專利名稱：在種子中具有“不飽和”或降低飽和水平的脂肪酸的某些植物以及來自種子的油的制作方法
與相關(guān)申請的交叉參考本發(fā)明要求提交于2004年10月8日的美國臨時申請系列號60/617,532的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
植物油已經(jīng)逐漸取代動物油和脂肪作為飲食脂肪攝入的主要來源。然而，在多數(shù)工業(yè)國家中飽和脂肪攝入保持在總熱量消耗的約15％至20％。在推動更健康的生活方式的努力中，美國農(nóng)業(yè)部(USDA)最近已經(jīng)推薦飽和脂肪占每日熱量攝入的小于10％。為使消費者易于了解，當(dāng)前由USDA發(fā)布的標(biāo)簽指導(dǎo)現(xiàn)在要求總飽和脂肪酸水平低于1.0g/14g方可獲得“低飽和”標(biāo)簽，低于0.5g/14g方可獲得“無飽和”標(biāo)簽。這意味著植物油的飽和脂肪酸含量需要低于7％和3.5％方可分別獲得“低飽和”和“無飽和”標(biāo)簽。由于這些指導(dǎo)的發(fā)布，因此對“低飽和”油的消費需求明顯增加。迄今為止，滿足要求的主要為油菜油以及程度低得多的向日葵油和紅花油。
無論是植物或動物來源，油的特征主要由碳和氫原子的數(shù)目以及脂肪酸鏈包含的雙鍵的數(shù)目和位置決定。來自植物的多數(shù)油由不同數(shù)量的軟脂酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)脂肪酸組成。習(xí)慣上將軟脂酸和硬脂酸稱為“飽和”，因為其碳鏈被氫原子飽和，因此不具有雙鍵；它們含有最大可能數(shù)目的氫原子。然而，油酸、亞油酸和亞麻酸是其中分別具有1、2和3個雙鍵的18碳脂肪酸鏈。一般認(rèn)為油酸是單不飽和脂肪酸，而認(rèn)為亞油酸和亞麻酸是多不飽和脂肪酸。美國農(nóng)業(yè)部將“無飽和”產(chǎn)品定義為具有少于3.5％(以重量計)的組合飽和脂肪酸(與脂肪酸總量相比)的產(chǎn)品。
不飽和脂肪(單不飽和及多不飽和)是有益的(特別是適量消費時)，而飽和脂肪及反式脂肪則不然。飽和脂肪和反式脂肪提高血中LDL膽固醇水平。膳食膽固醇也提高LDL膽固醇，并且甚至不提高LDL而促進(jìn)心臟病。因此，建議選擇低飽和脂肪、反式脂肪和膽固醇的食品作為健康飲食的一部分。
最近的研究已經(jīng)確定了以高水平單不飽和脂肪酸(特別是油酸)作為主要飲食脂肪組分的健康價值。這些飲食認(rèn)為可降低由高飽和脂肪酸飲食導(dǎo)致的動脈硬化的發(fā)病率。因此存在對具有高單不飽和脂肪酸含量的食用植物油的需求。種子誘變已經(jīng)用于產(chǎn)生具有不高于4％飽和脂肪酸含量的菜籽油(PCT國際專利申請公布號WO 91/15578)。
1985年，超過13％的世界食用油供應(yīng)產(chǎn)生自油料種子作物物種蕓苔，通常稱為油菜籽或芥菜。蕓苔是第三重要的食用油來源，僅次于大豆和棕櫚。由于蕓苔能在相對低的溫度下萌發(fā)和生長，因此它也是可在較冷的農(nóng)業(yè)區(qū)種植以及在更溫暖的地區(qū)作為冬季作物的少數(shù)具有經(jīng)濟(jì)重要性的食用油料種子作物之一。此外，正更多地考慮將植物油(特別是菜籽油)用于工業(yè)應(yīng)用，因為它們具有提供與合成油或礦物/基于環(huán)烷的油相當(dāng)?shù)男阅艿臐摿?，還具有可生物降解這一非常需要的優(yōu)勢。
在所有的植物油中，蕓苔油具有最低水平的飽和脂肪酸?！笆|苔”指油菜籽(芥)，其具有至多為種子脂肪酸總量2％(以重量計)(優(yōu)選至多0.5％(以重量計)，最優(yōu)選基本為0％(以重量計))的芥酸(C22:1)，并在壓榨后產(chǎn)生每克含有小于30微摩爾脫脂(無油)粉的風(fēng)干粉。這些類型的油菜籽通過其與該物種中更常規(guī)變種相比較的可食性來區(qū)分。
可以以化學(xué)方法進(jìn)行植物油的修飾。已經(jīng)使用該方法獲得含有少于約3％飽和脂肪酸的沙拉/烹調(diào)油(美國專利號4,948,811)；油可以通過化學(xué)反應(yīng)形成，或者通過物理分離飽和脂類而形成。一般參考使用“遺傳工程”獲得具有所需特征的油(參閱第3欄第58行及以下等等)。然而，沒有詳細(xì)公開如何這樣修飾任一特定油料種子植物以提供具有所需特征的植物油。
作為替代的，一般通過常規(guī)育種技術(shù)修飾植物油的脂肪酸組成。這些技術(shù)使用現(xiàn)存的種質(zhì)作為影響脂肪酸組成的天然發(fā)生的突變的來源。使用適當(dāng)?shù)暮Y選與其后的育種結(jié)合來發(fā)現(xiàn)和選擇這些突變。例如，已經(jīng)使用這樣的方法來降低菜籽油中長鏈飽和脂肪酸芥酸的含量(Stefansson，B.R.(1983)《High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils》，Kramer J.K.G.等編輯；Academic Press，New York；144-161頁)和提高玉米油中單不飽和脂肪酸油酸的量(美國專利申請系列號07/554,526)。
近來，已經(jīng)嘗試通過使用誘變劑增加用以選擇所需特征的可用突變。然而，誘變劑一般通過失活或修飾已存在的基因而導(dǎo)致特定功能的喪失或降低來發(fā)揮作用。因此通過誘變引入新特征經(jīng)常依賴于某個現(xiàn)存性狀的喪失。此外，通過誘變劑實現(xiàn)所需目的通常是不確定的。使用該方法僅在植物油中獲得了少數(shù)類型的修飾脂肪酸組成。這種影響脂肪酸組成的“創(chuàng)造性”突變的一個實例是降低菜籽油中多不飽和脂肪酸(特別是亞油酸和亞麻酸)，而同時提高單不飽和脂肪酸油酸(Auld，M.，等，(1992)Crop Sci.出版中)。另一實例是降低菜籽油中的飽和脂肪酸(PCT國際專利申請公布號WO 91/15578)。然而，種子油合成的生物化學(xué)是復(fù)雜并且尚未完全了解的，可能存在若干機(jī)制造成在菜籽油中觀察到的脂肪酸組成改變(PCT國際專利申請公布號WO 91/15578)。使用誘變影響這些改變基本上是隨機(jī)、非特異的。
理論上，通過使用遺傳工程修飾脂肪酸組成的可能性會允許精確受控地引入特定的所需基因以及失活不需要的特定基因或基因產(chǎn)物。因此，可以向植物中引入完全不依賴于現(xiàn)存基因的新性狀，或者可以失活或修飾預(yù)選擇的基因。然而，有效使用遺傳工程修飾脂肪酸組成的一個先決條件是在植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)脂肪酸合成和加工的機(jī)理的合理的準(zhǔn)確模型。
美國專利號6,495,738(還可參閱WO 99/50430)顯示可以通過在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)真菌軟脂酰CoAΔ-9去飽和酶來改變玉米油和煙草種子的飽和脂肪酸水平。這些蛋白質(zhì)最可能使軟脂酰CoA分子酶酶促去飽和，優(yōu)選通過移去分子CoA部分的第9和第10個碳原子之間的兩個氫原子并添加雙鍵，從而產(chǎn)生棕櫚油酰CoA(16:1Δ-9)。棕櫚油酰CoA最終摻入種子油中，從而降低所述油的總飽和水平。玉米油的總飽和脂肪酸水平(平均約為13.9％)不符合上文所述當(dāng)前的標(biāo)簽指導(dǎo)。此外，與大豆、蕓苔、向日葵等相比，一般不認(rèn)為玉米是油料作物。事實上，認(rèn)為產(chǎn)生并提取自玉米的油是淀粉提取中使用的濕磨方法的副產(chǎn)品。因此，幾乎沒有興趣修飾玉米油的飽和水平。
公認(rèn)在油料種子中脂肪酸合成主要發(fā)生在質(zhì)體中，并且新合成的脂肪酸從質(zhì)體外運至胞質(zhì)。它們在胞質(zhì)中用于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生甘油三酯的裝配。
脂肪酸合成的主要產(chǎn)物是軟脂酸(16:0)，它似乎可有效延伸成硬脂酸(18:0)。仍然在質(zhì)體中時，飽和脂肪酸可以接著通過稱為Δ-9去飽和酶的酶去飽和，以引入一個或多個碳-碳雙鍵。特別是硬脂酸可被質(zhì)體Δ-9去飽和酶迅速去飽和而獲得油酸(18:1)。事實上，軟脂酸也可被質(zhì)體Δ-9去飽和酶去飽和成棕櫚油酸(16:1)，但該脂肪酸在多數(shù)植物油中僅以痕量存在(0-0.2％)。
因此，質(zhì)體中脂肪酸合成的主要產(chǎn)物為軟脂酸、硬脂酸和油酸。在多數(shù)油中，由于飽和脂肪酸以小得多的比例存在，因此油酸是合成的主要脂肪酸。
其后在胞質(zhì)中質(zhì)體外植物脂肪酸的去飽和似乎僅限于油酸，它可去飽和成亞油酸(18:2)和亞麻酸(18:3)。此外，取決于植物，油酸可以通過延長(至20:1、22:1和/或24:1)或通過加入官能團(tuán)而進(jìn)一步進(jìn)行修飾。接著這些脂肪酸與飽和脂肪酸軟脂酸和硬脂酸一起可以裝配成甘油三酯。
植物Δ-9去飽和酶是可溶的。它位于質(zhì)體間質(zhì)中，使用酯化成ACP(主要是硬脂酰ACP)的新合成脂肪酸作為底物。這與酵母Δ-9去飽和酶相反，后者位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER，或微粒體)中，使用酯化成CoA的脂肪酸作為底物，并且使飽和脂肪酸軟脂酸和硬脂酸去飽和。美國專利號5,723,595和6,706,950涉及植物去飽和酶。
酵母Δ-9去飽和酶已經(jīng)從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分離、克隆并測序(Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.26416537-16544(1989)；Stukey，J.E.等，J.Biol.Chem.26520144-20149(1990))。該基因還已用于在顯然過表達(dá)的條件下轉(zhuǎn)化同一酵母菌株，引起轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中貯藏脂類累積的提高，所述提高通過使用尼羅紅染色甘油三酯的熒光顯微術(shù)測定(美國專利號5,057,419)。沒有對脂肪酸組成進(jìn)行表征。該參考文獻(xiàn)包含對使用來自分離的酵母Δ-9去飽和酶基因的信息首先從酵母或從其他生物分離其他去飽和酶基因，接著在條件下將這些基因再引入酵母或植物的一般討論。推測這可以導(dǎo)致高表達(dá)，從而修飾產(chǎn)生的油及其脂肪酸組成。
其后，報道了將酵母Δ-9去飽和酶基因引入煙草葉組織(Polashcok，J.等，F(xiàn)ASEB J.5A1157(1991))并在該組織中明顯表達(dá)。此外，該基因在番茄中表達(dá)。參閱Wang等，J.Agric Food Chem.443399-3402(1996)和C.Wang等，Phytochemistry 58227-232(2001)。盡管在煙草和番茄中報道了某些不飽和物的提高和一些飽和物的降低，但是煙草和馬鈴薯顯然不是油料植物。還將該酵母基因引入了歐洲油菜(Brassica napus)中(參閱美國專利號5,777,201)。盡管報道了軟脂酸和硬脂酸(飽和物)的減少以及棕櫚油酸和油酸(不飽和物)的增加(參閱該專利實施例7的表1a和1b)，但在下文詳述章節(jié)中將更詳細(xì)地討論該參考文獻(xiàn)。WO 00/11012和美國專利號6,825,335涉及用于在植物中表達(dá)的合成酵母去飽和酶基因，其中該基因包含去飽和酶結(jié)構(gòu)域和cyt b5結(jié)構(gòu)域。這些參考文獻(xiàn)的背景章節(jié)詳細(xì)討論了脂肪酸合成。
植物油的性能特征(無論是飲食特征或工業(yè)特征)基本由其脂肪酸譜決定，即由油中存在的脂肪酸種類以及每個種類的相對和絕對量決定。盡管已知脂肪酸譜和性能特征之間的若干關(guān)系，但有許多仍然未知。盡管如此，植物油中存在的不飽和的類型和數(shù)量與其飲食和工業(yè)應(yīng)用都相關(guān)。
標(biāo)準(zhǔn)蕓苔油含有約8-12％的亞麻酸，這使其就氧化而言(因此也就風(fēng)味和穩(wěn)定性而言)處于與大豆油相似的類別。可以以許多方式提高蕓苔油的氧化穩(wěn)定性，例如通過氫化來減少不飽和量、添加抗氧化劑和用具有較好氧化穩(wěn)定性的油進(jìn)行調(diào)和。例如，用低亞麻酸油(如向日葵)調(diào)和蕓苔油可降低18:3水平，從而提高油的穩(wěn)定性。然而，這些處理必然提高油的費用，并且可能具有其他問題，例如氫化可能同時提高飽和脂肪酸的水平和反式不飽和的量，這兩者都是飲食應(yīng)用中所不希望的。
高油酸油是可以提供的，但是除了這些溢價油可能增加的費用以外，來自為極高油酸水平育種的作物的植物油可證明不適用于工業(yè)用途，因為它們保留了很高水平的多不飽和脂肪酸，主要是亞油酸和/或亞麻酸。這些油對于飲食應(yīng)用仍然非常有用，包括作為烹調(diào)油，但在可見于工業(yè)應(yīng)用的更嚴(yán)格條件下氧化穩(wěn)定性不足。添加抗氧化劑甚至也不能使這些油達(dá)到工業(yè)應(yīng)用所需的氧化穩(wěn)定性水平，這可能是因為這些油中對氧化極端敏感的亞麻酸水平。
