專利名稱：：用于檢測甲基化dna的手段和方法用于檢測甲基化DNA的手段和方法本申請涉及具有編碼雙功能多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述雙功能多肽包含屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)家族的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分。此外，公開了包含所述核酸分子的栽體和宿主細(xì)胞和所述核酸分子編碼的多肽以及產(chǎn)生所述多肽的方法。此外，本申請?zhí)峁┝颂禺惤Y(jié)合所述多肽的抗體和組合物，尤其診斷組合物，所idia合物包含本申請的核酸分子、載體、宿主細(xì)胞、多肽或抗體。此外，提供了使用本發(fā)明的多Jlb險測甲基化DNA，尤其肝瘤組織或者肺瘤細(xì)胞中的甲基化DNA的方法和用途。產(chǎn)生所有活的生物的細(xì)胞的信息包含在它們的DNA中。DNA由簡寫為G、A、T和C的四種4^組成并且像長的梯子一樣構(gòu)造，這些字母對組成梯子的每個"橫檔"。字母G與C配對，A與T配對.這些對的字符串將信息像編碼的信息一樣儲存，組成分組為區(qū)域的特定分子的信息稱作基因，二倍體動物的每個細(xì)胞含有每個基因的兩個拷貝，我們每個基因的一個拷貝來自母親并且一個拷貝來自父親.(該規(guī)則的唯一例外是染色體上決定生物發(fā)育成"雄性"還是"雌性"的基因)。DNA甲基化和基因調(diào)節(jié)除了"拼出"我們的基因組的四種堿基-腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧咬和胸腺嘧咬之外，還存在第五種威基，其通過復(fù)制后DNA的修飾產(chǎn)生.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)可以催化甲基從甲基供體S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧咬環(huán)的轉(zhuǎn)移，并從而產(chǎn)生堿基5-甲基胞嘧咬。特定胞嘧啶殘基在哺乳動物中被修飾，所述胞嘧啶殘基在DNA序列中鳥嘌呤殘基之前(CpG二核苷酸)(Singal，Blood93(1999)，4059-4070);Robertson,Nat.Rev.Genet.1(2000)，11-19;Ng，Curr.Opin.Genet.Dev.(2000)，158-163;Razin，EMBOJ.17(1998)，4905-4卯8)。CpG二核苷酸的甲基化通常與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)并且可能導(dǎo)致大部分非編碼基因組和潛在可能的序列如轉(zhuǎn)座子、重復(fù)或者病毒插入片段不轉(zhuǎn)錄這一事實。有趣的是CpG二核苷酸在基因組中分布非常不均(Singal(1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000),在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)?；蚪M的大部分含有比統(tǒng)計預(yù)期的少得多的CpG。這可能是由于5-甲基胞嘧啶比較容易地脫氨成胸苷，其在進化過程中導(dǎo)致CpG二核苷酸的數(shù)目相對減少。然而，再次，有更多數(shù)目的CpG分布在基因組中，即所稱作的CpG烏。這些區(qū)域通常含有轉(zhuǎn)錄起始點和基因啟動子并且通常不甲基化，相比之下，CpG不與CpG島有關(guān)。在正常細(xì)胞中，CpG島的甲基化僅在罕見的病例中觀察到，如雌性細(xì)胞的x染色體的第二個拷貝和親本印記基因組的失活(Singal(1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。DNA甲基化的調(diào)節(jié)僅僅部分理解DNA曱基化模式怎樣在胚胎發(fā)生過程中建立起來和CpG甲基化怎樣在基因組中保持和受到調(diào)節(jié)(Singal(1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。在哺乳動物物種中，已知有三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、3a和3b)，其催化DNA甲基化過程。然而，必須澄清每種DNMT對于CpG甲基化的維持和調(diào)節(jié)所做貢獻的對應(yīng)份額，然而，所有三種酶顯然對于胚胎發(fā)生都是必需的，對應(yīng)的敲除小鼠在子宮內(nèi)(inutero)死亡或者出生后不久死亡(Bestor，Hum.Mol.Genet.9(2000)，2395-2402;ElOsta，Bioessays25(2003)，1071-1084)。同時已經(jīng)幾次顯示了DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾和某些組蛋白修飾之間的聯(lián)系。DNA的甲基化多數(shù)與組蛋白脫乙酰作用和組蛋白H3的賴氨酸9殘基的曱基化相關(guān)(Sims，TrendsGenet.19(2003)，629-639，F(xiàn)ahrner，CancerRes.62(2002)，7213-7218)。因此，DNMT與組蛋白乙絲轉(zhuǎn)移酶(HDACs)或者攜阻抑物復(fù)合體有關(guān)。還幾乎不知道甲基是怎樣從CpG殘基除去的。在增殖細(xì)胞中，DNA甲基化還可能在復(fù)制期間被動地發(fā)生。然而，也有在有絲分裂后細(xì)胞中DNA甲基化的實例，其可以通過存在活性的迄今還未知的脫甲基酶來解釋(Wo股e，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)，5894-5896)。CpG甲基化和基因沉默啟動子(但不是非調(diào)節(jié)序列)的甲基化與穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄阻抑相關(guān)(Singal(1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，Razin(1998)，在上述引文中)。5-甲基胞嘧啶的阻抑性質(zhì)可以通過兩種機制介導(dǎo)。首先，DNA甲基化可以直接損害轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。第二種可能性沐可能造成最大部分的阻抑)是甲基-Cp&結(jié)合蛋白(MBPs)的募集(Ballestar，Eur.J.股ochem.268(2001)，1-6)。MBP如MECP2或MBD2(MeCPl復(fù)^^的組分)伴隨著協(xié)阻抑物復(fù)合體和HDAC，其具有阻抑效果并且負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄因子不能接近的稠密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(異染色質(zhì))的形成(Ballestar(2001)，在上述引文中)。腫瘤發(fā)生中的外遺傳改變正越來越清楚的是肺瘤的形成不僅受到遺傳損傷(例如，突變或者易位)而且受到外遺傳改變的支持.異常的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或者DNA甲基化可以影響癌基因或者腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)并且可以促進肺瘤生長。DNA甲基化的改變包括正常甲基化序列中甲基化的損失(低甲基化)或者正常的未甲基化序列的甲基化(超甲基化)(Roberston(2000)，在上述引文中，Herman,N.Engl.J.Med.349(2003)，2042-2054;Momparler，Oncogene22(2003)，6479-6483;Esteller,Science297(2002)，1807-1808;Plass，Hum.Mol.Genet11(2002)，2479-2488)。低甲基化已經(jīng)對幾乎所有類型的肺瘤描述了總體DNA低甲基化。在肺瘤組織中，5-甲基胞嘧啶的含量與正常組織相比降低，甲基化事件的主要份額在染色體的重復(fù)衛(wèi)星序列或者著絲粒區(qū)域中發(fā)現(xiàn)。然而，在單個情況中，還已經(jīng)描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的去甲基化和活化(Costello，J.Med.Genet.38(2001)，285-303)。超甲基化或者CpG島CpG島通常發(fā)揮基因調(diào)節(jié)功能。這是為什么甲基化狀態(tài)的改變最直接地與有關(guān)基因座的轉(zhuǎn)錄活性的改變相關(guān)的原因(Robertson(1999);Herman(2003);Esteller(2002);Momparler(2003);Plass(2002)，所有都在上述引文中)。多數(shù)CpG島以未曱基化形式存在于正常細(xì)胞中。然而，在一些情況下，CpG島也可以在基因調(diào)節(jié)事件中被甲基化。雌性細(xì)胞的失活的X染色體的CpG烏的多l(xiāng)bl例如甲基化的(Goto，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998)，362-378)。CpG烏還可以在正常的衰老過程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol.109(2003),103-108)。尤其在腫瘤中，通常不甲基化的CpG島可以以超甲基化形式存在。在許多情況中，受到超甲基化影響的基因編碼抵消腫瘤的生長的蛋白質(zhì)，如腫瘤抑制基因.下表列出了基因的實例，可以表明這些基因在肝瘤中通過超甲基化的外遺傳的機制被失活.表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>DNA修復(fù)06-MGMT2^26DNA甲基轉(zhuǎn)移酶BRCA127《27DNA修復(fù)蛋白程序性細(xì)TMS-1/ASCJ6p"-/)JJ胱天蛋白酶1的銜接子胞死亡胱天蛋白酶8々M-《^/PCD起始物(Fas，Trail，TNF，…)DAPK1IFNy的PCDE-鉀勦著蛋白722黏著分子VHL^26-/^5促進血管發(fā)生的蛋白質(zhì)TIMP國3"《"-《"金屬蛋白酶抑制劑THBS1血管生成抑制劑ER-a"25雌激素受體生長因子RAR-P視黃酸受體應(yīng)答SOCS-lJ印"JAK/STAT信號途徑中的陰性調(diào)節(jié)物腫瘤特異性超甲基化的理由幾乎未知.有趣的是，某些種類的腫瘤似乎具有它們自身的超甲基化譜，可以在更大的比較研究中表明超甲基化不是均勻分布的而是它依賴于腫瘤發(fā)生。在白血病的情況中，與例如結(jié)腸癌或者神經(jīng)膠質(zhì)瘤相比，多數(shù)其他基因;U1曱基化的，從而，超甲基化可以用于對肺瘤分類(Esteller，CancerRes.61(2001)，3225-3229;Costello，Nat-Genet24(2000)，132-138)。在許多情況中，超甲基化還與HDAC的升高的活性組合。用脫甲基化物質(zhì)(例如，5-氮胞苷)治療后，僅在也用HDAC抑制劑(如曲古抑菌素A(TSA))后才可以活化許多甲基化的基因(S股uki，Nat.Genet31(2002)，141-149;Ghoshal，Mol.Cell.Biol.22(2002)，8302-8319;Kalebie，Ann.N.Y.Acad，Sci983(2003)，278-285),劑如TSA治療而逆轉(zhuǎn)TSA(Suzuki(2002);Ghoshal(2002)，在上述引文中)，然而，最近指出，已經(jīng)用于臨床的一種HDAC抑制劑丙戊酸鹽可以導(dǎo)致DNA的脫甲基作用(Detich，J.Biol.Chem.278(2003)，27586-27592)。然而，迄今還沒有在這方面進行系統(tǒng)的分析。逆轉(zhuǎn)外遺傳改變的臨床方法盡管癌癥的遺傳原因(例如，突變)是不可逆的，但是對腫瘤發(fā)生產(chǎn)生影響的外遺傳改變可能是可逆的。從而，外遺傳改變的可能的治療提供了用于治療瘤形成的療法的新的可能性(Herman(2003);Momparler(2003);Plass(2002)，all在上述引文中；Leone,Clin.Immunol.109(2003)，89-102;Claus，Oncogene22(2003)，6489-6496)。20多年前，5-氮雜胞苷已經(jīng)被開發(fā)為抗腫瘤藥物并且在不知該物質(zhì)的分子作用的情況下使用?，F(xiàn)在，它已經(jīng)以進一步開發(fā)的形式(脫氧-5-氮雜胞苷，脫氧氮雜胞苷)用于治療骨髄增生異常綜合征和繼發(fā)性白血病(Leone(2003)，在上述引文中；Lyons,Curr.Opin.Investig.Drugs4(2003)，1442-1450;Issa，Curr.Opin.Oncol.15(2003)，446-451)。由于體外觀察到同作用，當(dāng)前，在世界范圍內(nèi)進行先導(dǎo)研究，組合使用兩類物質(zhì)(Kalebic(2003);Claus(2003)，在上述引文中；Gagnon，AnticancerDrugs14(2003)，193-202;Shaker,Leuk.Res.27(2003)，437-444)。用于分析CpG甲基化的檢測方法用于分析基因組CpG甲基化的檢測方法的開發(fā)具有重要性，這是由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CpG甲基化模式的改變可以與諸如癌癥的疾病有關(guān).當(dāng)前，存在已知的用于檢測已知基因座的CpG甲基化的技術(shù)(Dahl，Biogerontology4(2003)，233-250)。允許分析基因組中CpG甲基化的方法還較不成熟。在下文中，概述了用于分析CpG甲基化的最常見方法以及它們的主要應(yīng)用領(lǐng)域。甲基化敏感性限制酶用于檢測CpG甲基化^^用細(xì)菌限制性內(nèi)切核酸酶的同切點酶確定特定CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)，所述同切點酶的特征是對5-甲基胞嘧啶的不同的敏感性。它的實例是酶和3/印I-都切割CCGG序列，然而僅在內(nèi)部胞嘧啶不被甲基化時切割。一些測定法基于甲基化敏感性限制酶的使用，所述測定法用于分析個體基因和分析整個基因組中的CpG甲基化。甲基化敏感性限制性消化片段多數(shù)通過限制性位點側(cè)翼區(qū)域的DNA印跡或者基因組PCR來檢測(Dahl(2003)，在上述引文中)。迄今已經(jīng)發(fā)表的在基因組中CpG甲基化的所有分析都使用甲基化敏感性限制酶作為該方法的成分。例如，限制性標(biāo)記的基因組掃描(RLGS)(Costello，Methods27(2002),144-149)使用一種二維瓊脂糖i^電泳，其中每一維用不同的甲基化敏感性限制酶消化以鑒定兩個DNA群體中CpG甲基化的身份差異。甲基化CpG島擴增(MCA)富集具有曱基化Smfll限制性位點的片段并且使用LM-PCR富集所述片段。此類擴增產(chǎn)物已經(jīng)通過代表性差別分析(RDA)(Smith,GenomeRes.13(2003)，558-569)或者CpG島微陣列(Yan，CancerRes.6(2001)，8375-8380)成功地分析.對于基因組中CpG甲基化的分析，基于甲基化敏感性限制酶的所有測定法都具有缺點。為了以最佳的方法進行測定，必須保證完成所有限制性消化。最大的缺點是分析僅僅提供已經(jīng)被所用的甲基化敏感性限制酶識別的胞嘧啶瓶基的甲基化狀態(tài)。限制酶的選擇自動地限制了可檢測的序列的數(shù)目-因此對CpG曱基化的中立分析是不可能。用于分斥斤CpG甲基化的亞石危酸氫鹽處理用亞硫酸氬鈉處理雙鏈基因組DNA導(dǎo)致未甲基化的胞嘧啶殘基脫氨成尿嗜啶殘基和形成不再互補的兩條單鏈。在該處理期間，5-甲基胞嘧啶保持不變，以這種方式產(chǎn)生的序列差異形成甲基化和未甲基化DNA之間區(qū)別的^ftb(Frommer，Proc.Natl.Acad.Sci.889(1992)，1827-1831)。用亞硫酸氫鹽處理的DNA可以直接用于PCR中，其中尿嘧啶^(以前為未甲基化的胞嘧咬)和胸苷殘基作為胸苷擴增并且僅僅5-甲基胞嘧咬殘基擴增為胞嘧啶殘基。取決于應(yīng)用，用于PCR的引物在甲基化和未甲基化的序列之間分化或者獨立于甲基化狀態(tài)擴增片段。已經(jīng)使用非區(qū)別性引物擴增的PCR片段可以例如直接測序以確定甲基化和未甲基化CpG中的份額。其他方法利用此類PCR片段的物理差異(解鏈行為、單鏈構(gòu)象、限制酶的限制性位點，等等)用于確定甲基化程度(Dahl(2003)，在上述引文中)。其他方法利用序列中的不同，通過有識別力的引物或者探針進行甲基化和未甲基化序列的特異擴增(甲基化特異性PCR，methylightPCR)(Dahl(2003)，在上述引文中)。通過甲基化特異性寡核苷酸(MSO)微陣列也可以發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物序列中的亞硫酸氫鹽誘導(dǎo)的差異(Shi，J.Cell.股ochem.88(2003)，138-143;Adorjan，NucleicAcidRes.30(2002)，e21;Gitan，GenomeRes.12(2002)，158-164)。與甲基化敏感性限制酶相比，用亞硫酸氫鹽處理的DNA可以提供關(guān)于所擴增的基因組片段中一些CpG殘基的甲基化狀態(tài)的信息。所處理的DNA可能由于其降低的復(fù)雜性和高度變性而不適于整個基因組內(nèi)的分析。用于檢測CpG甲基化的其他方法識別變性的單鏈DNA中CpG甲基化的針對5-甲基胞嘧啶的抗體主要用于個體固定化細(xì)胞的染色體上CpG曱基化的免疫組織化學(xué)染色。然而，這些抗體不適于富集甲基化的序列.在1994年，A.Bird的實驗室已經(jīng)開發(fā)了通過親和層析富集甲基化DNA片段的方法(Gross，Nat.Genet.6(1994)，236-244)。結(jié)合M的重組MECP2用于結(jié)合甲基化的DNA。自此該技術(shù)已經(jīng)被其他工作小組使用、改進和與其他技術(shù)組合使用(Shiraishi，Proc.Natl.Acad.Sci.96(1999)，2913-2918;Brock,NucleicAcid.Res.29(2001)，E123)。強烈或較不強烈的甲基化基因組序列與親和基質(zhì)的結(jié)*賴于鹽濃度，該鹽濃度使得可能分離具有密集甲基化的CpG島與具有較低甲基化密度的其他序列。該親和層析的缺點是需要大量基因組DNA(50-100嗎)和相對耗時的步驟?？紤]到前面的，顯然CpG二核苷酸的甲基化是控制細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性的重要的外遺傳機制。通常，CpG二核苷酸的甲基化與轉(zhuǎn)錄失活相關(guān)。然而，在正?；蛲嘶姆只^程中，基因座的甲基化模式可以改變。因此，在肺瘤發(fā)生期間正常甲基化模式的逆轉(zhuǎn)可以導(dǎo)致基因如肺瘤抑制基因或者癌基因的異常阻抑(或者活化)，并從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。所以，CpG甲基化DNA的檢測和誤調(diào)節(jié)的胂瘤抑制基因和/或癌基因的鑒定是最具臨床重要性的。如上面提到的，現(xiàn)有技術(shù)描述了檢測甲基化DNA的不同方法，然而，其存在某些缺點。例如，現(xiàn)有技術(shù)的方法可能不允許CpG甲基化DNA的中性的基因組范圍的分析或者不適于高通量應(yīng)用或者不能可靠地檢測CpG甲基化的DNA，尤其如果分析的目標(biāo)是少量DNA時。從而，仍然需要其他檢測曱基化DNA的手段和方法，它們可以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足。因此，本發(fā)明下面的技術(shù)問M滿足上述需要。通過提供權(quán)利要求中表征的技術(shù)方案解決了該技術(shù)問題.因此，本發(fā)明的第一方面是具有編碼雙功能多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述雙功能多肽包含屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)家族的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分.所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在下文中描述。它可以在本發(fā)明的備選實施方案中是其片段，只要所述片段能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化的DNA。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，包苷酸序列.優(yōu)選地，編碼所述接頭多肽的核苷酸序列位于編碼本發(fā)明的雙功能多肽的多核苷酸中編碼MBD的核苷酸序列和Fc部分之間，從而它導(dǎo)致所述MBD、接頭多肽和Fc部分的融合。"