎發(fā)生都是必需的，對應的敲除小鼠在子宮內(nèi)(inutero)死亡或者出生后不久死亡(Bestor，Hum.Mol.Genet.9(2000)，2395-2402;ElOsta，Bioessays25(2003)，1071-1084)。同時已經(jīng)幾次顯示了DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾和某些組蛋白修飾之間的聯(lián)系。DNA的甲基化多數(shù)與組蛋白脫乙酰作用和組蛋白H3的賴氨酸9殘基的甲基化相關(guān)(Sims，TrendsGenet.19(2003)，629-639，F(xiàn)ahrner，CancerRes.62(2002)，7213-7218)。因此，DNMT與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HDACs)或者攜阻抑物復合體有關(guān)。還幾乎不知道甲基是怎樣從CpG殘基除去的。在增殖細胞中，DNA甲基化還可能在復制期間4皮動地發(fā)生。然而，也有在有絲分裂后細胞中DNA甲基化的實例，其可以通過存在活性的迄今還未知的脫甲基酶來解釋(Wo附e，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)，5894-5896)。CpG甲基化和基因沉默啟動子(但不是非調(diào)節(jié)序列)的甲基化與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄阻抑相關(guān)(Shigal(1999)，在上述引文中，Ng(2000),在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。5-甲基胞嘧啶的阻抑性質(zhì)可以通過兩種機制介導。首先，DNA甲基化可以直接損害轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。第二種可能性(其可能造成最大部分的阻抑)是甲基-CpG-結(jié)合蛋白(MBPs)的募集(Ballestar，Eur.J.Biochem.268(2001)，1-6)。MBP如MECP2或MBD2(MeCPl復合體的組分)伴隨著協(xié)阻抑物復合體和HDAC,其具有阻抑效果并且負責轉(zhuǎn)錄因子不能接近的稠密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(異染色質(zhì))的形成(Ballestar(2001)，在上述引文中)。腫瘤發(fā)生中的外遺傳改變正越來越清楚的是腫瘤的形成不僅受到遺傳損傷(例如，突變或者易位)而且受到外遺傳改變的支持。異常的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或者DNA甲基化可以影響癌基因或者腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)并且可以促進肺瘤生長。DNA甲基化的改變包括正常甲基化序列中甲基化的損失(低甲基化)或者正常的未甲基化序列的甲基化(超曱基化)(Roberston(2000)，在上述引文中，Herman,N.Engl.J.Med.349(2003)，2042-2054;Momparler,Oncogene22(2003)，6479-6483;Esteller,Science297(2002)，1807-1808;Plass,Hum.Mol.Genet11(2002)，2479-2488)。低甲基化已經(jīng)對幾乎所有類型的腫瘤描述了總體DNA低甲基化，在腫瘤組織中，5-甲基胞嘧啶的含量與正常組織相比降低，甲基化事件的主#額在染色體的重復衛(wèi)星序列或者著絲粒區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。然而，在單個情況中，還已經(jīng)描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的去甲基化和活化(Costello，J.Med.Genet.38(2001)，285-303)。超甲基化或者CpG島CpG島通常發(fā)揮基因調(diào)節(jié)功能。這是為什么甲基化狀態(tài)的改變最直接地與有關(guān)基因座的轉(zhuǎn)錄活性的改變相關(guān)的原因(Robertson(1999);Herman(2003);Esteller(2002);Momparler(2003);Plass(2002)，所有都在上述引文中)。多數(shù)CpG島以未甲基化形式存在于正常細胞中。然而，在一些情況下，CpG島也可以在基因調(diào)節(jié)事件中被甲基化。雌性細胞的失活的X染色體的CpG島的多l(xiāng)fcA例如甲基化的(Goto，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998)，362-378)。CpG島還可以在正常的衰老過程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol.109(2003)，103-108)。尤其在腫瘤中，通常不甲基化的CpG島可以以超甲基化形式存在。在許多情況中，受到超甲基化影響的基因編碼抵消腫瘤的生長的蛋白質(zhì)，如腫瘤抑制基因。下表列出了基因的實例，可以表明這些基因在腫瘤中通過超甲基化的外遺傳的機制被失活。表腫瘤中超甲基化基因(實例)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>腫瘤特異性超甲基化的理由幾乎未知。有趣的是，某些種類的腫瘤似乎具有它們自身的超甲基化鐠，可以在更大的比較研究中表明超甲基化不是均勻分布的而是它依賴于腫瘤發(fā)生。在白血病的情況中，與例如結(jié)腸癌或者神經(jīng)膠質(zhì)瘤相比，多數(shù)其他基因是超甲基化的。從而，超甲基化可以用于對胖瘤分類(Esteller,CancerRes.61(2001)，3225-3229;Costello，Nat.Genet.24(2000)，132-138)。在許多情況中，超甲基化還與HDAC的升高的活性組合。用脫甲基化物質(zhì)(例如，5-氮胞苷)治療后，僅在也用HDAC抑制劑(如曲古抑菌素A(TSA))后才可以活化許多甲基化的基因(Suzuki,Nat.Genet.31(2002)，141-149;Ghoshal，Mol.Cell.Biol.22(2002)，8302-8319;Kalebic，Ann.N.Y.Acad.Sci983(2003)，278-285)。多數(shù)分析提示DNA甲基化^^優(yōu)勢抑制并且它不能通過用HDAC抑制劑如TSA治療而逆轉(zhuǎn)TSA(Suzuki(2002);Ghoshal(2002)，在上述引文中)。然而，最近指出，已經(jīng)用于臨床的一種HDAC抑制劑丙戊酸鹽可以導致DNA的脫甲基作用(Detich,J.Biol.Chem.278(2003)，27586-27592)。然而，迄今還沒有在這方面進行系統(tǒng)的分析，逆轉(zhuǎn)外遺傳改變的臨床方法盡管癌癥的遺傳原因(例如，突變)是不可逆的，但是對肺瘤發(fā)生產(chǎn)生影響的外遺傳改變可能是可逆的。從而，外遺傳改變的可能的治療提供了用于治療瘤形成的療法的新的可能性(Herman(2003);Momparler(2003);Plass(2002),all在上述引文中；Leone，Clin.Immunol.109(2003)，89-102;Claus，Oncogene22(2003)，6489-6496)。20多年前，5-氮雜胞苷已經(jīng)被開發(fā)為抗腫瘤藥物并且在不知該物質(zhì)的分子作用的情況下使用。現(xiàn)在，它已經(jīng)以進一步開發(fā)的形式(脫氧-5-氮雜胞苷，脫氧氮雜胞苷)用于治療骨髄增生異常綜合征和繼發(fā)性白血病(Leone(2003)，在上述引文中；Lyons,Curr.Opin.Investig.Drugs4(2003)，1442-1450;Issa，Curr.Opin.Oncol.15(2003)，446-451)。由于體外，見察到同作用，當前，在世界范圍內(nèi)進行先導研究，組合使用兩類物質(zhì)(Kalebic(2003);Claus(2003)，在上述引文中；Gagnon，AnticancerDrugs14(2003)，193-202;Shaker,Leuk.Res.27(2003)，437-444)。用于分析CpG甲差^化的檢測方法用于分析基因組CpG甲基化的檢測方法的開發(fā)具有重要性，這是由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CpG甲基化模式的改變可以與諸如癌癥的疾病有關(guān)。當前，存在已知的用于檢測已知基因座的CpG甲基化的技術(shù)(Dahl，Biogerontology4(2003)，233-250)。允許分析基因組中CpG甲基化的方法還較不成熟。在下文中，概述了用于分析CpG甲基化的最常見方法以及它們的主要應用領(lǐng)域。甲基化敏感性限制酶用于檢測CpG甲基化用細菌限制性內(nèi)切核酸酶的同切點酶確定特定CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)，所述同切點酶的特征是對5-甲基胞嘧啶的不同的敏感性。它的實例是酶H/wII和M^I-都切割CCGG序列，然而H/wII僅在內(nèi)部胞嘧啶不被甲基化時切割。一些測定法基于甲基化敏感性限制酶的使用，所述測定法用于分析個體基因和分析整個基因組中的CpG曱基化。甲基化敏感性限制性消化片段多數(shù)通過限制性位點側(cè)翼區(qū)域的DNA印跡或者基因組PCR來檢測(Dahl(2003),在上述引文中)。迄今已經(jīng)發(fā)表的在基因組中CpG甲基化的所有分析都使用甲基化敏感性限制酶作為該方法的成分。例如，限制性標記的基因組掃描(RLGS)(Costello,Methods27(2002)，144-149)使用一種二維瓊脂糖凝膠電泳，其中每一維用不同的甲基化敏感性限制酶消化以鑒定兩個DNA群體中CpG甲基化的身份差異。甲基化CpG島擴增(MCA)富集具有甲基化S/mil限制性位點的片段并且使用LM-PCR富集所述片段。此類擴增產(chǎn)物已經(jīng)通過代表性差別分析(RDA)(Smith,GenomeRes.13(2003)，558國569)或者CpG島微陣列(Yan，CancerRes.6(2001)，8375-8380)成功地分才斤。對于基因組中CpG甲基化的分析，基于甲基化敏感性限制酶的所有測定法都具有缺點。為了以最佳的方法進行測定，必須保證完成所有限制性消化。最大的缺點是分析僅僅提供已經(jīng)被所用的甲基化敏感性限制酶識別的胞嘧啶殘基的甲基化狀態(tài)。限制酶的選擇自動地限制了可檢測的序列的數(shù)目-因此對CpG甲基化的中立分析是不可能。用于分析CpG甲基化的亞硫酸氫鹽處理用亞硫酸氬鈉處理雙鏈基因組DNA導致未甲基化的胞嘧啶殘基脫氨成尿嗜啶殘基和形成不再互補的兩條單鏈。在該處理期間，5-甲基胞嘧啶保持不變.以這種方式產(chǎn)生的序列差異形成甲基化和未甲基化DNA之間區(qū)別的絲(Frommer,Proc.Natl.Acad.Sci.889(1992)，1827-1831)。用亞硫酸氫鹽處理的DNA可以直接用于PCR中，其中尿嘧啶殘基(以前為未甲基化的胞嘧咬)和胸苷殘基作為胸苷擴增并且僅僅5-甲基胞嘧啶殘基擴增為胞嘧啶殘基。取決于應用，用于PCR的引物在甲基化和未甲基化的序列之間分化或者獨立于甲基化狀態(tài)擴增片段。已經(jīng)使用非區(qū)別性引物擴增的PCR片段可以例如直接測序以確定甲基化和未甲基化CpG中的份額。其他方法利用此類PCR片段的物理差異(解鏈行為、單鏈構(gòu)象、限制酶的限制性位點，等等)用于確定甲基化程度(DahI(2003)，在上述引文中)。允許高通量甲基化分析的其他方法利用序列中的不同，通過有識別力的引物或者探針進行甲基化和未甲基化序列的特異擴增(甲基化特異性PCR，methylightPCR)(Dahl(2003)，在上述引文中)。通過甲基化特異性寡核苷酸(MSO)微陣列也可以發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物序列中的亞硫酸氫鹽誘導的差異(Shi，J.Cell.Biochem.88(2003)，138-143;Adorjan，NucleicAcidRes.30(2002)，e21;Gitan，GenomeRes.12(2002)，158-164)。與甲基化敏感性限制酶相比，用亞硫酸氫鹽處理的DNA可以提供關(guān)于所擴增的基因組片段中一些CpG殘基的甲基化狀態(tài)的信息。然而，使用有識別力的引物或者探針對CpG曱基化的檢測局限于單個(或者幾個)胞嘧啶殘基的甲基化狀態(tài)。所以，現(xiàn)有技術(shù)的適于單個基因座的高通量甲基化分析的所有當前已知的測定法提供的信息局限于目的基因內(nèi)一個或者但^僅幾個CpG殘基。用于檢測CpG甲基化的其他方法識別變性的單鏈DNA中CpG甲基化的針對5-甲基胞嘧啶的抗體主要用于個體固定化細胞的染色體上CpG甲基化的免疫組織化學染色。在1994年，A.Bird的實驗室已經(jīng)開發(fā)了通過親和層析富集甲基化DNA片段的方法(Gross，Nat.Genet.6(1994)，236-244)。結(jié)合基質(zhì)的重組MECP2用于結(jié)合甲基化的DNA。自此該技術(shù)已經(jīng)被其他工作小組使用、改進和與其他技術(shù)組合使用(Shiraishi，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)，2913-2918;Brock，NucleicAcid.Res.29(2001)，E123)。強烈或較不強烈的甲基化基因組序列與親和基質(zhì)的結(jié)合依賴于鹽濃度，該鹽濃度使得可能分離具有密集曱基化的CpG島與具有較低甲基化密度的其他序列.該親和層析的缺點是需要大量基因組DNA(50-100嗎)和相對耗時的步驟。考慮到前面的，顯然CpG二核苷酸的甲基化是控制細胞的轉(zhuǎn)錄活性的重要的外遺傳機制。通常，CpG二核苷酸的甲基化與轉(zhuǎn)錄失活相關(guān)。然而，在正?；蛲嘶姆只^程中，基因座的甲基化模式可以改變。因此，在腫瘤發(fā)生期間正常甲基化模式的逆轉(zhuǎn)可以導致基因如肺瘤抑制基因或者癌基因的異常阻抑(或者活化)，并從而導致腫瘤發(fā)生。所以，CpG甲基化DNA的檢測和誤調(diào)節(jié)的腫瘤抑制基因和/或癌基因的鑒定是最具臨床重要性的。如上面提到的，現(xiàn)有技術(shù)描述了檢測甲基化DNA的不同方法，然而，其存在某些缺點。現(xiàn)有技術(shù)的方法可能不適于高通量應用或者不能可靠地檢測CpG甲基化的DNA，尤其如果分析的目標是少量DNA時。從而，仍然需要其他檢測曱基化DNA的手段和方法，它們可以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足。因此，本發(fā)明下面的技術(shù)問題是滿足上述需要.通過提供權(quán)利要求中描述的實施方案解決了該技術(shù)問題。因此，在第一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測曱基化DNA的體外方法，其包括(a)將容器用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被；(b)將所述多肽與包含甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。如所附權(quán)利要求書中記載的，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)單管測^/體外方法可以安全和可靠地用于檢測甲基化的核酸分子，尤其CpG甲基化的DNA分子/DNA片段。所述方法的優(yōu)點是它對優(yōu)選甲基化DNA的快速、靈敏和可靠現(xiàn)有技^M目比，本文提供的方法不需要亞硫酸氬鹽處理或者甲基化敏感性限制并且不限于檢測單個/幾個CpG殘基。提供的信息可以實際上比現(xiàn)有技術(shù)的其他方法的信息更相關(guān)，因為鄰近啟動子的甲基化密度可以與該區(qū)域內(nèi)單個CpG殘基的甲基化狀態(tài)相比與基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)更好地相關(guān)。