氧化穩(wěn)定性對于工業(yè)應(yīng)用是很重要的，可在熱和壓力條件下以及在化學(xué)副產(chǎn)物存在下延長潤滑劑的壽命。在這些應(yīng)用中，亞麻酸(以及亞油酸，其程度較低)仍然是弱氧化穩(wěn)定性的最主要原因。
因此需要獲得歐洲油菜變種，其具有農(nóng)業(yè)成活力并產(chǎn)生具有足以使其可用于飲食應(yīng)用的氧化穩(wěn)定性水平，并且還本身足夠穩(wěn)定或者(取決于確切的應(yīng)用)對抗氧化劑具有足夠的感應(yīng)性，從而可用于工業(yè)應(yīng)用。
歐洲專利申請EP 323753、美國專利號5,840,946和美國專利號5,638,637涉及具有80-90％油酸含量(以脂肪酸總量的重量計)和不高于2％的芥酸的菜籽油。使用誘變提高油酸含量。’946申請的權(quán)利要求書進(jìn)一步規(guī)定該油具有不超過2％的芥酸含量和小于3.5％的α-亞麻酸含量以及不高于7％的硬脂酸和軟脂酸形式的飽和脂肪酸含量。這些專利涉及在誘變之后進(jìn)行選擇。
美國專利號5,387,758、5,434,283和5,545,821涉及具有2-4％(以重量計)的硬脂酸和軟脂酸組合以及不高于約2％(以重量計)的芥酸含量的菜籽油。使用誘變降低硬脂酸和軟脂酸含量。
國際申請WO 92/03919和美國專利號5,668,299、5,861,187和6,084,157涉及具有改變的脂肪酸譜的油菜籽、植物和油。提到了若干這樣的譜，其全部預(yù)期最高約2％的芥酸含量與約7％至約12％的軟脂酸含量、約14％至約20％的亞油酸含量、約0.8％至約1.1％的硬脂酸含量、約7％至約9％的α-亞麻酸含量以及某些范圍的FDA飽和物的組合。這些專利將飽和脂肪酸和“FDA飽和物”定義為月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、軟脂酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的總和。
國際申請WO 93/06714和美國專利號6,270,828、6,562,397、6,680,396和6,689,409涉及具有降低的硫苷(glucosinolate)(從而具有降低的硫)以及約2％至約7％的α-亞麻酸含量的蕓苔油和種子。
美國專利號6,169,190涉及來自蕓苔種子的油，其具有約71-77％的油脂肪酸含量和少于約3％的亞麻酸含量。還要求了34-55之間的油酸∶亞麻酸比。
美國專利號6,063,947和5,850,026要求保護(hù)得自蕓苔種子的油、相關(guān)蕓苔植物以及產(chǎn)生油的方法，其中油具有高于約80％(約86-89％)的油酸含量、約2％至約6％的亞油酸含量、少于約2.5％(約1-2％)的α-亞麻酸含量和少于約2％(水解后)的芥酸含量。這些專利涉及種子特異性抑制微粒體油酸去飽和酶(將油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸的Δ-12去飽和酶)和微粒體亞油酸去飽和酶(將亞油酸轉(zhuǎn)化成α-亞麻酸的Δ-15去飽和酶)的基因表達(dá)。
美國專利號5,952,544要求保護(hù)催化碳15和16間反應(yīng)的植物質(zhì)體或微粒體Δ-15脂肪酸去飽和酶的片段。
美國專利號4,627,192和4,743,402涉及向日葵種子和向日葵油，其具有約80-94％(相對于其總脂肪酸含量)的油酸含量，并且亞油酸與油酸的比值小于約0.09。這些向日葵植物通過常規(guī)育種技術(shù)得到。
WO 2003002751涉及激酶基因等用于改變植物油表型的用途。
不能預(yù)計Δ-9去飽和酶基因顯著(并且需要地)影響已經(jīng)有益的油料種子作物的脂肪酸譜的能力，特別是降低飽和脂肪水平而不對植物和油的其他方面產(chǎn)生不利影響的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明提供“無飽和”蕓苔油。本發(fā)明還部分涉及減少某些植物種子中飽和脂肪酸的方法。令人驚奇地，通過在蕓苔(Brassica)中使用Δ-9去飽和酶基因?qū)崿F(xiàn)了這些結(jié)果。該技術(shù)可應(yīng)用于本文公開的其他植物。本發(fā)明包括能產(chǎn)生這些油和種子的植物，優(yōu)選蕓苔。本發(fā)明還提供來自所述植物的種子和油，其中特別地，油具有此前未曾得到過的優(yōu)勢特征和脂肪酸譜。本發(fā)明還提供植物優(yōu)化的Δ-9去飽和酶基因。在一些優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選的植物包含本發(fā)明Δ-9去飽和酶基因的至少兩個拷貝。令人驚奇地，這些植物產(chǎn)生的種子不顯示基因沉默的效應(yīng)，而是還具有總飽和物水平的令人驚奇的降低。
附圖簡述

圖1顯示在擬南芥中實現(xiàn)了飽和脂肪酸大于60％的降低。該圖概述了單個擬南芥事件的T2和T3種子數(shù)據(jù)。
圖2顯示來自18個額外轉(zhuǎn)化體的T2擬南芥種子中“飽和物”高達(dá)60-70％的降低。該圖中展示的數(shù)據(jù)為表8中顯示的數(shù)值數(shù)據(jù)和較早的數(shù)值數(shù)據(jù)的組合。
圖3顯示在Westar蕓苔中飽和脂肪超過43％的降低(包括24:0時為50％的降低)。
圖4A顯示來自多種蕓苔植物(包括事件36-11.19)的種子中總飽和物與對照相比的柱形圖。圖4B和4C顯示柱形圖中展示的數(shù)值數(shù)據(jù)。
圖5A顯示來自多種蕓苔植物(包括事件218-11.30)的種子中總飽和物與對照相比的柱形圖。圖5B和5C顯示柱形圖中展示的數(shù)值數(shù)據(jù)。
圖6A-F顯示來自T3大田試驗的半種子數(shù)據(jù)。圖6A和6B明確顯示了與空白(轉(zhuǎn)基因分離出植物的事件)和野生型對照(未轉(zhuǎn)化株系)相比，轉(zhuǎn)基因事件中C16:0的降低和C16:1的提高。圖6C和6D明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C18:0的降低和C18:1的提高。圖6E和6F分別明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C20:0和C22:0的降低。
圖6G和6H明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C16:0的改變和降低以及C16:1的改變和提高。圖6I和6J明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C18:0的改變和降低以及C18:1的改變和提高。圖6K和6L顯示C18:2和C18:3相似的柱形圖。圖6M進(jìn)一步展示了與現(xiàn)有的優(yōu)秀株系Nex 710相比總飽和物的降低。圖6N顯示了1000個種子的分布。
圖7A和7B展示使用實施例16的方案得到的數(shù)據(jù)。
圖8和9是用來自實施例19討論的F3植物的DNA進(jìn)行的兩個凝膠電泳的圖片。
序列簡述SEQ ID NO1顯示本文使用的植物優(yōu)化的Δ-9去飽和酶基因可讀框的核酸序列。
SEQ ID NO2顯示前面為Kozak序列和BamHI克隆位點(殘基1-10)的SEQ ID NO1的ORF序列以及ORF末端的翻譯終止子(殘基1379-1381)。
SEQ ID NO3顯示用于擴(kuò)增Δ-9基因的Δ-9正向B引物的核酸序列。
SEQ ID NO4顯示用于擴(kuò)增Δ-9基因的Δ-9反向B引物的核酸序列。
SEQ ID NO5顯示SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供“無飽和”蕓苔油。本發(fā)明還部分涉及減少某些植物種子中飽和脂肪酸的方法。令人驚奇地，通過在植物(優(yōu)選油料植物，更優(yōu)選蕓苔(Brassica))中使用Δ-9去飽和酶基因產(chǎn)生“無飽和”水平的脂肪酸實現(xiàn)了這些結(jié)果。本發(fā)明包括這些植物，還提供來自所述植物的種子和油，其中油具有此前未曾獲得的特別有利的特征和脂肪酸譜。
本文示例了構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)微粒體Δ-9-CoA去飽和酶基因。這種Δ-9去飽和酶是膜結(jié)合酶，催化16:0-CoA和18:0-CoA至16:1-CoA和18:1-CoA的反應(yīng)(在Δ-9位置加入雙鍵)。本發(fā)明的意義還在于其他飽和物(如C20:0、C22:0和C24:0)的水平也令人驚奇并有利地降低了，而C16:1和C18:1不飽和物則提高(C18:2和C18:3不提高或幾乎不提高，在一些情況下這些相對不穩(wěn)定的多不飽和物甚至降低)。迄今為止尚不清楚這在已經(jīng)具有需要的(但不是最優(yōu)的)脂肪酸譜的蕓苔和其他“優(yōu)良”油料種子作物中是否是良好的酶(包括該基因是否可以足夠表達(dá))。(例如，它在玉米中僅得到飽和物10％的降低。)如背景章節(jié)中提到的，由于復(fù)雜的脂肪酸譜和不同生物和植物的代謝途徑及其不同的物理細(xì)胞機(jī)器，盡管該基因和酶可能在蕓苔中有效力，也不能期待該效力是有益的。如背景章節(jié)中所討論的，一種或多種類型所需脂肪酸的提高經(jīng)常導(dǎo)致其他所需脂肪酸的降低、不需要脂肪酸的提高和農(nóng)學(xué)損失(即對修飾植物的其他完全不利的效應(yīng))。令人驚奇地，還可以實踐本發(fā)明而不對其他有價值的農(nóng)學(xué)特征，如種莢大小、種子產(chǎn)量、種子大小、油產(chǎn)量等產(chǎn)生相應(yīng)的不利效應(yīng)。在單個轉(zhuǎn)基因插入片段純合的植物中沒有不利效應(yīng)。一些雙純合疊加(通過兩個轉(zhuǎn)基因事件的雜交產(chǎn)生)顯示種莢數(shù)和結(jié)實率的降低，原因未知。然而表27含有具有與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障嗨频姆N子產(chǎn)量以及“無飽和”組成的疊加(即顯然提高了拷貝數(shù)的事件)。
去飽和酶之間(甚至是酵母、真菌、植物和動物Δ-9去飽和酶之間)的差異產(chǎn)生了不可預(yù)見性的另一原因。去飽和酶的差異可以部分歸結(jié)為不同去飽和酶的來源生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異。上文背景章節(jié)中討論了來自美國專利號5,777,201的酵母去飽和酶。它比本文示例的曲霉去飽和酶更長(510個氨基酸對455個氨基酸)。此外，它僅在約400個氨基酸上具有約52％的同一性(通過BLAST和BestFit(Smith-Waterman程序)確定，都用EMBOSS完成)。該專利實施例7的表1a和1b顯示使用酵母去飽和酶實現(xiàn)的飽和物降低遠(yuǎn)弱于根據(jù)本發(fā)明在蕓苔中使用示例的曲霉去飽和酶實現(xiàn)的降低。有多種因素可能解釋酵母去飽和酶相對弱的性能。例如，該蛋白可能在植物中內(nèi)在地不穩(wěn)定(而本發(fā)明去飽和酶很顯然在蕓苔中非常穩(wěn)定)。在其他酶特性上也可能存在差異，如催化效率、底物親和力、輔因子親和力等。
與美國專利號5,723,595和6,706,950的紅花去飽和酶相比，紅花去飽和酶(396個氨基酸)比本發(fā)明示例的曲霉去飽和酶(455個氨基酸)更短。紅花去飽和酶還可見于質(zhì)體，而本發(fā)明曲霉去飽和酶見于ER/微粒體/胞質(zhì)隔室。此外，紅花去飽和酶使用見于質(zhì)體的?；鵄CP底物，而曲霉去飽和酶使用見于胞質(zhì)隔室的?；鵆oA底物。因此，就本發(fā)明而言，不了解?；鵆oA底物庫中的大部分是否可用于曲霉去飽和酶。
因此，非常有意義的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的Δ-9去飽和酶能夠獲得具有優(yōu)秀特性(特別是就提高油的食用品質(zhì)而言)的蕓苔植物、種子和來自于它們的油。非常令人驚奇地，在擬南芥中獲得了飽和脂肪酸的高于60％的降低，在蕓苔中獲得了飽和脂肪酸的高于43％的降低。必須注意到，這是在已經(jīng)產(chǎn)生任何適當(dāng)植物的最佳脂肪酸譜之一的植物中獲得的。如下文所示并詳細(xì)討論的，本發(fā)明還用于獲得令人驚奇并有利的脂肪酸譜和比例。盡管認(rèn)為硬脂酸是飽和脂肪酸，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有降低膽固醇的作用。因此，相對較高的硬脂酸水平可能是有益的。類似的，相對較高水平的花生四烯酸可能是需要的。如本文數(shù)據(jù)所示，來自本發(fā)明種子的油具有有利的這兩種脂肪酸譜以及所需水平的如11-十八碳烯酸。本文還顯示，在本發(fā)明的商品品質(zhì)植物中，有利水平的這些脂肪酸和/或總飽和物與需要的植物高度、產(chǎn)量和其他有益特征組合存在(與如矮化植物相反)。本文展示了這些本發(fā)明植物的示例數(shù)據(jù)。