融合，，指通過兩個和多個蛋白肽主鏈進行共線性連接，從而，優(yōu)選的融合蛋白包括MBD的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段，其中所述片段優(yōu)選具有結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA的活性，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片殺:共價連接到接頭多肽，該接頭多肽自身共價連接如本文描述的抗體的Fc部分。所述多肽接頭優(yōu)選是柔性接頭。優(yōu)選地，它包含多個親水的肽鍵結(jié)合的氨基酸并且連接MBD的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C-末端和Fc部分的N-末端。任選地，本發(fā)明的多肽含有Fc部分之前的蛋白酶切割位點，其允許如需要切割所述Fc部分。蛋白酶切割位點為例如凝血酶切割位點。優(yōu)選地，所述多肽接頭包含多個甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、異亮氨酸和/或精氨酸殘基。還優(yōu)選所述多肽接頭包含M酸序列的多個連續(xù)拷貝。通常，多肽接頭包含1到20個，優(yōu)選1到19個，1到18個，1到17個，1到16個或1到15個氨基酸，盡管多于20個M酸的多肽接頭也可以使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多肽接頭包含1到14個氨基酸殘基。在本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽中的所述多肽接頭包含14個氨基酸。如所附實施例中闡明，所述多肽接頭有利地包含^&酸序列"AAADPIEGRGGGGG"，其也在SEQIDNO:2(圖l)的116到129位顯示。本發(fā)明的多肽可以任選在其N和/或C-末端包含標(biāo)記。"標(biāo)記"是與它所融合的M酸序列同源或者異源的M酸序列。所述標(biāo)記可以方便它融合的所述蛋白質(zhì)的純化或方便所述蛋白質(zhì)的檢測。優(yōu)選地，所述標(biāo)記選自HA-標(biāo)記、myc6-標(biāo)記、flag-標(biāo)記、str印誦標(biāo)記、strepII-標(biāo)記、TAP-標(biāo)記、HAT-標(biāo)記、殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)、麥芽糖結(jié)合蛋白、免疫球蛋白A(IgA)、His-6-標(biāo)記、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記、內(nèi)含肽和鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合蛋白(SBP)標(biāo)記。CpG島通常含有基因啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點并且在正常細(xì)胞中通常不甲基化。CpG島的甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。在癌中，CpG島啟動子的甲基化導(dǎo)致腫瘤抑制子基因的異常沉默，促進疾病的致病。迄今，在人類癌癥中異常的CpG烏甲基化的研究主要采用候逸基因方法，然而，該方法具有幾個缺點。這些缺點是例如不完全覆蓋涉及可能是甲基化(超曱基化或低甲基化)對象的腫瘤發(fā)生中的基因座或者當(dāng)使用例如限制性標(biāo)記的基因組掃描(RLGS)時由于受限的手段和方法而導(dǎo)致基因座的不完全分析.為了允許在基因組范圍內(nèi)無偏i^險測CpG甲基化的DNA，本發(fā)明提供了允許分離和檢測CpG甲基化的手段和方法，而不應(yīng)用例如甲基化敏感性限制性內(nèi)切核酸酶或者亞硫酸氫鹽處理。這些手段和方法是基于結(jié)合曱基-CpG的抗體樣蛋白質(zhì)，其有效結(jié)合CpG甲基化的DNA。如本文所述的，結(jié)合甲基-CpG的抗^#蛋白質(zhì)包含屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的恒定部分。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，重組的結(jié)合甲基-CpG的抗體樣蛋白質(zhì)可以優(yōu)選以抗體樣方式結(jié)合CpG甲基化的DNA。il^示本發(fā)明的結(jié)合甲基-CpG的抗體樣蛋白質(zhì)對它的"抗原"具有高親和性和高親合性，所述抗原優(yōu)選為優(yōu)選在CpG二核苷酸甲基化的DNA。不被理論束綽，本發(fā)明的多Jlb寸它的"抗原"的高親和性和親合性由所述結(jié)合甲基-CpG的抗體樣蛋白質(zhì)的獨特結(jié)構(gòu)引起。認(rèn)為本發(fā)明多肽的獨特結(jié)構(gòu)通過存在抗體的恒定區(qū)并從而使得所述多肽優(yōu)選為雙功能分子而實現(xiàn)。認(rèn)為恒定區(qū)在本發(fā)明的兩種多肽分子的每種的恒定區(qū)的免疫球蛋白重鏈之間形成二>^鍵。因此，優(yōu)選形成與抗體的結(jié)構(gòu)非常相似的抗^#結(jié)構(gòu)。再次，不被理論束縛，認(rèn)為該結(jié)構(gòu)增加本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性。這是因為，在本領(lǐng)域中描述，與抗體的恒定區(qū)融合的蛋白質(zhì)可以賦予所述蛋白質(zhì)更高的穩(wěn)定性和更長的半壽期。此外，認(rèn)為恒定區(qū)的分子間相互作用導(dǎo)致的抗體樣結(jié)構(gòu)將本發(fā)明一個多肽的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與本發(fā)明另一多肽的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域密切接近。這允許甲基-DNA結(jié)合蛋白和甲基化DNA之間的二價相互作用。因此，本發(fā)明多肽優(yōu)選能夠通過作為本發(fā)明多肽的部分的兩個甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到它的抗原。本發(fā)明多肽的高親和力結(jié)合尤其還通過優(yōu)選使用蛋白質(zhì)的甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)，而不實現(xiàn)，所述:長甲基DNA結(jié)合蛋白質(zhì)可能擾亂或者干擾如本文描述的獨特適用性，已知甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域來特異結(jié)合甲基化DNA,優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是結(jié)合未甲基化的DNA。此外，甲基DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選使用保證實際上結(jié)合甲基化的DNA，因為檢測是直接而不是間接的。多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)方法僅可以通過PCR間接檢測甲基化的DNA。這些性質(zhì)使得本發(fā)明的多肽成為可靠和容易應(yīng)用的診斷工具，用于分離、純化、富集和/或檢測甲基化DNA，即使所述DNA僅以非常少量存在，例如，約大于10ng、小于10ng、小于7,5ng、小于5ng、小于2,5ng或者約lng，如本文所述。因此，由于它的抗體樣結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的多肽是有效的分子，其使得它可以應(yīng)用于例如多種應(yīng)用，包括單管測定中的多步步驟。例如，使用反向South-Western印跡分析和甲基-CpG免疫沉淀(MCIp)闡明了CpG甲基化DNA的特定分離和檢測。MCIp結(jié)合實時PCR，例如，LightCyclerPCR，允許從少至例如lng總基因組DNA靈敏,測候選CpG島啟動子的CpG島甲基化。MCIp產(chǎn)生的基因組DNA片段可以容易地擴增、標(biāo)記和用于CpG島微陣列雜交。使用本文描述的技術(shù)，可能產(chǎn)生人癌癥中異常CpG島甲基化的基因組范圍的分布圖和例如鑒定肺瘤抑制基因或者其他抑制基因活性。在詳細(xì)描述本發(fā)明前，將理解本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、方案、細(xì)菌、栽體和試劑等等，因為它們可以改變.還將理解本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不意在限制本發(fā)明的范圍，其僅僅受到所附權(quán)利要求的限制。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。優(yōu)選地，本文4吏用的術(shù)語如"Amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(IUPACRecommendations)",Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和K61bl，H.eds.(1995)，HelveticaChimicaActa,CH-4010Basel,Switzerland)中描述的定義。在該說明書和下面的權(quán)利要求書全文中，除非上下文需要相反的意思，單詞"包含"和變型如"包括，，將理解為暗含包括所述的整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟，但是不排除任何其他整數(shù)或步驟或者一組整數(shù)或步驟.必須指出如本文和所附權(quán)利要求書中所用的，單數(shù)形式"一種"、"這種"包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文清楚地指出相反意思。從而例如，對"一種試劑"的引用包括一種或多種此類不同的試劑，并且對"這種方法"的引用包括引用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的等同步驟和方法，其可以修^j5或者替代本文描述的方法。術(shù)語"核酸分子"當(dāng)用于本文時包括任一核酸分子，其具有包含嘌呤和嘧咬威基的威基的核苷酸序列，所述^J^被所述核酸分子包含，其中所述堿基代表核酸分子的一級結(jié)構(gòu)。核酸序列包括有義和反義鏈的DNA、cDNA、基因組DNA、RNA、合成形式，例如，PNA和混合的聚合物，或者可以含有非天然或者衍生的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理成，其可以是未經(jīng)修飾的RNA或者DNA或者經(jīng)修飾的RNA或者DNA。例如，多核苷酸可以由單鏈和雙鏈DNA、為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA和為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的RNA、包含可以為單成。此外，多核苷酸可以由包含RNA或者DNA或者RNA和DNA的三鏈區(qū)組成。多核苷酸還可以含有一個或多個經(jīng)修飾的^或者為了穩(wěn)定性或者其他原因修飾的DNA或者RNA主鏈。"經(jīng)修飾的，，堿基包括例如，三苯甲基^ft^和稀有M如次黃噪呤?？梢詫NA和RNA做出多種*;從而術(shù)語"核酸分子"包括化學(xué)、敝或者代謝糾的形式。術(shù)語"多肽"當(dāng)在本文中使用時指可互換使用并且包含給定長度的氨基酸鏈的肽、蛋白質(zhì)或者多肽，其中氨基酸^JJf過共價肽鏈連接。然而，本發(fā)明還包括此類蛋白質(zhì)/多肽的擬物(peptidomimetics),其中M酸和/或肽鍵已經(jīng)被功能類似物以及其他20種基因編碼的M酸之外的^J^酸如硒代半胱氨酸替代.肽、寡肽和蛋白質(zhì)可以稱作多肽。如所提到的，術(shù)語多肽和蛋白質(zhì)通常在本文中可互換使用。術(shù)語多肽還指并且不排除多肽的修飾.修飾包括糖基化、乙酰化、跣化、磷酸化、ADP-核糖基化、酰胺化、共價連接黃素、共價連接血紅素部分、共價連接核苷酸或者核苷酸衍生物、共價連接脂類或者脂類衍生物、共價連M脂跣肌醇、共價交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基作用、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、formulation、傳化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的加入，如精氨酰化，和遍在蛋白化；見例如，PROTEINS曙STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,2ndEd"T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993);POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson,Ed"AcademicPress,NewYork(1983)，pgs.1-12;Seifter，Meth.Enzymol.182(19卯)；626-646,Rattan,Ann.NYAcad.Sci.663(1992);48-62。本發(fā)明的多肽優(yōu)選具有如本文描述的本發(fā)明的核酸分子編碼的氨基酸序列或者可以通過產(chǎn)生所述多肽的方法或者產(chǎn)生能夠表達(dá)本文描述的多肽的細(xì)胞的方法得到。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，所述多肽是雙功能多肽。"雙功能多肽"指本發(fā)明的多肽，由于抗體的Fc部分是本發(fā)明多肽的部分，該多肽除了結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選結(jié)合CpG甲基化DNA外還具有其他能力，例如，所述Fc部分優(yōu)選賦予將化合物或者部分綴合、連接或者共價偶聯(lián)所述Fc部分的可能性。本文使用的術(shù)語"共價偶聯(lián)的，，指特定化合物或者部分直接共價相互結(jié)合；或者通過一個或多個間插部分，如橋、間隔臂或者一個或多個連接部分間接共價結(jié)合。此類化合物可以是可檢測的物質(zhì)。可檢測的物質(zhì)的實例包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬，使用多種正電子發(fā)射成像術(shù)，和非放射性順磁金屬離子?？蓹z測的物質(zhì)可以直接偶聯(lián)或者級合到抗體的Fc部分(或者其部分)或者通過中間體(如本文中已知的接頭)，使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)間接偶聯(lián)或者綴合。關(guān)于可以綴合到抗體的Fc部分用作根據(jù)本發(fā)明的診斷劑的金屬離子，見例如美國專利號4，741，卯0。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、^半乳糖苷酶或者乙酰膽喊酯酶；合適的輔基復(fù)合體的實例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三喚基胺熒光素、丹磺酰氯或者藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括荄光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性物質(zhì)的實例包括12SI、1311或991\:,此外，所述Fc部分可以綴合到治療部分如細(xì)胞毒素，如細(xì)胞抑制劑或者殺細(xì)胞劑、治療劑或者it射性金屬，例如，a射線發(fā)射體，如21381。細(xì)胞毒素或者細(xì)胞毒性劑包括對細(xì)胞有害的任何物質(zhì)。實例包括紫杉醇、細(xì)胞松他素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根喊、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、M新堿、長春喊、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤莓素和其類似物或同系物。治療劑包括但不限于，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基噤呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、a霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(ll)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(以前道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(以前放線菌素)、博來霉素、光輝霉素、和氨茴霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(例如，^新堿和長*>成)。此外，本發(fā)明多肽的Fc部分可以偶聯(lián)或者級合到具有目的生物活性的蛋白質(zhì)或者多肽.此類蛋白質(zhì)可以包括例如，毒素如相思豆毒蛋白、蓖M蛋白A、假單胞菌外毒素、或者白喉毒素；蛋白質(zhì)，如肺瘤壞死因子、a干擾素、^干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、細(xì)胞凋亡劑。Fc部分還允許本發(fā)明的多肽附著到固相支持體，其尤其可用于免疫測定或者純化如本文描述的把抗原。此類固相支持體包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯跣胺、尼龍、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或者聚丙烯等等。將化合物綴合、偶聯(lián)或者連接到Fc部分的技術(shù)是公知的，見例如，Arnon等人"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrom等人，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等人(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies，84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985);"Analyzis，Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy'",inMonodonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(AcademicPress1985)，和Thorpe,Immunol.Rev.，119-158。術(shù)語"屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)家族的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域"包括優(yōu)選具有MBD家族的蛋白質(zhì)的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的多肽，所述MBD家族包括蛋白質(zhì)MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法檢測甲基-DNA結(jié)合活性。術(shù)語"曱基化DNA"優(yōu)選包括甲基化DNA，更優(yōu)選地，CpG甲基化DNA，包括半甲基化DNA或者在兩^上甲基化的DNA或者單鏈甲基化DNA.迄今最重要的實例是曱基化的胞嘧啶，其主要在二核苷酸CpG背景中和CpNpG-和CpNpN-序列的背景中發(fā)生.原則上，其他天然存在的二核苷酸也可以被甲基化。優(yōu)選本發(fā)明的多肽作為本文描述的單體或者二聚體或者多價分子結(jié)合甲基化的DNA。它優(yōu)選能夠結(jié)合高度甲基化的DNA或者低甲基化的DNA。優(yōu)選地，它可以結(jié)合單個甲基化的CpG對，MeCP2、MBDl、MBD2、MBD3和MBD4組成了共有甲基-CpG^結(jié)合結(jié)構(gòu)域的脊推動物蛋白質(zhì)家族。MBD蛋白質(zhì)家族包含基于已知的MBD的序列的兩個亞組。MBD4的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與MeCP2在一級序列上最相似，而MBD1、MBD2和MBD3的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互之間比與MBD4或者MeCP2更相似。然而，基于在MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4的所有5種基因內(nèi)的保守位置上存在內(nèi)0，每種蛋白質(zhì)內(nèi)的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域似乎在進化上相關(guān)。