因此，在本文中提供了"單管"測定法，其中可以相對于(基因組)輸入DNA的PCR反應估計甲基化程度。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的均勻包被的容器優(yōu)選地促進了能夠結(jié)合甲基化DNA并且根據(jù)本文描述的方法使用的多肽對于曱基化DNA具有最大結(jié)合能力。容器的均勻包被可以通過本領(lǐng)域已知的方法并且優(yōu)選通過本文描述和/或所附實施例中本發(fā)明的方法實現(xiàn)。此外，通過本領(lǐng)域已知的方法如考馬斯藍染色可以控制均勻包被。術(shù)語"容器"包括通常使用和/或適于科學和/或診斷目的的任何容器。優(yōu)選地，所述容器由下面的材料組成聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯等等，更優(yōu)選地，它由聚碳酸酯組成。還優(yōu)選聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯或者聚碳酸酯是熱循環(huán)似目容的，即它優(yōu)選在不同溫度下不同的時間間隔內(nèi)是熱穩(wěn)定的和/或耐用的。此外，優(yōu)選聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯或者聚碳酸酯對于與本發(fā)明方法聯(lián)用的化學和/或生物學試劑是惰性的。迄今為止，可包被的PCR管僅僅用于免疫-聚合酶鏈式反應(免疫畫PCR)(Sano，Science258(1992);Adler，BiochemBiophysResCommun.308(2003),240-250)。免疫-PCR是一種抗原檢測系統(tǒng)，其中特定DNA分子用作標記物。對于生物素和免疫球蛋白G具有緊密的和特異性結(jié)合親和性的鏈霉抗生物素蛋白-蛋白A嵌合體用于將生物素化的DNA特異附著到固定在微量滴定板孔上的抗原-單克隆抗體復合體。然后，通過PCR擴增所附DNA的區(qū)段。免疫-PCR與常規(guī)ELISA技術(shù)相當并且使用夾層方法與更靈敏的檢測系統(tǒng)(標記DNA的PCR檢測)。從而，與本發(fā)明(其中DNA是直接檢測目標)相比，免疫-PCR使用DNA作為檢測抗原的手段(標記物)。術(shù)語"包被，，指容器的表面優(yōu)選完全用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被，從而在所述容器的表面的每個區(qū)域中存在基^M目同量的所述多肽。此類結(jié)合多肽的實例在下文中給出并且尤其和優(yōu)選地包含屬于甲基-DNA結(jié)合蛋白(MBD)家族的多肽，最優(yōu)選雙功能多肽，其包含屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBDs)的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分。所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在下文描述。任選地，所述雙功能多肽包含在下文描述的多肽接頭。因此，所述雙功能多肽優(yōu)選地由SEQIDNO:2(圖7)中顯示的^J^酸序列扇^征，其由SEQIDNO:l(圖7)中顯示的核苷酸序列編碼。術(shù)語"能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽，，包括可以結(jié)合如本文描述的甲基化DNA的任一種多肽。結(jié)合甲基化DNA的能力可以通過本領(lǐng)域中已知的方法測試。術(shù)語"多肽，，當在本文中使用時指可互換使用并且包含給定長度的M酸鏈的肽、蛋白質(zhì)或者多肽，其中4^酸殘^t過共價肽鏈連接。然而，本發(fā)明還包括此類蛋白質(zhì)/多肽的Jlb^擬物(p印ticIoinimetics)，其中氨基酸和/或肽鍵已經(jīng)被功能類似物以及其他20種基因編碼的M酸之外的氨基酸如硒代半胱氨酸替代。肽、寡肽和蛋白質(zhì)可以稱作多肽。如所提到的，術(shù)語多肽和蛋白質(zhì)通常在本文中可互換使用。術(shù)語多肽還指并且不排除多肽的修飾。修飾包括糖基化、乙酰化、酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、酰胺化、共價連接黃素、共價連接血紅素部分、共價連接核苷酸或者核苷酸衍生物、共價連接脂類或者脂類衍生物、共價連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基作用、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、formulation,y^化、糖基化、GPI錨形成、鞋基化、捵化、曱基化、豆蔻?；⒀趸?、加入聚乙二醇、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、竭化、磷酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導的氨基酸向蛋白質(zhì)的加入，如精氨跣化，和遍在蛋白化；見例如，PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993);POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson,Ed"AcademicPress,NewYork(1983)，pgs.1-12;Seifter，Meth.Enzymol.182(19卯)；626-646,Rattan,Ann.NYAcad.Sci.663(1992);48-62。優(yōu)選地，術(shù)語"多肽"包括能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽。所述術(shù)語還包括能夠結(jié)合甲基化DNA的雙功能多肽并且它包括抗曱基化DNA抗體，此類多Wt本文中描述并且用于本發(fā)明的方法中檢測甲基化DNA。"雙功能多肽，，指這樣的多肽，由于抗體的Fc部分是所述雙功能多肽的部分，該多肽除了結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選結(jié)合CpG甲基化DNA外還具有其他能力。例如，所述Fc部分優(yōu)選賦予將化合物或者部分綴合、連接或者共價偶聯(lián)所述Fc部分的可能性。本文使用的術(shù)語"共價偶聯(lián)的"指特定化合物或者部分直接共價相互結(jié)合；或者通過一個或多個間插部分，如橋、間隔臂或者一個或多個連接部分間接共價結(jié)合.此外，所述Fc部分可以用于將所述雙功能多肽偶聯(lián)到容器，如本文所述。優(yōu)選的雙功能多肽通過SEQIDNO:2(圖7)中顯示的#^酸序列^￡。進一步優(yōu)選的雙功能多肽在下文描述。不被理論束繂，認為包含甲基化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分的新生的雙功能多肽在宿主細胞內(nèi)折疊，從而優(yōu)選地，兩個多肽以與抗體的恒定區(qū)類似或優(yōu)選相同的方式連接在它們的Fc部分，得到如本文描述的雙功能多肽。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，所述雙功能多肽，優(yōu)選具有抗體樣蛋白質(zhì)的行為的雙功能多肽可以優(yōu)選以抗體樣方式結(jié)合CpG甲基化的DNA。這意味著，雙功能多肽對它的"抗原"具有高親和力和高親合力，所述抗原優(yōu)選是甲基化的DNA，其優(yōu)選在CpG二核苷酸處甲基化。再次，不被理論束繂，在本發(fā)明方法中使用的用于檢測甲基化DNA的雙功能多Jfe寸它的"抗原，，的高親和力和親合力由所述雙功能多肽的獨特結(jié)構(gòu)引起。這是因為，假定恒定區(qū)在所述雙功能多肽的兩個多肽分子的每個的恒定區(qū)的免疫球蛋白重鏈之間形成二疏鍵。因此，優(yōu)選形成抗體樣結(jié)構(gòu)，其與抗體的結(jié)構(gòu)非常相像。此外，不被理論束綽，認為該抗體樣結(jié)構(gòu)增加例如用于本發(fā)明方法中檢測甲基化DNA的雙功能多肽的穩(wěn)定性.這是因為，在本領(lǐng)域中描述，與抗體的恒定區(qū)融合的蛋白質(zhì)可以賦予所述蛋白質(zhì)更高的穩(wěn)定性和更長的半壽期。此外，認為恒定區(qū)的分子間相互作用導致的抗體樣結(jié)構(gòu)使用于本發(fā)明方法中檢測甲基化DNA的雙功能多肽的一個多肽的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與用于本發(fā)明方法中的另一多肽的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域密切接近，這允許甲基-DNA結(jié)合蛋白和甲基化DNA之間的二價相互作用.因此，本文描述的雙功能多肽優(yōu)選能夠通過作為所述雙功能多肽的部分的兩個甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到它的抗原。雙功能多肽的高親和力結(jié)合尤其還通過優(yōu)選使用蛋白質(zhì)的甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)，而不是使用含有與其他蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域的全長甲基DNA結(jié)合蛋白質(zhì)實現(xiàn)，所述全長甲基DNA結(jié)合蛋白質(zhì)可能擾亂或者干擾如本文描述的獨特適用性，已知甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是結(jié)合未甲基化的DNA。此外，認為甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選使用保證實際上結(jié)合曱基化的DNA，因為檢測是直接而不是間接的。多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)方法僅可以通過PCR間接檢測甲基化的DNA。這些性質(zhì)賦予優(yōu)選的雙功能多肽為可靠的和容易應用的診斷工具，其可以用于本發(fā)明的方法中檢測甲基化DNA。然而，它還可以用于分離、純化、富集甲基化DNA的方法中，即使所述DNA僅以極少量存在，例如，如本文所述的約多于10ng、少于10ng、少于7.5ng、少于5ng、少于2.5ng、少于1000pg、少于500pg、少于250pg或少于約150pg。因此，由于它的抗體樣結(jié)構(gòu)，本文描述的雙功能多肽是穩(wěn)固的分子，使得它可應用于例如多種應用，包括單管測定法中的多步步驟，如本文和所附實施例所述。術(shù)語"接觸"包括導致如本文描述的能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽與包含甲基化和/或非甲基化DNA的樣品接觸的任何技術(shù)。優(yōu)選地，所述包含甲基化和/或非甲基化DNA的樣品通過移液步驟優(yōu)選轉(zhuǎn)移到容器中，該容器用本文描述的能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被。用于檢測甲基化DNA的本發(fā)明方法的另一優(yōu)點是容器、優(yōu)選PCR管被包被后，甲基化的DNA可以被能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽優(yōu)選在40-50分鐘內(nèi)結(jié)合。優(yōu)選應用的隨后洗滌步驟僅需要優(yōu)選約5分鐘，其使得本文描述的檢測甲基化DNA的方法是快速和穩(wěn)健的方法，該方法可以以高通量形式運行，其可以任選自動化。術(shù)語"檢測"包括適于檢測甲基化DNA的任一種技術(shù)。在優(yōu)選實施方案中，通過限制酶消化、亞疏酸氫鹽測序、焦磷酸測序(pyrosequencing)或者DNA印跡可以檢測被能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽結(jié)合的甲基化DNA。然而，甲基化DNA的檢測不限于前述方法，而是包括本領(lǐng)域中已知的用于檢測甲基化DNA的所有其他合適的方法，如RDA、微陣列等等。術(shù)語"甲基化DNA"優(yōu)選包括甲基化DNA，更優(yōu)選地，CpG甲基化DNA，包括半甲基化DNA或者在兩#^上甲基化的DNA或者單鏈甲基化DNA。最重要的實例是甲基化的胞嘧啶，其主要在二核苷酸CpG背景中和CpNpG-和CpNpN-序列的背景中發(fā)生。然而，原則上，其他天然存在的二核苷酸也可以被甲基化。在備選且優(yōu)選的實施方案中，通過擴增技術(shù)，優(yōu)選PCR，例如，常規(guī)或者實時PCR，包括單一或多路常規(guī)或者實時PCR，優(yōu)選使用基因特異性引物，檢測被能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽結(jié)合的甲基化DNA。術(shù)語"擴增技術(shù)"指允許產(chǎn)生多種同一或者基本同一(例如，至少95%或者更優(yōu)選至少98%，甚至更優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少99.5%，如99.9%同一)的核酸分子或者其部分。此類方法在本領(lǐng)域中是成熟的；見Sambrook等人"MolecularCloning,ALaboratoryManual",第二版1989，CSHPress,ColdSpringHarbor。多種PCR技術(shù)，包括實時PCR例如由Ding,J.Biochem.Mol.Biol.37(2004)，1-10綜述。如上文提到的，多種擴增方法是本領(lǐng)域中已知的，它們預期都可以用于檢測被本文描述的能夠結(jié)合本發(fā)明方法中曱基化DNA的多肽結(jié)合的甲基化DNA。優(yōu)選通過PCR實現(xiàn)步驟(c)中的檢測。PCR是用于在短時間內(nèi)通,板的反復復制擴增DNA數(shù)百萬倍的強大的技術(shù)。該方法利用幾組特異的體外合成的寡核苷酸引發(fā)DNA合成。引物的設(shè)計取決于希望分析的DNA的序列。已知引物的長度由不同參數(shù)決定(Gillam(1979),Gene8，81-97;I加is(1990)，PCRProtocols:Aguidetomethodsandapplications,AcademicPress,SanDiego，USA),優(yōu)選地，引物將僅雜交或者結(jié)合^L^苦酸序列的特定區(qū)域。在統(tǒng)計學上僅與耙核苷酸序列的一個區(qū)域雜交的引物的長度可以通過下式計算C/4)x(其中x是引物的長度)。例如，七或者八核苷酸將足以在統(tǒng)計學上僅結(jié)合37kb的序列一次。然而，已知與互補模;tl給清確匹配的引物必須長為至少9個4^對，否則不能產(chǎn)生穩(wěn)定的雙鏈(Goulian(1973)，Biochemistry12，2893-2901),還設(shè)想基于計算機的算法可以用于設(shè)計能夠擴增本發(fā)明的核酸分子的引物。優(yōu)選地，本發(fā)明的引物長為至少10個核苷酸，更優(yōu)選長為至少12個核苷酸，甚至更優(yōu)選長為至少15個核苷酸，尤其優(yōu)選長為至少18個核苷酸，甚至更優(yōu)選長為至少20個核苷酸，最優(yōu)選長為至少25個核苷酸。然而，本發(fā)明還可以用更短或者更長的引物進行。通過許多輪(通常20-50)的在高溫下解M^板，讓引物與模板內(nèi)的互補序列退火然后用DNA聚合酶復制該模板，進行PCR技術(shù)。該方法已經(jīng)用從生長在海洋或者溫泉中的熱出口的細菌分離的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶自動化。在第一輪復制期間，一個拷貝的DNA轉(zhuǎn)化成兩個拷貝等等，導致引物靶定的序列的拷貝數(shù)的指數(shù)增加。M20輪后，DNA的一個拷貝就被擴增2,000,000倍。在優(yōu)選實施方案中，上述方法還包括步驟(d):分析能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽結(jié)合的DNA。該分析優(yōu)選通過測序進行。