還應(yīng)該注意，本發(fā)明不僅限于示例的去飽和酶。GENBANK中提供了多種去飽和酶和Δ-9去飽和酶，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行序列比對以觀察并比較酶序列的差異?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用與本文的示例相似的酶。
例如，本發(fā)明的曲霉去飽和酶具有兩個結(jié)構(gòu)域。第一個結(jié)構(gòu)域(大致在分子的氨基端三分之二)為去飽和酶結(jié)構(gòu)域，第二個結(jié)構(gòu)域(大致在分子的C端三分之一)為細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。例如，SEQ ID NO5的殘基62-279可以與如脂肪酸去飽和酶gnl|CDD|25523 pfam00487的殘基4-233比對。SEQID NO5的殘基332-407可以與gnl|CDD|22935 pfam00173(細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域)的殘基1-74比對。SEQ ID NO5的殘基17-305可以與脂肪酸去飽和酶gnl|CDD|11113 COG1398(OLE1)脂類代謝結(jié)構(gòu)域的殘基3-288比對。SEQ ID NO5的殘基301-449可以與gnl|CDD|14396 COG5274的CYB5(與脂類代謝相關(guān)的細(xì)胞色素b)的殘基11-163比對。缺乏細(xì)胞色素b5的SEQ ID NO5去飽和酶結(jié)構(gòu)域可以是功能性的，因為這是植物質(zhì)體去飽和酶的一般結(jié)構(gòu)。也已經(jīng)公開了假想的微粒體松去飽和酶(LOCUSAF438199)，其使用可見于胞質(zhì)隔室的?；鵆oA底物，并且缺乏細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。還可以將曲霉細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域與其他生物(甚至是來自植物胞質(zhì)去飽和酶)的進(jìn)行交換。如下文詳細(xì)討論的，這些結(jié)構(gòu)域或編碼一種或兩種這些結(jié)構(gòu)域的區(qū)段可作為探針用于定義本發(fā)明的分子。
因此，可根據(jù)本發(fā)明使用的基因和蛋白質(zhì)不僅包括具體示例的全長序列，還包括這些序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括與全長分子相比的內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物。用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有替代的氨基酸，只要它們保留本文具體示例的蛋白質(zhì)的特征性酶活性。“變體”基因具有編碼相同蛋白質(zhì)或與示例蛋白質(zhì)功能等價的等價蛋白質(zhì)的核苷酸序列。術(shù)語“變體蛋白質(zhì)”和“等價蛋白質(zhì)”指具有與示例蛋白質(zhì)相同或基本相同的生物/功能活性的蛋白質(zhì)。在本文中使用的“等價”序列指具有改善功能性或不對功能性產(chǎn)生不利影響的氨基酸替換、缺失、添加或插入的序列。該定義還包括保留功能性的片段。保留與示例蛋白相應(yīng)片段相同或相似功能的片段和其他等價物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以為了多種目的而產(chǎn)生變化如氨基酸替換或添加，例如為了提高(或降低)蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性(而不明顯/顯著降低蛋白質(zhì)的功能性)。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如產(chǎn)生點突變)便利地構(gòu)建基因的改變。此外，例如美國專利號5,605,793描述了通過在隨機(jī)斷裂后使用DNA再裝配產(chǎn)生額外的分子多樣性的方法。變體基因可用于產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)，重組宿主可用于產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。使用這些“基因改組”技術(shù)可以構(gòu)建等價基因和蛋白質(zhì)，其包含任一本文示例序列的(例如)任意5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60個連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)。
可以使用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶按照標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生全長基因的片段。例如可以使用酶如Bal31或位點定向誘變來系統(tǒng)地從這些基因的末端切除核苷酸。還可以使用多種限制性酶獲得編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)直接獲得這些蛋白質(zhì)的活性片段。
可以截短本發(fā)明蛋白質(zhì)而仍然保留功能活性，這在本發(fā)明范圍內(nèi)?！敖囟痰鞍踪|(zhì)”指可以切割而在切割后仍然顯示酶活性的蛋白質(zhì)的部分。此外，可以使用分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生有效切割的蛋白質(zhì)，其中通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其他技術(shù)去除編碼所述蛋白質(zhì)的DNA堿基。截短后，可以在異源系統(tǒng)如大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)、酵母等中表達(dá)所述蛋白質(zhì)，接著在本文公開的昆蟲測定中測定活性。本領(lǐng)域熟知，可以成功地產(chǎn)生截短蛋白質(zhì)，以使它們保留功能活性，而比完整的全長序列更短。本領(lǐng)域熟知，可以以截短(核心毒素)形式使用B.t.毒素。參閱如Adang等，Gene 36289-300(1985)，“Characterizedfull-length and truncated plasmid clones of the crystal protein of Bacillusthuringiensis subsp kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta.”。存在其他保留殺蟲活性的截短蛋白質(zhì)的實例，包括昆蟲保幼激素酯酶(Regents of the University of California的美國專利號5,674,485)。本文使用的術(shù)語“毒素”還意在包括功能活性截短物。
可以通過如使用寡核苷酸探針定義、鑒定和/或獲得根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)和基因。這些探針為可檢測的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于適當(dāng)?shù)臉?biāo)記或如國際申請?zhí)朩O 93/16094所述使其具有固有的熒光性而可被檢測。探針(和本發(fā)明的多核苷酸)可以是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U，RNA分子中)之外，本發(fā)明的合成探針(和多核苷酸)還可以含有次黃苷(能與全部四種堿基配對的中性堿基，有時用于在合成探針中代替全部四種堿基的混合物)。因此，當(dāng)本文中提到合成的簡并寡核苷酸時一般使用“N”或“n”，“N”或“n”可以是G、A、T、C或次黃苷。本文使用的多義密碼子與提交本申請的標(biāo)準(zhǔn)IUPAC命名約定一致(如R為A或G、Y為C或T等)。
如本領(lǐng)域所熟知，如果探針分子與核酸樣品雜交，可以合理的假設(shè)探針和樣品具有顯著同源性/相似性/同一性。優(yōu)選地，首先進(jìn)行多核苷酸雜交，之后使用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)在低、中或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行洗滌，如Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)《DNA Probes》，Press，New York，NY，169-170頁中所述。例如，如文中所述，可以通過首先在室溫下用2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗滌15分鐘來得到低嚴(yán)格條件。一般進(jìn)行兩次洗滌。可以通過降低鹽濃度和/或通過提高溫度得到較高的嚴(yán)格性。例如，在上述洗滌之后可以接著在室溫下兩次用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌15分鐘，然后在55℃用0.1×SSC/0.1％SDS接著洗滌30分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這些溫度可以與本文公開的其他雜交和洗滌程序一起使用(例如可以用SSPE代替SSC作為鹽使用)?？梢酝ㄟ^向445ml水中加入50ml 20×SSC和5ml 10％SDS制備2×SSC/0.1％SDS?？梢酝ㄟ^組合NaCl(175.3g/0.150M)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015M)和水并接著用10NNaOH調(diào)整pH至7.0，然后調(diào)節(jié)體積至1升來制備20×SSC?？梢酝ㄟ^將10g SDS溶解到50ml高壓滅菌水中，然后稀釋到100ml來制備10％SDS。
探針檢測提供了以已知方式測定雜交是否保持的方法。這種探針分析提供了鑒定本發(fā)明毒素編碼基因的快速方法。可以使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)程序合成本發(fā)明用作探針的核苷酸片段。這些核苷酸序列還可以用作PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。
與給定的多核苷酸雜交是可用于鑒定、發(fā)現(xiàn)和/或定義本發(fā)明蛋白質(zhì)和基因的技術(shù)。本文使用的“嚴(yán)格”雜交條件指得到與本文所述條件相同或大致相同程度雜交特異性的條件。通過標(biāo)準(zhǔn)方法可以進(jìn)行固定在DNA印跡上的DNA與32P標(biāo)記的基因特異性探針的雜交(參閱如Maniatis，T.，E.F.Fritsch，J.SambrookMolecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。一般在允許檢測靶序列的條件下進(jìn)行雜交和其后的洗滌。對于雙鏈DNA基因探針，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在DNA雜交體解鏈溫度(Tm)以下20-25℃進(jìn)行過夜雜交。按下式描述解鏈溫度(Beltz，G.A.，K.A.Jacobs，T.H.Eickbush，P.T.Cherbas和F.C.KafatosMethods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave[編輯]Academic Press，New York 100266-285)Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(G+C％)-0.61(甲酰胺％)-600/雙鏈體長度(堿基對)一般如下述進(jìn)行洗滌1)在1×SSPE、0.1％SDS中室溫洗滌兩次，每次15分鐘(低嚴(yán)格洗滌)。
2)在0.2×SSPE、0.1％SDS中在Tm-20℃洗滌一次15分鐘(中度嚴(yán)格洗滌)。
對于寡核苷酸探針，在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中在雜交體解鏈溫度(Tm)以下10-20℃進(jìn)行過夜雜交。按下式確定寡核苷酸探針的TmTm(℃)＝2(T/A堿基對數(shù)目)+4(G/C堿基對數(shù)目)(Suggs，S.V.，T.Miyake，E.H.Kawashime，M.J.Johnson，K.Itakura和R.B.WallaceICN-UCLA Symp.Dev.Biol.Using PurifiedGenes，D.D.Brown[編輯]，Academic Press，New York，23683-693)。