然而，MBD家族的成員之間的序列相似性很大程度上局限于它們的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，盡管MBD2和MBD3是相似的并JL^大部分它們的長度上共有約70%的總同一性.最大的分歧發(fā)生在C-末端，其中MBD3具有12個連續(xù)谷氨酸殘基。根據(jù)本發(fā)明使用的MBD或者其片段，優(yōu)選甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段可以例如通過使用本領(lǐng)域已知、優(yōu)選本文描述的手段和方法進行序列比較和/或比對和將已知的MBD與懷疑為MBD的序列比較和/或比對來鑒定。例如，當(dāng)兩個比較的序列兩者中的一個位置被相同4^或者^J^酸單體亞基占據(jù)(例如，如果兩個DNA分子每一個中的一個位置M嘌呤占據(jù)，或者兩個多肽的每一個中的一個位置，氨酸占據(jù))時，那么各自分子在該位置上是同一的。兩條序列之間同一性百分lbl兩條序列共有的匹配或者同一位置的數(shù)目除以位置數(shù)xlOO的函數(shù)。例如，如果兩條序列中10個位置的6個是匹配或者同一的，那么這兩條序列是60%同一的。作為實例，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%同源性(6個總位置的3個是匹配的)。通常，當(dāng)兩條序列比對以得到最大同源性和/或同一性時進行比較。使用通過計算機程序如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地實現(xiàn)的例如Needleman，J.MolBiol.48(1970):443-453的方法可以提供此類比對。同源序列共有相同或相似的氨基酸戎基，其中相似的^J^是比對的參考序列中對應(yīng)M酸殘基的保守替代或者"允許的點突變"。在這方面，參考序列中殘基的"保守替代，，是物理上或者功能上類似于對應(yīng)的參考?xì)埢哪切┨娲缇哂邢嗨频拇笮?、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)的替代，包括能夠形成共價鍵或者氬鍵等等。尤其優(yōu)選的保守替M滿足Dayhoff等人，5:AtlasofProteinSequenceandStructure,5:Suppl.3,chapter22:354-352，Nat.Biomed.Res.Foundation,Washington,D.C.(1978)中對"可接受的點突變"定義的標(biāo)準(zhǔn)的那些保守替代。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段具有如本文描述的結(jié)構(gòu)和/或功能特征。優(yōu)選地，本文描述的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段能夠結(jié)合甲基化的DNA，優(yōu)選CpG甲基化的DNA。本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段優(yōu)選為昆蟲來源、線蟲來源、魚來源、兩棲動物來源，更優(yōu)選為脊推動物來源，甚至更優(yōu)選為哺乳動物來源，最優(yōu)選為小鼠來源，尤其優(yōu)選為人來源的。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段具有獨特的a-螺4t/jS鏈夾層結(jié)構(gòu)，其具有如Ballester和Wolffe，Eur.J.股ochem.268(2001)，1-6的圖1中所示的特征環(huán)并且能夠結(jié)合曱基化DNA。更優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的MBD或者其片段包含Ballester和Wo附e(2001)，在上述引文中所示的MBD的至少50個，更優(yōu)選至少60個，甚至更優(yōu)選至少70個或者至少80個氨基酸殘基并且能夠結(jié)合甲基化DNA。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段與Ballester和Wolffe(2001)，在上述引文中的圖1中所示的MBD在氨基酸水平上共有優(yōu)選50%、60%、70%、80%或90%、更優(yōu)選95%或97%、甚至更優(yōu)選98%，最優(yōu)選99%同一性，并且能夠結(jié)合甲基化DNA。確定序列(如M酸序列)的同一性的手段和方法在本文別處描述。最優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者其片段包含Ballester和Wo附e(2001)，在上述引文中的圖1中所示的MBD蛋白質(zhì)的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者Hendrich和Tweedy,TrendsGenet.19(2003)，269-77中描述的MBD蛋白的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且能夠結(jié)合甲基化DNA。當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的多肽優(yōu)選是雙功能的并且含有優(yōu)選如上所述的兩個甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中優(yōu)選地兩個甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域都能夠結(jié)合單個甲基化的CpG對.在本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人MBD2的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在更尤其優(yōu)選的實施方案中，甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人MBD2的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含具有Genbank檢索號NM_003927的^^酸序列的M酸144到230。在最尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽的甲基-DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含來自SEQIDNO:2(圖1)中所示的M酸序列的29到115位的M酸序列。作為本發(fā)明多肽組分的抗體的"Fc部分"優(yōu)選包含免疫球蛋白重鏈分子的恒定區(qū)的至少一部分。Fc區(qū)域優(yōu)選限于恒定結(jié)構(gòu)域鉸鏈區(qū)和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明多肽中的Fc區(qū)域還可以限于鉸鏈區(qū)的部分，該部分能夠形成分子間二石克鍵，和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或者其功能等同物。備選地，還優(yōu)選Fc部分包含至少所需的那些CH區(qū)域，使得本發(fā)明的多肽仍然具有本文上述多肽的性質(zhì)，尤其用于所附實施例中多肽的性質(zhì)。在另一備選方案中，還優(yōu)選所述恒定區(qū)當(dāng)與本領(lǐng)域中已知的恒定區(qū)比較時含有一個或多個M酸替代。優(yōu)選地，它含有1到100、1到卯、1到80、1到70、1到60、1到50、1到40、1到30或1到20，更優(yōu)選1到10、甚至更優(yōu)選1到9、1到8、1到7或1到6最優(yōu)選1到5、1到4、1到3或2或1個替代。優(yōu)選如本領(lǐng)域所述的進行或者比較，更優(yōu)選地，如本文別處描述的進行比較。備選地，所述恒定區(qū)優(yōu)選包含至少CH1區(qū)，更優(yōu)選CH1和CH2區(qū)，最優(yōu)選CHl、Ch2和Ch3區(qū)。如本領(lǐng)域中已知，抗體的恒定區(qū)含有兩個免疫球蛋白重鏈，其^^有由約110個M酸組成的三個特征性免疫^l蛋白結(jié)構(gòu)域，其中兩個免疫球蛋白重鏈通過二硫鍵共價連接。不被理論束縛，認(rèn)為包含甲基化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分的本發(fā)明的新生的多JlM^宿主細(xì)胞內(nèi)折疊，從而優(yōu)選地，兩個多肽以與抗體的恒定區(qū)類似或優(yōu)選相同的方式連接在它們的Fc部分，得到如本文描述的雙功能多肽。還設(shè)想恒定區(qū)可以優(yōu)選為雞或者鴨來源的.然而，優(yōu)選地，恒定區(qū)是IgM、IgA、IgD或IgE同種型的，并且更優(yōu)選地，它是IgG同種型的，最優(yōu)選IgGl同種型的。優(yōu)選地，前述同種型是脊推動物來源的，更優(yōu)選為哺乳動物來源的，甚至更優(yōu)選為小鼠、大鼠、山羊、馬、驢、駱駝或者黑猩猩來源的，最優(yōu)選為人來源的，優(yōu)選地，所述IgG同種型是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4類的，所述IgA同種型是IgAl、IgA2類的。如本文所述，本發(fā)明優(yōu)選提供了雙功能多肽。然而，還設(shè)想包含一個或多個本發(fā)明的雙功能多肽的多聚雙功能多肽。此類多聚體可以通過使用通常多價的Ig分子如IgM五聚體或者IgA二聚體的那些Fc區(qū)域或者其部分產(chǎn)生。可以理解可以需要J鏈多肽形成和穩(wěn)定IgM五聚體和IgA二聚體。在更優(yōu)選的實施方案中，上述包含本發(fā)明的核苷酸序列的核酸分子選自(a)具有SEQIDNO:l(圖l)中顯示的核苷酸序列的核酸序列；(b)核酸序列，其具有編碼SEQID:NC^(圖1)中顯示的M酸序列的多肽的核苷酸序列；(c)核酸序列，其具有編碼具有SEQID:NO2(圖1)中顯示的M^列的多肽的片段的核苷^f列，其中所述片段包含所述多肽的至少M酸130到361，并且能夠結(jié)合甲基化的DNA;(d)核酸序列，其具有編碼(a)到(c)任一項的多核苷酸編碼的多肽的變體的核苷酸序列，其中在所述變體中，一個或多個氨基酸殘基與所述多IM目比被替代，并且所述變體能夠結(jié)合甲基化的DNA;(e)具有核苷酸序列的核酸序列，所述核苷酸序列與(a)到(d)任一項的核酸序列雜交并且與(a)的核酸分子的核苷酸序列至少65%同一并且編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(f)核酸分子，其編碼與(b)的核酸分子編碼的多肽至少65%同一并且能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；和(g)核酸序列，其具有作為(a)到(f)任一項的多核苷酸的核苷酸序列的簡并序列的核苷酸序列；或者這種多核苷酸的互#^。如上文所述，具有SEQID:NO2(圖1)中所示M酸序列的本發(fā)明多肽的片段包含SEQID:NO2(圖l)中所示絲紗列的至少絲酸130到361。這意味著除了代表Fc部分的氨基酸130到361外，所述片段還可以包含一個或多個氨基酸，從而所述片段能夠結(jié)合甲基化DNA,優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA。因此，設(shè)想所述片段更優(yōu)選地包含SEQID:NO2(圖l)中所示M酸序列的至少氨基酸116到361。甚至更優(yōu)選地，所述片段可以包含SEQID:NO2(圖l)中所示M酸序列的至少氨基酸29到115和130到361。在最優(yōu)選的實施方案中，所述片段可以包含至少氨基酸29到361。通常優(yōu)選本發(fā)明多肽的片段能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA。該能力可以通過本領(lǐng)域中已知的方法或者優(yōu)選通過所附實施例中描述的那些方法測試。本發(fā)明多肽的"變體"包含多肽，其中與所述多^M目比，一個或多個氨基酸殘基被替代，優(yōu)選被保守替代，并且其中所述變體優(yōu)選能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA。此類變體包括根據(jù)本領(lǐng)域中已知的一般規(guī)則選擇的缺失、插入、倒位、重復(fù)和替代，以便對本發(fā)明的多肽的活性沒有影響。例如，關(guān)于怎樣產(chǎn)生表型上沉默的JL^酸替代的指導(dǎo)在Bowie，Science247:(19卯)1306-1310中提供，其中作者指出有兩個主要策略用以研究M酸序列對改變的耐受性。第一種策略利用在進化過程中自然選擇對M酸替代的耐受性。通過比較不同物種中M酸序列，可以鑒定保守的氨基酸。這些保守的氨基酸對于蛋白質(zhì)功能可能是重要的。相比，替代被自然選擇耐受的M酸位置表明這些位置對于蛋白質(zhì)功能不是關(guān)鍵的。從而，可以修飾耐受M酸替代的位置而仍然保留蛋白質(zhì)的生物活性。第二種策略使用遺傳工程在所克隆的基因的特定位置引入氨基酸改變以鑒定對于蛋白質(zhì)功能關(guān)鍵的區(qū)域。例如，可以使用位點定向誘變或者丙氨酸掃描誘變(在分子的每個殘基引入單個丙氨酸突變)(Cunniiigham和Wells,Science244:(1989)1081-1085.)。然后可以測試所得突變分子的生物活性，如作者指出的，這兩種策略已經(jīng)揭示蛋白質(zhì)令人驚奇地耐受M酸替代.作者還指出哪些氨基酸改變可能在蛋白質(zhì)的某些M酸位置是允許的。例如，多數(shù)埋入(在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)內(nèi))的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而通常表面?zhèn)孺湈缀鯖]有特征是保守的。本發(fā)明包括多肽，其具有較低的同一性程度但是具有足夠的相似性以便進行如本發(fā)明多肽執(zhí)行的一種或多種功能。通過保守絲酸替代確定相似性。此類替代是通it^目似特征(例如，化學(xué)性質(zhì))的另一M酸替代多肽中給定氨基酸的那些替代.根據(jù)上文的Cunningham等人，此類保守替代可能是表型沉默的。關(guān)于哪些氨基酸改變可能是表型沉默的額外的指導(dǎo)可以見Bowie,Science247:(19卯)1306-1310。本發(fā)明的耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或者疏水氨基酸Ala、Val、Leu和lie的替代；羥基殘基Ser和Thr的替代；酸性殘基Asp和Glu的替代；酰胺殘基Asn和Gin的替代；堿性殘基Lys、Arg和His的替代；芳族殘基Phe、Tyr和Trp的替代，和小尺寸氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替代。此外，本發(fā)明還包括下表提供的保守替代。表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>除了上述用途，此類li^酸替代還可以增加蛋白質(zhì)或者肽穩(wěn)定性，本發(fā)明包括M酸替代，其含有例如蛋白質(zhì)或者肽序列中一個或多個非肽鍵(其替代肽鍵)。還包括這樣的替代，其包括不同于天然發(fā)生的L-氨基酸的氨基酸殘基，如D-iJ^酸或者非天然發(fā)生的或者合成的氨基酸，例如，^或者7氨基酸，參考下面的出版物可以容易地計算同一性和相似性ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InfoliuatiesandGenomeProjects,Smith,DM.，ed.，AcademicPress,NewYork,1993;InformafiesComputerAnalyzisofSequenceData,Part1,Griffin，A.M.，andGriffin,H.G.，eds"HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalyzisinMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademiePress,1987;andSequenceAnalyzisPrimer,Gribskov，M.和Devereux，eds.，MStocktonPress,NewYorb1991。如上述，本發(fā)明還涉及核酸序列，其與如本文描述的(圖l)SEQIDNO:1中顯示的核酸序列或者其片段或變體雜交并且與SEQIDNO:l(圖l)中顯示的核酸序列至少65%同一并且優(yōu)選編碼能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA的多肽。還如所述的，本發(fā)明優(yōu)選涉及編碼與SEQIDNO:2中顯示的多肽至少65%，更優(yōu)選70%、75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選99%同一的多肽的核,列。根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語"雜交"優(yōu)選涉及在嚴(yán)*件下雜交。術(shù)語"雜交序列，，優(yōu)選指與上文所述的編碼能夠結(jié)合甲基化DNA,優(yōu)選CpG甲基化DNA，而不是未甲基化的DNA的多肽的核酸序列具有至少65%的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少70%，尤其優(yōu)選至少80%，更尤其優(yōu)選至少90%,甚至更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%、98%或99%的同一性的序列。可以根據(jù)如在Sambrook，Russell"MolecularCloning,ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(2001);Ausubel，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.(1989)，或Higgins和Hames(Eds.)"Nucleicacidhybridization,apracticalapproach"IRLPressOxford,WashingtonDC,(1985)中描述的常規(guī)方案建立所述雜交條件。條件的設(shè)置在技術(shù)人員能力范圍內(nèi)并且可以根據(jù)本領(lǐng)域描述的方案確定。從而，僅特異雜交序列的檢測將通常要求嚴(yán)4NHt和洗滌條件，如65。C下O.lxSSC，0.1%SDS。用于檢測同源的或者非準(zhǔn)確互補序列的非嚴(yán)格雜交條件可以設(shè)置為65°C下的6xSSC，l。/。SDS。如/〉知的，^4f長度和將確定的核酸的組成構(gòu)成了雜交條件的其他^lt。注意到上述條件的變化可以通過包括和/或替代用于抑制雜交實驗中背景的備選封閉試劑來完成。典型的封閉試劑包括Denhardt試劑、BLOTTO、肝素、變性鮭精DNA，和可商購的專利制劑。由于與相容性相關(guān)的問題，特定封閉試劑的包括可以需要修飾上述雜交條件。雜交核酸分子還包含上述分子的片段。此類片段可以代表如本文所述的核酸序列。此外，與上述核酸分子的任一種雜交的核酸分子還包括這些分子的互補片段、衍生物和等位基因變體。此外，雜交復(fù)合體指通過在互補的G和C^之間和互補的A和T^之間形成氬鍵，在兩條核,列之間的復(fù)*;這些氫鍵可以通it^堆積作用進一步穩(wěn)定化。兩條互補的核酸序列以反平行構(gòu)型以氬鍵結(jié)合。雜交復(fù)合體可以在溶液(例如，Cot或Rot分析)中形成或者在溶液中存在的一種核酸序列和固相支持體(例如，膜、濾器、芯片、針、或者載玻片，其上已經(jīng)固定例如細(xì)胞)上固定的另一種核酸序列之間形成。術(shù)語互補的或者互補性指在堿基配對許可的鹽和溫度條件下，多核苷酸的天然結(jié)合。例如，序列"A-G-T，，結(jié)合互補序列"T-C-A"。兩個單鏈分子之間的互補性可以是"部分的"，其中僅一些核酸結(jié)合，或者當(dāng)兩個單鏈分子之間存在完全互補性時，結(jié)合可以是完全的。核酸鏈之間互補性程度對于核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著影響。這在擴增反應(yīng)中尤其重要，其取決于核酸鏈之間的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，在兩個或多個核酸或者M酸序列上下文中，術(shù)語"同一的，，或者"百分比同一性"指當(dāng)為了最大對應(yīng)在比較窗口或者在指定的區(qū)域內(nèi)進行比較和比對時，如使用本領(lǐng)域已知的序列比較算法，或者通過手工比對和視覺檢查測量的，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸^或者核苷酸(例如，至少65%同一性，優(yōu)選至少70-95%同一性，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或99%同一性)的兩個或多個序列或者子序列。具有例如65%到95%或者更大序列同一性的序列被認(rèn)為是實質(zhì)同一的。這種定義還應(yīng)用于測試序列的互補序列.