所述測序優(yōu)選通過本領(lǐng)域中已知的方法進行，如才艮據(jù)Sanger方法(Proc.Natl.Acad.Sci.74(1977)，5463-5467)使用熒光雙脫氧核普酸進行自動化雙脫氧測序。對于自動化測序，根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法并且優(yōu)選根據(jù)用于制備所述DNA用于測序的試劑盒的使用說明書制備將被測序的DNA。在詳細描述本發(fā)明前，將理解本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、方案、細菌、栽體和試劑等等，因為它們可以改變。還將理解本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不意在限制本發(fā)明的范圍，其僅僅受到所附權(quán)利要求的限制。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學數(shù)據(jù)具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。優(yōu)選地，本文4吏用的術(shù)語如"Amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(IUPACRecommendations)",Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和K61bl，H.eds.(1995)，HelveticaChimicaActa,CH-4010Basel,Switzerland)中描述的定義。在該說明書和下面的權(quán)利要求書全文中，除非上下文需要相反的意思，單詞"包含，，和變型如"包括，，將理解為暗含包括所述的整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟，但是不排除任何其他整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟。必須指出如本文和所附權(quán)利要求書中所用的，單數(shù)形式"一種"、"這種"包括復數(shù)引用，除非上下文清楚地指出相反意思。從而例如，對"一種試劑"的引用包括一種或多種此類不同的試劑，并且對"這種方法"的引用包括引用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的等同步驟和方法，其可以修飾或者替代本文描述的方法。CpG島經(jīng)常含有啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點并且通常在正常細胞中是未甲基化的。CpG島的甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。在癌癥中，CpG島啟動子的甲基化導致腫瘤抑制基因的異常沉默，促進疾病的發(fā)病。如上面提到的，現(xiàn)有技術(shù)描述了檢測甲基化候選基因的不同方法，然而這些方法存在某些缺點。例如，現(xiàn)有技術(shù)的高通量方法可以局限于檢測單個/幾個CpG殘基或者可能不能可靠地檢測CpG甲基化的DNA，尤其如果僅僅少量DNA可以用于分析時。為了允許快速和靈敏g測候選基因的CpG甲基化程度，本發(fā)明提供了允許檢測CpG甲基化而不應用例如甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶或者亞石克酸氫鹽處理的手段和方法。除了上文提到的關(guān)于本發(fā)明用于檢測甲基化DNA的方法的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)外，還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)甲基化DNA和/或其片段與容器、優(yōu)選PCR管的相對小的表面的結(jié)合足以優(yōu)選ilM^測甲基化和/或甲基化DNA和/或其片段的復雜混合物內(nèi)單個基因座。因此，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選地用于檢測甲基化DNA的稱作甲基-結(jié)合(MB)-PCR的單管測定法是可靠和容易應用的診斷工具，尤其用于分離、純化、富集和/或優(yōu)選檢測甲基化DNA，即使所述DNA僅以極少量，如本文所述的約多于10ng、少于IOng、少于7,5ng、少于5ng、少于2.5ng、少于1000pg、少于500pg、少于250pg或少于約150pg的量存在。使用本文描述的方法和試劑盒，可能在例如多種樣品中產(chǎn)生人癌癥中的單個或多個基因座的甲基化譜。簡言之，本發(fā)明的用于檢測甲基化DNA的方法的優(yōu)選實施方案是MB-PCR，其可以如下工作將對于甲基化DNA尤其CpG甲基化DNA優(yōu)選具有高親和力的蛋白質(zhì)包被到優(yōu)選PCR-循環(huán)儀相容的反應容器、優(yōu)選管的孔上并用于優(yōu)選從基因組DNA混合物選擇性捕獲甲基化DNA和/或DNA片段。使用PCR(標準PCR或者實時PCR，單一或者多路)，可以在相同的容器中檢測特定DNA和/或DNA片段(例如，特定基因的CpG島啟動子)的保留。可以相對于基因組輸出DNA的PCR反應估計甲基化程度。從而，本發(fā)明提供了一種快速、簡單、可靠、穩(wěn)健和非常靈敏的技術(shù)，其允許檢測甲基化DNA，尤其來自有限樣品的腫瘤組織或者腫瘤細胞的甲基化DNA。在圖1A中顯示了優(yōu)選的診斷應用，其使用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽。圖1B顯示了優(yōu)選的診斷應用，其利用能夠結(jié)合如本文描述的CpG甲基化DNA的雙功能多肽。簡言之，在第一步中，優(yōu)選將甲基-CpG^結(jié)合多肽加入到可包被的PCR容器，例如來自Nunc的TopYieldStrips中。這樣，該多肽優(yōu)選通過本領(lǐng)域已知和本文描述的技術(shù)包被的所述容器的內(nèi)表面。在下一步中，向包被的PCR容器中加入封閉試劑，例如，約5%奶粉。在另一步中，優(yōu)選將目的DNA片段(例如，甲基化和/或未甲基化DNA片段(圖1A和B中使用的術(shù)語"CpG-甲基化低"包含并且尤其指未甲基化的DNA)加入包被和封閉的PCR容器中。認為甲基-CpG-結(jié)合多肽特異結(jié)合甲基化DNA(如果存在)。在下一步中溫育優(yōu)選含有DNA片段的經(jīng)包被和封閉的PCR容器，然后洗滌以除去未結(jié)合的DNA片段。之后，將PCR混合物加入以優(yōu)選地運行實時PCR或者常規(guī)PCR，接著通過凝膠電泳來分離擴增產(chǎn)物，所述PCR混合物優(yōu)選包括基因特異引物或者，而且也優(yōu)選的至少2、3、4、5、6、7種等等對的引物，其用于懷疑被甲基化或者未被甲基化的目的基因或基因座的多路PCR。任選地，可以如圖1A或者1B所示為"P-反應"的進行對照反應，其在下文描述。MB-PCR的優(yōu)選的詳細方案如下優(yōu)選地，使用熱穩(wěn)定的T叩Yield，Strips(NuncCat.No.248卯9)制備PCR管。優(yōu)選地，向每管加入50jil本文描述的多肽，優(yōu)選曱基-CpG"結(jié)合多肽(在10mMTris/HClpH7.5中以15jig/ml稀釋)并在4。C過夜溫育.優(yōu)選地，將孔用200nlTBS(20mMTris，pH7.4含有170mMNaCl)洗滌三次并優(yōu)選在室溫下用100pi封閉溶液(10mMTris，pH7.5含有170mMNaCl，5%脫脂奶粉，5mMEDTA和1jig/ml每種聚d(I/C)，聚d(A/T)和聚d(CG))洗滌三次。優(yōu)選地，將管用200|iUTBST(TBS，含有0.05%Tween-20)洗滌三次。優(yōu)選地，向每孔加入50jil結(jié)合緩沖液(20mMTris，pH7.5，含有400mMNaCl，2mMMgCl2，0.5mMEDTA，和0.05%Tween畫20)，并優(yōu)選向每第二個孔加入2jil消化的DNA，優(yōu)選用Msel消化的基因組DNA，其量優(yōu)選為5ng/jil(M-反應)。優(yōu)選通過本領(lǐng)域已知的試劑盒，例如，使用BloodandCellCultureMidiKit(Qiagen)制備基因組DNA。優(yōu)選通過瓊脂糖^^電'^M^制基因組DNA制備物的質(zhì)量，并優(yōu)選通過UV分光光度法測定DNA濃度。優(yōu)選使用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)進行DNA的定量。將含有本文描述的多肽和DNA,優(yōu)選DNA片段(通過酶促消化或者機械斷裂產(chǎn)生)的孔在振蕩器上優(yōu)選在室溫下溫育優(yōu)選40-50分鐘。優(yōu)選地，將管用200nl結(jié)合緩沖液(BindingBuffer)洗滌兩次并用10mMTris/HClpH8.0洗滌一次。接著，優(yōu)選直接在TopYieldTMStrips中進行PCR。優(yōu)選地，PCR-Mix(50nl/孔)，優(yōu)選PCRMasterMix(Promega)含有10pmol每種基因特異性引物(由Metabion合成)。在實施例中給出了目的特異基因的引物序列和循環(huán)參數(shù)。當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計任何其他合適的基因特異性或者基因座特異性或者多個基因座特異性引物。此外，技術(shù)人員可以容易確定和/或測試最適合引物和基因、一個或多個目的基因座的PCR參數(shù)。加入PCR混合物后，優(yōu)選將1MseI-消化的DNA(優(yōu)選5ng/jd的量)加入每第二個孔，其以前不與DNA片段溫育(P-反應)。優(yōu)選地，使用瓊脂糖;^電泳分析PCR產(chǎn)物并使用例如Typhoon9200Imager(Amersham/Pharmacia)掃描溴化乙錠染色的剿歐。任選地，如圖IA或IB中顯示為"P反應"的進行對照反應，其在下文中詳述。因此，設(shè)想本發(fā)明的方法可用于檢測甲基化DNA，優(yōu)選地下文中描述的樣品中CpG甲基化DNA，所述樣品可以包括一個或多個單個細胞。還設(shè)想可用于完整細胞。"完整細胞，，指完整單個細胞的基因組背景。在下文中，描述了能夠結(jié)合甲基化DNA的優(yōu)選的多肽。因此，用于本發(fā)明方法中檢測甲基化DNA的多肽優(yōu)選選自(a)屬于甲基-DNA結(jié)合蛋白(MBD)家族的多肽；(b)(a)的多肽的片段，其中所述片段能夠結(jié)合甲基化DNA;(c)(a)的多肽或者(b)的片段的變體，其中與(a)的多肽或者(b)的片段相比，在所述變體中，一個或多個殘基被替代，并且其中所述變體能夠結(jié)合甲基化DNA;(d)多肽，其是抗甲基化DNA抗體或者其片段；和(e)多肽，其與(a)到(c)任一項的多肽至少70%同一并且能夠結(jié)合甲基化的DNA。當然，設(shè)想本文描述的能夠檢測甲基化DNA的多肽由核酸分子編碼。術(shù)語"核酸分子"當用于本文時包括任一核酸分子，其具有包含噪呤和嘧啶堿基的核苷酸序列，所述>^^被所述核酸分子包含，其中所ii^代表核酸分子的一級結(jié)構(gòu)。核酸序列包括有義和反義鏈的DNA、cDNA、基因組DNA、RNA、合成形式，例如，PNA和混合的聚合物，或者可以含有非天然或者衍生的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解。編碼能夠結(jié)合甲基化DNA并且用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選由任何多核糖核苷酸或者多脫氧核糖核普酸組成，其可以是未經(jīng)修飾的RNA或者DNA或者經(jīng)修飾的RNA或者DNA。例如，多核苷酸可以由單鏈和雙鏈DNA、為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA和為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的RNA、包含可以為單鏈或更典型地雙鏈或者單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA和RNA的雜交分子組成。此外，多核苷酸可以由包含RNA或者DNA或者RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)組成。多核苷酸還可以含有一個或多個經(jīng)修飾的^或者為了穩(wěn)定性或者其他原因經(jīng)修飾的DNA或者RNA主鏈。"經(jīng)修飾的，，堿基包括例如，三苯甲基化威基和稀有a如次黃嘌呤?？梢詫NA和RNA做出多種修飾；從而術(shù)語"核酸分子"包括化學、S^或者代謝修飾的形式。在備選的但是也優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法的能夠結(jié)合甲基化DNA的雙功能多肽(例如，用于本文提供的方法和試劑盒中的MBD蛋白質(zhì))由核酸分子編碼，該核酸分子包含上文所述的本發(fā)明的核苷酸序列，其選自(a)具有SEQIDNO:l(圖7)中顯示的核苷酸序列的核酸序列；(b)具有編碼SEQID:NO2(圖7)中顯示的M酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸序列；(c)具有編碼具有SEQID:NO2(圖7)中顯示的M酸序列的多肽的片段的核普酸序列的核酸序列，其中所述片段包含所述多肽的至少氨基酸130到361，并且能夠結(jié)合甲基化的DNA;(d)核酸序列，其具有編碼(a)到(c)任一項的多核苷酸編碼的多肽的變體的核苷酸序列，其中在所述變體中，一個或多個氨基酸殘基與所述多JiM目比,皮替代，并且所述變體能夠結(jié)合甲基化的DNA;(e)具有核苷酸序列的核酸序列，所述核苷酸序列與(a)到(d)任一項的核酸序列雜交并且與(a)的核酸分子的核苷酸序列至少65%同一并且編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(f)核酸分子，其編碼與(b)的核酸分子編碼的多肽至少65%同一并且能夠結(jié)合曱基化DNA的多肽；和(g)核酸序列，其具有作為(a)到(f)任一項的多核苷酸的核苷酸序列的簡并序列的核苷酸序列；或者這種多核苷酸的互補鏈。因此，上面的實施方案例如涉及"MBD-Fc"分子在本文提供的試劑盒和方法中的用途。如上文所述，用于本發(fā)明方法中檢測甲基化DNA的具有SEQID:NO2(圖7)中所示M酸序列的雙功能多肽的片段包含SEQID:NO2(圖7)中所示M酸序列的至少氨基酸130到361。這意味著除了代表Fc部分的氨基酸130到361外，所述片段還可以包含一個或多個氨基酸，從而所述片段能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA。因此，設(shè)想所述片段更優(yōu)選地包含SEQID:NO2(圖7)中所示M酸序列的至少氨基酸116到361。甚至更優(yōu)選地，所述片段可以包含SEQID:NO2(圖7)中所示#^,列的至少M酸29到115和130到361。在最優(yōu)選的實施方案中，所述片段可以包含至少氨基酸29到361。通常優(yōu)選本文描述的多肽的片段能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA。該能力可以通過本領(lǐng)域中已知的方法或者優(yōu)選通過所附實施例中描述的那些方法測試。本發(fā)明優(yōu)選還涉及方法，其中使用與編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽的核酸序列雜交的核酸序列。所述雜交核酸編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽此夕卜，在本發(fā)明的方法中，使用與如本文描述的(圖7)SEQIDNO:1中顯示的序列或者其片段或變體雜交并且與SEQIDNO:l(圖7)中顯示的核酸序列至少65%同一并且優(yōu)選編碼能夠結(jié)合甲基化DNA,優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA的多肽的雙功能多肽的核酸，其中所述多肽用于本發(fā)明的方法中檢測甲基化DNA。