如下述進(jìn)行洗滌1)在1×SSPE、0.1％SDS中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。
2)在1×SSPE、0.1％SDS中在雜交溫度下洗滌一次15分鐘(中度嚴(yán)格洗滌)。
一般可以改變鹽和/或溫度以改變嚴(yán)格性。對于長度＞70堿基左右的標(biāo)記DNA片段，可以使用以下條件低 1或2×SSPE，室溫低 1或2×SSPE，42℃中 0.2×或1×SSPE，65℃高 0.1×SSPE，65℃。
雙鏈體的形成和穩(wěn)定性依賴于雜交體兩條鏈間的顯著互補(bǔ)性，且如上文所提到的，某種程度的錯配是允許的。因此，本發(fā)明的探針序列包括所述序列的突變(單個和多個)、缺失、插入及其組合，其中所突變、插入和缺失允許與目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜交體。可以以多種方法在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失，這些方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。其他方法可能在將來被了解。
由于遺傳密碼的簡并性/冗余性，多種不同的DNA序列都可以編碼本文公開的氨基酸序列。產(chǎn)生編碼相同或基本相同的酶的替代DNA序列在受本領(lǐng)域訓(xùn)練的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些變體DNA序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，本發(fā)明包括1)得自野生型生物的蛋白質(zhì)；2)由突變產(chǎn)生的變體；3)通過進(jìn)行保守性氨基酸替換設(shè)計的變體；和4)通過隨機(jī)斷裂并重新組裝編碼本發(fā)明TC蛋白的多種不同序列(DNA改組)產(chǎn)生的變體。參閱如美國專利號5,605,793。
編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列可以是野生型序列、突變體序列或設(shè)計用于表達(dá)預(yù)定蛋白質(zhì)的合成序列。通過如避免多腺苷酸化信號和使用植物優(yōu)選的密碼子而設(shè)計在植物中高表達(dá)的DNA序列是特別有用的。
本文示例了某些蛋白質(zhì)和基因。由于這些蛋白質(zhì)和基因僅作為示例，因此顯然本發(fā)明包括具有與示例蛋白質(zhì)相同或相似功能的變體或等價蛋白質(zhì)(以及編碼其等價物的核苷酸序列)的用途。等價蛋白質(zhì)與示例酶(或其活性片段)具有氨基酸相似性(和/或同源性)?？梢砸暂^窄的同一性和/或相似性范圍的方式定義本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本文示例或建議的序列相比，酶蛋白的同一性和/或相似性可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。可以使用上文列出的任一數(shù)字定義上限和下限。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以定義為例如與示例蛋白具有50-90％的同一性。
除非另有說明，使用如Karlin和Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中所改良的Karlin和Altschul(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的算法確定本文所使用的兩個核酸的序列同一性和/或相似性百分比。這樣的算法整合在Altschul等(1990)，J.Mol.Biol.215402-410的NBLAST和XBLAST程序中。使用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，評分＝100、字寬＝12。可以如Altschul等(1997)，Nucl.AcidsRes.253389-3402中所述使用Gapped BLAST。使用BLAST和GappedBLAST程序時，使用程序(NBLAST和XBLAST)各自的默認(rèn)參數(shù)。參閱NCBI/NIH網(wǎng)站。
使用默認(rèn)參數(shù)，用Vector NTI Suite 8(InforMax，Inc.，North Bethesda，MD，美國A)中的AlignX函數(shù)得到用于比較目的的缺口比對。默認(rèn)參數(shù)一般為缺口打開罰分15、缺口延伸罰分6.66和缺口分離罰分范圍8?？梢砸赃@種方式或本領(lǐng)域熟知的其他技術(shù)比對和比較兩種或更多序列。通過分析這些比對可以鑒定本發(fā)明多肽中相對保守和非保守的區(qū)域。這可用于例如評估通過修飾或替換一個或多個氨基酸殘基來改變多肽序列是否預(yù)期是可接受的。
氨基酸同源性/相似性/同一性一般(但不必然)在蛋白質(zhì)的決定生物活性的區(qū)域中是最高的，或者在與最終決定生物活性的三維構(gòu)型決定相關(guān)的區(qū)域中是最高的。考慮到這一點，某些氨基酸替換是可以接受的并預(yù)計是可承受的。例如，這些替換可以在對活性非關(guān)鍵的蛋白質(zhì)區(qū)域中。可以使用蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析和基于軟件的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模來鑒定可(使用位點定向誘變、改組等)進(jìn)行修飾以確實改變蛋白質(zhì)特性和/或提高功能性的蛋白質(zhì)區(qū)域。
還可以改變蛋白質(zhì)的多種特性和三維特征而不對蛋白質(zhì)的活性/功能性產(chǎn)生不利影響。保守性氨基酸替換預(yù)期是可以接受的/不對分子的三維構(gòu)型產(chǎn)生不利影響的。氨基酸可置于如下類別非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要替換不損害化合物的生物活性，則保守性替換在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在所述保守性替代中，一種類別的氨基酸被同一類型的另一氨基酸替換。下表提供了屬于每一類的氨基酸實例。
在一些情況下，還可以進(jìn)行非保守性替代。關(guān)鍵因素是這些替代不能明顯降低蛋白質(zhì)的功能/生物/酶活性。
為了在植物中得到異源基因的高表達(dá)，例如，可以優(yōu)選重新設(shè)計所述基因以使其在植物細(xì)胞中更有效的表達(dá)。可以設(shè)計序列用于一般地在植物中優(yōu)化表達(dá)，或者可以設(shè)計用于在特定類型的植物中優(yōu)化表達(dá)。蕓苔就是這樣的一種植物，其中優(yōu)選在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計異源基因以提高其在所述植物中的表達(dá)水平。因此，在設(shè)計編碼真菌蛋白質(zhì)的基因中額外的步驟是例如重新設(shè)計異源基因，以用于在不同類型的生物中優(yōu)化表達(dá)。關(guān)于產(chǎn)生優(yōu)化用于植物表達(dá)的合成基因的指導(dǎo)可見于例如美國專利號5,380,831。本文中以SEQ ID NO1(其編碼SEQ ID NO5所示的示例蛋白)示例了優(yōu)化用于植物表達(dá)的序列。
本文使用的“分離的”多核苷酸和/或蛋白質(zhì)以及“純化的”蛋白質(zhì)是指這些分子不伴隨有與其天然共存的其他分子。因此，提到“分離的”和/或“純化的”表示與本文所述的“人為”相關(guān)。例如，置于植物中進(jìn)行表達(dá)的本發(fā)明真菌多核苷酸(或“基因”)是“分離的多核苷酸”。同樣，植物所產(chǎn)生的本發(fā)明蛋白質(zhì)是“分離的蛋白質(zhì)”。
“重組”分子指經(jīng)重組的分子。涉及核酸分子時，該術(shù)語指由通過分子生物學(xué)技術(shù)連接的核酸序列組成的分子。涉及蛋白質(zhì)或多肽時，術(shù)語“重組”指使用一種或多種重組核酸分子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子。
涉及核酸序列時，術(shù)語“異源”指與其在自然界中不連接或在自然界中在不同位置連接的核酸序列連接(或經(jīng)操作而與其連接)的核酸序列。因此，術(shù)語“異源”表示使用遺傳工程(即通過人工介入)對核酸分子進(jìn)行了操作。因此，本發(fā)明的基因可以與異源啟動子(或“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)”，指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)與目的序列有效連接時能介導(dǎo)或調(diào)節(jié)目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列)有效連接。優(yōu)選的異源啟動子可以是植物啟動子。當(dāng)序列功能性連接從而允許轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)介導(dǎo)或調(diào)節(jié)目的序列的轉(zhuǎn)錄時，則啟動子和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)與目的序列“有效連接”。在一些實施方案中，為了有效連接，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以與目的序列位于同一鏈上。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以位于目的序列的5’。在這些實施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以直接在目的序列的5’，或者在這些區(qū)域之間可以存在間插序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)與目的序列的有效連接可能需要適當(dāng)?shù)姆肿?如轉(zhuǎn)基因激活蛋白)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，因此本發(fā)明包括(體外或體內(nèi))提供這些分子的實施方案。
有多種方法可用于獲得按本發(fā)明方法使用的蛋白質(zhì)。例如，可以使用針對本文公開蛋白質(zhì)的抗體從混合物中鑒定和分離其他蛋白質(zhì)。具體地，可以針對最恒定和與其他蛋白質(zhì)區(qū)別最大的蛋白質(zhì)部分產(chǎn)生抗體。然后可以通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫印跡使用這些抗體特異性鑒定具有特征活性的等價蛋白質(zhì)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)程序便利地制備針對本文公開蛋白質(zhì)或等價蛋白質(zhì)或這些蛋白質(zhì)的片段的抗體。這些抗體是本發(fā)明的一個方面。
“來自”或“得自”任一本文提到或建議的隔離群的蛋白質(zhì)指該蛋白質(zhì)(或相似的蛋白質(zhì))可得自示例隔離群或其他來源，如另一真菌菌株或細(xì)菌菌株或植物(如經(jīng)改造用于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的植物)?！把苌浴币簿哂写艘饬x，包括如得自給定真菌或細(xì)菌類型的多核苷酸(和蛋白質(zhì))，例如其中多核苷酸經(jīng)修飾用于在植物中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在真菌基因和蛋白質(zhì)公開后就可以改造植物以產(chǎn)生該蛋白質(zhì)?？梢允褂帽疚墓_的多核苷酸和/或氨基酸序列制備抗體制劑、核酸探針(如DNA和RNA)等，并用于從其他(天然)來源篩選和回收其他蛋白質(zhì)基因。
本發(fā)明的油保持了高度的氧化穩(wěn)定性，但含有較低水平的飽和脂肪酸和高水平的不飽和脂肪酸。本發(fā)明優(yōu)選的油具有少于3.5％的總飽和脂肪酸含量、至少75％(優(yōu)選并令人驚奇地少于80％)的油酸含量和少于20％(更優(yōu)選少于15％，更優(yōu)選少于10％，并且甚至更優(yōu)選少于9％)的多不飽和脂肪酸含量。本發(fā)明還可用于獲得具有不高于(優(yōu)選低于)總脂肪酸含量的2.5％(優(yōu)選具有上文提到的油酸范圍)的總飽和脂肪酸含量(C:14、C:16、C:18、C:20、C:22和C:24)的蕓苔種子。促進(jìn)油不穩(wěn)定性的18:2和18:3水平?jīng)]有提高或優(yōu)選地降低(對于食品應(yīng)用)。用于任一這些特定脂肪酸、其任一組合和具體地兩種C18不飽和物中的一種或兩種的范圍終點可得自本文提供的任一圖和表。