優(yōu)選地，所描述的同一性存在于長為至少約232個M酸或者696個核苷酸的區(qū)域內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣使用例如基于如本領(lǐng)域已知的CLUSTALW計算;^序(ThompsonNucl.AcidsRes.2(1994)，4673-4680)或FASTDB(BrutlagComp.App.Biosci.6(1990)，237-245)的算法確定序列之間和之中的百分比同一性。盡管FASTDB算法通常不考慮序列中的內(nèi)部非匹配缺失或者添加，即，缺口，但是在它的計算中，這可以手工校正以避免o/。同一性的過高估計。然而，CLUSTALW不將序列缺口計入它的同一性計算中。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以得到的是BLAST和BLAST2.0算法(AltschulNud.AcidsRes.25(1977),3389-3402)。用于核酸序列的BLASTN程序使用字長(W)ll、期望值(E)IO、M=5、N-4和兩條隨的比較作為默認(rèn)值。對于M酸序列，BLASTP程序使用字長(W)3、期望值(E)10作為默認(rèn)值。BLOSUM62評分矩陣(HenikoffProc.Natl.Acad.Sci.，USA,89，(1989)，10915)使用比對(B)50、期望值(E)IO、M=5、N^4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)值。例如，代表基本局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)(Altschul，Nucl.AcidsRes.25(1997)，3389-3402;Altschul，J.Mol.Evol.36(1993)，290-300;Altschul,J.Mol.Biol.215(l外O)，403-410)的BLAST2.0可以用于搜索局部序列比對。BLAST產(chǎn)生核苷酸和M酸序列的比對以確定序列相似性。因為比對的局部性質(zhì)，BLAST特別可用于確定精確匹配或者鑒定相似序列。BLAST程序輸出的基M位是高得分區(qū)M(High-scoringSegmentPair)(HSP)。HPS由任意但是相等長度的兩個序列片段組成，所述片段的比對為局部最大并且它們的比對得分滿足或者超過用戶設(shè)置的閾值或者截斷得分。BLAST方法是尋找查詢序列和數(shù)據(jù)庫序列之間的HPS，以評估所發(fā)現(xiàn)的任何匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性，和僅報告滿足用戶選擇的顯著性閾值的那些匹配.^ItE建立統(tǒng)計學(xué)顯著性閾值用于報告數(shù)據(jù)庫序列匹配。E解釋為在整個數(shù)據(jù)庫檢索的背景中HSP(或者HPS集合)的機會發(fā)生的預(yù)期頻率的上限。匹配滿足E的任何數(shù)據(jù)庫序列以程序輸出報告。使用BLAST(Altschul(1997)，在上述引文中；Altschul(1993)，在上述引文中；Altschul(1990)，在上述引文中)的類似的計算機技術(shù)搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫如GenBank或EMBL中的相同或者相關(guān)的分子，該分析比基于多個膜的雜交快得多。此外，可以修飾計算機搜索的靈敏性以確定任一具體匹配分類為精確的還是相似的。搜索的M是乘積得分，其定義為%序列同一性x。/。最大BLAST得分100并且它考慮兩條序列之間的相似性程度和序列匹配的長度。例如，對于40的乘積得分，匹配將在1-2%誤差內(nèi)是精確的；在70時，匹配將是精確的。通iti^擇顯示出15到40的乘積得分的那些分子，通常鑒定相似的分子，盡管較低的得分可以鑒定相關(guān)的分子。此外，本發(fā)明還涉及核酸分子，所述核酸分子的序列與上述核酸分子的序列相比是簡并的。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時，術(shù)語"遺傳密碼簡并產(chǎn)物"指由于遺傳密碼冗余性，不同的核苷酸序列編碼相同的氨基酸。當(dāng)然，本發(fā)明還設(shè)想上文和下面提到的核酸分子的互##:(如果它們可以為單鏈形式)。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子可以是任何類型的核酸，例如，DNA、基因組DNA、cDNA、RNA或者PNA(肽核酸)。對于本發(fā)明，肽核酸(PNA)是聚跣胺類型的DNA類似物并且腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧咬和胞嘧咬的單體單位可以通過商業(yè)途徑獲得(Perceptive股osystems)。DNA的某些成分，如磷、磷氣化物或者脫氧核糖衍生物不存在于PNA中。如Nielsen等人Science254:1497(1991);和Egholm等人Nature365:666(1993)公開的，PNA特異并且緊密結(jié)合互補的DNA鏈并且不被核酸酶降解。實際上，PNA比DNA自身更強烈地結(jié)合DNA。這可能是因為兩條鏈之間沒有靜電排斥，并且聚酰胺主鏈更有柔性。為此，PNA/DNA雙鏈體比DNA/DNA雙鏈體在更寬的嚴(yán)4MH^下結(jié)合，使得它更容易進行多路雜交。由于強烈結(jié)合，可以使用比DNA更小的探針.此外，用PNA/DNA雜交更可能確定單個M錯配，因為PNA/DNA15聚體中的單個錯配降低解鏈溫度(Tm)8。-20。C，相比DNA/DNA15聚體雙鏈體降低解鏈溫度4。-16。C。而且，PNA中不存在帶電基團意味著雜交可以在低離子強度下進行并且在分析期間減小鹽的可能的干擾。DNA可以例如是基因組DNA或者cDNA。RNA可以是例如mRNA'核酸分子可以是天然的、合成的或者半合成的，或者它可以是衍生物，如肽核酸(Nielsen，Science254(1991)，1497-1500)或者石克代鱗酸酯。此外，核酸分子可以是重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子，其包含單獨或者組合的前述核酸分子的任一種。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子是載體的部分。因此，本發(fā)明在另一實施方案中涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體。此類栽體可以是例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或者例如常規(guī)用于遺傳工程中的另一種栽體，并且可以包含其他基因如標(biāo)記基因，其允許在合適的宿主細(xì)胞和合適的條件下選擇和/或復(fù)制所述栽體。在優(yōu)選實施方案中，所述載體是表達(dá)載體，其中本發(fā)明的核酸分子有效連接到如本文描述的允許在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列。該上下文中使用的術(shù)語"有效連接"指一個或多個表達(dá)控制序列和將表達(dá)的多核苷酸中編碼區(qū)之間以這樣的方式連^:得在與表達(dá)控制序列相容的條件下實現(xiàn)表達(dá)。從而本發(fā)明的核酸分子可以插入到一些通過商業(yè)途徑可獲得的栽體。非限制性實例包括與哺乳動物細(xì)胞相容的質(zhì)粒載體，如pUC、pBluescript(Stratagene)、pET(Novagen)、pREP(Invitrogen)、pCRTopo(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMClneo(Stratagene)、pXTl(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO畫pSV2neo、pBPV-l、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2國dhfr、pUCTag、pIZD35、pLXINandpSIR(Clontech)和plRES-EGFP(Clontech)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的核酸分子插入到栽體SignalpIGplus(Ingenius，R&DSystems)中。桿狀病毒載體如pBlueBac、BacPaczBaculovirusExpressionSystem(CLONTECH)和MaxBacTMBaculovirusExpressionSystem、昆蟲細(xì)胞和方案(Invitrogen)可以通過商業(yè)途徑得到并且也可以用于產(chǎn)生高產(chǎn)量的生物活性蛋白質(zhì).(也見Miller(1993)，Curr.Op.Genet.Dev.,3，9;O'Reilly,BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual,p.127)。此夕卜，>^、核栽體如pcDNA2和酵母栽體如pYes2是適于用于本發(fā)明的其他栽體的非限制性實例。本發(fā)明的其他優(yōu)選的表達(dá)栽體是本領(lǐng)域中公知的用于在果蠅細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的那些表達(dá)栽體，如Invitrogen的DES⑧系列。優(yōu)選地，所述果蠅細(xì)胞表達(dá)載體是pMTBiP/V5-HisB(Invitrogen)。pMT/BiP/V5-His栽體提供了下面的額外特征。它具有小尺寸(3.6kb)以提高DNA產(chǎn)率和增加亞克隆效率，它具有用于用抗V5抗體快速檢測的C-末端V5表位標(biāo)記并且它具有C-末端6xHis標(biāo)記，其用于用鎳螯合樹脂簡單地純化重組融合蛋白。關(guān)于栽體修飾技術(shù)，見Sambrook和Russel(2001)，上文。載體可以含有用于克隆或表達(dá)的一個或多個復(fù)制和遺傳系統(tǒng)，用于在宿主中選擇的一種或多種標(biāo)記，例如，抗生素抗性，和一個或多個表達(dá)盒。插入栽體中的編碼序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法合成、從天然來源分離或者制備為雜交體?？梢允褂媒⒌姆椒ㄟM行編碼序列與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(例如，啟動子、增強子和/或絕緣子)和/或其他M酸編碼序列的連接.此外，除了本發(fā)明的核酸序列外，栽體還可以包^^表達(dá)控制元件，允許在合適的宿主中正確表達(dá)編碼區(qū)。此類控制元件是技術(shù)人員已知的并且可以包括啟動子、翻#始密碼子、翻譯和插入位點或者內(nèi)部核糖體i^位點(IRES)(Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(2001)，1471-1476)以將插入片段導(dǎo)入載體.優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸分子有效連接允許在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的所i^達(dá)控制序列。確保在真核和原核細(xì)胞中表達(dá)的控制元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。如上面提到的，它們通常含有確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)序列和任選地確保轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定化的多聚A信號.額外的調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄以;si翻譯增強子，和/或天然結(jié)合的或者異源啟動子區(qū).允許在例如哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)的可能的調(diào)節(jié)元件包含CMV-HSV胸苷激酶啟動子、SV40、RSV啟動子(勞斯肉瘤病毒)、人JC伸因子la-啟動子、CMV增強子、CaM-激酶啟動子或者SV40-增強子。對于在原核細(xì)胞中表達(dá)，已經(jīng)描述了多種啟動子，包括例如，tac-lac-啟動子、lacUV5或者trp啟動子。除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的元件外，此類調(diào)節(jié)元件還可以包含多核苷酸下游的轉(zhuǎn)錄終止信號，如SV40-多聚-A位點或者tk-多聚-A位點。在該上下文中，合適的表達(dá)栽體是本領(lǐng)域中已知的，如Okayama-BergcDNA表達(dá)栽體pcDVl(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNAl、pcDNA3(In-Vitrogene，如在所附的實施例中使用)、pSPORTl(GIBCOBRL)或pGEMHE(Promega)、或者原核表達(dá)栽體，如入gtll。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)栽體至少能夠指導(dǎo)本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)的復(fù)制，優(yōu)選地表達(dá)。合適的復(fù)制起點包括例如，ColEl、SV40病毒和M13復(fù)制起點。合適的啟動子包括例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、lacZ啟動子、gal10啟動子和苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角體病毒(AcMNPV)多角體啟動子。合適的終止序列包括例如，牛生長激素、SV40、lacZ和AcMNPV多角體多聚腺苷酸化信號.選擇標(biāo)記的實例包括新審素、氨節(jié)青霉素和潮霉素抗性等等。特別設(shè)計的載體允許DNA在不同的宿主細(xì)胞如細(xì)菌-酵母、或者酵母-動物細(xì)胞或者細(xì)菌-真菌細(xì)胞或者細(xì)菌-無脊推動物細(xì)胞之間穿梭，除了本發(fā)明的核酸分子外，栽M可以包含編碼分泌信號的核酸序列。當(dāng)本發(fā)明的多肽在果蠅細(xì)胞、優(yōu)選果掩S2細(xì)胞中表達(dá)時，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的本發(fā)明的分泌信號是本領(lǐng)域中公知的果蠅Bip分泌信號.在本發(fā)明的上下文中使用的優(yōu)選的Bip分泌信號在SEQIDNO:2的M酸序列的1到28位顯示。其他分泌信號序列是本領(lǐng)域技"員公知的。此外，取決于使用的表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)⒈磉_(dá)的多肽導(dǎo)向細(xì)胞區(qū)室的前導(dǎo)序列可以加入到本發(fā)明的核酸分子的編碼序列中并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。前導(dǎo)序列與翻譯、起始和終止序列在合適的相位裝配并且優(yōu)選地，能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)或者其部分分泌到細(xì)胞外膜的前導(dǎo)序列。任選地，異源序列可以編碼融合蛋白，該融合蛋白包括賦予所希望的特征如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定化或者簡化純化的C-或者N-末端標(biāo)識肽。一旦已經(jīng)將載體摻入合適的宿主，那么宿主就在適合高水平表達(dá)核苷酸序列的條件下保持，并且如希望，可以接著收集和純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)、抗原片段或者融合蛋白。當(dāng)然，栽體還可以包含來自病原體生物的調(diào)節(jié)區(qū).此外，所述栽體除了可以是表達(dá)栽體外，還可以是基因轉(zhuǎn)移和/或基因?qū)ぐ休d體?；蛑委熓腔蜣D(zhuǎn)移的最重要的應(yīng)用之一，它基于通過離體(ex-vivo)或者體內(nèi)技術(shù)向細(xì)胞中導(dǎo)入治療基因(例如用于接種)。用于體外或者體內(nèi)基因治療的合適的載體、栽體系統(tǒng)和方法在文獻中描述并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的；見例如，Giordano,NatureMedicine2(1996)，534-539;Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919;Anderson,Science256(1992)，808-813，Isner，Lancet348(1996)，370-374;Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086;Wang,NatureMedicine2(1996)，714-716;WO94/29469;WO97/00957;Schaper，CurrentOpinioninBiotechnology7(1996)，635-640或Verma，Nature389(1997)，239-242和其中引用的參考文獻?？梢栽O(shè)計如本文所述的本發(fā)明的核酸分子和栽體用于直接導(dǎo)入或者通過月旨質(zhì)體或者病毒栽體(例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體)導(dǎo)入細(xì)胞中。此夕卜，桿狀病毒系統(tǒng)或者基于痘苗病毒或者SemHki病毒的系統(tǒng)可以用作本發(fā)明核酸分子的真核表達(dá)系統(tǒng)。除了重組產(chǎn)生外，還可以使用固相技^Uf過直接肽合成產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段、融合蛋白或者抗原性片段(參見Stewart等人(1969)SolidPhasePeptideSynthesis;FreemanCo，SanFrancisco;Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85(1963)，2149-2154)。可以寸吏用手工技術(shù)或者通過自動化進行體外蛋白質(zhì)合成。例如，使用AppliedBiosystems431A肽合成儀(PeptideSynthesizer)(PerkinElmer,FosterCityCA)根據(jù)生產(chǎn)商提供的使用說明實現(xiàn)自動化合成?？梢詥为毣瘜W(xué)合成多種片段并使用產(chǎn)生全長分子的化學(xué)方法組合.本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的核酸分子或者本發(fā)明的栽體基因工程化的宿主細(xì)胞。所述宿主可以如下產(chǎn)生將所述栽體或者核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞，其當(dāng)存在于細(xì)胞中時介導(dǎo)本發(fā)明的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)或者包含根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或者栽體，其中所述核香酸序列和/或編碼的多肽是宿主細(xì)胞外源的。"外源的"指核苷酸序列和/或編碼的多肽是宿主異源的，這意味著來自具有不同基因組背景的細(xì)胞或者生物，或者是宿主同源的但是位于與所述核苷酸序列的天然存在的副本不同的基因組環(huán)境中。這意味著，如果核苷酸序列與宿主同源，那么它不位于所述宿主的基因組中它的天然位置中，尤其它受到不同基因的包圍。在該情況中，該核酸序列可以處于它的自身啟動子控制下或者處于異源啟動子控制下。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如DNA印跡，可以確定導(dǎo)入的核酸分子或者栽體的位置。存在于宿主中的本發(fā)明的栽體或者核苷酸序列可以整合到宿主的基因組中或者它可以以某種形式保持在染色體外。在這方面，還理解本發(fā)明的核苷酸序列可以用于通過同源重組恢復(fù)或者產(chǎn)生突變基因。所述宿主可以是任何原核或者真核細(xì)胞。合適的原核/細(xì)菌細(xì)胞是通常用于克隆的細(xì)胞，像大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)或者枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。所述真核宿主可以是哺乳動物細(xì)胞、兩棲動物細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或者細(xì)菌細(xì)胞(例如，大腸桿菌菌抹HB101、DH5a、XL1Blue、Y10卯和JM101).優(yōu)選真核重組宿主細(xì)胞。