此夕卜，本發(fā)明優(yōu)選涉及方法，其中使用編碼多肽的核酸序列，所述多肽與本文描述的能夠結(jié)合曱基化DNA的多肽至少65。/。，更優(yōu)選70%、75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選99%同一。還優(yōu)選設(shè)想在本發(fā)明的方法中，使用的多肽與SEQIDNO:2中顯示的多肽至少65%,更優(yōu)選70%、75%、80%、85%、90%,更優(yōu)選99%同一。根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語"雜交，，優(yōu)選涉及在嚴M件下雜交。術(shù)語"雜交序列"優(yōu)選指與上文所述的編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽或者能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未曱基化的DNA的雙功能多肽具有至少65%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少70%，尤其優(yōu)選至少80%，更尤其優(yōu)選至少90%,甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%、98%或99%的同一性，其中所述能夠結(jié)合甲差L化DNA的多肽或者所述雙功能多肽用于本發(fā)明的方法中檢測甲基化DNA?？梢愿鶕?jù)如在Sambrook，Russell"MolecularCloning,ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(2001);Ausubel，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",GreenPublishingAssociatesandWHeyInterscience，N.Y.(1989)，或Higgins和Hames(Eds.)"Nucleicacidhybridization,apracticalapproach"IRLPressOxford,WashingtonDC,(1985)中描述的常規(guī)方案建立所述雜交條件。條件的設(shè)置在技術(shù)人員能力范圍內(nèi)并且可以根據(jù)本領(lǐng)域描述的方案確定。從而，僅特異雜交序列的檢測將通常要求嚴^^ff和洗滌務ff，如65。C下0.1xSSC，0.1%SDS。用于檢測同源的或者非準確互補序列的非嚴格雜交條件可以設(shè)置為65°C下6xSSC，l%SDS。如/>知的，探針長度和將確定的核酸的組成構(gòu)成了雜交條件的其他^。注意到上述條件的變化可以通過包括和/或替代用于抑制雜交實驗中背景的備選封閉試劑來完成。典型的封閉試劑包括Denhardt試劑、BLOTTO、肝素、變性鮭精DNA,和可商購的專利制劑。由于與相容性相關(guān)的問題，特定封閉試劑的包括可以需要修飾上述雜交條件。雜交核酸分子還包含上述分子的片段。此類片段可以代表如本文所述的核酸序列。此外，與上述核酸分子的任一種雜交的核酸分子還包括這些分子的互補片段、衍生物和等位基因變體。此外，雜交復合體指通it^互補的G和C4^之間和互補的A和T>^之間形成氫鍵，在兩條核酸序列之間形成的復合體；這些氬鍵可以通it4^基堆積作用進一步穩(wěn)定化。兩條互補的核酸序列以反平行構(gòu)型以氬鍵結(jié)合.雜交復合體可以在溶液(例如，Cot或Rot分析)中形成或者在溶液中存在的一種核酸序列和固相支持體(例如，膜、濾器、芯片、針、或者載玻片，其上已經(jīng)固定例如細胞)上固定的另一種核酸序列之間形成。術(shù)語互補的或者互補性指在堿基配對許可的鹽和溫度條件下，多核苷酸的天然結(jié)合。例如，序列"A-G-T，，結(jié)合互補序列"T-C-A"。兩個單鏈分子之間的互補性可以是"部分的，，，其中僅一些核酸結(jié)合，或者當兩個單鏈分子之間存在完全互補性時，結(jié)合可以是完全的。核酸鏈之間互補性程度對于核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著影響。這在擴增反應中尤其重要，其取決于核酸鏈之間的結(jié)合。此外，本發(fā)明還涉及方法，其使用核酸分子，所述核酸分子的序列與上述核酸分子的序列相比是簡并的，其中所述簡并的核酸分子編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽或者編碼如本文描述并且用于本發(fā)明方法中檢測甲基化DNA的的雙功能多肽。當根據(jù)本發(fā)明使用時，術(shù)語"遺傳密碼簡并產(chǎn)物"指由于遺傳密碼冗余性，不同的核苷酸序列編碼相同的氨基酸。當然，本發(fā)明還設(shè)想上文和下面提到的核酸分子的互#^(如果它們可以為單鏈形式)。優(yōu)選地，編碼能夠結(jié)合甲基化DNA或者能夠結(jié)合甲基化DNA的雙功能多肽并且用于本發(fā)明方法中的核酸分子可以是任何類型的核酸，例如，DNA、基因組DNA、cDNA、RNA或者PNA(肽核酸)。對于本發(fā)明，肽核酸(PNA)是聚酰胺類型的DNA類似物并且腺嘌呤、鳥噪呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的單體形式可以通過商業(yè)途徑獲得(PerceptiveBiosystems)。DNA的某些成分，如磷、磷氧化物或者脫氧核糖衍生物不存在于PNA中。如Nielsen等人，Science254:1497(1991);和Egholm等人，Nature365:666(1993)公開的，PNA特異并且緊密結(jié)合互補的DNA鏈并且不被核酸酶降解。實際上，PNA比DNA自身更強烈地結(jié)合DNA。這可能是因為兩條鏈之間沒有靜電排斥，并且聚酰胺主鏈更有柔性.為此，PNA/DNA雙鏈體比DNA/DNA雙鏈體在更寬的嚴4MHf下結(jié)合，使得它更容易進行多路雜交。由于強烈結(jié)合，可以使用比使用DNA更小的探針。此外，用PNA/DNA雜交更可能確定單個^a^錯配，因為PNA/DNA15聚體中的單個錯配降低解鏈溫度(TJ8。-20。C，相比DNA/DNA15聚體雙鏈體降低解鏈溫度4。-16。C。而且，PNA中不存在帶電基團意味著雜交可以在低離子強度下進行并且在分析期間減小可能的鹽的干擾.DNA可以例如是基因組DNA或者cDNA。RNA可以是例如mRNA。核酸分子可以是天然的、合成的或者半合成的，或者它可以是衍生物，如肽核酸(Nielsen，Science254(1991)，1497-1500)或者硫代磷酸酯。此外，核酸分子可以是重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子，其包含單獨或者組合的前述核酸分子的任一種，編碼本文所述的用于本發(fā)明方法中檢測甲基化DNA的多肽的核酸分子被設(shè)想包含在栽體(例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒、嗟菌體)中，該載體可以轉(zhuǎn)化到宿主細胞(原核或者真核細胞)中，從而產(chǎn)生用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明的多肽。用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明的多肽可以通過孩史生物學方法或者通過轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生。還設(shè)想從轉(zhuǎn)基因植物回M發(fā)明的多肽。備選地，可以合成或者半合成地產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。例如，可以使用化學合成，如HoughtonProc.Natl.Acad.Sci.USA(82)(1985)，5131-5135所述的固相方法。另一種方法是mRNA的體外翻譯。優(yōu)選的方法涉及在上述宿主細胞中重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)。例如，包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的任一種的全部或者部分的核酸序列可以通過PCR合成，插入到表達栽體中，并用該表達栽體轉(zhuǎn)化宿主細胞。之后，培養(yǎng)宿主細胞以產(chǎn)生目的多肽，將其分離或者純化?？梢酝ㄟ^幾種已知的技術(shù)的任一種實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離和純化；所述技術(shù)為例如但不限于，離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析、高壓液相層析(HPLC)、反向HPLC、制備性圓盤凝膠電泳。此外，無細胞的翻譯系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。根據(jù)本發(fā)明使用的合適的無細胞表達系統(tǒng)包括兔網(wǎng)織紅細胞裂解物、麥胚抽提物、犬胰臟,體膜、；^桿菌S30提取物，和偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，如TNT-系統(tǒng)(Promega)。這些系統(tǒng)允許在加入含有編碼區(qū)和合適的啟動子元件的克隆栽體、DNA片段或者RNA序列時表達重組多肽或者肽。如上文提到的，蛋白質(zhì)分離/純化技術(shù)可以需要用常規(guī)方法修飾本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，可以將組蛋白標簽加到蛋白質(zhì)以允許在DMi上純化。其他修飾可以導致更高或者更低的活性，允許更高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，或者簡化蛋白質(zhì)的純化。產(chǎn)生用于本發(fā)明方法的多肽后，它可以通過加入聚乙二醇、衍生等等修彿，術(shù)語"屬于甲基-DNA結(jié)合蛋白(MBD)的多肽"包括優(yōu)選具有MBD家所述MBD家族包括蛋白質(zhì)MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4。所述術(shù)語還包括具有結(jié)合甲基化DNA的能力的多肽，其包括針對甲基化DNA產(chǎn)生的抗體。優(yōu)選地，所述抗體是抗-5-甲基半胱氨酸抗體或者其片段。優(yōu)選地，所述片段是Fab、F(ab，)2、Fv或scFv片段?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法檢測甲基-DNA結(jié)合活性。優(yōu)選本文描述的多肽作為本文別處描述的單體或者二聚體或者多價分子結(jié)合甲基化的DNA。它優(yōu)選能夠結(jié)合高度甲基化的DNA或者低甲基化的DNA。優(yōu)選地，它可以結(jié)合單個甲基化的CpG對。MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4組成了共有甲基-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的脊推動物蛋白質(zhì)家族。MBD蛋白質(zhì)家族包含基于已知的MBD的序列的兩個亞組。MBD4的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與MeCP2的在一級結(jié)構(gòu)上最相似，而MBD1、MBD2和MBD3的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互之間比與MBD4或者MeCP2更相似。然而，基于在MeCP2、MBDl、MBD2、MBD3和MBD4的所有5種基因內(nèi)的保守位置上存在內(nèi)含子，每種蛋白質(zhì)內(nèi)的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域似乎在進化上相關(guān)。然而，MBD家族的成員之間的序列相似性很大程度上局限于它們的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，盡管MBD2和MBD3是相似的并且在大部分它們的長度上共有約70>%的總同一性。最大的分歧發(fā)生在C-末端，其中MBD3具有12個連續(xù)谷氨酸殘基。根據(jù)本發(fā)明方法使用的屬于MBD家族的蛋白質(zhì)或者其片段，優(yōu)選甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以例如通過使用本領(lǐng)域已知、優(yōu)選本文描述的手段和方法進行序列比較和/或比對和將已知的MBD與懷疑為MBD的序列比較和/或比對來鑒定。例如，當兩個比較的序列兩者中的一個位置被相同^或者^酸單體亞基(例如，如果兩個DNA分子每一個中的一個位置被腺噪呤占據(jù)，或者兩個多肽的每一個中的一個位置被賴氨酸占據(jù))時，那么各自分子在該位i置上是同一的。兩條序列之間同一性百分lbi兩條序列共有的匹配或者同一位置的數(shù)目除以所比較的位置數(shù)x100的函數(shù)。例如，如果兩條序列中10個位置的6個是匹配或者同一的，那么這兩條序列是60%同一的。作為實例，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%同源性(6個總位置的3個是匹配的)。通常，當兩條序列比對以得到最大同源性和/或同一性時進行比較。使用通過計算;t^序如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地實現(xiàn)的例如Needleman，J.MolBiol.48(1970):443-453的方法可以提供此類比對。同源序列共有相同或相似的氨基酸殘基，其中相似的殘基是比對的參考序列中對應氨基酸殘基的保守替代或者"允許的點突變"。在這方面，參考序列中殘基的"保守替代"是物理上或者功能上類似于對應的參考殘基的那些替代，如具有相似的大小、形狀、電荷、化學性質(zhì)的替代，包括能夠形成共價鍵或者氫鍵等等。尤其優(yōu)選的保守替代是滿足Dayhoff等人，5:AtlasofProteinSequenceandStructure,5:Suppl.3，chapter22:354-352，Nat.Biomed.Res.Foundation,Washington,D.C.(1978)中對"可接受的點突變，，定義的標準的那些保守替代。優(yōu)選地，本文描述的并且用于本發(fā)明方法中的能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽的片段，優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段優(yōu)選具有屬于如本文描述的MBD-家族的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能特征。優(yōu)選地，本文描述的甲基-DNA-結(jié)合蛋白的片段能夠結(jié)合甲基i化DNA，優(yōu)選CpG曱基化DNA。用于本發(fā)明方法中的多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段優(yōu)選為昆蟲來源、線蟲來源、魚來源、兩棲動物來源，更優(yōu)選為脊推動物來源，甚至更優(yōu)選為哺乳動物來源，最優(yōu)選為小鼠來源，尤其優(yōu)選為人來源的。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段具有獨特的a-螺勿jS鏈夾層結(jié)構(gòu)，其具有如Ballester和Wolffe，Eur.J.Biochem.268(2001)，1-6的圖1中所示的特征環(huán)并且能夠結(jié)合曱基化DNA。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明多肽的屬于MBD家族的蛋白質(zhì)或者其片段包含Ballester和Wo附e(2001)，在上述引文中所示的MBD的至少50個，更優(yōu)選至少60個，甚至更優(yōu)選至少70個或者最少80個氨基酸殘基并且能夠結(jié)合甲基化DNA。