本發(fā)明可用于提供農(nóng)業(yè)良種蕓苔種子，其產(chǎn)生總飽和物少于3.5％的精制油/脫臭油。來自這些植物的油可用于制備多種終產(chǎn)物，或者它們可單獨用作“無飽和”(或“低飽和”)產(chǎn)品的煎炸油。
除非另有說明，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法測定給定的一組蕓苔種子的飽和脂肪酸含量，其中通過壓榨種子從種子中移出油，并按照與甲醇和氫氧化鈉的反應(yīng)以脂肪酸甲酯進(jìn)行提取。接著使用毛細(xì)柱通過氣液層析分析得到的酯的脂肪酸含量，所述毛細(xì)柱允許基于不飽和程度和鏈長度進(jìn)行分離。該分析方法描述于例如J.K.Daun等，J.Amer.Oil Chem.Soc.601751-1754(1983)。
如下文所述以“半種子”分析、“單個/完整種子”分析或“批量種子”分析來測定蕓苔種子的脂肪酸組成。對于“半種子”分析，從胚上取下部分子葉組織并進(jìn)行分析；保留剩余的種子，需要時可進(jìn)行萌發(fā)。盡管半種子技術(shù)在選擇穩(wěn)定遺傳控制的脂肪酸突變(和其后的育種和雜交)中可能不太可靠，但是本發(fā)明證明可以引入優(yōu)選基因并用于產(chǎn)生穩(wěn)定株系。與未表征突變不同，本領(lǐng)域熟知可以將基因引入植物并穩(wěn)定維持。因此，本文公開的分析證明了本發(fā)明基因的用途，以及可以獲得具有所指出特征的蕓苔油。
在來自市售Nexera 710(蕓苔)種質(zhì)的轉(zhuǎn)基因株系的種子中達(dá)到了“無飽和”(即No Sat)的脂肪酸水平。No Sat水平定義為低于3.5％的組合飽和物。此外，使用同一轉(zhuǎn)化構(gòu)建體在Westar蕓苔株系和另一Crucifer(擬南芥)中觀察到降低的飽和物。值得注意的是，在一些種子中單個種子的飽和水平低至2.6至2.7％。本發(fā)明還可用于產(chǎn)生具有2.5％或更低總飽和物的種子。這是很重要的，因為油加工可以使總飽和“分?jǐn)?shù)”增加～0.5-1％，意味著經(jīng)加工的油產(chǎn)品仍可使用標(biāo)準(zhǔn)測試方法可測量地達(dá)到FDA定義的No Sat水平。具有這種容許量水平不僅允許測試裝置(被較高飽和的種子)的某種水平的污染(特別是如果植物操作者不能良好地使種子批次分開時)，還允許某種水平的大田種植條件變化(如傾向于產(chǎn)生更多飽和物的高溫)和來自臨近的大田中未改良蕓苔飄來的花粉的異花授粉(可稀釋目的基因)。
美國食品與藥物管理局將“飽和脂肪”定義為“對于一份中飽和脂肪的克數(shù)的表述，定義為所有不含雙鍵的脂肪酸的總數(shù)”21 CFR 101.9(c)(2)(i)。除非另有說明，這就是本文中對于“總飽和物”和“總飽和脂肪”的定義。如果一份食品“在一份中含有小于0.5g的總脂肪”，則認(rèn)為該產(chǎn)品為“無飽和脂肪”21 CFR 101.9(c)(2)(i)?！翱傊尽倍x為“對于一份中總脂肪克數(shù)的表述，定義為總脂類脂肪酸并表達(dá)為甘油三酯”21 CFR 101.9(c)(2)。21CFR 101.12(b)中定義了多種類型食品的“份大小”，一份油定義為一湯匙或15ml。在本文中理解為指14克。因此，本文中“無飽和”蕓苔油(或不含有飽和脂肪的蕓苔油)定義為一份(14克蕓苔油，含有14克脂肪)中總飽和脂肪低于0.5克的蕓苔油。換言之，“無飽和”蕓苔油包含低于3.57％的總飽和物(0.5克總飽和物除以14克總脂肪)。除非另有說明，本文的所有脂肪酸百分比均為該脂肪酸作為組分的油的重量百分比。
如本文所示，本發(fā)明可令人驚奇地用于獲得來自蕓苔種子的油，其中所述油包含少于3.57％的總飽和物。可以使用本領(lǐng)域熟知的方法從受試種子獲得油，如以上段落所述，并且可以使用熟知的技術(shù)，包括本文示例的技術(shù)測定油的含量。除非另有說明，用于產(chǎn)生半種子油數(shù)據(jù)和大田油數(shù)據(jù)的分析使用堿催化的酯交換反應(yīng)(AOCS Ce 2-66，備選方法)。該方案與本文描述的皂化/酸酯化方案相似，只是皂化/酸酯化方案測量總脂類，其中大部分是與通過堿催化的酯交換反應(yīng)檢測到的來自甘油三酯的相同的脂肪酸。
在市售的Nexera 710種質(zhì)中，促進(jìn)氧化不穩(wěn)定性的18:3脂肪酸水平相對而言沒有變化。因此，本發(fā)明不僅提供具有較低飽和脂肪的植物、種子和油，還提供令人驚奇地保持其他有益特征的植物、種子和油。即可以令人驚奇地使用本發(fā)明的植物和基因，而不對植物的其他有益特征產(chǎn)生不利影響。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明Δ-9去飽和酶基因的一個以上的表達(dá)拷貝的植物。本文展示的結(jié)果顯示表達(dá)該基因的多個拷貝令人驚奇地改善了蕓苔植物的脂肪酸譜(飽和脂肪水平大幅降低)。這是令人驚奇的，部分在于迄今為止本領(lǐng)域仍無法預(yù)計同一基因的多個拷貝的表達(dá)。“基因沉默”是一種已知的現(xiàn)象，其教導(dǎo)反對使用異源基因的多個拷貝(例如在基因組不同位置插入)。嘗試獲得多重轉(zhuǎn)化事件也不是理想的。因此，沒有動機(jī)產(chǎn)生包含多于1個(2個、3個、4個等)Δ-9去飽和酶事件的植物。也沒有預(yù)計這些植物實際上具有改善的特征。
本文示例了十字花科植物的兩種實例歐洲油菜(蕓苔)和擬南芥。然而，如本領(lǐng)域所知，其他蕓苔物種和其他十字花科可用于例如在蕓苔等中育種和開發(fā)所需性狀?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明這樣使用的其他植物包括蕪菁(Brassica rapa)、芥菜(Brassica juncea)、Brassica carinata、Brassica nigra、甘藍(lán)(Brassica oleracea)、蘿卜(Raphanus sativus)和白芥(Sinapis alba)。也可以根據(jù)本發(fā)明測試大豆、大豆植物和大豆油的改進(jìn)。
在優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)化了本發(fā)明的Δ-9去飽和酶基因用于植物表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供植物優(yōu)化的Δ-9去飽和酶基因。本文示例的優(yōu)化包括引入優(yōu)選的密碼子和Kozak翻譯起始區(qū)以及除去不需要的序列?；蛴搔?菜豆蛋白啟動子(強(qiáng)雙子葉植物貯藏蛋白啟動子)驅(qū)動。
可以使用表達(dá)與油合成吻合的啟動子(如ACP，延伸酶)來進(jìn)一步減少飽和物，因為表達(dá)在貯藏蛋白表達(dá)之前發(fā)生。(目前的煙草構(gòu)建體使用nos 3’UTR，目前的玉米構(gòu)建體使用組成型玉米泛蛋白-1啟動子和nos 3’UTR。)可以根據(jù)本發(fā)明使用其他雙子葉種子啟動子，包括豌豆球蛋白、凝集素、cruciferin、大豆球蛋白和大豆聚球蛋白(conglycinin)啟動子、US20030005485A1中公開的植物種子啟動子、US20030159173A1中的延伸酶啟動子和美國專利號5,767,363中的ACP啟動子。還參閱如US6100450A(種子特異性，在胚中表達(dá)，第8欄第8行)、US20030159173A1(第0044節(jié)，種子特異性啟動子，實例為USP、大麥醇溶蛋白、ACP、油菜籽蛋白、FatB3和FatB4)、WO9218634A1(引言討論了來自其他專利的種子特異性啟動子，1-7頁)、WO0116340A1(第7頁第13行提供了“種子特異性”啟動子的定義，一般在其他組織中的表達(dá)低于5％；第10頁第19-29行討論了種子貯藏蛋白如白蛋白、球蛋白、豌豆球蛋白和豆球蛋白樣蛋白、非貯藏油質(zhì)蛋白、與脂肪酸代謝相關(guān)的啟動子如ACP、飽和酶、去飽和酶、延伸酶)、WO2003014347A2(啟動子定義，23-25頁優(yōu)選種子特異性高于2x)、US20030233677A1(第0033節(jié)提供了“種子啟動子”的實例[油菜籽蛋白、ACCase、2S白蛋白、菜豆蛋白、油質(zhì)蛋白、玉米醇溶蛋白、谷蛋白、淀粉合酶、淀粉分支酶])、WO2003092361A2(第15頁提供了“啟動子”的定義，第17頁上方提供了啟動子實例和專利參考文獻(xiàn)(僅為貯藏蛋白)，包括玉米醇溶蛋白、7S貯藏蛋白、巴西堅果蛋白、phe-free蛋白、白蛋白、β-大豆聚球蛋白、11S、α-hordothionin、arcelin、凝集素、麥谷蛋白)、US20030148300A1(參閱權(quán)利要求8，包括油菜籽蛋白啟動子、菜豆蛋白啟動子、大豆胰蛋白酶抑制劑啟動子、ACP啟動子、硬脂酰-ACP去飽和酶啟動子、大豆7S啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、大豆聚球蛋白啟動子、油質(zhì)蛋白啟動子、胚胎發(fā)生高豐度蛋白啟動子、胚球蛋白啟動子、arcelin 5、油菜籽蛋白啟動子和酸性幾丁質(zhì)酶啟動子)、美國專利號5,777,201(第6欄，第30-50行，組成型啟動子、種子和/或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動子，如植物脂肪酸脂質(zhì)生物合成基因[ACP、?；D(zhuǎn)移酶、去飽和酶、脂轉(zhuǎn)移蛋白]或種子啟動子[油菜籽蛋白、cruciferin、大豆聚球蛋白、凝集素]或誘導(dǎo)型啟動子[光、熱、創(chuàng)傷誘導(dǎo)劑])。
高等植物的質(zhì)體是遺傳工程的有意義的靶標(biāo)。已經(jīng)實現(xiàn)了葉綠體(質(zhì)體的一種)轉(zhuǎn)化，并且是有利的。參閱如美國專利號5,932,479、6,004,782和6,642,053。還參閱美國專利號5,693,507和6,680,426。轉(zhuǎn)化葉綠體基因組的優(yōu)勢包括可能的環(huán)境安全性，因為轉(zhuǎn)化的葉綠體僅為母系遺傳，因此不通過花粉雜交傳遞到其他植物中；獲得高拷貝數(shù)外源基因的可能性以及降低植物能耗，因為減少了將蛋白質(zhì)運輸至葉綠體，這是高能耗的。
植物質(zhì)體(葉綠體、造粉體、油質(zhì)體、黃化質(zhì)體、色質(zhì)體等)是主要的生物合成中心，與光合作用一起負(fù)責(zé)產(chǎn)生許多具有工業(yè)重要性的混合物，如氨基酸、復(fù)雜碳水化合物、脂肪酸和色素。質(zhì)體來自稱為前質(zhì)體的共同前體，因此給定植物物種的質(zhì)體都具有相同的遺傳內(nèi)容。
多數(shù)植物的質(zhì)體為母本遺傳。因此，與在核中表達(dá)的異源基因不同，在質(zhì)體中表達(dá)的異源基因不分布在花粉中。從而引入植物質(zhì)體的性狀將不會傳遞到野生型親緣植物中。這為植物的遺傳改造提供了耐受或抵抗天然或化學(xué)條件的優(yōu)勢，如除草劑耐性，因為這些性狀不會傳遞到野生型親緣植物中。
高等植物的質(zhì)體基因組(原質(zhì)體系)是120-160kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子，每個葉細(xì)胞中可存在1900-50000個拷貝(Palmer，1991)。通常植物細(xì)胞含有500-10000個拷貝的小120-160kb環(huán)狀基因組，其每個分子具有一個大(約25kb)反向重復(fù)。因此，可以改造植物細(xì)胞以含有高達(dá)20000個拷貝的特定目的基因，這可能引起極高水平的外源基因表達(dá)。
本發(fā)明的油可用于(并且特別適用于)工業(yè)以及多種食品用途。除了烹調(diào)油本身以外，本發(fā)明還包括“無飽和”產(chǎn)品，如炸土豆片等(參閱美國專利號6,689,409，其要求包含馬鈴薯和蕓苔油的油炸食品組合物，然而，本發(fā)明可用于改進(jìn)’409專利所描述的組合物)。
本發(fā)明的植物可以與其他植物雜交，以獲得特征和性狀的多種需要的組合。甚至可以通過使用已知的育種技術(shù)和其他有利的種質(zhì)來源(如具有額外的或其他有益性狀和特征的其他蕓苔株系)雜交本發(fā)明植物來進(jìn)行其他改進(jìn)。另一實例是與具有質(zhì)體Δ-9去飽和酶的株系雜交。
因此，本發(fā)明可用于在可變環(huán)境條件下在商品油中獲得少于3.5％的總飽和脂肪酸(和原種的種子油中少于3％的總飽和脂肪酸)。這可以實現(xiàn)而不降低貯藏蛋白質(zhì)質(zhì)量和數(shù)量、不提高蕓苔食品中的不消化纖維并且不對每英畝的種子產(chǎn)量(或其他希望的農(nóng)學(xué)性狀)產(chǎn)生不利影響。
下文為本文使用的脂肪酸通用名及其碳原子數(shù)和雙鍵數(shù)的列表。飽和脂肪雙鍵數(shù)為0。
表1.