真核宿主細(xì)胞的實例包括但不限于，酵母，例如，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳^X魯維酵母(KIuyveromyceslactis)或者巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)細(xì)胞、人、牛、豬、猴和嚙齒類來源的細(xì)胞系，以及昆蟲細(xì)胞，包括但不限于草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)昆蟲細(xì)胞和斑馬魚細(xì)胞，然而，優(yōu)選果蠅細(xì)胞，更優(yōu)選地，所述果錄細(xì)胞是果蠅S2(ATCCCRL-1963),其優(yōu)選用于在果蠅表達(dá)系統(tǒng)，例如果蠅表達(dá)系統(tǒng)(DES⑧)中表達(dá)異源蛋白質(zhì).S2細(xì)胞系來自晚期(20-24小時大)黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)胚胎的原代培養(yǎng)物。該通用的細(xì)胞系在室溫沒有0)2的^下快速生長并且容易適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。通常，當(dāng)表達(dá)本發(fā)明的多肽時，優(yōu)選昆蟲細(xì)胞，因為它們具有含有較少或者優(yōu)選無甲基化DNA的優(yōu)點。因此，當(dāng)表達(dá)和分離并且優(yōu)選純化本發(fā)明的多肽時，所述多肽優(yōu)選不受它可以優(yōu)選結(jié)合的甲基DNA的污染。使用昆蟲細(xì)胞的另一優(yōu)點是它們優(yōu)選在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中生長，從而當(dāng)優(yōu)選從培養(yǎng)基(如果所述多肽優(yōu)選分泌到所述培養(yǎng)基中)分離、回收和/或純化本發(fā)明的多肽時，減小了本發(fā)明多肽的進一步污染。適于使用并且可通過商業(yè)途徑獲得的哺乳動物物種來源的細(xì)胞系包括，但不限于L細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-l細(xì)胞(ATCCCRL1650)、COS-7細(xì)胞(ATCCCRL1651)、HeLa細(xì)胞(ATCCCCL2)、C1271(ATCCCRL1616)、BS-C誦1(ATCCCCL26)和MRC-5(ATCCCCL171)。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生能夠結(jié)合甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA的多肽的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞并回收產(chǎn)生的多肽。所述多肽優(yōu)選由本發(fā)明的核酸分子編碼。用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的優(yōu)選方法在實施例2中描述。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生能夠表W發(fā)明的多肽的細(xì)胞的方法，所述多肽能夠結(jié)合甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA，該方法包括通過本領(lǐng)域中已知的或者本文描述的體外方法基因工程化細(xì)胞。所述多肽優(yōu)選由本發(fā)明的核酸分子編碼。在本領(lǐng)域中存在用于在合適的宿主中產(chǎn)生多肽的多種合適的方法。如果宿主是單細(xì)胞生物或者哺乳動物或者昆蟲細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用多種培養(yǎng)條件，其可以進一步優(yōu)化而不用過度的工作負(fù)擔(dān).方便地，通過成熟的技^培養(yǎng)基或者從分離的(生物)膜收獲產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。此外，可以直接從宿主細(xì)胞分離產(chǎn)生的多肽。通過微生物學(xué)方法或者轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。還設(shè)想從轉(zhuǎn)基因植物回收本發(fā)明的多肽。備選地，可以合成或者半合成地產(chǎn)生本發(fā)明的多肽.例如，可以使用化學(xué)合成，如HoughtonProc.Natl.Acad.Sci.USA(82)(1985),5131-5135所述的固相方法。另一種方法是mRNA的體外翻譯。優(yōu)選的方法涉及在上述宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生蛋白質(zhì).例如，包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的任一種的全部或者部分的核酸序列可以通過PCR合成，插入到表達(dá)載體中，并用該表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。之后，培養(yǎng)宿主細(xì)胞以產(chǎn)生目的多肽，將其分離或者純化?？梢酝ㄟ^幾種已知的技術(shù)的任一種實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離和純化；所述技術(shù)為例如但不限于，離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析、高壓^bf目層析(HPLC)、反相HPLC、制備圓盤凝膠電泳。此外，無細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。根據(jù)本發(fā)明使用的合適的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、麥胚抽提物、犬胰臟微粒體膜、大腸桿菌S30提取物，和偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，如TNT-系統(tǒng)(Promega)。這些系統(tǒng)允許在加入含有編碼序列和合適的啟動子元件的克隆栽體、DNA片段或者RNA序列時表達(dá)重組多肽或者肽。如上文提到的，蛋白質(zhì)分離/純化技術(shù)可以需要用常規(guī)方法修飾本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，可以將組蛋白標(biāo)簽加到蛋白質(zhì)以允許在鎳柱上純化。其他修飾可以導(dǎo)致更高或者更低的活性，允許更高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，或者簡化蛋白質(zhì)的純化。產(chǎn)生本發(fā)明的多肽后，它可以通過PEG化、衍生等等修飾.在另一實施方案中，本發(fā)明涉及特異結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體.優(yōu)選地，多肽具有結(jié)合甲基化DNA的能力并且是如本文描述的雙功能蛋白質(zhì)。術(shù)語"特異"在該上下文中指抗體與本發(fā)明的多肽反應(yīng)，但是不與所述多肽的僅部分反應(yīng)，即，不與甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Fc部分或者前導(dǎo)或者分泌序列反應(yīng)。然而，所述抗體可以特異結(jié)合本發(fā)明的多肽的多肽接頭(如果存在這種多肽接頭)。因此，所述抗體特異結(jié)合例如本發(fā)明多肽的甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fc部分的部分或者特異結(jié)合甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和接頭多肽的部分或者特異結(jié)合接頭多肽的部分和Fc部分，或僅結(jié)合接頭多肽.不管抗體是否如上文定義的特異反應(yīng)，其都可以通過將所述抗體與如上述部分和僅與本發(fā)明多肽的各自部分的結(jié)合反應(yīng)進行比較來測試，本發(fā)明的抗體可以是例如多克隆或者單克隆的。術(shù)語"抗體，，還包括其仍然保留結(jié)合特異性的衍生物或者片段。用于產(chǎn)生抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并JLjE例如Harlow和Lane"Antibodies,ALaboratoryManual",CSHPress,ColdSpringHarbor,1988中描述，這些抗體可以用于例如本發(fā)明多肽的免疫沉淀和免疫定位以M視此類多肽例如在重組生物或者診斷中的存在。它們還可以用于鑒定與根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)相互作用的化合物(如下文提到的)。例如，如用于BIAcore系統(tǒng)中的表面等離子體共振可以用于增加結(jié)合本發(fā)明多肽的表位的噬菌體抗體的效率(Schier，HumanAntibodiesHybridomas7(1996),97-105;Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995)，7-13)。本發(fā)明還包括嵌合、單鏈和人源化抗體，以及抗體片段，像Fab片段等等?？贵w片段或者衍生物還包含F(xiàn)(ab')2、Fv或scFv片段；見例如HarlowandLane，上文。多種步驟是本領(lǐng)域中已知的并且可以用于產(chǎn)生此類抗體和/或片段。從而，(抗體)衍生物可以通過JIM^擬物產(chǎn)生。此外，對產(chǎn)生單鏈抗體描述的技術(shù)(見美國專利4，946，778)可以適于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的單鏈抗體。而且，轉(zhuǎn)基因動物也可以用于表達(dá)針對本發(fā)明多肽的人源化抗體。最優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。為了制備單克隆抗體，可以使用通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的任一種技術(shù)。此類技術(shù)的實例包括雜交瘤技術(shù)(K他ler和MilsteinNature256(1975)，495497)、三瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor，ImmunologyToday4(1983)，72)和用于產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV畫雜交瘤技術(shù)(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，Inc.(1985)，77-96)。描述產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(例如，美國專利4，946，778)可以適于產(chǎn)生針對如上述的免疫原性多肽的單鏈抗體。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠可以用于表達(dá)針對所述免疫原性多肽的人源化抗體。尤其優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用或者能夠在細(xì)胞中表達(dá)的抗體/抗體構(gòu)建體以及抗體片段或者衍生物。這可以通過直接注射對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子或者通過注射編碼所述蛋白質(zhì)分子的核酸分子來實現(xiàn)，此外，設(shè)想基因治療方法。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抗體分子"涉及完整免疫球蛋白分子以及此類免疫球蛋白分子的部分.此外，如上文討論的，該術(shù)語涉及^務(wù)飾的和/或改變的抗體分子，像嵌合和人源化抗體。該術(shù)語還涉及單克隆或者多克隆抗體以及重組或者合成產(chǎn)生的/合成的抗體。該術(shù)語還涉及完整抗體以及其抗體片段，像分離的輕鏈和重鏈、Fab、Fab/c、Fv、Fab，、F(ab，)2。術(shù)語"抗體分子"還包括雙功能抗體和抗體構(gòu)建體，像單鏈Fvs(scFv)或抗體-融合蛋白。在本發(fā)明上下文中還設(shè)想術(shù)語"抗體，，包括可以在細(xì)胞中表達(dá)的抗體構(gòu)建體，例如，可以通過病毒或者載體轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體構(gòu)建體。當(dāng)然，本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)、連接或者綴合到如上文關(guān)于本發(fā)明多肽的Fc部分描述的可檢測的物質(zhì)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸分子、載體、宿主細(xì)胞、多肽或者抗體的組合物。根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語"組合物"涉及包含至少一種前述化合物的組合物。設(shè)想下文描述的本發(fā)明的組合物包含任一組合的前述化合物。它可以任選地包含能夠結(jié)合甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA的其他分子。組合物可以是固體、液體或者氣體形式并且可以為粉劑、片劑、溶液劑、氣溶膠、粒劑、丸劑、混懸劑、乳劑、膠嚢劑、糖漿劑、液體、酏劑、浸骨、酊劑或者流浸骨的形式或者尤其適于口服或腸胃外或者局部施用的形式。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸分子、栽體、宿主、多肽或者抗體的試劑盒。有利地，本發(fā)明試劑盒還任選包含反應(yīng)緩沖液、貯存溶液和/或進行科學(xué)或者診斷測試等等所需的剩余的試劑或者材料.此外，本發(fā)明的試劑盒的部分可以單獨包裝在小瓶或者瓶子中或者組合在容器或者多容器單位中。本發(fā)明的試劑盒可以有利地用于實施如本文所述的分離、富集、純化和/或檢測甲基化DNA的方法和/或它可以用于本文提到的多種應(yīng)用中，例如，作為診斷試劑盒、作為研究工具或者治療工具。此外，本發(fā)明的試劑盒可以含有適合科學(xué)、醫(yī)學(xué)和/或診斷目的的檢測手段.試劑盒的生產(chǎn)優(yōu)選按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法。如上所述，本發(fā)明基于如下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)包含甲基-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分的雙功能的抗體樣分子能夠以高親和性和高親合性特異結(jié)合甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA，其使得它是用于從多于10ng、小于10ng、小于7,5ng、小于5ng、小于2.5ng或者約lng樣品中分離、富集和/或檢測甲基化DNA的合適的診斷工具。因此，在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物是診斷組合物，其任選還包含合適的檢測手段，本發(fā)明的另一實施方案是本發(fā)明的多肽用于檢測甲基化DNA的用途。此外，本發(fā)明的核酸分子、多肽、載體、宿主細(xì)胞或者抗體用于制備用于檢測甲基化DNA的診斷組合物。此外，本發(fā)明的核酸分子、多肽、栽體、宿主細(xì)胞或者抗體用于制備用于檢測肺瘤組織或者肺瘤細(xì)胞的診斷組合物。如本文提到的，本發(fā)明的多肽具有出乎意料的優(yōu)良性質(zhì)，尤其用于分離、富集、純化和/或檢測甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA。從而，本發(fā)明提供了本發(fā)明多肽的多種診斷用途和其使用方法。甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA的優(yōu)選的小恥漠富集方法在實施例3中描述。簡言之，本發(fā)明的多肽結(jié)合到例如蛋白Asepharose并洗滌以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，接著，將目的DNA優(yōu)選消化并加入到本發(fā)明的結(jié)合的多肽。此外，將所述消化的DNA與本發(fā)明的結(jié)合的多肽溫育，洗滌并^t^發(fā)明的多肽結(jié)合后，進行艦。因此，本發(fā)明還涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)將包含甲基化和/或未甲基化DNA的樣品與本發(fā)明的多肽接觸；和(b)檢測所述多肽與甲基化DNA的結(jié)合。優(yōu)選地，所述體外方法是如實施例3中示例的反向South-Western印跡、甲基化DNA的免疫沉淀、親和純化或者如實施例4和5中示例的甲基-CpG^免疫沉淀(MCIp).然而，所述體外方法不限于此，而是可以基本上為任何步驟，其中本發(fā)明的多肽連接到固體基質(zhì)，例如，諸如sepharose、瓊脂糖、毛細(xì)管、容器壁的基質(zhì)，如本文中也關(guān)于本發(fā)明的診斷組合物所述。更優(yōu)選地，前述體外方法還包括作為步驟(c)的分析甲基化DNA,例如，通過測序、DNA印跡、限制酶消化、亞硫酸氫鹽測序、焦磷酸測序(pyrosequencing)或者PCR來分析.然而，通過使用本發(fā)明的多肽分析已經(jīng)分離、富集、純化和/或檢測的甲基化DNA不限于前述方法，而是包括本領(lǐng)域中已知的用于分析甲基化DNA的所有方法，例如，RDA、微陣列等等。本發(fā)明多肽的優(yōu)選的診斷應(yīng)用是圖7中顯示的所稱作的MB-PCR。簡言之，在第一步中，將本發(fā)明的多肽加入可包被的PCR容器，例如，來自Nunc的TopYieldStrips。這樣，通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將多肽優(yōu)選包被到所述容器的內(nèi)表面。下一步，向被包被的PCR容器加入封閉試劑，例如，4.5%奶粉。在另一步中，向經(jīng)包被和封閉的PCR容器優(yōu)選加入目的DNA片段(例如，甲基化和/或未甲基化的DNA片段)。認(rèn)為本發(fā)明的多肽特異結(jié)合甲基化DNA(如果存在)。在下一步中，將優(yōu)選含有DNA片段的經(jīng)包被和封閉的PCR容器溫育然后洗滌以除去未結(jié)合的DNA片段。之后，加入PCR混合物以優(yōu)選進行實時PCR或者常規(guī)PCR,接著電泳以分離擴增產(chǎn)物，所述PCR混合物優(yōu)選包括基因特異性引物，或者還優(yōu)選地，用于例如懷疑被曱基化或者未甲基化的目的基因或者基因座的多路PCR的至少2、3、4、5、6、7等等個引物對。優(yōu)選如下進行MB誦PCR:優(yōu)選地，使用熱穩(wěn)定的TopYieldTMStrips(NuncCat.No.248卯9)制備PCR管。優(yōu)選地，將優(yōu)選為重組形式的50pi本發(fā)明多肽(在10mMTris/HClpH7.5中稀釋為15fig/ml)加入每孔中并在4。C過夜溫育。優(yōu)選地，用200nlTBS(20mMTris，pH7.4，含有150mMNaCl)洗滌孔三次，并在4。C用100nl封閉溶液(IOmMTris，pH7.5含有150mMNaCl，4.50/。脫脂奶粉，5mMEDTA和0.8jig/ml每種多聚d(I/C)，多聚d(A/T)和多聚d(CG))過夜封閉。優(yōu)選地，然后用200nlTBST(含有0.1%Tween-20的TBS)洗滌管三次.優(yōu)選地，向每孔加入50pi結(jié)合緩沖液(20mMTris，pH7.5，含有400mMNaCl,2mMMgCl2，0.5mMEDTA，和0.1%Tween-20),并優(yōu)選向每第二個孔加入1pi消化的DNA，優(yōu)選用Msel消化的基因組DNA，其量優(yōu)選為10ng/jil(M-反應(yīng))。優(yōu)選通過本領(lǐng)域已知的試劑盒，例如，使用BloodandCellCultureMidiKit(Qiagen)制備基因組DNA。優(yōu)選通過瓊脂糖凝膠電泳控制基因組DNA制備物的質(zhì)量，并優(yōu)選通過UV分光光度法測定DNA濃度。優(yōu)選使用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)進行DNA的定量。將含有本發(fā)明的多肽和DNA，優(yōu)選DNA片段(通過酶促消化或者M斷裂產(chǎn)生)的孔在振蕩器上優(yōu)選在4。C下溫育3小時，優(yōu)選地，將管用200pi結(jié)合緩沖液(BindingBuffer)洗滌三次并用10mMTris/HClpH7.5洗滌一次。接著，優(yōu)選直接在T叩Yiel(FMStrips中進行PCR。