甚至更優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段與Ballester和Wo附e(2001)，在上述引文中的圖l中所示的MBD在氨基酸水平上共有優(yōu)選50。/。、60%、70%、80%或90%、更優(yōu)選95%或97%、甚至更優(yōu)選98%，最優(yōu)選99%同一性，并且能夠結(jié)合甲基化DNA。確定序列(如M酸序列)的同一性的手段和方法在本文別處描述'根據(jù)本發(fā)明，在兩個或多個核酸或者M酸序列上下文中，術(shù)語"同一的，，或者"百分比同一性，，指當為了最大對應在比較窗口或者在指定的區(qū)域內(nèi)進行比較和比對時，如使用本領(lǐng)域已知的序列比較算法，或者通過手工比對和視覺檢查測量的，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸殘基或者核苷酸(例如，至少65%同一性，優(yōu)選至少70-95%同一性，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%同一性)的兩個或多個序列或者子序列。具有例如65%到95%或者更大序列同一性的序列被認為是實質(zhì)同一的。這種定義還應用于測試序列的互補序列。優(yōu)選地，所描述的同一性存在于長為至少約232個M酸或者696個核苷酸的區(qū)域內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣使用例如基于如本領(lǐng)域已知的CLUSTALW計算;t^序(ThompsonNucl.AcidsRes.2(1994)，4673-4680)或FASTDB(BrutlagComp.App.Biosci.6(1990)，237-245)的算法確定序列之間和之中的百分比同一性。盡管FASTDB算法通常不考慮序列中的內(nèi)部非匹配缺失或者添加，即，缺口，但是在它的計算中，這可以手工校正以避免。/。同一性的過高估計。然而，CLUSTALW不將序列缺口計入它的同一性計算中。本領(lǐng)域才支術(shù)人員還可以得到的是BLAST和BLAST2.0算法(AltschulNucl.AcidsRes.25(1977),3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序使用字長(W)ll、期望值(E)IO、M=5、N-4和兩a的比較作為默認值。對于M酸序列，BLASTP程序使用字長(W)3、期望值(E)10作為默認值。BLOSUM62評分矩陣(HenikoffProc.Natl.Acad.Sci"USA,89,(1989)，10915)使用比對(B)50、期望值(E)IO、M=5、N-4和兩^的比較作為默認值。例如，代表基本局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)(Altschul，Nucl.AcidsRes.25(1997)，3389-3402;Altschul，J.Mol.Evol.36(1993)，2卯-300;Altschul，J.Mol.Biol.215(19卯)，403-410)的BLAST2.0可以用于搜索局部序列比對。BLAST產(chǎn)生核苷酸和M酸序列的比對以確定序列相似性.因為比對的局部性質(zhì)，BLAST特別可用于確定精確匹配或者鑒定相似序列。BLAST程序輸出的基本單位是高得分區(qū)^Xt(High-scoringSegmentPair)(HSP)。HPS由任意但是相等長度的兩個序列片段組成，所述片段的比對為局部最大并且它們的比對得分滿足或者超過用戶設(shè)置的閾值或者截斷得分。BLAST方法是尋找查詢序列和數(shù)據(jù)庫序列之間的HPS，以評估所發(fā)現(xiàn)的任何匹配的統(tǒng)計學顯著性，和僅報告滿足用戶選擇的顯著性閾值的那些匹配。ME建立統(tǒng)計學顯著性閾值用于報告數(shù)據(jù)庫序列匹配。E解釋為在整個數(shù)據(jù)庫檢索的背景中HSP(或者HPS集合)的機會發(fā)生的預期頻率的上限。其匹配滿足E的任何數(shù)據(jù)庫序列以程序輸出報告。使用BLAST(Altschul(1997)，在上述引文中；Altschul(1993)，在上述引文中；Altschul(1990)，在上述引文中)的類似的計算機技術(shù)用于搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫如GenBank或EMBL中的相同或者相關(guān)的分子。該分析比基于多個膜的雜交快得多。此外，可以修飾計算機搜索的靈敏性以確定任一具體匹配分類為精確的還是相似的。搜索的M是乘積得分，其定義為%序列同一性x%最大BLAST得分100并且它考慮兩條序列之間的相似性程度和序列匹配的長度。例如，對于40的乘積得分，匹配將在1-2%誤差是精確的；在70時，匹配將;l精確的。通過選擇顯示出15到40的乘積得分的那些分子，通常降^^目似的分子，盡管較低的得分可以鑒定相關(guān)的分子。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法中的多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段或者變體包含Ballester和Wo附e(2001)，在上述引文中的圖l中顯示的MBD蛋白質(zhì)的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者Hendrich和Tweedy,TrendsGenet19(2003)，269-77中描述的MBD蛋白質(zhì)的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且能夠結(jié)合甲基化DNA。在本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法中多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人MBD2的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在更尤其優(yōu)選的實施方案中，甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)^A人MBD2的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含具有Genbank檢索號NM一003927的M酸序列的氨基酸144到230。在最尤其優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法中多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含來自SEQIDNO:2(圖3)中所示的^酸序列的29到115位的M酸序列。能夠結(jié)合甲基化DNA并且用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明多肽的"變體"包含多肽，其中與所述多Abf目比，一個或多個M酸^L替代，優(yōu)選被保守替代，并且其中所述變體優(yōu)選能夠結(jié)合甲基化DNA,優(yōu)選CpG甲基化DNA。此類變體包括根據(jù)本領(lǐng)域中已知的一皿則選擇的缺失、插入、倒位、重復和替代，以〗更對本發(fā)明的多肽的活性沒有影響。例如，關(guān)于怎樣產(chǎn)生表型上沉默的氨基酸替代的指導在Bowie,Science247:(1990)1306-1310中提供，其中作者指出有兩個主要策略用以研究M^列對改變的耐受性。第一種策略利用在進化過程中M酸替代對自然選擇的耐受性。通過比較不同物種中M酸序列，可以鑒定保守的氨基酸。這些保守的氨基酸對于蛋白質(zhì)功能可能是重要的。相比，替代被自然選擇耐受的M酸位置表明這些位置對于蛋白質(zhì)功能不是關(guān)鍵的。從而，可以修飾耐受M酸替代的位置而仍然保留蛋白質(zhì)的生物活性.第二種策略使用遺傳工程在所克隆的基因的特定位置引入M酸改變以鑒定對于蛋白質(zhì)功能關(guān)鍵的區(qū)域。例如，可以使用位點定向誘變或者丙氨酸掃描誘變(在分子的每個殘基引入單個丙氨酸突變)(Cunningham和Wells,Science244:(1989)1081-1085.)。然后可以測試所得突變分子的生物活性，如作者指出的，這兩種策略已經(jīng)揭示蛋白質(zhì)令人驚奇地耐受M酸替代。作者還指出哪些氨基酸改變可能在蛋白質(zhì)的某些^J^酸位置是允許的。例如，多數(shù)埋入(在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)內(nèi))的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而通常表面?zhèn)孺湈缀鯖]有特征是保守的。本發(fā)明包括多肽，其具有較低的同一性程度但是具有足夠的相似性以便進行如本文描述的用于本發(fā)明方法的多肽執(zhí)行的一種或多種功能。通過保守氨基酸替代確定相似性.此類替代是通過相似特征(例如，化學性質(zhì))的另一氨基酸替代多肽中給定氨基酸的那些替代。根據(jù)上文的Cunningham等人，此類保守替代可能是表型沉默的。關(guān)于哪些氨基酸改變可能是表型沉默的額外的指導可以見Bowie，Science247:(1990)1306-1310。本發(fā)明的耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或者疏水氨基酸Ala、Val、Leu和lie的替代；羥基殘基Ser和Thr的替代；酸性殘基Asp和Glu的替代；酖胺殘基Asn和Gin的替代；堿性絲Lys、Arg和His的替代；芳族殘基Phe、Tyr和Trp的替代，和小尺寸氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。此外，本發(fā)明還包括下表提供的保守替代。表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>除了上述用途，此類M酸替代還可以增加蛋白質(zhì)或者肽穩(wěn)定性。本發(fā)明包括M酸替代，其含有例如蛋白質(zhì)或者肽序列中一個或多個非肽鍵(其替代肽鍵)。還包括的這樣的替代，其包括不同于天然發(fā)生的L-M酸的氨基酸殘基，如D-iJ^酸或者非天然發(fā)生的或者合成的氨基酸，例如，^或者7氣基酸。參考下面的出版物可以容易地計算同一性和相似性ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.,ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InfoliuatiesandGenomeProjects,Smith,DM.，ed.，AcademicPress,NewYork,1993;Informa打esComputerAnalyzisofSequenceData，Part1，Griffin,A.M.，andGriffin,H.G.，eds"HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalyzisinMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademiePress,1987;andSequenceAnalyzisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，eds.，MStocktonPress,NewYork,1991。如上文提到的，用于結(jié)合甲基化DNA的多肽還優(yōu)選包括抗甲基化DNA抗體，其優(yōu)選為抗-5-甲基胞嘧咬抗體或者其Fab、F(ab，)2、Fv或scFv片段。優(yōu)選地，所述抗-5-甲基胞嘧咬抗體特異結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG-甲基化DNA。術(shù)語"特異"在該上下文中指所述抗體與CpG"甲基化DNA反應，但是不與未甲基化的DNA和/或在胞嘧咬之外的其他核苷酸上甲基化的DNA和/或在胞嘧啶的C5原子之外的位置甲基化的DNA反應?？贵w是否如上文定義的特異反應可以容易地如下測試比較所述抗體與CpG-甲基化DNA的結(jié)合反應和與未甲基化的DNA和/或在胞嘧咬之外的其他核苷酸上甲基化的DNA和/或在胞嘧啶的C5原子之外的位置甲基化的DNA的結(jié)合反應。本發(fā)明的抗體可以是例如多克隆或者單克隆的。術(shù)語"抗體，，還包括其仍然保留結(jié)合特異性的衍生物或者片段，如Fab、F(ab，)2、Fv或scFv片段。用于產(chǎn)生抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且在例如Harlow和Lane"Antibodies,ALaboratoryManual",CSHPress,ColdSpringHarbor,1988中描述。本發(fā)明還包括嵌合的、單鏈和人源化抗體，以及上述抗體片段；也見例如Harlow和Lane，在上述引文中。多種步驟是本領(lǐng)域中已知的并且可以用于產(chǎn)生此類抗體和/或片段。從而，(抗體)衍生物可以通過肽模擬物產(chǎn)生。此外，對產(chǎn)生單鏈抗體描述的技術(shù)(見美國專利4，946,778)可以適于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的單鏈抗體。而且，轉(zhuǎn)基因動物也可以用于表達針對本發(fā)明多肽的人源化抗體。最優(yōu)選地，本發(fā)明的抗甲基化DNA抗體是單克隆抗體。為了制備單克隆抗體，可以使用通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的任一種技術(shù)。此類技術(shù)的實例包括雜交瘤技術(shù)(K池ler和MHsteinNature256(1975)，495-497)、三瘤(trioma)技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor，ImmunologyToday4(1983)，72)和用于產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤4支術(shù)(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，Inc.(1985)，77-96)。描述產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(例如，美國專利4，946，778)可以適于產(chǎn)生針對如上述的免疫原性多肽的單鏈抗體。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抗體分子，，涉及完整免疫球蛋白分子以及此類免疫球蛋白分子的部分。此外，如上文討論的，該術(shù)語涉及修飾的和/或改變的抗體分子，像嵌合和人源化抗體。該術(shù)語還涉及單克隆或者多克隆抗體以及重組或者合成產(chǎn)生的/合成的抗體。該術(shù)語還涉及完整抗體以及其抗體片段，像分離的輕鏈和重鏈、Fab、Fab/c、Fv、Fab，、F(ab，)2。術(shù)語"抗體分子"還包括雙功能抗體和抗體構(gòu)建體，像單鏈Fvs(scFv)或抗體-融合蛋白。在本發(fā)明上下文中還設(shè)想術(shù)語"抗體"包括可以在細胞中表達的抗體構(gòu)建體，例如，可以通過病毒或者載體轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導的抗體構(gòu)建體。當然，本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)、連接或者綴合到可檢測的物質(zhì)?？蓹z測的物質(zhì)的實例包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬，使用多種正電子發(fā)射成像術(shù)，和非放射性順磁金屬離子.可檢測的物質(zhì)可以直接偶聯(lián)或者綴合到抗體的Fc部分(或者其片^a)或者通過中間體(如本文中已知的接頭)，使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)間接偶聯(lián)或者綴合.