*＝Δ-9位置的雙鍵**＝Δ-11位置的雙鍵本文提到或引用的所有的專利、專利申請、臨時申請和出版物均引入本文作為參考文獻(xiàn)，其程度為它們不與本說明書的明確教導(dǎo)矛盾。
除非明確指出或者暗示，術(shù)語“一個”表示如本文使用的“至少一個”。
下文為展示實踐本發(fā)明的方法的實施例。這些實施例不應(yīng)理解為限制性的。除非另有說明，所有的百分比均以重量計，所有的溶劑混合物比例以體積計。
實施例1-Δ-9去飽和酶基因的重建通過將構(gòu)巢曲霉序列變成植物優(yōu)選的翻譯密碼子、引入獨特限制性酶位點和去除不需要的序列和某些二級結(jié)構(gòu)的組合來重新設(shè)計本發(fā)明的Δ-9去飽和酶基因，以用于植物表達(dá)。重新設(shè)計的基因由Operon，Inc.合成。本文中以SEQ ID NO1提供該多核苷酸的可讀框序列。SEQ ID NO2提供了ORF序列，其之前為Kozak序列和BamHI克隆位點(帽)，并且ORF末端為翻譯終止子(帽)。
實施例2-Δ-9去飽和酶植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建將BamHI-BstEII基因片段克隆進(jìn)載體中Pv β-菜豆蛋白啟動子與Pvβ-菜豆蛋白3’UTR(pPhas-UTR)之間。該構(gòu)建體命名為pOIL。通過用NotI消化從pOIL中切出啟動子-基因-UTR片段、補(bǔ)平并克隆進(jìn)載體pOEA1的平末端PmeI位點中。最終載體命名為pPD9-OEA1。
實施例3-用pPD9-OEA1進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒載體pPD9-OEA1轉(zhuǎn)化進(jìn)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)[菌株C58GV3101(C58C1RifR)pMP90(GmR)。Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet(1986)]。接著通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化獲得Δ-9去飽和酶植物。
使用本領(lǐng)域熟知的“浸染法”轉(zhuǎn)化擬南芥。自交植物，收集干燥種子用于FAME(脂肪酸甲酯)分析。
Katavic[Katavic，Campbell，L.，F(xiàn)riesen，L.，Palmer，D.，Keller，W.，and Taylor，D.C.(1996)，“Agrobacterium-mediated genetic transformationof selected high erucic acid B.napus cultivars，”4thCanadian Plant TissueCulture and Genetic Engineering Conference，Saskatoon，SK，June 1-4，1996]描述了用于蕓苔轉(zhuǎn)化的方案，對DAS的Nexera株系進(jìn)行了改良。從歐洲油菜Westar或Nexera 710栽培種的6日齡苗分離下胚軸切片，在轉(zhuǎn)化前先在愈傷組織起始培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化當(dāng)天，將下胚軸與含有帶有性狀基因的質(zhì)粒pPD9-OEA1的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物共溫育，從而包括Δ-9去飽和酶基因的質(zhì)粒DNA片段整合進(jìn)細(xì)胞染色體中。共溫育期后，將下胚軸轉(zhuǎn)移至含有作為選擇劑的草銨膦的愈傷組織起始培養(yǎng)基。獲得健康的抗性愈傷組織并重復(fù)轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基上約12至16周。再生植物并轉(zhuǎn)移至Convirons培養(yǎng)箱。自交植物以獲得種子。如果轉(zhuǎn)基因植物是不育的，將其與來自未修飾Nexera 710株系的花粉雜交。收獲干燥種子用于FAME分析。
實施例4-蕓苔事件分選處理和蕓苔結(jié)果概述除非另有說明，使用以下方法獲得Nex 710/Δ-9蕓苔種子，以下實施例中展示了所述數(shù)據(jù)。
開發(fā)、選擇或分選事件一般有四個主要步驟分選最初的轉(zhuǎn)基因事件、分選T1和T2種子、分選T1或T2植物和通過大田性能分選事件。首先將轉(zhuǎn)化的愈傷組織再生成T0植物。
對于最初的分選，通過農(nóng)學(xué)和DNA印跡篩選了107個推定的轉(zhuǎn)基因(簡單或復(fù)雜，即多于3個拷貝)。每個事件篩選多個種子。測定T1種子的飽和物、測定C16:1/C16:0比(以推斷催化效率)并且測定了生物化學(xué)表型的分離?；谶@些數(shù)據(jù)和種子可用性(時間選擇、數(shù)量)，有限的部分種子進(jìn)行后續(xù)實驗。
對于T1和T2種子分選(少數(shù)事件前進(jìn)一個世代)，進(jìn)行半種子分析，鑒定可能的純合子?；谠摂?shù)據(jù)，選擇來自分離種群的半種子用于溫室培養(yǎng)。
下一個主要步驟是分選T1或T2植物(少數(shù)事件前進(jìn)一個世代)。進(jìn)行DNA印跡以測定轉(zhuǎn)基因整合復(fù)雜度。還通過INVADER測定(Third WaveTechnologies，Inc.)測定接合性。使用這些數(shù)據(jù)選擇用于大田試驗的種子。
對于T1溫室研究，將每個事件的30個種子用于半種子分析。使用Nex 710蕓苔作為商品檢驗。對事件內(nèi)的所有個體進(jìn)行接合性采樣，以測定Δ-9和PAT的等位基因拷貝數(shù)。這之后進(jìn)行PCR和吲哚乙酰胺水解酶(IAAH，可陰性評分或選擇標(biāo)記)分析。對事件內(nèi)的所有個體進(jìn)行葉面噴灑以測定PAT分離比。對達(dá)到“無飽和”譜、陽性IAAH并且PAT和Δ-9為純合的個體進(jìn)行DNA印跡分析。
接著將這些用于T2分析(對來自每個以上植物的100個種子進(jìn)行半種子分析)。使用INVADER證實拷貝數(shù)并觀察事件對于D9和PAT是否分離。使用葉面噴灑觀察株系的PAT是否分離。基于半種子數(shù)據(jù)、INVADER結(jié)果、LP和IAAH陽性從植物收集10個種子批次脂肪酸數(shù)據(jù)。
第四個主要步驟是通過大田性能進(jìn)行分選(種植T2或T3種子、分析T2或T3植物，再分析T3或T4種子)。對轉(zhuǎn)基因事件廣泛采樣。進(jìn)行農(nóng)學(xué)、DNA印跡和接合性分析。還進(jìn)行了批量種子油分析。基于這些數(shù)據(jù)，選擇事件用于雜交以提高基因劑量。
使用以下選擇標(biāo)準(zhǔn)選擇株系進(jìn)入大田研究。在3個地點的一式兩份苗圃中評估了來自23個事件(6 reps/entry)的224個株系(包括空白)。種植了6個T3和17個T2事件?；诓迦霐?shù)和半種子分析以及其后的對來自每個植物的種子進(jìn)行的10種子批量脂肪酸分析來選擇株系/事件進(jìn)入大田。選擇的株系的總飽和百分比范圍約在3.3-4.5％范圍內(nèi)。選擇以下T3事件用于進(jìn)一步開發(fā)表2A.
選擇以下T2事件用于進(jìn)一步開發(fā)表2B.
按下文進(jìn)行大田測試。如以下實施例的討論進(jìn)行農(nóng)學(xué)評估，以確認(rèn)Δ-9(D9)不與農(nóng)學(xué)損失相關(guān)。從最有希望的28個T3株系(加上近親空白)采集15個INVADER葉組織用于進(jìn)一步的拷貝數(shù)驗證和測定株系的PAT是否分離?；诰哂猩儆?.5％的總飽和物選擇D9株系。
從最有希望的3個T2株系采集10個Southern組織樣品，基于具有少于3.5％的總飽和物進(jìn)行選擇。所有的組織采樣植物進(jìn)行自花受粉?；趤碜宰越恢参锏?0種子批次(455個樣品)以及來自O(shè)P行的1克批次種子樣品(1445)進(jìn)行脂肪酸分析。
以下為“最佳”的T4事件表3A.
以下為“最佳的”T3事件表3B.
一般未觀察到與Δ-9相關(guān)的重大農(nóng)學(xué)損失，某些株系在種子重量上表現(xiàn)出約10％的提高。下文在實施例18中更詳細(xì)地討論了農(nóng)學(xué)結(jié)果。下文實施例11-13中討論了個體脂肪酸組分分布的一般觀察。表4-7中展示了事件218-11.30、36-11.19和69-11.19的平均TSAT數(shù)據(jù)、TSAT變化百分比和某些脂肪酸組分變化百分比的概述。一般觀察到TSAT相對于近親空白和野生型～30％至～40％的降低。然而，下文更詳細(xì)地討論了例如進(jìn)一步改進(jìn)，并可進(jìn)行進(jìn)一步雜交。
表4.來自3個地點的株系218-11.30的所有株系的平均TSAT
表5.TSAT C16:0、C16:1、C18:0和C18:1相對于空白和WT對照Nex 710的％變化
表6.TSAT C16:0、C16:1、C18:0和C18:1相對于空白和WT對照Nex 710的％變化
表7.TSAT C16:0、C16:1、C18:0和C18:1相對于空白和WT對照Nex 710的％變化
實施例5-植物的分子表征采集葉組織用于DNA分析，以通過PCR和DNA印跡分析驗證轉(zhuǎn)基因的存在，并有時通過ELISA確認(rèn)PAT的表達(dá)。
5A.用于Δ-9去飽和酶的PCR分析的方案。使用以下兩種引物Δ-9正向B5’TGA GTT CAT CTC GAG TTC ATG 3’(SEQ ID NO3)Δ-9反向B5’GAT CCA ACA ATG TCT GCT CC 3’(SEQ ID NO4)該引物對在擴(kuò)增Δ-9基因后得到～1380bp的片段。
在該篩選中用MJ四相熱循環(huán)儀使用以下循環(huán)方案1.94℃，2分鐘2.94℃，1分鐘3.50℃，2分鐘4.72℃，3分鐘，+5秒/循環(huán)延伸5.重復(fù)步驟2-4 25次6.4℃至可用于分析，或者至少2分鐘5B.提取用于DNA印跡分析的植物基因組DNA的方案。使用來自Qiagen的DNeasy Plant Maxi試劑盒。使用手冊中的方案，對洗脫部分進(jìn)行了以下變化。用DNA級水(Fisher號BP561-1)以1∶10稀釋緩沖液AE。使用0.75ml預(yù)熱至65℃的稀釋的AE緩沖液洗脫兩次。用異丙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗滌。將DNA沉淀重懸于100μl 1X TE緩沖液中。定量DNA濃度。將6μg DNA等分試樣并調(diào)整至終體積為40μl。將樣品存放于-20℃。
5C.FAME分析(用甲醇H2SO4從種子直接進(jìn)行FAME合成)用于FAME分析的方案如下。
GC Specs氣相色譜儀具有兩個注射口和兩個火焰電離探測器的Hewlett-Packard 6890。
數(shù)據(jù)系統(tǒng)HP Chemstation，Leap Technologies，Carrboro，NC27510，PAL系統(tǒng)。
柱J&W毛細(xì)柱，DB-23，60M×0.25mm內(nèi)徑，0.15微膜厚度，最高操作溫度250℃。目錄號122-2361。
溫度分布平衡時間1分鐘。起始溫度50℃。起始時間3分鐘。提高率40℃/分鐘。終溫度240℃。終時間7.25分鐘。
用于擬南芥的FAME方法。將100μl(50μg)15:0標(biāo)準(zhǔn)品加入干凈的16×125mm玻璃管中(內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)貯存液500μg/ml C15:0TAG，溶于2∶1的氯仿∶異丙醇中)。在氮氣中以55℃蒸汽浴干燥標(biāo)準(zhǔn)品。
干燥時，加入含2ml含2％DMP(100ml∶95.22ml甲醇，2.772mlH2SO4，2ml DMP＝2，2-二甲氧基丙烷)的1N甲醇H2SO4。
稱出～5mg擬南芥種子裝入干凈的16×125mm玻璃管中并記錄準(zhǔn)確的重量。
為破壞脂肪酶，將熱的甲烷H2SO4和標(biāo)準(zhǔn)品加入裝有種子的管，在85℃溫育15分鐘。
將管冷卻至～50℃，接著在小研磨器中用玻璃杵碾碎種子。
將樣品轉(zhuǎn)移回管中，在氮氣下在85℃溫育至少1個小時。將管在冰上冷卻。先加入0.5ml 0.9％NaCl，再加入250μl己烷中的17:0標(biāo)準(zhǔn)品(0.1335mg/ml甲酯貯存液)。渦旋，以1000g離心5分鐘。
用Pasteur移液器轉(zhuǎn)移100-200μl至帶有圓錐板的1.5ml瓶(0.5ml)。
將5μl注射進(jìn)GC中。
用于蕓苔的FAME方法。將100μl(50μg)15:0標(biāo)準(zhǔn)品加入干凈的16×125mm玻璃管中(內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)貯存液2∶1的氯仿∶異丙醇中500μg/mlC15:0 TAG)。在氮氣中以55℃蒸汽浴干燥標(biāo)準(zhǔn)品。
干燥時，加入含2ml含2％DMP(100ml∶95.22ml甲醇，2.772mlH2SO4，2ml DMP＝2，2-二甲氧基丙烷)的1N甲醇H2SO4。將管加熱至85℃。
稱量一個蕓苔種子裝入干凈的管中并記錄準(zhǔn)確的重量。
為破壞脂肪酶，將種子樣品加入含有標(biāo)準(zhǔn)品和熱的甲烷H2SO4的管，在85℃溫育15分鐘。
將管冷卻至～50℃，接著用玻璃杵碾碎種子。
在N2下在85℃溫育至少1個小時。
將管在冰上冷卻。先加入0.5ml 0.9％NaCl，再加入250μl己烷中的17:0標(biāo)準(zhǔn)品(0.1335mg/ml甲酯貯存液)。渦旋，以1000g離心5分鐘。
用Pasteur移液器轉(zhuǎn)移100-200μl至帶有圓錐板的1.5ml瓶(0.5ml)。
將5μl注射進(jìn)GC中。
實施例6-擬南芥結(jié)果最初的結(jié)果示于圖1，顯示獲得了高于60％的飽和脂肪酸降低。還獲得了比16:0(4.4％)更多的16:1(如5.9％)。
通過Δ9-CoA-去飽和酶方法獲得的無飽和油FAME分析分析了來自約18個額外轉(zhuǎn)化體的T2種子。該數(shù)據(jù)(見表8和圖2)顯示“飽和物”的降低高達(dá)60-70％。這是比最初的數(shù)據(jù)(見圖1)所表明的更強(qiáng)的飽和脂肪酸降低。需要注意到T2世代仍然是分離的，因此，可以預(yù)期在其后的世代中性能更好的株系。這一點對所有的T1、T2、T3和其他本文中別處報道的最初世代(包括蕓苔株系)都是真實的，除非性狀已固定，并且株系對于轉(zhuǎn)基因是純合的。(在以下的實施例中產(chǎn)生并描述了性狀固定的穩(wěn)定株系和植物。)
表8.