優(yōu)選地，PCR-Mix(50pl/孔)含有標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液(Roche)，優(yōu)選2.5UFastStartTaqDNA聚合酶(Roche)，優(yōu)選10pmol每種基因特異性引物(由Qiagen合成)、dNTPs(優(yōu)選每種200mM，Amersham/Pharmacia)，優(yōu)選1M甜菜堿(Sigma)。特定目的基因的引物序列和循環(huán)^在實施例6的表2和3中顯示。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計任何其他合適的基因特異性或者基因座特異性或者多個基因座特異性引物。此外，技術(shù)人員可以容易確定和/或測試最適合引物和基因、一個或多個目的基因座的PCR參數(shù)。加入PCR混合物后，優(yōu)選將1nlMseI-消化的DNA(優(yōu)選10ng/jil的量)加入每隔二個孔，其以前不與DNA片段溫育(P-反應(yīng)).優(yōu)選地，使用瓊脂糖皿電泳分析PCR產(chǎn)物并使用例如Typhoon9200Imager(Amersham/Pharmacia)掃描溴化乙錠染色的劍歐，因此，設(shè)想本發(fā)明的多肽可用于檢測下文中描述的樣品中甲基化DNA，優(yōu)選地CpG甲基化DNA，所述樣品可以包括一個或多個單個細(xì)胞.還設(shè)想可用于完整細(xì)胞。"完整細(xì)胞，，指完整單個細(xì)胞的基因組背景。從而它可以用于甲基化DNA的基因組范圍的分析。此類方法優(yōu)選包括使用本發(fā)明多肽對甲基化DNA的富集/純化步驟和檢測步驟，例如，基因組DNA微陣列的雜交、嵌合陣列(tilingarrays)、低密度陣列或者芯片實驗室(lab-on-a-chip)方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易進行本領(lǐng)域中公知的檢測方法。這些方法的一些在所附的實施例中顯示，其中本發(fā)明的多肽用于富集、純化和/或分離甲基化DNA。一個實施例顯示了所稱作的MB-PCR，其可以適于高通量、穩(wěn)健的單管測定法。此外，本發(fā)明的多肽尤其可用于在單個基因水平上檢測CpG甲基化。此類方法優(yōu)選包括富集和/或純化單個基因的甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA的步驟和通過使用PCR、實時PCR等檢測所述甲基化DNA的步驟。本發(fā)明多肽的另一種可能的診斷應(yīng)用是免疫組織化學(xué)。因此，本發(fā)明的多肽可以用于"染色"甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA。本發(fā)明的多肽通過它的Fc部分偶聯(lián)、連接或者綴合到如本文描述的合適的檢測物質(zhì)，或者例如，將第二種抗-Fc部分抗體用于檢測結(jié)合到甲基化DNA的本發(fā)明的多肽。認(rèn)為通過本發(fā)明的方法通過一些惡性腫瘤的甲基化模式/分布圖可以檢測這些惡性肺瘤，所述甲基化模式/分布圖從而可以具有預(yù)后和/或可預(yù)測的價值。這意味著曱基化模式可以用于為患者設(shè)立藥理學(xué)譜。例如，如果檢測到某些癌基因和/或腫瘤抑制基因私適甲基化或低甲基化，那么可以確定對例如抗癌藥物的易感性和/或敏感性。因此，技術(shù)人員選擇最合適的藥物避免陰性和/或不利效果，如果例如所述藥物可以抑制癌基因的話，盡管所述癌基因已經(jīng)私逸甲基化并JL^而認(rèn)為它它們是無活性的。本文描述的方法可以用于首先鑒定在惡性如癌癥或腫瘤疾病中超甲基化或者的低甲基化的基因座和/或基因并且其次，提供在單個基因水平上測定所述基因座和/或基因的甲基化狀態(tài)的基礎(chǔ)。所述惡性優(yōu)選是腫瘤。腫瘤可以^1任何可能類型的腫瘤。實例4JC膚、乳腺、腦、宮頸癌、睪丸癌、頭和頸癌、肺、縱隔、胃腸道、生殖泌尿系統(tǒng)、婦科系統(tǒng)、乳腺、內(nèi)分泌系統(tǒng)、皮膚、兒童期、未知的原發(fā)部位或者轉(zhuǎn)移性癌、軟組織和骨的肉瘤、間皮瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤、淋巴瘤、白血病、瘤外綜合征、皿carcinomastosis、免疫抑制相關(guān)的惡性和/或轉(zhuǎn)移性癌等等。腫瘤細(xì)胞可以例如來自頭和頸，包括鼻腔、鼻旁竇、弄咽、口腔、口咽、喉、下咽部、唾液腺的腫瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、肺的癌癥，包括非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)J!W癌、縱隔癌、胃腸道癌，包括食管、胃、、肝臟、膽系、小腸、結(jié)腸、直腸和膽門區(qū)的癌、生殖泌尿系統(tǒng)的癌，包括腎、尿道、膀胱、前列腺、尿道、陰莖和睪丸的癌、婦科癌，包括宮頸、陰道、陰門、子宮體、^滋養(yǎng)層細(xì)胞病、卵巢、輸卵管、皿的癌癥，乳腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌，包括甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺皮質(zhì)的腫瘤、胰腺內(nèi)分泌腫瘤、類癌瘤和類癌綜合征、多發(fā)性內(nèi)分泌腺腫瘤形成、軟組織和骨的肉瘤、間皮瘤、皮膚癌、黑素瘤，包括皮膚黑素瘤和眼內(nèi)黑素瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胂瘤、兒童期癌癥，包括視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤、WHm腫瘤、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、Ewing肉瘤家族的肺瘤、橫B肉瘤、淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，和霍奇金病、白血病，包括急性白血病、慢性髄性和淋巴細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞肺瘤和骨髄異常增生綜合征、瘤外綜合征、未知的原發(fā)部位的癌癥、腹膜carcinomastosis、免疫抑制相關(guān)的惡性腫瘤，包括艾滋病相關(guān)的惡性腫瘤，包括卡波西肉瘤、艾滋病相關(guān)的淋巴瘤、艾滋病相關(guān)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、艾滋病相關(guān)的霍奇金病和艾滋病相關(guān)的肛門生殖器癌，和移植相關(guān)的惡性腫瘤、向肝臟的轉(zhuǎn)移性癌癥、向骨的轉(zhuǎn)移性癌癥、惡性胸膜和心包滲出液和惡性腹水。最優(yōu)選所述癌癥或者肺瘤疾病是頭和頸、肺、縱隔、胃腸道、生殖泌尿系統(tǒng)、婦科系統(tǒng)、乳腺、內(nèi)分泌系統(tǒng)、皮膚、兒童期、未知的原發(fā)部位或者轉(zhuǎn)移性癌癥、軟組織和骨的肉瘤、間皮瘤、黑素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、淋巴瘤、白血病、瘤外綜合征、腹膜carcinomastosis、免疫抑制相關(guān)的惡性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移性癌.優(yōu)選的腫瘤是AML、漿細(xì)胞瘤或者CLL.本發(fā)明的診斷組合物包含至少一種本文描述的本發(fā)明的化合物。診斷組合物可以用于分離、富集和/或確定例如來自如上述的個體的樣品中甲基化DNA、優(yōu)選CpG甲基化DNA的存在。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"樣品"意指來自個體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或者含有多核苷酸或者多肽或者其部分的其他來源的任何生物樣品。如所指出的，生物樣品包括發(fā)現(xiàn)表^w發(fā)明的多核苷酸的體液(如血液、血清、血漿、尿液、滑膜液和脊髄液)和組織來源。從哺乳動物得到組織活檢樣品和體液的方法是本領(lǐng)域中公知的。包括基因組DNA、mRNA或蛋白質(zhì)的生物樣品優(yōu)選為來源。診斷組合物的其他應(yīng)用在本文描述并且在所附的實施例中顯示。診斷組合物任選包含用于檢測的合適的手段，上述核酸分子、載體、宿主、抗體和多肽例如適于用于免疫測定中，其中它們可以以'^目使用或者結(jié)合到固相載體。公知的栽體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯離子、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵。對于本發(fā)明，栽體的性質(zhì)可以是可溶的或不溶的。固相栽體是本領(lǐng)域中已知的并且可以包含聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠體金屬顆粒、玻璃和/或硅片和表面、硝酸纖維素strips、膜、片、duracytes和反應(yīng)盤的孔壁、塑料管或者其他試管.用于在固相上固定核酸分子、栽體、宿主、抗體、適體、多肽等等的合適的方法包括但不限于，離子、疏水、共價相互作用或者(化學(xué))交聯(lián)等等.可以利用本發(fā)明的所述化合物的免疫測定法的實例為直接或者間接形式的竟?fàn)幒头蔷範(fàn)幟庖邷y定法。常用的檢測測定法可以包4^^射性同位素或非it射性同位素方法。此類免疫測定法的實例是放射免疫測定法(RIA)、夾層(免疫測定)和RNA印跡或DNA印跡測定法。此外，這些檢測方法包括IRMA(免疫放射免疫測定)、EIA(酶免疫測定)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、FIA(熒光免疫測定)、和CLIA(化學(xué)發(fā)光免疫測定)。此外，本發(fā)明的診斷化合物可以用于像FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測定的技術(shù)中.合適的標(biāo)記和用于標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的.可以用于本發(fā)明的標(biāo)記類型的實例包括熒光染料(像螢光素、羅丹明、TexasRed等等)、酶(像辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶)、放射性同位素(像32P、33P、35S或125I)、生物素、洋地黃毒苷、膠體金屬、化學(xué)或者生物發(fā)光化合物"象二氧雜環(huán)丁烷、魯米諾或者acridiniums)。多種4支術(shù)可以用于標(biāo)記生物分子，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且包括共價偶聯(lián)酶或生物素基團、磷酸化、生物素化、隨機引發(fā)、缺口翻譯、加尾(使用末端轉(zhuǎn)移酶)。此類技術(shù)例如在Tijssen，"Practiceandtheoryofenzymeimmunoassays",BurdenandvonKnippenburg(Eds)，Volume15(1985);"Basicmethodsinmolecularbiology",DavisLG，DibmerMD，BatteyElsevier(19卯)；Mayer，(Eds)"Immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology"AcademicPress,London(1987);或在系列"MethodsinEnzymology"，AcademicPress,Inc中描述。檢測方法包括但不限于，放射自顯影、熒光顯微術(shù)、直接和間接SH1^應(yīng)等等。本發(fā)明的另一優(yōu)選的組合物是藥物組合物，其任選還包含可藥用栽體。所述藥物組合物包含本發(fā)明的多肽，其可以偶聯(lián)到另一種肽，例如，組蛋白脫乙酰酶、組蛋白乙g轉(zhuǎn)移酶、DNA-曱基化酶和/或DNA脫甲基酶。它還可以偶聯(lián)限制酶或者核酶。認(rèn)為如果偶聯(lián)如上述的一種或多種其他蛋白質(zhì)的本發(fā)明的多肽結(jié)合到甲基化DNA，那么它可以將所述蛋白質(zhì)進一步把定DNA。因此，DNA甲基化酶可以超甲基化或者低甲基化DNA，例如，低甲基化的癌基因基因座或者癌基因或者DNA。這樣，可以實Si^因失活。備選地，DNA脫曱基酶可以脫甲基超甲基化的基因或者基因座，例如，胂瘤抑制基因或者基因座。這樣，可以實現(xiàn)基因活化。組蛋白脫乙酰酶通過脫乙跣組蛋白的乙?；馁嚢彼醊l&，從而導(dǎo)致DNA與組蛋白的更緊密包裝并抑制基因，造成活性基因的轉(zhuǎn)錄抑制.如本領(lǐng)域中已知，組蛋白乙SL^轉(zhuǎn)移酶可以進行相反作用，限制酶或者核酶當(dāng)靶定將^JL切割的DNA時可以發(fā)揮它的作用。合適的限制酶是本領(lǐng)域中已知的?？梢匀绫绢I(lǐng)域中已知的制備把DNA序列特異性核酶。因此，藥物組合物可以用于治療癌癥和/或瘤性疾病。它們都已知由不受控制的基因表達(dá)、活化和/或抑制引起，其受到組蛋白乙?；?脫乙酰化和/或DNA-甲基化/脫甲基化的調(diào)節(jié)。如本文所述，可以用生理上可接受的栽體將藥物組合物施用于患者。在特定實施方案中，術(shù)語"可藥用的"指得到管理機構(gòu)或者其他^^人的藥典認(rèn)可用于動物或者更具體地用于人中。術(shù)語"栽體"指用于施用治療劑的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者栽體。此類藥物栽體可以是無菌的液體，如水和油，包括石油、動物、植物或者合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、^M由等等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時，水是優(yōu)選的栽體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液態(tài)栽體，尤其用于注射液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、硬脂酸甘油酯、滑石、鈉離子、干燥的脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果希望，組合物還可以含有少量增濕劑或者乳化劑，或者pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠嚢劑、粉劑、持續(xù)釋放制劑等等的形式。用常MJt合劑和載體如甘油三酯可以將組合物配制成栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。合適的藥物栽體的實例在E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述。此類組合物將含有治療有效量的前述化合物，優(yōu)選純化形式的前述化合物，以及合適量的栽體以提供正確施用于患者的形式，制劑將適于施用方式.在另一優(yōu)選實施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物配制成適于靜脈內(nèi)施用于人類的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因以減輕注射部位的疼痛。通常，成分單獨或者混合在一起以單位劑型提供，例如，作為密封容器如^或者小囊中的凍干的粉劑或者無水濃縮物，所^器指示活性成分的量。當(dāng)通過輸注施用組合物時，它可以用含有無菌藥物級水或者鹽水的輸注瓶分配。當(dāng)通過注射施用組合物時，可以提供用于注射用無菌水或者鹽水的"^A而可以在施用前混合成分。本發(fā)明的藥物組合物可以配制為中性或者鹽形式?？伤幱名}包括用陰離子如來自氬氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽和用陽離子如來自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基M乙醇、組氨酸、普魯卡因等等的陽離子形成的鹽。體外測定可以任選用于幫助鑒定最佳的劑量范圍。用于制劑的精確劑量將還依賴于施用途徑、疾病或病癥的嚴(yán)重性，并且將根據(jù)開業(yè)醫(yī)生的判斷和每名患者的情況決定?？梢詮膩碜泽w外或者動物模型試驗系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推有效劑量。優(yōu)選地，藥物組合物直接或者與輔藥組合施用。優(yōu)選將藥物組合物設(shè)計成在基因治療中應(yīng)用?；蛑委煹募夹g(shù)已經(jīng)關(guān)于本發(fā)明的核酸分子在上文中描述并且其中所有所述的也適用于藥物組合物。例如，藥物組合物中核酸分子優(yōu)選為允許它導(dǎo)入、表達(dá)和/或穩(wěn)定R到將治療的個體的細(xì)胞中的形式。對于基因治療，可以利用多種病毒栽體，例如，腺病毒、皰瘆病毒、痘苗病毒，或者優(yōu)選地，RNA病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒。其中可以插入單個外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實例包括但不限于莫洛尼鼠白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肺瘤病毒(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(RSV)。許多額外的逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體也可以摻入到多個基因中。所有這些栽體可以轉(zhuǎn)移或者摻入選擇標(biāo)記的基因使得可以鑒定和產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。通過插入例如，編碼糖、糖脂或者蛋白質(zhì)的多核苷酸，可以使得逆轉(zhuǎn)錄病毒是乾標(biāo)特異的。M域技術(shù)人員將知道或者不用過度的實驗容易地確定特定多核苷酸序列，所述序列可以插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組以允許含有插入的多核苷酸序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體的把標(biāo)特異遞送.因為重組逆轉(zhuǎn)錄病M選是缺陷的，所以它們需要幫助以產(chǎn)生感染性栽體顆粒。例如通過使用輔助細(xì)胞系可以提供該幫助，所述輔助細(xì)胞i含有編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒的所有結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒，所述結(jié)構(gòu)基因處于LTR內(nèi)調(diào)節(jié)序列的控制下.這些質(zhì)粒缺少使得包裝K制是識別用于殼體化的RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列。具有包裝信號缺失的輔助細(xì)胞系包括，但不限于例如w2、PA317和PA12。這些細(xì)胞系產(chǎn)生空病毒體，因為沒有基因組被包裝。如果將逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體導(dǎo)入此類包裝信號是完整的但是結(jié)構(gòu)基因被其他目的基因替換的細(xì)胞中，那么栽體可以包裝并且產(chǎn)生栽體病毒體。備選地，可以通過常M酸鉤轉(zhuǎn)染，用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染NIH3T3或者其他組織培養(yǎng)物細(xì)胞。然后用含有目的基因的栽體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。所得的細(xì)胞釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的核酸分子的另一種定向遞送系統(tǒng)AJ^體^t系統(tǒng)。膠體^t系統(tǒng)包括大分子復(fù)合體、毫微型膠嚢、凝球體、珠和基于脂類的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、微粒、混合微粒、和脂質(zhì)體。本發(fā)明的優(yōu)選的膠體系統(tǒng)^J旨質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工膜嚢，其可以用作體外和體內(nèi)遞送栽體。已經(jīng)表明大小為0.2-4.0pm的大單層脂質(zhì)體(LUV)可以包裹很大百分比的含有大分子的水性緩沖液。RNA、DNA和完整病務(wù)沐可以包裹在水性內(nèi)層并以生物活性形式遞送到細(xì)胞(Fraley，等人，TrendsBiochem.Sci.，6:77，1981)。除了哺乳動物細(xì)胞，脂質(zhì)體還可以用于遞送多核苷酸到植物、酵母和細(xì)菌細(xì)胞中。