關(guān)于可以綴合到抗體的Fc部分用作^L據(jù)本發(fā)明的診斷劑的金屬離子，見例如美國專利號4，741，卯0。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、i8-半乳糖苷酶或者乙酰膽堿酯酶；生物素；:適的熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮、熒光素、異-危氰酸熒光素、羅丹明、二氯三噢基胺熒光素、丹磺酰氯或者藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)的實例包括1251、^I或"Tc。將化合物綴合、偶聯(lián)或者連接到Fc部分的技術(shù)是公知的，見例如，Arnon等人，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrom等人，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies，84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985);"Analyzis，Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy'",inMonoelonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(AcademicPress1985)，andThorpe,Immunol.Rev.，119-158。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用于本發(fā)明方法中的如本文描述的多肽融合在異源多肽的N-和/或C-末端以檢測甲基化的DNA，所述異源多肽優(yōu)選選自HA-標簽、myc6-標簽、FLAG-標簽、STREP-標簽、STREPII-標簽、TAP-標簽、HAT-標簽、殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、麥芽糖-結(jié)合蛋白、His6-標簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽、Intein-標簽、鏈霉抗生物素蛋白-結(jié)合蛋白(SBP)標簽和抗體的Fc部分。"標簽"是與它融合的^jL^列同源或者異源的M酸序列.所述標簽可以尤其方便蛋白質(zhì)的純化或者方便它融合的所述蛋白質(zhì)的檢測。融合指共線性連接并導致翻譯融合。在另一優(yōu)選實施方案中，能夠結(jié)合甲基化DNA的本發(fā)明的多肽融合到異源多肽并且任選在所述多肽和所述異源多肽的N和/或C-末端之間包含額外的接頭。所述接頭優(yōu)選是柔性接頭。優(yōu)選地，它包含多個親水的肽鍵結(jié)合的M酸。任選地，接頭包含蛋白酶切割位點，其允許切除與本發(fā)明的多肽融合的異源多肽，如果需要，蛋白酶切割位點是例如凝血酶切割位點。優(yōu)選地，所述接頭包含多個甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和/或精氨酸殘基。還優(yōu)選所述多肽接頭包含M酸序列的多個連續(xù)拷貝。通常，多肽接頭包含1到20個，優(yōu)選1到19個，1到18個，1到17個，1到16個或1到15個氨基酸，盡管多于20個氨基酸的多肽接頭也可以使用。優(yōu)選地，所述抗體的Fc蛋白優(yōu)選包含免疫球蛋白重鏈分子的恒定區(qū)的至少一部分。Fc區(qū)域優(yōu)選限于恒定結(jié)構(gòu)域4^鏈區(qū)和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。能夠結(jié)合甲基化DNA并且用于本發(fā)明方法中的本發(fā)明多肽中的Fc區(qū)域還可以限于鉸鏈區(qū)的部分，該部分能夠形成分子間二硫鍵，和Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域，或者其功能等同物。備選地，還優(yōu)選Fc部分包含至少所需的一組CH區(qū)域使得能夠結(jié)合甲基化DNA的本發(fā)明的多肽仍然具有本文上述多肽的性質(zhì)，尤其用于所附實施例中多肽的性質(zhì)。在另一備選方案中，還優(yōu)選所述恒定區(qū)當與本領(lǐng)域中已知的恒定區(qū)比較時含有一個或多個^酸替代。優(yōu)選地，它含有1到100、1到卯、1多80、l至'j70、l多j60、1多50、1多40、1至，30或1多20，il優(yōu)選1至'10、甚至更優(yōu)選1到9、1到8、1到7或1到6最優(yōu)選1到5、1到4、1到3或2或1個替代。比較優(yōu)選如本領(lǐng)域所述的進行或者，更優(yōu)選地，如本文別處描述的進行。備選地，所述恒定區(qū)優(yōu)選包含至少Ch1區(qū)，更優(yōu)選QHl和Ch2區(qū)，最優(yōu)選CHl、Ch2和Ch3區(qū)。如本領(lǐng)域中已知，抗體的恒定區(qū)含有兩個免疫球蛋白重鏈，其含有由約110個M酸組成的三個特征性免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其中兩個免疫球蛋白重鏈通過^^鍵共價連接。還設(shè)想恒定區(qū)可以優(yōu)選為雞或者鴨來源的.然而，優(yōu)選地，恒定區(qū)是IgM、IgA、IgD或IgE同種型的，并且更優(yōu)選地，它是IgG同種型的，最優(yōu)選IgGl同種型的。優(yōu)選地，前述同種型是脊推動物來源的，更優(yōu)選為哺乳動物來源的，甚至更優(yōu)選為小鼠、大鼠、山羊、馬、驢、駱駝或者黑猩猩來源的，最優(yōu)選為人來源的。優(yōu)選地，所述IgG同種型是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4類的，所述IgA同種型是IgAl、IgA2類的，在本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方案中，用于本發(fā)明方法中的多肽是MBD2蛋白質(zhì)的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和如本文公開的抗體的Fc部分之間的融合蛋白。任選地，優(yōu)選的融合蛋白包含如本文描述的接頭多肽，其中所述接頭多肽優(yōu)選位于MBD2的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分之間。融合到用于本發(fā)明方法中的多肽的本文所述的異源多肽方便用于本發(fā)明方法中的多肽結(jié)合和/或附著到容器或固相支持體，所述容器或固相支持體包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯等等。優(yōu)選地,所述容器是由聚碳酸酯制成的PCR管，更優(yōu)選地，它是來自NuncCat.No.248卯9的熱穩(wěn)定的T叩Yieldstrip。所述PCR管或者strip可以是96孔、384孔或者1024孔板。因此，本發(fā)明的方法適于高通量應用，其可以自動化，因為本發(fā)明的方法可以以所稱作的"一管-一測定"進行。在優(yōu)選實施方案中，容器或者固相支持體，優(yōu)選地PCR管或者strip用用于本發(fā)明方法中的多肽直接或者間接包被例如，將通過使用本發(fā)明的生物素化多肽和鏈霉抗生物素蛋白包被的容器，優(yōu)選PCR管直接實現(xiàn)包被。然而，本發(fā)明設(shè)想本領(lǐng)域中已知的用肽包被容器的任何其他技術(shù)。間接包被可以優(yōu)選地通過包被在所述容器表面上的抗體實現(xiàn)，所述抗體能夠特異結(jié)合能夠結(jié)合甲基化DNA的本發(fā)明多肽或者特異結(jié)合異源多肽，該異源多肽優(yōu)選融合到所述能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽或者特異結(jié)合本發(fā)明的抗甲基化DNA抗體。實際上，所i^器用能夠結(jié)合甲基化DNA的本發(fā)明的多肽間接包被。如本文所述的容器的包被可以如下實現(xiàn)將所述容器用適于與融合到能夠結(jié)合甲基化DNA的本發(fā)明多肽的異源多^目互作用的試劑包被。例如，所述容器可以用谷胱甘肽包被，并且因此，本發(fā)明的GST-標記的多肽被谷胱甘肽結(jié)合，其導致所述容器用用于本發(fā)明方法中的多肽包被。優(yōu)選地，由于用于制造本文所述優(yōu)選容器的塑料的性質(zhì)，發(fā)生容器的包被。因此，當本發(fā)明的多肽與本發(fā)明的容器接觸時，所述多肽包被所述容器。如本文提到的，本發(fā)明的方法允許檢測甲基化DNA，優(yōu)選單個基因座的甲基化DNA,其使得它為合適的診斷工具，用于檢測多于15將、少于15嗎、少于10將、少于10ng、7.5ng、5ng、2.5ng、1ng、0.5ng、0.25ng、或約150pg的甲基化DNA。術(shù)語生物樣品從含有多核普酸或者多肽或者其部分的受試者或者個體、細胞系、組織、培養(yǎng)物或者其他來源得到。如所指出的，生物樣品包括體液(如血液、血清、血漿、尿液、滑膜液和脊髄液)和發(fā)現(xiàn)表i^發(fā)明的多核苷酸的組織樣品。用于從哺乳動物得到組織活組織檢查和體液的方法是本領(lǐng)域中公知的。包括基因組DNA、mRNA或者蛋白質(zhì)的生物樣品優(yōu)選作為來源。不被理論束縛，認為CpG二核苷酸的甲基化與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)并且可能導致大部分非編碼基因組和可能有害的序列不被轉(zhuǎn)錄。對于幾乎所有種類的腫瘤已經(jīng)描述了總體DNA低甲基化。在肺瘤組織中，與正常組織相比，5-甲基胞嘧啶的含量降低，脫甲基化事件的主*額在染色體的重復衛(wèi)星序列或者著絲粒區(qū)中發(fā)現(xiàn)。然而，在單個情況中，也已經(jīng)描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的脫甲基化和激活(Costello，J.Med.Genet.38(2001)，285-303)。CpG島通常發(fā)揮基因調(diào)節(jié)功能。這是為什么甲基化狀態(tài)的改變與有關(guān)基因座的轉(zhuǎn)錄活性的改變最直接相關(guān)的原因(Robertson(1999);Herman(2003);Esteller(2002);Momparler(2003);Plass(2002)，都在上述引文中)。多數(shù)CpG以未甲基化形式存在于正常細胞中。然而，在一些情況下，CpG島還可以在基因調(diào)節(jié)事件中被甲基化。雌性細胞的失活的X染色體的CpG島多l(xiāng)bi例如甲基化的(Goto，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998)，362-378)。CpG島還可以在正常的衰老過程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol.109(2003)，103-108)。尤其在肺瘤中，通常不甲基化的CpG島可以以超甲基化形式存在.在許多情況中，受到超甲^&化影響的基因編碼阻礙腫瘤生長的蛋白質(zhì)，如腫瘤抑制基因。在上文描述了可以表明可以在腫瘤中通it^甲基化的外遺傳機制失活的基因的實例。腫瘤特異的超甲基化的原因幾乎未知。有趣的是，某些種類的腫瘤似乎具有它們自身的超甲基化諳。在更大的比較研究中可以表明超曱基化不是均勻分布的，而是它,于腫瘤發(fā)生。對于白血病，與例如結(jié)腸癌或者神經(jīng)膠質(zhì)瘤相比，多數(shù)其他基因;lj逸甲基化的。從而，超甲基化可以用于分類腫瘤(Esteller，CancerRes.61(2001)，3225-3229;Costello，Nat.Genet.24(2000)，132-138)。從而，認為外遺傳效應如低和/或超甲基化與癌癥、肺瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。用于得到用以檢測甲基化DNA的樣品的本發(fā)明受試者被懷疑具有低和/或超曱基化基因座。此類低和/或超甲基化基因座表明癌癥、肺瘤或者轉(zhuǎn)移。腫瘤或者癌癥可以是任一可能類型的腫瘤或者癌癥。實例M膚、乳腺、腦、宮頸癌、睪丸癌、頭和頸癌、肺、縱隔、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、婦科系統(tǒng)、乳腺、內(nèi)分泌系統(tǒng)、皮膚、兒童期、未知的原發(fā)部位或者轉(zhuǎn)移性癌、軟組織和骨的肉瘤、間皮瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤、淋巴瘤、白血病、副腫瘤性綜合征、腹膜癌病、免疫抑制相關(guān)的惡性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移性癌等等。肺瘤細胞可以例如來自頭和頸，包括鼻腔、鼻旁竇、鼻咽、口腔、口咽、喉、下咽部、唾g的腫瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、肺的癌癥，包括非小細胞肺癌、小細胞肺癌、縱隔癌、胃腸道癌，包括食管、胃、胰腺、肝臟、膽系、小腸、結(jié)腸、直腸和肛門區(qū)的癌、泌尿生殖系統(tǒng)的癌，包括腎、尿道、膀胱、前列腺、尿道、陰莖和睪丸的癌、婦科癌，包括宮頸、陰道、陰門、子宮體、M滋養(yǎng)層細胞病、卵巢、輸卵管、皿的癌癥，乳腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，包括甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質(zhì)的肺瘤、m內(nèi)分泌腫瘤、類癌瘤和類癌綜合征、多發(fā)性內(nèi)分泌腺肺瘤形成、軟組織和骨的肉瘤、間皮瘤、皮膚癌、黑素瘤，包括皮膚黑素瘤和眼內(nèi)黑素瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤、兒童期癌癥，包括成視網(wǎng)膜細胞瘤、腎胚細胞瘤、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、成神經(jīng)細胞瘤、Ewing肉瘤家族的腫瘤、橫B肉瘤、淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，和霍奇金病、白血病，包括急性白血病、慢性髄性和淋巴細胞白血病、漿細胞腫瘤和骨髓增生異常綜合征、副腫瘤性綜合征、未知的原發(fā)部位的癌癥、皿癌病、免疫抑制相關(guān)的惡性腫瘤，包括艾滋病相關(guān)的惡性腫瘤，包括卡波西肉瘤、艾滋病相關(guān)的、淋巴瘤、艾滋病相關(guān)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、艾滋病相關(guān)的霍奇金病和艾滋病相關(guān)的肛殖癌，和移船目關(guān)的惡性腫瘤、向肝臟的轉(zhuǎn)移性癌癥、向骨的轉(zhuǎn)移性癌癥、惡性胸膜和心包滲出液和惡性腹水。最優(yōu)選所述癌癥或者肺瘤疾病是頭和頸、肺、縱隔、胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、婦科系統(tǒng)、乳腺、內(nèi)分泌系統(tǒng)、皮膚、兒童期、未知的原發(fā)部位或者轉(zhuǎn)移性癌癥、軟組織和骨的肉瘤、間皮瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、淋巴瘤、白血病、副腫瘤性綜合征、Wt癌病、免疫抑制相關(guān)的惡性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移性癌。優(yōu)選的腫瘤是AML、漿細胞瘤或者CLL。如本文提到的，本發(fā)明提供了以單管測定法檢測甲基化DNA,優(yōu)選CpG甲基化DNA片段的方法，其包括下面的步驟基因組DNA結(jié)合到能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽、優(yōu)選甲基-CpG-結(jié)合蛋白，所述多肽包被到容器、優(yōu)選PCR管的內(nèi)表面，洗除未結(jié)合的(未甲基化的)DNA片段并優(yōu)選直接應用基因特異性PCR檢測甲基化DNA的富集.