數(shù)值來自單個樣品制備和GC電泳(非平均值)。
TF-21的行為方式與野生型(未轉(zhuǎn)化)植物相同，可能的解釋包括沉默或非轉(zhuǎn)基因逃逸(用草銨膦除草劑選擇不足)。
“？”表示在GC色譜圖上峰可疑或未知。
實施例7-Westar數(shù)據(jù)將與實施例5C所述類似的方案應(yīng)用于來自熟知的“Westar”蕓苔的蕓苔株系。如圖3所示，標(biāo)出的飽和脂肪降低了超過43％，包括24:0時則獲得了50％的降低。
實施例8-示例Nexera 710數(shù)據(jù)將與本文中別處所述相似的方案應(yīng)用于來自熟知的“Nexera 710”商品良種蕓苔的蕓苔株系。使用本文討論的方法計算總飽和物，并在下文中標(biāo)出。
總飽和物來自16:0+18:0+20:0+22:0+24:0脂肪酸的總和。表9中給出了單個種子中一些值得注意的飽和物水平。油譜以摩爾％值給出。摩爾％值在計算中引入了每種特定脂肪酸的化學(xué)式量。它使用給定脂肪酸種類的質(zhì)量(峰區(qū)，或與用于直接計算脂肪酸百分比相同的值)除以該脂肪酸種類的化學(xué)式量。
分析了具有最低的總飽和物的種子的譜(種子113a 11.19#4、113a11.19#8、5 11.19#6和5 11.19#8)。未修飾Nexera 710種質(zhì)的值來自進(jìn)行的同一FAME分析。在Convirons培養(yǎng)箱中培養(yǎng)植物，因此實際的摩爾％可能與大田培養(yǎng)的種子不同。一般而言，轉(zhuǎn)基因植物顯示16:0、18:0和20:0的降低和16:1的升高。18:0水平一般從Nexera 710的平均值1.4％(上至2.08％，下至0.81％)下降至選擇的轉(zhuǎn)基因材料中的平均值0.1％(上至0.6％，下至0％)。同時，16:0水平從平均值4.6％(上至5.12％，下至4％)下降至3.0％(上至3.41％，下至2.63％)。同樣，20:0水平從Nexera 710中的平均值0.5％下降至選擇的轉(zhuǎn)基因植物中的0％。16:1水平從Nexera 710中的不可檢測提高至轉(zhuǎn)基因植物中的平均值2.3％(上至2.71％，下至1.72％)。平均18:3水平在少數(shù)轉(zhuǎn)基因種群中稍有提高，但值的范圍與未修飾的Nexera 710樣品重疊。這些結(jié)果概述如下
實施例9-其他蕓苔數(shù)據(jù)將與本文中別處所述相似的方案應(yīng)用于來自熟知的“Nexera 710”商品良種蕓苔的蕓苔株系。使用本文討論的方法計算總飽和物和每種脂肪酸類型的重量百分比，在下文中標(biāo)出。
圖4A-C和5A-C分別顯示了來自事件36-11.19和218-11.30的代表性結(jié)果，證明可以通過實踐本發(fā)明獲得降低的飽和脂肪酸水平。通過進(jìn)行本發(fā)明的其他操作，甚至可以進(jìn)一步降低本文示例的飽和脂肪水平。所有這些數(shù)據(jù)均得自本文指出的自交轉(zhuǎn)基因蕓苔植物。
總之，對于事件36-11.19，來自溫室培養(yǎng)的植物的T2半種子分析具有低至2.57％的總飽和物。對于來自溫室培養(yǎng)植物的T3完整種子，總飽和物低至3.66％。結(jié)果圖示于圖4A(數(shù)值數(shù)據(jù)在圖4B和4C中)。對于事件218-11.30的溫室培養(yǎng)植物，T2半種子分析顯示總飽和物低至2.71％。T3完整種子具有低至3.37％的總飽和物。結(jié)果圖示于圖5A(數(shù)值數(shù)據(jù)在圖5B和5C中)。作為參照，NATREON在大田條件下具有6.5％的總飽和物。
通過根據(jù)進(jìn)行本發(fā)明的其他改進(jìn)(如額外輪次的自交、與其他優(yōu)秀株系雜交、[通過額外的轉(zhuǎn)化、通過進(jìn)一步育種雜交等]提高去飽和酶基因拷貝數(shù)、改變?nèi)ワ柡兔副磉_(dá)的時間以及誘變)，甚至可以獲得更大程度的總飽和脂肪降低。
實施例10-其他蕓苔數(shù)據(jù)的分析——總飽和脂肪的降低百分比可以使用實施例9所示的數(shù)據(jù)進(jìn)行多種計算，以展示本發(fā)明的多個方面。例如，可以通過先用給定植物的總飽和物除以對照株系的總飽和物再從100％中扣除來計算總飽和脂肪降低的百分比。本發(fā)明提供的這種降低的實例示于下文。可以通過四舍五入為最接近的整數(shù)(非小數(shù))來對結(jié)果進(jìn)行近似。
表11.
本文中任一圖、圖表、表或其他各處討論的任一數(shù)字均可作為端點用于定義本發(fā)明的邊界和界限。同樣，使用任一這些數(shù)字(如上文所示以及下文詳細(xì)討論的)的任一計算均可用于定義本發(fā)明的邊界和界限。表12-14顯示了事件218-11.30、36-11.19和69-11.19的株系的其他代表性結(jié)果和計算。
表12.用于雜交的事件218-11.30HS選擇
表13.用于雜交的事件36-11.19HS選擇
表14.用于雜交的事件69-11.19HS選擇
實施例11-其他蕓苔數(shù)據(jù)的分析——詳細(xì)的脂肪酸譜圖4A-C和5A-C顯示了具有事件218-11.30和36-11.19的多種植物的脂肪酸譜的一些代表性結(jié)果。一般而言，這些結(jié)果顯示不僅16:0和18:0水平大幅降低(同時導(dǎo)致相應(yīng)不飽和物水平的提高)，而且20:0、22:0和24:0水平也有利地令人驚奇并且意外地降低了。在一些情況下，18:2和18:3水平也可以降低，這增強(qiáng)了改良油的氧化穩(wěn)定性。此外，上文建議的任一比例(如16:0-16:1、18:0-18:1和例如18:0-[20:0+22:0+24:0])均可用于定義實踐本發(fā)明的有利結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明還令人驚奇地實現(xiàn)了C20:0+C22:0+C24:0總的降低百分比的組合。因此，本發(fā)明提供如本文示例的具有有利并改良的脂肪酸譜的植物。通過進(jìn)行本發(fā)明的其他改良，可以實現(xiàn)甚至飽和物更好的降低、“無飽和”的提高以及更好的比例。
例如，使用以下來自圖5C和圖4B的數(shù)據(jù)的多種計算可用于展示本發(fā)明的成就。來自圖5C和圖4B的樣本數(shù)據(jù)示于下表。標(biāo)出了每個事件的每種標(biāo)出的脂肪酸的量，并在括號中標(biāo)出了相關(guān)對照植物的脂肪酸的量。
表15.
就218-11.30事件而言，在對照中C20:0、C22:0和C24:0對飽和物的總貢獻(xiàn)為1.08％，而這些組分在本發(fā)明的蕓苔株系中有利地降低至0.26％。這顯示了這些飽和物超過4倍的降低。同樣，可以單獨考慮每種組分。再就218-11.30事件而言，C20:0組分在對照/野生型中為0.62％，而在本發(fā)明的植物株系中降低約5.6倍(低至0.11％)。C22:0組分降低約22/3倍從缺乏去飽和酶基因的對照株系中的0.32％降低至d-9去飽和酶植物株系中的0.12％。C24:0降低約42/3倍，從0.14％降低至0.03％。
對于事件36(或36-11.19)，兩個株系的C20:0、C22:0和C24:0含量分別為0.32、0.15和0.04以及0.30、0.14和0.07。與分別為0.64、0.42和0.21的對照相比，這些株系C20:0的降低約為一半，C22:0和C24:0降低至少約為3倍。上文提到的第一個株系實際顯示出超過5×的C24:0降低。
將很快顯而易見，可以對本發(fā)明任一其他株系的這些優(yōu)選脂肪酸任一組分進(jìn)行大量類似的計算。這些展示不應(yīng)理解為限制性，任一這種新的降低和比例均可用于定義本發(fā)明。
實施例12-其后世代的其他半種子數(shù)據(jù)其他半種子FAME分析公開于表16。該圖表顯示總飽和物在T3世代中低至2.64％，在T4世代中低至2.66％。表17顯示了各個株系中存在的D-9去飽和酶基因拷貝數(shù)(見表16的樣品ID和表17的ID列)。下文實施例14和19中更詳細(xì)地討論了拷貝數(shù)的影響。
表17.