為了^J旨質(zhì)體成為有效的基因轉(zhuǎn)移栽體，應(yīng)該存在下面的特征(l)以高效率包裹目的基因而不損害它們的生物活性；(2)與非靶細(xì)J!&^目比，優(yōu)先和實質(zhì)結(jié)合靶細(xì)胞；(3)以高效率遞送嚢泡的水性內(nèi)含物到靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)；和(4)準(zhǔn)確和有^Jiit傳信息(Mannino，等人，股otechniques，6:682，1988)。脂質(zhì)體的組成通常是磷脂類，尤其高相變溫度磷脂的組合，通常與類固醇、特別是膽固醇組合。還可以使用其他磷脂或者其他脂類。脂質(zhì)體的物理特征取決于pH、離子強度和二價陽離子的存在。用于脂質(zhì)體產(chǎn)生的脂類的實例包括磷脂酰基化合物，如磷脂跣甘油、磷脂跣膽喊、磷脂跣絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。尤其有用的是二St^磷脂酰甘油，其中脂類部分含有14-18個碳原子，尤其16-18個碳原子，并且是飽和的.闡明性磷脂包括卵磷脂跣膽堿、二棕櫚酰磷脂跣膽堿和二刷旨B^脂酰膽喊。脂質(zhì)體的靶定可以基于解剖學(xué)和機械因素分類.解剖學(xué)分類可以基于選擇性水平，例如，器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性。機械把定可以基于它是被動還是主動的來區(qū)分，被動靶定利用脂質(zhì)體分布到含有竇狀毛細(xì)血管的器官中網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞中的天然傾向。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物可以用于體內(nèi)成像甲基化DNA，優(yōu)選CpG甲基化DNA。因此，將所述組合物施用于需要其的受試者。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"受試者"指需要情感障礙治療的個體。優(yōu)選地，受試者是脊推動物，甚至更優(yōu)選哺乳動物，尤其優(yōu)i^A。術(shù)語"施用的"指對個體施用治療或者診斷有效劑量的編碼本發(fā)明多肽的前述核酸分子。"治療或診斷有效量"指所施用的產(chǎn)生效果的劑量。精確劑量將取決于治療或者診斷目的，并且將通it^領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)確定。如本領(lǐng)域中已知和上述的，對全身對比局部遞送、年齡、體重、一般健康、性別、妖^食、施用時間、藥物相互作用和狀況的嚴(yán)重性的調(diào)節(jié)是必要的，并且將通過本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實驗確定。方法可以應(yīng)用于人治療和獸醫(yī)應(yīng)用.本文所述的具有所希望的治療活性的化合物可以以生理上可接受的栽體施用于患者，如本文所述。取決于導(dǎo)入的方式，可以以如下文討論的多種方法配制化合物.制劑中治療活性化合物的濃度可以從約0.1-100wt%變化.活性劑可以單獨或者與其他治療組合施用?？梢砸匀缟嫌懻摰亩喾N方式進行藥物組合物的施用，所述方式包括，但不限于，口服、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、結(jié)節(jié)內(nèi)、髄內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、鼻內(nèi)、支氣管內(nèi)、經(jīng)皮、結(jié)節(jié)內(nèi)、直腸內(nèi)、皿內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸、或者眼內(nèi)方式.在一些情況中，例如，在傷口和炎癥的治療中，候選活性劑可以作為溶液干燥噴霧直接應(yīng)用。主治醫(yī)生和臨床因素將決定劑量方案.如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知，任一患者的劑量取決于許多因素，包括患者的大小、體表面積、將施用的具體化合物、性別、施用時間和途徑、一般他泉、和同時施用的其他藥物。典型的劑量可以是例如0.001到1000嗎范圍；然而，設(shè)想低于或高于該示例范圍的劑量，特別考慮前面的因素。劑量優(yōu)選每周一次給予，然而，在治療的i^H期間，劑量可以以更長的時間間隔給予，并且需要時可以以更短的時間間隔例如每天給予。在優(yōu)選情況中，使用本文所述的方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法監(jiān)視免疫應(yīng)答并且，例如，在時間、量和/或組成方面優(yōu)化劑量。劑量將改變，但是DNA的靜脈內(nèi)施用的優(yōu)選劑量為約106到1012個拷貝/DNA分子，如果方案是連續(xù)輸注，那么它將還在l嗎到10mg單位/kg體重/分鐘的范圍內(nèi)'可以通過定期評估監(jiān)視逸艮.可以局部或全身施用本發(fā)明的藥物組合物。施用將優(yōu)選是腸胃外，例如靜脈內(nèi)的。腸胃外施用的制劑包括無菌水性或者非水性溶液劑、混懸劑和乳劑，非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄欖油、和可注射的有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳劑和混懸劑，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外栽體包括氯化鈉溶液、林格葡萄糖注射液、葡萄糖和鈉離子、乳酸^注射液或者不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑(如基于;M^葡萄糖注射液的那些)，等等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等，還i殳想藥物組合物與其他藥物用于共同治療方法中，所述其他藥物為例如用于檢測甲基化DNA并J^而例如用于診斷可以顯示出典型的甲基化模式的惡性肺瘤的藥物。附圖描述圖1:圖1顯示了質(zhì)粒pMTBip/MBD2-Fc的核苷酸序列和質(zhì)粒pMTBip/MBD2-Fc編碼的MBD2-Fc雙功能蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(粗體)。MBD2-Fc雙功能蛋白質(zhì)的^J^酸序列具有下面的特征，AA1-28(nt851-934):果蠅BiP分泌信號(來自pMT/Bip/V5-His栽體的前導(dǎo)肽)AA29-115(nt935-1196):人MBD2的AA144-230AA116-129(nt1196-1237):柔性接頭(AAADPIEGRGGGGG)AA130-361(1238-1933):人IGHG1的AA99-330圖2:MBD2-Fe在果蠅Schneider細(xì)胞中的表達(dá)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的S2細(xì)胞接種在培養(yǎng)基WoFCS中，其具有w/o500pMCuS04。4天后收集上清液并在4XM吏用sepharose珠進行預(yù)清除.將lml預(yù)清除的上清液用蛋白As印harose沉淀、洗滌、重懸浮在SDS-上樣染料中并進行SDS-PAGE。凝膠用考馬斯染色以檢測沉淀的蛋白質(zhì).圖3:反向South-Western印跡.將人ICSBP啟動子的50bpPCR片段(A)或者不同CpG密度的甲基化啟動子片段(50ng)(CpG-二核苷酸數(shù)目/100bp:ICSBP:10,6;CHI3L1:2,9;TLR2:6，2;TLR3:2，1)用Sssl曱基化，進行瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色顯示為對照)并直接印跡到尼龍膜上。如實施例3所述將膜用MBD2-Fc、HRP綴合的抗人Fc和ECL染色。圖4:曱基化CpG與MBD-Fc珠的依賴于鹽濃度的結(jié)合(A)人啟動子片段的圖示。圓形標(biāo)記CpG二核苷酸的位置(o:未甲基化的-CPM;參SssI甲基化的-CCL13,TLR2，CHI3L1)。(B，C)曱基化的和未甲基化的片段的混合物結(jié)合到MBD2-Fc畫sepharose(給出了MBD2-Fc的量/50fU蛋白Asepharose)，用增加的鹽濃度洗脫，純化并使用瓊脂糖凝膠電泳分離(與1/5輸入混合物一起)。用溴化乙錠顯示帶并用TyphoonImager(Pharmacia-Amersham)掃描，圖5:通過MCIp對CpG島的富集。將所示細(xì)胞類型的基因組DNA(300ng)進行MCIp。使用LightCycler實時PCR定量三種CpG烏啟動子(TLR2、p15和ESR1)的富集。相對于未處理的基因組DNA對照顯示了從MCIp，3y^液擴增的具體啟動子片段的量。在THP-l細(xì)胞中檢測不到pl5啟動子，表明該基因突變或者缺失。圖6:通過MCIp檢測甲基化CpG島的靈敏性。將減少量的受限的基因組U937DNA進行MCIp.使用LightCycler實時PCR定量兩種CpG島啟動子(TLR2，pl5)的富集。相對于未處理的基因組對照顯示了從MCIp洗脫液擴增的具體啟動子片段的量。圖7:MB-PCR的原理。該圖顯示了MB-PCR的圖示。圖8:在正常和四種白血病DNA樣品中TLR2、ESR1和p15啟動子的MB-PCR,將所示細(xì)胞類型的基因組DNA(10ng)進行MB-PCR。通過標(biāo)準(zhǔn)基因組PCR檢測三種CpG島啟動子(TLR2、p15和ESRl)的富集.在THP-1細(xì)胞中檢測不到p15啟動子，表明該基因突變或缺失。圖9:使用實時PCR對特定CpG島啟動子中CpG甲基化的MCIp檢測.(A-C)將分級的甲基-CpG免疫沉淀(MCIp)與實時LightCyclerPCR組合以檢測來自未處理的(灰色條形)和5*ssl甲基化和限制的基因組DNA片段(黑色條形)的所示基因的甲基化狀態(tài)。從MCIp洗脫液回收的基因片段(NaCl濃度(mM)在上面的方框中給出)和等量的輸入DNA通過LightCycler-PCR擴增。個體級分的值(平均值士SD，n-4)代表回收的百分比并ibt目對于從各自輸入DNA(100。/。)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的量計算。每個圖上圖示了對應(yīng)于CpG島的3kB區(qū)域。每個CpG二核苷酸通過垂直線表示。外顯子的位置以灰色框指出，轉(zhuǎn)錄起始位點用箭頭指出。白色框代表100bp片段。黑色框指出所檢測的MseI片段的位置。(D-G)通過如上的實時PCR分析三種人骨髄白血病細(xì)胞系(KG-1、U937和THP-1)以;SJE常AJL液單核細(xì)胞(N)的高鹽(1000mM)MCIp級分中的5TViW，iV、7X及2、五S/W和CZ)iOV25基因片段。圖10:MCIp方法的靈敏性和線性。(A)將減少量的處理的U937DNA進行MCIp。如上定量0)JDV25和7X及2基因片段。(B)將正常Ajk單核細(xì)胞(N)和KG-1細(xì)胞的Msel處理的DNA以所示的比例混合并將混合物進行MCIp并用如上的LightCycler-PCR定量TLR2基因片段。從下面的實施例可以更好地理解本發(fā)明并看出它的許多優(yōu)點，這些實施例僅用于闡明的目的，并且不意在以任何方式限定本發(fā)明的范圍。實施例l:pMTBip/MBD2-Fc的克隆使用引物MBD2-Nhe_S(5，-AGATGCTAGCACGGAGAGCGGGAAGAGG3，)(SEQIDNO:4)和MBD2-Not一AS(5，-ATCACGCGGCCGCCAGAGGATCGTTTCGCAGTCTC-3，)(SEQIDNO:5)和HerculaseDNA聚合酶(Stratagene)從反轉(zhuǎn)錄的人原代巨噬細(xì)胞總RNA通過PCR擴增對應(yīng)于人MBD2的甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)(Genbankacc.no.NM—003927;AA144-230)的cDNA。循環(huán)參數(shù)為95匸3分鐘變性；95。C，20s，65。C，20s，72。C，80s擴增34個循環(huán)；72。C，5min最后延伸。將PCR產(chǎn)物沉淀，用NotI/NheI消化，克隆到Signalpigplus栽體(Ingenius，R&DSystems)的Notl/Nhel位點中并^ii序列得到plg/MBD2-Fc(真核生物表達(dá)栽體)。為了克隆用于在果蠅S2細(xì)胞中重組表達(dá)的pMTBip/MBD2-Fc，將含有融合到人IgGl的Fc尾的人MBD2的MDB的plg/MBD2-Fc的ApaI/NheI片段亞克隆到pMTBiP/V5-HisB(Invitrogen)的ApaI/SpeI位點。實施例2:抗體樣曱基-CpODNA結(jié)合蛋白的重組表達(dá)使用5-mC抗體可以有效檢測單鏈但是非雙鏈的DNA分子中的甲基化胞嘧啶。為了能夠像抗體那樣檢測雙鏈CpG甲基化DNA，構(gòu)建將如上面實施例1中描述的載體，其編碼融合蛋白，該融合蛋白包含人曱基-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域2(MDB2)的甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)、柔性接頭多肽和人IgGl的Fc部分。蛋白質(zhì)在果錄S2Schneider細(xì)胞中處于金屬可誘導(dǎo)的啟動子的控制下表達(dá)，并通過蛋白A親和層析從上清液收集。純化的蛋白質(zhì)以大量(4-5mg/L細(xì)胞培養(yǎng)物上清液)表達(dá)并且具有約40kDa的預(yù)期分子量(圖2)。因此，詳細(xì)地，由于幾種原因選擇昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)用于重組表達(dá)MBD2-Fc蛋白。主要原因是不存在或者存在低豐度的CpG甲基化.在哺乳動物(特別是人)細(xì)胞中產(chǎn)生該蛋白質(zhì)可以導(dǎo)致DNA污染(結(jié)合到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的MBD2-Fc蛋白質(zhì))，其可以使得CpG甲基化DNA的隨后分析復(fù)雜化。其他原因包括簡單的培養(yǎng)條件和蛋白質(zhì)的可能的高產(chǎn)量。果蠅S2細(xì)MATCC得到并且在培養(yǎng)箱中25X:下含有10%FCS(PAA)的Insect-Xpress培養(yǎng)基(BioWhittaker)中培養(yǎng)。使用Effectene轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的方案用1.5pgpMTBip/MBD2畫Fc和0.3ngpCoHygro(Invitrogeii)的混合物轉(zhuǎn)染4x106^趟S2細(xì)胞/60mm細(xì)胞培養(yǎng)臟。在第三天，M轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，洗滌并在含有10%FCS和300^g/ml潮霉素(BDBiosciences)的選擇培養(yǎng)基(Insect-Xpress)中再次平板接種，在5周內(nèi)每4-5天更換選擇培養(yǎng)基。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞庫擴大并將幾個等分試樣在液氮中保存.對于大規(guī)模生產(chǎn)，在2000ml旋轉(zhuǎn)瓶中沒有FCS(任選地300fig/ml潮霉素)的100-200mlInsect-Xpress中培養(yǎng)1-5x108個細(xì)胞后加入0.5mMCuS04。每4-7天M培養(yǎng)基并將細(xì)胞再次平板接種在補充CuS04的培養(yǎng)基中進一步產(chǎn)生蛋白質(zhì)。合并細(xì)胞培養(yǎng)上清液，對TBS(pH7.4)透析并使用蛋白A柱純化。合并含有MBD-Fc的級分并對TBS(pH7.4)透析。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞產(chǎn)生3-5mg重組MBD2-Fc蛋白/升細(xì)胞培養(yǎng)上清液。實施例3:在膜上檢測CpG甲基化的DNA(反向South-Western印跡)為了測試在Western印跡樣的步驟中，MBD2-Fc是否能夠檢測膜上CpG甲基化的DNA，我們使用等同于常規(guī)DNA印跡然而在印跡前不變性DNA的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將具有不同CpG密度的曱基化或者未甲基化的PCR片段體外印跡到尼龍膜上。如圖3中所示，使用標(biāo)準(zhǔn)印跡條件和MBD-Fc作為一級抗體的等同物，可以以線性方式(圖3A)并且取決于CpG含量(圖3B)在尼龍膜上檢測甲基化的DNA。這些結(jié)果表明MBD-Fc融合蛋白能夠檢測結(jié)合固相支持體的CpG甲基化的DNA。實施例4:使用曱基-CpG免疫沉淀(MCIp)小，富集CpG^甲基化DNA下面的方案允許使用旋轉(zhuǎn)柱快速富集CpG甲基化的DNA。DNA結(jié)合到通過通過蛋白A偶聯(lián)到Sepharose珠的MBD2-Fc蛋白質(zhì)。甲基化DNA的親和性隨著甲基化CpG二核苷酸的密度增加并且隨著洗滌緩沖液的離子強度減小。4.1MBD2-Fc蛋白對蛋白ASepharose的結(jié)合向1mlTBS中的50jil蛋白ASepharose4FastFlow珠(Amersham)加入8-10將純化的MBD^Fc蛋白并在旋轉(zhuǎn)器上4匸下過夜旋轉(zhuǎn)。第二天，將MBD2誦Fc珠用緩沖液A(20mMTris-HClpH8.0，2mMMgCl2，0.5mMEDTA，150mMNaCl，0.1%NP誦40)洗滌兩次。4.2DNA的限制性消化和定量將至少1將基因組DNA(使用Qiagen柱制備)用MseI消化.使用瓊脂糖剿歐電泳控制完全消化并用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)精確定量消化的DNA。4.3高度甲差化的CdG-DNA的定量將消化的DNA(300ng)加入到lml緩沖液A中洗滌的MBD2-Fc-珠中并在旋轉(zhuǎn)器上4t;下旋轉(zhuǎn)3小時.將珠子轉(zhuǎn)移到SpinX-柱并用約lml緩沖液A旋轉(zhuǎn)洗滌。用400jil緩沖液B(20mMTris-HClpH8.0，2mMMgCl2，0.5mMEDTA，450mMNaCl，0.1%NP-40)洗滌珠子兩次并用緩沖液C(20mMTris-HCIpH8.0，2mMMgCl2，0.5mMEDTA，650mMNaCl，0.1%NP-40)洗滌一次。將每次洗滌步驟的穿過液丟棄或者收集用于進一步分析。將CpG甲基化的DNA用250jil緩沖液D(20mMTris-HClpH8.0，2mMMgCl2，0.5mMEDTA，1000mMNaCl，0.1%NP畫40)洗脫到新管中。用QiaquickSpin柱(ELUTED)對洗脫的DNA脫鹽。平行地，將300ng消化的DNA(INPUT)重懸浮在250jil緩沖液D中并用QIAquickPCR純4匕試劑盒(Qiagen)脫鹽。用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)精確定量^yi的和輸入DNA。4.4.備選方法用不同的限制性內(nèi)切酶或者超聲處理可以限制DNA.實施例5:通過MCIp檢測和定量甲基化的CpG"DNA片段為了以免疫沉淀樣方法測試MBD-Fc融合蛋白是否能夠結(jié)合CpG-甲基化的DNA片段，我們首先測試了體外產(chǎn)生的和不同甲基化的DNA片段的結(jié)合性質(zhì).使用PCR產(chǎn)生具有不同CpG密度的人啟動子的PCR片段并用SmI甲基化CpG(CCL13,TLR2，CHI3L1)或者未甲基化(CPM)。DNA結(jié)合到150mMNaCl(實施例4)中的MBD-Fc-蛋白Asepharose珠并用增加濃度的NaCl洗脫。收集級分，旋轉(zhuǎn)純化并進行瓊脂糖凝膠電泳。如圖4B中所示，甲基化片段的親和性隨著甲基化CpG二核苷酸的密度增加，未甲基化的DNA(CPM啟動子片段)在相對低的鹽濃度下洗脫，高甲基化DNA(TLR2啟動子片段)在高鹽濃度下洗脫。輸入DNA的量的改變不顯著改變洗脫圖。然而，DNA的依賴鹽的親和性取決于蛋白Asepharose珠上MBD-Fc融合蛋白的密度。這些結(jié)果表明MBD-Fc融合蛋白能夠以依賴鹽濃度和CpG甲基化密度的方式結(jié)合溶液中的CpG甲基化DNA。5.14吏用基因特異性實時PCR在單個基因水平上定量5.1.1為了測試重組MBD-Fc蛋白是否能夠檢測復(fù)雜基因組DNA混合物中CpG烏啟動子的甲基化密度，將來自三種白血病細(xì)胞系、正常M單核細(xì)胞以及來自AML患者的胚細(xì)胞的基因組DNA用MseI消化并進行MClp。使用LightCycler-PCR檢測1000mMNaClMCIp級分中三種CpG島啟動子(TLR2，p15和ESR1)的富集。選擇這三個基因座是因為p15和ESR1是白血病中甲基化的已知把標(biāo)并且TLR2在以前表明在U937細(xì)胞中但是不在THP-1細(xì)胞中被甲基化,如圖5所示，在來自正常供者DNA(MO)的DNA制備物中不能顯著檢測三種基因座的任一種，這與正常細(xì)胞中CpG烏的通常未甲基化狀態(tài)一致。