因為由于"進行所有步驟的一個反應容器"，本發(fā)明的方法是穩(wěn)健、快速和容易應用的并且可靠的檢測甲基化DNA的診斷工具，所以本發(fā)明的方法可以高通量形式應用，其可以進行自動化.本發(fā)明的方法從而允許容易和高度靈敏地檢測CpG甲基化，優(yōu)選單個基因座的甲基化。因為腫瘤和/或癌的甲基化模式似乎jOl成有價值的診斷^lt，所有優(yōu)選提供包含用于執(zhí)行本發(fā)明方法的所有手段的試劑盒。因此，本發(fā)明涉及用于根據(jù)本發(fā)明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合如本文所述的甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；和(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。關(guān)于本發(fā)明方法公開的實施方案加以必要的變更應用于本發(fā)明的試劑盒。有利地，本發(fā)明的試劑盒還任選包含反應緩沖劑、貯存溶液、洗滌溶材料。一此夕卜:本發(fā)明的試劑盒的部分可以單獨包裝在小瓶或者瓶子中i者與容器或者多容器單位組合。本發(fā)明的試劑盒可以有利地尤其用于實施如本文所述的檢測甲基化DNA的方法和/或它可以用于本文中提到的多種應用，如作為診斷試劑盒、作為研究工具或者治療工具。此外，本發(fā)明的試劑盒可以含有適于科學、醫(yī)學和/或診斷目的的檢測手段。試劑盒的生產(chǎn)商優(yōu)選按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準步驟。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選用于如本文提供的"單管，，測定法中。本發(fā)明容器的"包被手段"都是適于用本發(fā)明的多肽包被所述容器的試劑，如交聯(lián)劑或者抗生物素蛋白或者谷胱甘肽等等。從而，基本上，適于與融合到能夠結(jié)合甲基化DNA的本發(fā)明多肽的異源多J!M目互作用的每種試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含預包被的容器，優(yōu)選PCR管。術(shù)語"檢測甲基化DNA的手段"包括實施如上文所述的甲基化DNA檢測方法必需的所有試劑。在更優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒包含怎樣根據(jù)本發(fā)明的方法進行甲基化DNA的檢測的使用說明手冊。附圖顯示了圖1:甲基-結(jié)合(MB)-PCR略圖。(A)圖解了MB-PCR程序的主要步驟。MB-PCR包括兩個單獨的反應對照-PCR反應(P-反應)，其直接從基因組模板擴增候選基因座，和甲基-CpG-結(jié)合PCR反應，其從以前M應容器中甲基-CpG-結(jié)合多肽結(jié)合的模板DNA擴增候選基因座(M-反應)。在第一步中，兩個反應容器的內(nèi)壁都用甲基結(jié)合多肽包被并隨后用封閉試劑飽和(步驟2)。然后將模板DNA(用Msel或者類似的酶限制性消化的基因組DNA)加入到一個管(M-^JI)中并允許結(jié)合(步驟3)。在最后步驟，將PCR反應混合物直接加入兩管中并向P-反應加入50%的以前用于M-反應的模板DNA?；蛱禺愋訮CR后，可以例如通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。用于圖1A和B中的術(shù)語"CpG-甲基低"包括并且具體指未甲基化的DNA。(B)使用上文重組的甲基-結(jié)合多肽MBD-Fc的MB-PCR程序的圖示。圖2:通過MB-PCR檢測白血病細胞系中三個CpG島啟動子中的CpG甲基化。(A)顯示了CpG二核苷酸的位置、Msel限制性位點、第一個外顯子和用于檢測/CAB戶、和CM2V^(pl5^K,啟動子片段的引物的位置。(B)8種不同的白血病細胞系的所指出的啟動子的代表性MB-PCR結(jié)果。P-反應直接擴增基因組DNA，而M-^^應僅擴增CpG甲基化的DNA片段。圖3:ICSBP啟動子的甲基化與白血病細胞系中ICSBP表達反相關(guān)。(A)通過LightCycler實時PCR相對于管家基因^CT5測定/CS5戶的轉(zhuǎn)錄水平。(B)分析用脫氧氮雜胞普(DAC)處理所指出的時間期限的U937細胞的/CS5尸表達。結(jié)果歸一化到^CTB表達。數(shù)據(jù)代表兩個獨立的LightCycler^^析的平均值土SD。圖4:AML細胞中異常CpG曱基化檢測。一些^i:供體和AML患者的五57W、C7)JCV2丑(pl5^K4b)和JCS5戶啟動子的代表性MB-PCR。圖5:ICSBP啟動子的MB-PCR與通過亞石克酸氫鹽測序得到的結(jié)勤目關(guān)。用亞石危酸氫鹽處理來自細胞系以及所選MW^和AML患者的細胞的基因組DNA。擴增并克隆ICSBP基因的所指出的區(qū)域。對一些獨立的插入片段測序并圖示結(jié)果。圓形標記CpG二核苷酸的位置(空心未甲基化的；實心甲差^化的)。圖6:MB-PCR的靈敏度。(A)來自^LS:供者的DNA(未甲基化)和來自細胞系KG-1的DNA(在所有三個基因座中甲基化)的DNA混合物的^SiW、CZ)J0V25(pl5"^4b)和/cy5戶啟動子的MB-PCR。(B)對來自三種細胞系的DNA進行MB-PCR,使用所指出量的DNA(或者用于P反應的所指示量的一半)用于M反應，使用降低量的DNA，在PCR期間(以括號給出)擴增循環(huán)的數(shù)目增加。還顯示了不包括DNA(H20)的樣品。圖7:圖7顯示了質(zhì)粒pMTBip/MBD2-Fc的核苷酸序列和質(zhì)粒pMTBip/MBD2-Fc編碼的MBD2-Fc雙功能蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(粗體)。MBD2-Fc雙功能蛋白質(zhì)的^^M列具有下面的特征。AA1-28(nt851-934):果蠅Bip分泌信號(來自pMT/Bip/V5-His栽體的前導肽)AA29-115(nt935-1196):人MBD2的AA144-230AA116-129(nt1196-1237):柔性接頭(AAADPIEGRGGGGG)AA130-361(1238-1933):人IGHG1的AA99-330圖8:MB-PCR檢測CpG烏啟動子的甲基化。(A)所檢測的五5*及2、a)A7V2B(pl5!NK4b)、/CS"AP、JSTK3和2W)A20的Afsel-片段(表示為灰色框)的圖示。標出了CpG二核苷酸的位置、MwI-限制性位點、轉(zhuǎn)錄起始位點、第一個外顯子和引物的相對位置。(B)顯示了所示啟動子的正常的(未甲基化的)和體外甲基化的基因組DNA的代表性MB-PCR結(jié)果。P-反應直接擴增基因組DNA，而M-反應僅擴增CpG甲基化的DNA片段。圖9:通過MB-PCR檢測白血病細胞系中CpG甲基化。(A)顯示了所示啟動子的8種不同的白血病細胞系的^R^性MB-PCR結(jié)果。(B)通過亞硫酸氫鹽測序分析相同細胞系的基因組DNA。擴增并克隆JC1S^戶基因的所示區(qū)域。測序幾個獨立的插入片段并圖示結(jié)果。正方形標記CpG二核苷酸的位置(空心未甲基化的；實心甲基化的)。圖10:原發(fā)性AMP胚細胞中異常CpG甲基化的檢測。顯示了一名代表性健康供者(N)和9名AML患者的JCS5戶啟動子和對應的測序結(jié)果。(亞石克酸氫鹽測序的結(jié)果如圖9中表示)。從下面的實施例可以更好地理解本發(fā)明并看出它的許多優(yōu)點，這些實施例僅用于闡明的目的，并且不意在以任何方式限定本發(fā)明的范圍。實施例1:用于使用甲基結(jié)合聚合酶鏈式反應(MB-PCR)檢測CpG甲基化的DNA片段的單管測定法該方法使用類似于ELISA的方法。將對CpG甲基化的DNA具有高親和力的蛋白質(zhì)包被到與反應容器相配的PCR循環(huán)儀的壁上，并用于從基因組DNA混合物選擇性捕獲強烈甲基化的DNA片段。使用PCR(標準PCR或者實時PCR，單一或者多路的)可以在同一個管中檢測特定DNA片段(例如，特定基因的CpG島啟動子)的存留?？梢韵鄬τ诨蚪M輸入DNA的PCR反應估計甲基化程度。圖1顯示了MB-PCR的圖示。l.細胞、患者樣品、DNA制備和斷裂細胞通過健康供者的白細胞分離法(leukapheresis)分離外周血單核細胞(MNC)，接著在菲可帕克上密度梯度離心。如Krause，J.Leukoc.Biol.60(1996)，540-545中描述的在J6ME離心機(Beckman，Mtinchen，Germany)中通it^t流離心淘析法從MNC分離單核細胞。從ATCC得到果蠅S2細胞并在培養(yǎng)箱中21。C下含有10。/。胎牛血清(FCS;PAA)的Insect-Xpress培養(yǎng)基(BioWhittaker)中培養(yǎng)。在補充10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人髄細胞白血病細胞系THP-1、NB-4、KG-1、K562、HL-60和U937。在添加10%FCS和1%OPI培養(yǎng)基補充物(Sigma)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人髄細胞白血病細胞系MonoMac6。在添加20%FCS和10ng/ml干細胞因子的aMEM中保持人髄細胞白血病細胞系MUTZ~3。對于DNA脫甲基化，用所示量的脫氧氮雜胞苷(2-脫氧-5，-氮雜胞苷，Sigma)處理U937細胞幾天。患者樣卯來自新近診斷的且未治療的或者繼發(fā)性AML的35名患者的新鮮外周血樣品和骨髄標本用于研究。才艮據(jù)GermanAMLCooperativeGroup的方案AMLCG^2000處理所有患者。研究得到機構(gòu)倫理委員會(InstitutionalEthicsCommittee)的批準，并在進入研究前從每名患者得到書面知情同意。DNA制備和斷裂使用BloodandCellCultureMidiKit(Qiagen)從多種細胞來源制備基因組DNA，所迷細胞來源包括本文描述的細胞系(例如，KGl、U937和THP-1)、正常人單核細胞(^:供者)和來自AML患者的冷凍的胚細胞。通過瓊脂糖凝膠電泳控制基因組DNA制備物的質(zhì)量并通過紫外分光光度法測定DNA濃度。將基因組DNA用MseI(NEB)消化并使用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)最終定量。如所指出的，用SssI甲基化酶(NEB)體外甲基化DNA。2.產(chǎn)生重組的甲基-CuG-結(jié)合多肽使用引物MBD2-Nhe_S(5，-AGATGCTAGCACGGAGAGCGGGAAGAGG-3，)(SEQIDNO:4)和MBD2-Not—AS(5，-ATCACGCGGCCGCCAGAGGATCGTTTCGCAGTCTC-3，)(SEQIDNO:5)和HerculaseDNA聚合酶(Stratagene)v^轉(zhuǎn)錄的人原代巨噬細胞總RNA通過PCR擴增對應于人MBD2(Genbankacc.no.NM一003927;AA144-230)的甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)的cDNA。循環(huán);^lt為95。C，3min變性；95。C，20s，65。C，20s，72。C，80s擴增34個循環(huán)；72°C，5min最終延伸。沉淀PCR產(chǎn)物，用NotI/NheI消化，克隆到Signalpigplus栽體(Ingenius，R&DSystems)的Notl/Nhel-位點中并iHt序列，得到plg/MBD2-Fc(真核表達栽體)。為了克隆用于在果蠅S2細胞中重組表達的pMTBip/MBD2-Fc，將含有融合到人IgGl的Fc尾的人MBD2的MDB的plg/MBD2-Fc的ApaI/NheI片段亞克隆到pMTBiP/V5國HisB(Invitrogen)的ApaI/SpeI位點。從ATCC得到果蠅S2細胞并在培養(yǎng)箱中含有10%FCS(PAA)的Insect誦Xpress培養(yǎng)基(BioWhittaker)中21。C下培養(yǎng)。使用Effectene轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的方案，用1.5pMTBip/MBD2-Fc和0.3figpCoHygro(Invitrogen)的混合物轉(zhuǎn)染4x106個果蠅S2細胞/60mm細胞培#^.在第三天，收獲轉(zhuǎn)染的細胞，洗滌并在含有10%FCS和300ng/ml潮霉素(BDBiosciences)的選擇培養(yǎng)基(Insect-Xpress)中再次平板接種。每4-5天更換選擇培養(yǎng)基，持續(xù)5周。擴大穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細胞庫。為了大規(guī)模產(chǎn)生甲基-CpG結(jié)合多肽MBD-Fc，在2000ml搖瓶中沒有FCS(任選地:300jig/ml潮霉素)的100-200mlInsect-Xpress中培養(yǎng)1-5x108個細胞，然后加入0.5mMCuS04。每4-7天收獲培養(yǎng)物并將細胞在添加CuS04的培養(yǎng)基上再鋪板以進一步產(chǎn)生蛋白質(zhì)。合并細胞培養(yǎng)物上清液，對TBS(pH7.4)透析并使用蛋白A柱純化。合并含有MBD-Fc的級分并對TBS(pH7.4)透析。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果錄S2細胞產(chǎn)生3-5mg重組MBD2-Fc蛋白質(zhì)/升細胞培養(yǎng)上清液。在圖7中顯示了MBD-Fc蛋白質(zhì)的序列和特征。3.MB-PCR管的制備向熱穩(wěn)定的TopYieldTMStrips(NuncCat.No.248909)的每孔中加入50pi重組MBD2-Fc蛋白質(zhì)并在4"過夜溫育，所述重組MBD2-Fc蛋白質(zhì)包含人甲基-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域2(MBD2)的甲基-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MDB)、柔性接頭多肽和人IgGl的Fc部分(在10mMTris/HClpH7.5中稀釋為15pg/ml)。用200nlTBS(20mMTris,pH7.4,含有170mMNaCl)洗滌孔三次，并在室溫下用100jil封閉溶液(10mMTris，pH7.5，含有170mMNaCl，5%脫脂奶粉，5mMEDTA和1jig/ml每種多聚d(I/C)，多聚d(A/T)和多聚d(CG)，都來自Amersham)封閉3-4小時。管用200nlTBST(含有0.05%Tween-20的TBS)洗滌三次.4.甲基化DNA片段的結(jié)合向每孔加入50nl結(jié)合緩沖液(20mMTris，pH7.5,含有400mMNaCl，2mMMgCI2，0.5mMEDTA，和0.05%Tween-20)，并向每第二個孔加入2fdMseI-消化的DNA(5ng/jil)(M反應)。在搖床上室溫下溫育孔40-50分鐘。用200結(jié)合緩沖液洗涂管兩次，并用10mMTris/HClpH8.0洗滌一次.5.甲基化DNA片段的檢測直接在處理和洗滌的TopYieldTMStrips中進行PCR。PCR混合物(PCRMasterMix(Promega);50jiK^物/孔)包括10pmol每種基因特異性引物(由Metabion合成)。引物序列為P15S(5，-GGCTCAGCTTCATTACCCTCC-3，)(SEQIDNO:6)，P15AS(5，-AAAGCCCGGAGCTAACGAC-3，)(SEQIDNO:7)，ESR1S(5，-GACTGCACTTGCTCCCGTC-3，)(SEQIDNO:8)，ESR1AS(5，國AAGAGCACAGCCCGAGGTTAG-3，)(SEQIDNO:9)，ICSBPS(5，-CGGAATTCCTGGGAAAGCC-3，)(SEQIDNO:10)，ICSBPAS(5，-TTCCGAGAAATCACTTTCCCG誦3，)(SEQIDNO:11)，METSS(5，-AATTGCGTCTGAAGTCTGCGG-3，)，(SEQIDNO.12)，METSAS(5，誦TCCCACACAACAGAGAGGCG-3，)(SEQIDNO.13)，DP103S(5，-GCTGTTAGTCCAGTTCCAGGTTCC-3，)(SEQIDNO.14)，DP103AS(5，-GTGCAACCACATTTATCTCCGG-3，)(SEQIDNO:15)。