TLR2在U937但不在THP-1中富集與以前在兩種細(xì)胞中觀察到的甲基化模式一致.如Hahnel，J.Immunol.168(2002)，5629-37)中所述對TLR3啟動子的亞硫酸氫鹽測序表明KGl-細(xì)胞中TLR2啟動子的幾乎完全曱基^化(lt據(jù)未顯示)，其與圖5中所示的強MCIp富集一致。p15在KG1和U937中的結(jié)果與公布的數(shù)據(jù)一致。這些數(shù)據(jù)表明MCIp可以用于檢測基因組DNA中單個基因片段的甲基化DNA片段。因此，通過實時Lightcycler-PCR檢測MCIp艦液中特定MseI片段的富集并相對于基因組輸入(INPUT)定量(見圖5)。還可以在洗脫的和輸入DNA的非特異DNA擴增后定量所述富集(見下面實施例5.2.1中的擴增子產(chǎn)生，數(shù)據(jù)未顯示)。表l-l:CpG島啟動子的基因特異性寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>p15ESR16991108GGCTCAGCTTCATTACCCTCC(SEQIDNO:8)GACTGCACTTGCTCCCGTC(SEQIDNO:10)AAAGCCCGGAGCTAACGAC<SEQIDNO:9)AAGAGCACAGCCCGAGGTTAG(SEQIDNO:ll)87129為了測試MCIp是否可以用于從基因組DNA區(qū)分甲基化和未甲基化的DNA片段，用MCIp富集來自M供者的單核細(xì)胞的體外Sssl甲基化的和未處理的正常DNA的Mwl-P艮制性消化的基因組DNA.選擇MseI用于DNA片段化是因為已知它優(yōu)先在低CpG含量的區(qū)域切割而留下許多CpG島不切割(Cross,Nat.Genet.6(1994)，236-244)。使用LightCycler實時PCR，確定相對于輸入DNA，在Sssl甲基化的和未處理的DNA中四種不同的CpG島啟動子和具有低CpG密度的啟動子的依賴鹽濃度的富集。作為DNA甲基化的陽性對照，使用S7Vi/W基因啟動子，其也在正常細(xì)胞中甲基化的兩個拷貝之一受到母本印記(Zeschnigk，Hum.Mol.Genet.6(1997)，387-395).在正常DNA中，在兩個單獨級分中富集57V1MW的兩種差別甲基化的等位基因片段(見圖9A).用Sssl甲基化的DNA觀察到僅一個富集的級分。對于已知在白血病細(xì)胞中頻繁甲基化的CDAA^5基因(也稱作pl51^411)(Chim，Aim.Hematol.82(2003)，738-742;Dodge,Int.J.Cancer78(1998),561-567;Dodge,Leuk.Res.25(2001)，917-925)(圖9B)，主要在來自正常DNA的低鹽級分和來自甲基化的DNA的高鹽級分中檢測到該片段.對于人雌激素受體10&5iW)基因(Issa，CancerRes.56(1996)，973-977)和人Toll國樣受體2基因(7Z及2)得到相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖9C中所示，在C^/3丄7基因座上甲基化和未甲基化DNA的分布圖與上面測試的CpG島啟動子的分布圖顯著不同.在較低NaCl濃度下回收了多數(shù)未處理的Cff/^J-片段，當(dāng)DNA被SssI甲基化時，對較高的NaCl濃度觀察到輕微偏移。上面的洗脫圖譜的^^斤表明a)在低或者高鹽級分中可以得到比曱基化程度較低的基因組片段強200到300倍的富集；b)具有低CpG密度的片段大部分從高鹽級分排除；c)分級分離的MCIp方法允許分辨CpG甲基化密度中的小差異(SssI處理的和未處理的單核細(xì)胞DNA之間的平均差異約為12個甲基化CpG殘基中6個，數(shù)據(jù)未顯示)。為了測試MCIp是否可以檢測肺瘤樣品中的異常超甲基化，對來自三種白血病細(xì)胞系(KGl，U937,THP-1)以及來自健康供者的單核細(xì)胞的DNA分析在高鹽級分中SA^AW、OWDV25、五5^/和7X及2啟動子富集(見圖9D-G)。7X及2基因啟動子在KG-1和U937細(xì)胞中富集，但是不在THP-1或正常細(xì)胞中富集。通過亞疏酸氫鹽測序證實7X及2的甲基化模式(Haehnel，J.Immunol.76《(2002)，5629-5637)(數(shù)據(jù)未顯示)。CDJ0V2B(KG"1和U937)和五5iW(KG-1)的結(jié)果也與以前公布的研究一致(Chim(2003);Dodge(2001);Issa(1996)，都如上文)。上面三種Mwl片段沒有一種在來自正常細(xì)胞的DNA中顯著富集。與它的印iW目關(guān)的甲基化狀態(tài)符合，SA7f/W基因啟動子在所有白血病細(xì)胞系以及正常細(xì)胞中顯著富集。這些實驗確定高鹽MCIp級分特別富集具有高度CpG甲基化的基因組DNA片段。為了測試該方法的靈敏性，使用MCIp方法^^析增加量的U937DNA。通過LightCycler實時PCR測定JX及2(強甲基化)和CDI0V2丑基因片段(無甲基化)的富集。如圖10A中所示，對于MCIp方法，使用少至lng的基因組DNA片段(等同于約150個腫瘤細(xì)胞)實現(xiàn)了TLR2片段的顯著富集。來自肺瘤的樣品可以含有顯著數(shù)目的正常細(xì)胞，其可以預(yù)期在多數(shù)CpG島未甲基化，為了測試CpG甲基化關(guān)于細(xì)胞純;tA多么線性的，用來自正常血細(xì)胞和白血病細(xì)胞系KG"1的DNA的混合物進行MCIp，表明在幾個啟動子處高水平的CpG島甲基化。如圖10B中所示，^含有KG-1DNA的樣品中檢測到7X及2啟動子片段并且信號隨著樣品中甲基化DNA的比例逐漸增強。對于五WW基因座得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。通常，當(dāng)把基因片段僅含有CpG島內(nèi)的鄰近啟動子時，得到信息最多(關(guān)于對轉(zhuǎn)錄的影響)和最清楚的結(jié)果(按照噪音和背景)。而且，除了酶限制，通過;Mfe方法如超聲處理也實現(xiàn)了DNA片段化(數(shù)據(jù)未顯示)。表1-2:用于CpG島啟動子的實時擴增的基因特異性寡核苷酸引物基因引物序列(有義&反義)_5TW2iV戶5、-TACATCAGGGTGATTGCAGTTCC-3、(SEQIDNO:12)5誦TACCGATCACTTCACGTACCTTCG-3'(SEQIDNO:13)7X及25-TGTGTTTCAGGTGATGTGAGGTC-3'(SEQIDNO:14)5、-CGAATCGAGACGCTAGAGGC-3(SEQIDNO:15)、5-GACTGCACTTGCTCCCGTC國3'(SEQIDNO:16)5國AAGAGCACAGCCCGAGGTTAG~3、(SEQIDNO:17)5-GGCTCAGCTTCATTACCCTCC-3、(SEQIDNO:18)5、-AAAGCCCGGAGCTAACGA(SEQIDNO:19)C朋"5、-ATCACCCTAGTGGCTCTTCTGC-3、(SEQIDNO:20)5、CTTTTATGGGAACTGAGCTATGTGTC-3、(SEQIDNO:21)5丄2為了確定檢測基因組DNA的復(fù)雜混合物中單個基因片段所需的DNA的量，將不斷減少量的DNA片段進行MCIp和l^的LightCycler實時PCR。如圖6中所示，可以富集甲基化的TLR2啟動子并且可以從少至lng來自U937細(xì)胞的基因組DNA檢測到。U937細(xì)胞中未甲基化的p15啟動子不能顯著富集(20ngMCIp-洗脫物)或者不能檢測到(4ng或1ngMCIp洗脫物)(圖6)。這些結(jié)果表明MCIp是一種檢測復(fù)雜基因組混合物中甲基化DNA片段的靈敏方法。5.2使用微陣列技術(shù)在基因組水平上定量5.2.1使用連接介導(dǎo)的(LM)-PCR從基因組MES-1片段產(chǎn)生DNA擴增子為了產(chǎn)生MseI-相容的LMPCR-接頭，如下退火寡核苷酸LMPCR_S-L(5，畫GCGGTGACCCGGGAGATCTCTTAAG誦3，)(SEQIDNO:22)和LMPCR一AS-L(5，國TACTTAAGAGATC-3，)(SEQIDNO:23)。將兩種寡核苷酸在無核酸酶的H20(USB)中以20fiM的濃度合并，在80"C溫育10分鐘，緩慢冷卻到RT。退火的接頭以50nl等分試樣保存在-20x:。在60jil反應(yīng)物中使用1piT4-連接酶(1200u/fil，NEB)在16°Co/n下將LMPCR省頭(0.5nl/ngg的-和輸入-DNA)連接到M的DNA并JLfr單獨反應(yīng)中連接到等量的輸入DNA.使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen)對接頭連接的DNA脫鹽并在55piTris-HClpH8.0(5mM)中使用LMPCR-引物(5，-GTGACCCGGGAGATCTCTTAAG~3，)(SEQIDNO:24)和TaqDNA聚合酶(Roche)通過PCR擴增接頭連接的DNA(分別為洪應(yīng)的-和輸入的)。PCR混合物含有25nl10xPCR-緩沖液(Roche),15jilMgCl2(25mM，Roche),10jildNTPs(每種10mM)65jil甜菜堿(5M，Sigma),2.5piLMPCR-引物，45接頭連接的DNA，2，5piTaqDNA聚合酶(5U/nl)，總體積250^1，將其分布到5個PCR管中。循環(huán)參數(shù)為58。C，2min(解鏈LMPCR一AS-L)，72。C5min(填充突出端)；95。C,30s，58。C，30s，72°C，3min擴增15個循環(huán)；72。C，10min最后延伸。將PCR反應(yīng)物組合并使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen)純4匕。4吏用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)精確定量洗脫的和輸入擴增子。5.2.2使用CpG島微陣列分析MCIp擴增子使用PCR(LightCycler，StandardPCR)分析MCIp擴增子以檢測單個基因片段的富集。為了檢測多種基因片段，可以使用陣列技術(shù)。使用例如CpG島微陣列對MCIp擴增子的分析將涉及MCIp-DNA片段的熒光標(biāo)記和I^4吏用標(biāo)準(zhǔn)方案與微陣列雜交。實施例6:使用甲基結(jié)合聚合SIM式反應(yīng)(MB-PCR)檢測CpG甲基化DNA片段的單管測定該方法使用類似于ELISA的方法。將對CpG甲基化DNA具有高親和性的蛋白質(zhì)包被到PCR循環(huán)似目配的反應(yīng)容器的壁上并用于從基因組DNA混合物選擇性捕獲強烈甲基化的DNA片段?？梢允褂肞CR(標(biāo)準(zhǔn)PCR或者實時PCR，單一或者多路)在同一管中檢測特定DNA片段(例如，特定基因的CpG島啟動子)的保留?？梢韵鄬τ诨蚪M輸入DNA的PCR反應(yīng)估計甲基化的程度.圖7顯示了MB-PCR的圖示。6.1DNA制備和片段化使用血液和細(xì)胞培養(yǎng)物Midi試劑盒(BloodandCellCultureMidiKit(Qiagen))從三種細(xì)胞系(KGl、UW7和THP-1)、正常人單核細(xì)胞(^Li:供者)和來自AML患者的冷凍胚細(xì)胞制備基因組DNA。通過瓊脂糖^電泳基因組DNA用MseI(NEB)消化并最終使用PicoGreendsDNAQuantitationReagent(MolecularProbes)定量。6.2PCR管的制備使用熱穩(wěn)定的T叩YieldTMStrips(NuncCat.No.248909)制備MBD-Fc-包被的PCR管。向每管中加入50jil重組MBD-Fc-蛋白質(zhì)(用10mMTris/HClpH7.5稀釋為15ng/ml)并在4"C過夜溫育。將孔用200jilTBS(20mMTris，pH7.4，含有150mMNaCl)洗滌三次并在4"用100jil封閉溶液(IOmMTris，pH7.5,含有150mMNaCl，4.5%脫脂奶粉，5mMEDTA和0.8jig/ml每種聚d(I/C)，聚d(A/T和聚d(CG))過夜封閉。將管用200piTBST(TBS，含有0.1%Tween-20)洗滌三次。6.3甲基化DNA的結(jié)合向每孔加入50jil結(jié)合緩沖液(20mMTris,pH7.5，含有400mMNaCl，2mMMgCl2，0.5mMEDTA，和0.05%Tween-20),并向每第二個孑L加入1jilMseI-消化的DNA(10ng/fil)(M反應(yīng))。在搖床上4t:下溫育孔3小時。用200pi結(jié)合緩沖液洗滌管三次，并用10mMTris/HClpH7.5洗滌一次。6.4甲基化DNA片段的檢測直接在TopYieldTMStrips中進行PCR。PCR混合物(50/孔)含有標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液(Roche)、2.5UFastStartTaqDNA聚合酶(Roche)、10pmol每種基因特異性引物(由Qiagen合成)、dNTPs(每種200mM，Amersham/Pharmacia)、1M甜菜堿(Sigma)，引物序列和循環(huán)^lt分別在表2和3中顯示。加入PCR混合物后，向每隔兩個孔加入ljilMseI-消化的DNA(10ng/jd),其以前沒有與DNA片段溫育(P-反應(yīng))。使用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物并使用Typhoon9200Imager(Amersham/Pharmacia)掃描溴化乙錠染色的凝膠.表2循環(huán)參數(shù)(MB-PCR):940C3min<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表3CpG島啟動子的基因特異性寡核苷酸基因MseI片段(bp)有義引物反義引物產(chǎn)物(bp)TLR2pl5ESR113586991108TGTGTTTCAGGTGATGTGAGGTC(SEQIDNO:14)GGCTCAGCTTCATTACCCTCC(SEQIDNO:8)GACTGCACTTGCTCCCGTC(SEQIDNO:16)CGAATCGAGACGCTAGAGGC(SEQIDNO:15)AAAGCCCGGAGCTACGAC(SEQIDNO:9)AAGAGCACAGCCCGAGGTTAG(SEQIDNO:17)11887129圖8顯示了分析5種細(xì)胞類型中三種不同的CpG島啟動子的甲基ttS分布圖的MB-PCR實驗的結(jié)果。標(biāo)記P的泳道^RJ^基因組輸入DNA的擴增。除了THP-1細(xì)胞中pl5基因例夕卜(可能缺失或突變)外，擴增了所有啟動子。值得注意的是，在MB-PCR反應(yīng)中從正常DNA對照沒有檢測到啟動子，這與這些啟動子在正常個體中不甲基化的事實一致。在細(xì)胞系以及患者樣品中，啟動子曱基化程度最大。結(jié)果對應(yīng)于在獨立的實驗中用MCIp得到的數(shù)據(jù)。權(quán)利要求1.具有編碼雙功能多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述雙功能多肽包含屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)家族的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分。2.權(quán)利要求1的核酸分子，其還包含編碼接頭多肽的核苷酸序列。3.權(quán)利要求1或2的核酸分子，其中所iL^于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)家族的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是MBD2蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。4.權(quán)利要求1到3任一項的核酸分子，其包f逸自如下的核苷酸序列(a)核酸分子，其具有SEQIDNO:l(圖l)中顯示的核苷酸序列；(b)核酸分子，其具有編碼具有SEQID:NO2(圖1)中顯示的^J^^f列的多肽的核苦酸序列；(c)核酸分子，其具有編碼具有SEQID:NO2(圖1)中顯示的M^列的多肽的片段的核苷,列，其中所述片段包含所述多肽的至少^J^酸130到361，并且能夠結(jié)合甲基化的DNA;(d)核酸分子，其具有編碼(a)到(c)任一項的多核苷酸編碼的多肽的變體的核苷酸序列，其中在所述變體中，一個或多個氨基酸殘基與所述多IMS比被替代，并且其中所述變體能夠結(jié)合甲基化的DNA;(e)核酸分子，其與(a)到(d)任一項的核酸分子雜交并且與(a)的核酸分子的核苷酸序列至少65%同一并且編碼能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；(f)核酸分子，其編碼與(b)的核酸分子編碼的多肽至少65%同一并且能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽；和(g)核酸分子，其具有作為(a)到(f)任一項的多核苷酸的核苷酸序列的簡并序列的核苷酸序列；或者這種多核苷酸的互^h^。5.權(quán)利要求1到4任一項的核酸分子，其是DNA、cDNA、基因組DNA、RNA或者PNA。6.栽體，其包含權(quán)利要求1到5任一項的核酸分子。7.權(quán)利要求6的栽體，其中所述核酸分子有效連接允許在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列。8.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求1到5任一項的核酸分子或者權(quán)利要求6或7的載體基因工程化。9.產(chǎn)生能夠結(jié)合甲基化DNA的多肽的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞并回收所述多肽。10.產(chǎn)生能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，所述多肽能夠結(jié)合甲基化DNA，所述方法包括用權(quán)利要求6或7的栽體在體外基因工程化細(xì)胞。11.多肽，其具有權(quán)利要求1到5任一項的核酸分子編碼的M酸序列或者可以通it^利要求10的方法得到，12.抗體，其特異結(jié)合權(quán)利要求ll的多肽。13.組合物，其包含權(quán)利要求1到5任一項的核酸分子、權(quán)利要求6或7的載體、權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求11的多肽或者權(quán)利要求12的抗體.14.權(quán)利要求13的組合物，其是診斷組合物，任選還包含合適的診斷手段。15.權(quán)利要求13的組合物，其是藥物組合物，任選還包含可藥用栽體，16.檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)將包含甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品與權(quán)利要求11的多肽接觸；和(b)檢測權(quán)利要求11的多肽與甲基化DNA的結(jié)合。17.權(quán)利要求16的方法，其是反向South-Western印跡、免疫沉淀、親和純化、甲基-CpG免疫沉淀(MCiP)或甲基結(jié)合(MB-)PCR。18.權(quán)利要求16或17的方法，其還包括步驟(c)通過限制酶消化、亞硫酸氫鹽測序、焦磷酸測序、DNA印跡或者PCR分析甲基化的DNA。19.權(quán)利要求11的多肽用于檢測甲基化DNA的用途。20.權(quán)利要求1到5任一項的核酸分子、權(quán)利要求6或7的栽體、權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求11的多肽或者權(quán)利要求12的抗體用于制備檢測甲基化DNA的診斷組合物的用途。21.權(quán)利要求1到5任一項的核酸分子、權(quán)利要求6或7的載體、權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求11的多肽或者權(quán)利要求12的抗體用于制備檢測腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞的診斷組合物的用途。全文摘要本申請涉及具有編碼雙功能多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述雙功能多肽包含屬于甲基-CpG結(jié)合蛋白(MBD)家族的蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗體的Fc部分。此外，公開了包含所述核酸分子的載體和宿主細(xì)胞和所述核酸分子編碼的多肽以及產(chǎn)生所述多肽的方法。此外，本申請?zhí)峁┝颂禺惤Y(jié)合所述多肽的抗體和組合物，尤其診斷組合物，所述組合物包含本申請的核酸分子、載體、宿主細(xì)胞、多肽或抗體。此外，提供了使用本發(fā)明的多肽檢測甲基化DNA，尤其腫瘤組織或者腫瘤細(xì)胞中的甲基化DNA的方法和用途。文檔編號C12N15/10GK101243191SQ200580047175公開日2008年8月13日申請日期2005年11月28日優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日發(fā)明者M·雷里申請人:雷根斯堡大學(xué)臨床中心