加入PCR混合物后，每隔兩孔加入1filMseI-消化的DNA(5ng/jU)，所述孔以前沒有與DNA片段溫育(P反應)。在MJResearch引擎上進行PCR,使用下面的循環(huán)條件95°C3min(變性)，94°C20s，60°C20s和72。C70s(36個循環(huán))和72。C5min(最后延伸)。使用3%瓊脂糖亂歐電泳分析PCR產(chǎn)物并使用Typhoon9200Imager(Amersham/Pharmacia)掃描溴化乙錠染色的凝膠。6.亞硫酸氫鈉測序如前述用亞石克酸氬鈉修飾DNA。用嵌套PCR反應擴增亞石克酸氫鹽處理的DNA，對于第一輪擴增使用引物icsbp-outS(5，-GGGGTAGTTAGTTTTTGGTTG-3，)(SEQIDNO:16)和icsbp-outAS(5，-ATAAATAATTCCACCCCCAC誦3，)(SEQIDNO:17),第二輪擴增4吏用icsbp-inS(5，-TTGTGGATTTTGATTAATGGGO，)(SEQIDNO:18)和icsbp-inAS(5，-CCRCCCACTATACCTACCTACC誦3，)(SEQIDNO:19)。使用TOPO-TACloningKit(Invitrogen)克隆PCR產(chǎn)物并對幾個獨立的克隆測序。7.RNA-制備、實時PCR通過硫氰^JI^/酸性酚方法(Chomczynski，Anal.Biochem.162(1987)，156-159)從不同的細胞型分離總RNA。使用SuperscriptIIMMLV-RT(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄RNA(2將)。使用Quantitect試劑盒(Qiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明書在Lightcycler(Roche)上進行實時PCR。使用的引物為人ICSBP:正義5、-CGTGGTGTGCAAAGGCAG-3、(SEQIDNO:20)，反義5、-CTGTTATAGAACTGCTGCAGCTCTC-3、(SEQIDNO:21);人ACTB(jS-肌動蛋白)正義5曙TGACGGGGTTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3、(SEQIDNO:22)，反義5畫CTAGAAGCATTTGTGGTGGACGATGGAGGG~3、(SEQIDNO:23)。循環(huán)溫度為:變性95。C，15min，擴增95。C，15s，57。C，20s，72。C，25s，50個循環(huán)。產(chǎn)物大小最初通過瓊脂糖^電泳控制，并分析解鏈曲線以控制PCR反應的特異性。將ICSBP數(shù)據(jù)針對管家基因/S-肌動蛋白(ACTB)的表達歸一化。從標準曲線計算相對單位，該標準曲線繪制了對于測量的熒光強度達到固定值時PCR循環(huán)數(shù)(CP)的三種不同濃度的對數(shù)稀釋。通過公式E-10-"醉從標準曲線的斜率計算擴增效率E。E!csBP為1.87到1.98的范圍，EAciB為1.76到1.84.對于每種樣品，將3次獨立分析的數(shù)據(jù)平均.8.通過MB-PCR分析E5iW、OWS^V2A(pl5!NK4b)和/CS^P啟動子的CpG島甲基化狀態(tài)通過MB-PCR對一些白血病細胞系分析它們的五S1W、a)J5[A^5(pl5iNK,和JCS5i>啟動子的CpG島甲基化狀態(tài)。用M^I消化基因組DNA。選#^酶是因為它是甲基化不敏感的并且將DNA切割成小的片段但是相對完整地留下CpG烏?；蛱禺愋訟fwI片斜目對于它們各自基因的第一個內(nèi)含子的位置以及用于PCR的基因特異性引物的位置在圖2A中顯示.選擇所有片段以包括推定的鄰近啟動子區(qū)?？偣?0ng限制酶消化的DNA用于M反應，5ng相同消化的基因組DNA用于P反應。來自8種不同的白血病細胞系的^RA性MB-PCR實驗的結(jié)果在圖2B中顯示。在所有8種樣品的M>^應中不同程度地擴增ES及/啟動子，這符合以前的報導，所述報導表明它在86%的人造血腫瘤中異常甲基化。CDA"iV25(pl5^K,啟動子的P反應在三種細胞系(THP-1，NB-4，K562)中完全失敗，提示在兩個等位基因上的突變或者缺失，其已經(jīng)在以前闡明。兩種細胞系(KG-1和MUTZ3)顯示出對于CDIOV25(pl5^K")啟動子的陽性M反應，而三種細胞系(U937，MonoMac6，HL-60)是陰性的。所觀察到的結(jié)果與這些細胞系的一些中f^及7和0>A7V2A(pl5^K處)啟動子的以前公布的甲基化分析相一致。在一些情況中，與其他細胞類型相比，P反應較弱，提示一個等位基因(例如，U937細胞中的EWW)的缺失或者突變。還在6種細胞系的M反應種擴增/C5丑戶啟動子。分析/CS5戶啟動子甲基化的程度和效果以進一步mtMB-PCR的實驗潛力。使用LightCycler實時PCR，用8種白血病細胞系分析ICSBP的表達水平。如圖3A中所示，mRNA表達水平與如通過MB-PCR確定的甲基化程度反相關(guān)。用甲基化試劑脫氧氮雜胞苷(5-氮雜-2，脫氧胞苷)處理顯示出高度JCS^戶啟動子甲基化的U937細胞導致ICSBPmRNA表達的顯著的、依賴于劑量和時間的誘導(見圖3B)，表明ICSBP轉(zhuǎn)錄的甲基化誘導的抑制在這些細胞中是可逆的。為了測試MB-PCR是否還可以檢測原發(fā)腫瘤細胞中CpG島啟動子的甲基化，從健康個體(11=4)的血液單核細胞和AML患者(n=ll)的胚細胞制備DNA,用Msel消化，并進行MB-PCR。如圖4中所示，在健康供者的DNA中沒有檢測到顯著甲基化水平，而多數(shù)患者顯示出所分析的三種啟動子中至少一種中顯著甲基化。為了確定MB-PCR結(jié)果怎樣與ICSBP啟動子上CpG甲基化的精確模式相關(guān)，通過所選細胞系、正常和肺瘤細胞中的亞硫酸氫鹽測序分析ICSBP啟動子甲基化。圖5中的結(jié)果表明啟動子曱基化程度可以通過MB-PCR預測-強擴增信號似乎指出高度甲基化，而較弱的信號指出較低程度的甲基化。因為患者樣品可以受到正常的可能未甲基化的細胞的污染，所以確定腫瘤細胞系的DNA樣品中增量的正常DNA的影響?；旌舷拗泼赶腄NA并進行MB-PCR。結(jié)果在圖6A中顯示，M反應中的信號以線性方式隨著樣品中正常的未甲基化DNA的增加的量降低。為了測試該方法的靈敏度，用降低量的DNA進行MB-PCR實驗。如圖6B中所示，當分析三種不同細胞系中ICSBP基因座的甲基化狀態(tài)時，使用測試的所有濃度(IOng-160pg)得到了相當?shù)慕Y(jié)果。這些結(jié)果表明，MB-PCR可以檢測正常和度范圍內(nèi)工作(低至160pgDNA)。9.通過MB-PCR分析^WW、CDiOV2丑(pl5INK4b)、/CS^P、￡7T3和2W)A^啟動子的CpG島甲基化狀態(tài)在另一實驗中，通過分析以前表明在白血病細胞中頻繁甲基化的單個CpG島啟動子的CpG甲基化程度來研究MB-PCR方法，所述啟動子即人CDAA^5基因(也稱作pl5INK4b)和人雌激素受體1(E5iW)基因。除了良好建立的腫瘤標記夕卜,還選擇具有可以潛在作為腫瘤抑制基因的具有CpG島啟動子的三種額外基因人干擾素共有結(jié)合蛋白(/CS^戶)基因、人Ets變體3基因(五7T3)，和人DEAD盒多肽20基因(/)DX20)。ICSBP是干擾素(INF)調(diào)節(jié)因子家族(IRF)的轉(zhuǎn)錄因子，在人髄細胞白血病中經(jīng)常被下調(diào)(Schmidt，Blood91(1991)，22-29)并且ICSBP缺陷小鼠顯示出類似于人中慢性髄性白血病(CML)的血液學改變(Holtschke，Cell87(1996)，307-317)，提示造血細胞中ICSBP的腫瘤抑制功能。在小鼠中，表明Ets抑制子ETV3(也稱作METS或PE1)和它的協(xié)阻抑物DDX20(也稱作DP103)連接終末單核細胞分化與細胞周期阻抑(Klappacher，Cell109(2002)，169-180)，其也可以表明可能的腫瘤抑制子角色。作為我們的方法的驗證，將來自正常細胞的基因組DNA不做處理或者使用Sssl在體外甲基化，用消化并進行MB-PCR。用消化基因組DNA是因為該酶是甲基不敏感的并且將DNA切割成小片段而相對完整地留下CpG島(Cross，Nat.Genet6(1994)，236-244)?；蛱禺愋訫seI片斜目對于它們的各自基因的第一個啟動子的位置以及用于MB-PCR的基因特異性引物的位置在圖8A中顯示，所有片段都包括推定的鄰近啟動子區(qū)。如圖8B中顯示，當使用正常DNA時，所有5種基因座的M反應都是陰性的，表明這些基因組區(qū)如所預期的在正常血細胞中沒有曱基化。然而，當在進行MB-PCR前用^sl甲基化,外甲基化相同的DNA時，每種基因座都在對應的M《^應中擴增。所以，MB-PCR能夠區(qū)分這些基因座上甲基化和未甲基化狀態(tài)。10.通過MB-PCR分析的肺瘤細胞系中特定CpG烏啟動子的甲基化狀態(tài)在另一實施方案中，測試MB-PCR是否能夠檢測生物樣品中上面的基因座的甲基化狀態(tài)，分析了一些白血病細胞系。通常，總共10ng限制酶消化的DNA用于M反應，5ng相同消化的基因組DNA用于P^jL來自8種不同的白血病細胞系的代表性MB-PCR實驗的結(jié)果在圖9A中顯示。在所有8種樣品的M反應中不同程度地擴增五SiW啟動子，其與以前的報導符合，所述報導表明80。/。以上的AJt血肺瘤中存在異常甲基化。在三種細胞系(THP-1，NB-4，K562)中CDA7V2B啟動子的P反應完全失敗，提示在兩個等位基因上的突變或者缺失，其已經(jīng)以前對于NB-4(Chim，Ann.Hematol.82(2003)，738-742)和K562(Paz，CancerRes.63(2003)，1114-1121)進行了闡明.兩種細胞系KG-1和MUTZ3顯示了對于CWS3V25啟動子的陽性M反應，而三種細胞系(U937，MonoMac6，HL-60)是陰性的。所觀察到的結(jié)果與以前公布的對五S/W(27)和C"Z)A7V25啟動子的甲差J匕分析很符合(Cameroon，Blood94(1999)，2445-2451;Chim(2003)，在上述引文中；Paz(2003)，在上述引文中)。在一些情況下，P反應與其他細胞系相比較弱，提示一個等位基因的喪失或者突變(例如，U937細胞中的ESiW)。有趣的是，還在6種細胞系的M反應中擴增了/CS5戶啟動子，而在￡rK和Z)DX20基因的啟動子中沒有檢測到顯著甲基化。為了確定MB-PCR結(jié)果怎樣與各細胞系中/CS^P啟動子上CpG甲基化的精確模式相關(guān)，通過亞硫酸氫鹽測序分析了/C^AP啟動子甲基化。圖9B中的結(jié)果表明啟動子甲基化程度對應于通過MB-PCR得到的結(jié)果。在KG-1、U937、MUTZ"3、HL-60和K562細胞系中看到的強烈擴增信號(與對應的P反應相當)似乎表明高度甲基化，而弱信號(如對NB-4細胞觀察到的)表明較低程度的甲基化，不存在DNA甲基化時(THP-1和MonoMac6細胞)，MB-PCR是陰性的。11.檢測原代腫瘤細胞中CpG島啟動子的曱基化從一些使泉的人(n-4)的血液單核細胞和具有以前未治療的AML患者(n=35)的白血病胚細胞制備DNA，用Mwl消化，并進行MB-PCR。圖11顯示了9名AML患者和1名正常個體的代表性JC^戶MB-PCR和對應的亞硫酸氫鹽測序結(jié)果。通常，在M反應中觀察到的帶的強度(與對應的P反應比較)與樣品中甲基化的平均強度顯示出良好的相關(guān)性。在測試的35名AML患者中，7名患者(20%)對于/CSAP顯示出陽性MB-PCR結(jié)果，21名患者(60%)對于五511^顯示出陽性MB-PCR結(jié)果，25名患者(71%)對于CDiDV2B顯示出陽性MB-PCR結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。為和甲基化觀察到的頻率與以前研究中描述的頻率一致。/CS5尸甲基化似乎僅僅影響一小組患者。測試了12名患者的五rK3和/)DX20基因的甲基化并且，如對白血病細胞系觀察到的，在任一種樣品中都沒有檢測到顯著甲基化。權(quán)利要求1.一種檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與包含甲基化和/或未曱基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)包括限制酶消化、亞石充酸氫鹽測序、焦磷酸測序、DNA印跡或者PCR。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(c)包括PCR。4.權(quán)利要求1到3任一項的方法，其還包括步驟(d)分析甲基化的DNA。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述分析所述甲基化的DNA包括測序。6.權(quán)利要求1到5任一項的方法，其中所述多狀選自(a)屬于甲基-DNA結(jié)合蛋白(MBD)家族的多肽；(b)(a)的多肽的片段，其中所述片段能夠結(jié)合曱基化DNA;(c)(a)的多肽或者(b)的片段的變體，其中與(a)的多肽或者(b)的片段相比，在所述變體中，一個或多個殘基被替代，并且其中所述變體能夠結(jié)合甲基化DNA;(d)多肽，其是抗甲基化DNA抗體或者其片段；和(e)多肽，其與(a)到(c)任一項的多肽至少70。/。同一并且能夠結(jié)合甲基化DNA。7.權(quán)利要求1到6任一項的方法，其中所述多肽融合到異源多肽。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述異源多肽選自HA-標簽、myc6-標簽、FLAG"標簽、STREP-標簽、STREPIl-標簽、TAP-標簽、HAT-標簽、殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、麥芽糖-結(jié)合蛋白、His6-標簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標簽、Intein-標簽、鏈霉抗生物素蛋白-結(jié)合蛋白(SBP)標簽和抗體的Fc部分。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述抗甲基化DNA抗體是抗-5-甲基胞嘧咬抗體或者其Fab、F(ab，)2、Fv或scFv片段。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述容器用所述多肽直接或者間接包被o11.權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品來自受試者，12.權(quán)利要求11的方法，其中所述受試者被懷疑具有低和/或超甲基化基因座。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述低和/或超曱基化基因座表明癌、肺瘤或者肺瘤轉(zhuǎn)移。14.用于根據(jù)權(quán)利要求1到13任一項的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；和(c)包被所錄器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。全文摘要本發(fā)明涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與含有甲基化和/或未甲基化DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括步驟(d)通過測序分析所檢測的甲基化DNA。本發(fā)明的另一方面是用于根據(jù)本發(fā)明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。文檔編號C12Q1/68GK101124338SQ200580047184公開日2008年2月13日申請日期2005年11月28日優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日發(fā)明者M·雷里申請人:雷根斯堡大學臨床中心