Southern拷貝數(shù)
表17.(續(xù))southern拷貝數(shù)
實施例13-來自實施例12的半種子數(shù)據(jù)的其他分析以及顯示脂肪酸轉(zhuǎn)換、不飽和物提高和飽和物降低的其他數(shù)據(jù)繪出了來自T3大田試驗的半種子數(shù)據(jù)以展示脂肪酸含量與“總飽和物”數(shù)據(jù)的多種比較。圖6A和6B明確顯示了與空白(非功能性插入片段的事件)和野生型對照(未轉(zhuǎn)化株系)相比，轉(zhuǎn)基因事件中C16:0的降低和C16:1的提高。圖6C和6D明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C18:0的降低和C18:1的提高。圖6E和6F分別明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C20:0和C22:0的降低。
在柱形圖中還展示了使用如實施例4的討論所獲得的數(shù)據(jù)的類似結(jié)果。圖6G和6H明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C16:0的轉(zhuǎn)換和降低以及C16:1的轉(zhuǎn)換和提高。圖6I和6J明確顯示了與空白和野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因事件中C18:0的轉(zhuǎn)換和降低以及C18:1的轉(zhuǎn)換和提高。圖6K和6L顯示了C18:2和C18:3的相似柱形。
上文所示圖和圖6M還明確展示了與已經(jīng)非常優(yōu)秀的Nex 710株系相比，總飽和物非常令人驚奇的降低。圖6N顯示了1000個種子的分布。實施例14-用多個Δ-9去飽和酶基因降低飽和脂肪水平來自溫室和大田試驗的結(jié)果提示在總飽和物降低與曲霉Δ-9去飽和酶拷貝數(shù)之間存在關(guān)系。
14A用于事件分選的FAME分析方案和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的影響樣品制備1.獲得單個種子的重量并放在塑料母板中。
2.在每個孔中加入2個1/8”的球3.將母板移至液體處理機(jī)Hamilton加入400μL有IS(C11:0)和代用品(C15:0 FAEE)的庚烷，接著加入100μL甲醇鈉(.5N)4.用頂蓋(strips caps)蓋住板(inserts)，Geno研磨5分鐘(1×@500)5.更換頂蓋
6.用橡皮墊對板加蓋(額外密封)。用黑電工膠帶包住蓋并去除母板的底以暴露瓶。
7.將板置于37℃/60rpm的渦旋/加熱器上15分鐘。(用沙子填充渦旋孔)8.以3500rpm將板離心2分鐘。
9.將底蓋放回，除去蓋/頂蓋。使用Hamilton將350μl頂層轉(zhuǎn)移至子板。
10.接著在提取板中加入400μL含IS和代用品的庚烷。
11.再重復(fù)步驟5至10兩次(總共轉(zhuǎn)移3次)12.在最后一次轉(zhuǎn)移后將提取板保留在Hamilton上。將50μl提取物轉(zhuǎn)移至玻璃片，所述玻璃片封固于含有450μl帶C11的庚烷的鋁砧中13.注入GCGC/FID分析GC參數(shù)每個樣品注入1ul無分流柱-DB23，15米，內(nèi)徑0.25mm，膜厚度0.15μmGC參數(shù)-烘箱溫度程序-保持70℃2.15分鐘(無分流)70℃-150℃@25℃-分鐘，150℃-180℃@5℃-分鐘，180℃-220℃@25℃-分鐘，保持220℃2分鐘注射器溫度-230℃檢測器溫度-240℃補(bǔ)充氣-氮氣@25mL/分鐘FID燃料-空氣@400mL/分鐘，
氫@40mL/分鐘前注射器清洗時間1分鐘清洗流速35ml/分鐘后注射器清洗時間2.15分鐘清洗氣流35ml/分鐘前入口壓力1.0mL/分鐘-恒流后入口壓力1.0mL/分鐘-恒流運行時間-14.95分鐘流速-氦恒流@1mL/分鐘采集序列在前柱和后柱之間分離96個樣品，以使尾管的造型最小化。用對應(yīng)于注入樣品類型的5種注入方法建立樣品列表。注入的前5種樣品均為1.基質(zhì)2.基質(zhì)3.標(biāo)準(zhǔn)品14.蕓苔陽性對照5.試劑空白6-27.蕓苔樣品33.標(biāo)準(zhǔn)品234-54.蕓苔樣品55.標(biāo)準(zhǔn)品3每個列表包含3個事件的16個樣品(48個樣品)。
標(biāo)準(zhǔn)品含有25ppm FAMES，總分布如下
14B估計拷貝數(shù)的初步DNA印跡分析用于這些目的的DNA制備方案如下。用HindIII消化約6微克DNA，將消化的DNA在0.75％瓊脂糖凝膠上電泳。印跡到帶正電的尼龍膜上并按典型方案雜交(Maniatis，Roche Applied Science，Inc.)。探針由用DIG標(biāo)記的(試劑盒來自Roche Applied Science，Inc.)的來自曲霉Δ-9去飽和酶基因的PCR產(chǎn)物組成。用室溫的2XSSC/0.1％SDS 5分鐘洗滌2次，接著用65℃0.1XSSC/0.1％SDS洗滌2次。用DIG發(fā)光檢測試劑盒按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)(Roche Applied Science，Inc.)使雜交條帶顯現(xiàn)。計數(shù)雜交條帶，如果顯示1至3個條帶，則轉(zhuǎn)基因樣品最初描述為“簡單的”，如果顯示多于3個條帶，則描述為“復(fù)雜的”。
14C轉(zhuǎn)基因事件中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)與飽和脂肪酸降低的比較在表中應(yīng)用以下定義
“飽和物降低比”用于對事件排序，因為它一般使用來自同一轉(zhuǎn)基因事件的種子。這種直接比較幫助降低了由不同時間的組織培養(yǎng)和植物培養(yǎng)導(dǎo)致的植物間的差異。
以上數(shù)據(jù)顯示了表觀基因劑量效應(yīng)，更多拷貝的轉(zhuǎn)基因傾向于引起更有效的飽和脂肪酸降低。例如，以上展示了57個“非對照”植物。這57個植物可以分為三組，每組19個植物。第一組植物(顯示最佳的飽和物降低和最低水平的飽和物)19個中有11個“復(fù)雜”事件(多于3個拷貝的去飽和酶基因)。該組在19個中含有8個表征為“簡單”或“可能簡單”的事件。中間組的19個植物在19個中僅有6個“復(fù)雜”事件(19個中有13個“簡單”或“可能簡單”事件)。另外，第三組的19個植物(顯示飽和物相對最低的降低)僅含有3個復(fù)合事件，19個事件中的16個為“簡單”或“可能簡單”事件。因此，細(xì)胞中含有多于3個拷貝的去飽和酶的植物似乎顯示了比細(xì)胞僅具有1個基因拷貝的植物更好的飽和物降低。
實施例15-油酸和11-十八碳烯酸的分離11-十八碳烯酸是在Δ-11位置具有雙鍵的C18:1。11-十八碳烯酸通過在質(zhì)體外延長Δ-9 C16:1而形成。以下是非常重要的，因為本文討論的其他分析方法將油酸和11-十八碳烯酸峰組合在一起作為標(biāo)記為“油酸”的單個百分比組成。即，除非另有說明，二者是不分離的。通過扣除11-十八碳烯酸的貢獻(xiàn)，目前證明油酸的貢獻(xiàn)百分比優(yōu)選并有利地(并且令人驚奇地)維持在低于80％，而仍能實現(xiàn)降低總飽和物(至“無飽和”或“低飽和”水平)。使用兩種類型的分析證明這一點，如以下兩個實施例所述。
實施例16-蕓苔Δ-9種子提取和11-十八碳烯酸SOP的分析圖7A和7B展示了使用以下方案獲得的數(shù)據(jù)。
樣品制備(與上文相同)1.獲得單個種子的重量并放在塑料母板中。
2.在每個孔中加入2個1/8”的球3.將母板移至液體處理機(jī)Hamilton加入400μL有IS(C11:0)和代用品(C15:0FAEE)的庚烷，接著加入100μL甲醇鈉(.5N)4.用頂蓋蓋住板，Geno研磨5分鐘(1×@500)5.更換頂蓋6.用橡皮墊對板加蓋(額外密封)。用黑電工膠帶包住蓋并去除母板的底以暴露瓶。
7.將板置于37℃/60rpm的渦旋/加熱器上15分鐘。(用玻璃珠填充渦旋孔)8.以3500rpm將板離心2分鐘。
9.將底蓋放回，除去蓋/頂蓋。使用Hamilton將350μl頂層轉(zhuǎn)移至子板。
10.接著在提取板中加入400μL含IS和代用品的庚烷。
11.再重復(fù)步驟5至10兩次(總共轉(zhuǎn)移3次)12.在最后一次轉(zhuǎn)移后將提取板保留在Hamilton上。將50μl提取物轉(zhuǎn)移至玻璃片，所述玻璃片封固于含有450μl帶IS C11的庚烷的鋁砧中13.注入GCGC/FID分析(與FAME譜不同)GC參數(shù)每個樣品注入1ul無分流柱-來自SGE的BPX 70，15米，內(nèi)徑0.25mm，膜厚度0.25μmGC參數(shù)-烘箱溫度程序-保持70℃2.15分鐘(無分流)70℃-140℃@25℃-分鐘140℃保持14分鐘140℃-180℃@10℃-分鐘，18℃保持3分鐘180℃-220℃@25℃-分鐘，220℃保持3分鐘注射器溫度-230℃檢測器溫度-240℃補(bǔ)充氣-氮氣@25mL/分鐘FID燃料-空氣@400mL/分鐘，氫@40mL/分鐘前注射器清洗時間1分鐘清洗流速35ml/分鐘后注射器清洗時間2.15分鐘清洗氣流35ml/分鐘前入口壓力1.0mL/分鐘-恒流后入口壓力1.0mL/分鐘-恒流運行時間-30.55分鐘流量-氦恒流@1mL/分鐘采集序列在前柱和后柱之間分離96個樣品，以使尾管的造型最小化。用對應(yīng)于注入樣品類型的5種注入方法建立樣品列表。注入的前5種樣品均為1.基質(zhì)2.基質(zhì)3.標(biāo)準(zhǔn)品14.試劑空白5-32.蕓苔樣品33.標(biāo)準(zhǔn)品234-54.蕓苔樣品55.標(biāo)準(zhǔn)品3每個列表包含6個事件的8個樣品(1個種子＝一個樣品)(48個樣品)。
標(biāo)準(zhǔn)品含有200ppm FAMES，總分布如下
實施例17-使用氣相色譜/質(zhì)譜/飛躍時間進(jìn)行的11-十八碳烯酸貢獻(xiàn)分析表21顯示了使用以下方案獲得的數(shù)據(jù)。在表21中，對于T4，脂類百分比未降低，在轉(zhuǎn)基因株系中維持在40.8％(與對照株系相同)。
*如果低于加工方法的檢測極限則默認(rèn)值為0采集和處理使用HP Chemserver軟件包儀器說明來自Leco的飛行時間質(zhì)譜儀Pegasus III，連接氣相色譜HP 6890來自CTC Analytics technology的Combi Pal自動注射器，安裝在具有10μl注射器的HP 6890。
GC方法GC參數(shù)每個樣品注入1至3μl無分流柱-SolGel Wax，30米，內(nèi)徑0.25mm，膜厚度0.25μmGC參數(shù)-烘箱溫度程序-70℃-175℃@25℃-分鐘(無分流)175℃保持25分鐘175℃-230℃@50℃-分鐘，230℃保持3分鐘注射器溫度-230℃轉(zhuǎn)移線-300℃后注射器清洗時間30秒清洗流速20ml/分鐘后入口壓力2mL/分鐘-恒流運行時間-33.3分鐘流速-氦恒流@2mL/分鐘質(zhì)譜儀質(zhì)量選擇選擇50至600amu的質(zhì)量燈絲偏壓(filament bias)-70V離子源225℃檢測器
檢測電壓1600V采集率10個光譜/秒溶劑延遲100秒斷裂ChromaTOF軟件用于匯編斷裂和去卷積共遷移峰以更好的分離和解釋。
通過保留時間和基于在相同條件注入的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(見下文)的斷裂匹配和/或與上述軟件內(nèi)包括的NIST/EPA/NIH數(shù)據(jù)庫的良好匹配進(jìn)行脂肪酸的鑒定。
通過運行由來自Sigma(CAS506-17-2)的11-十八碳烯酸產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)品，從蕓苔種子提取物中鑒定11-十八碳烯酸甲酯(也稱為順11-十八碳烯酸甲酯)。保留時間為1207秒，產(chǎn)生853個與標(biāo)準(zhǔn)品的匹配和814個與上述文庫的匹配。
注入標(biāo)準(zhǔn)品的組成
11-十八碳烯酸甲酯方法在甲基化100mg酸后獲得甲基化產(chǎn)物-100mg溶于30ml玻璃瓶中的5ml MeOHCl 0.5N(Supelco)中-在氮氣中以70℃加熱1小時-冷卻至室溫后，加入5ml含有0.9％NaCl的水。
-用三次連續(xù)的己烷萃取(15ml)，使酯分配到己烷中-通過使有機(jī)相與15ml含有2.5％HNaCO3的水混合來中和酸殘留-RT下在N2中蒸發(fā)有機(jī)層，以獲得對應(yīng)于11-十八碳烯酸甲酯的透明油層實施例18-在保留優(yōu)良農(nóng)學(xué)性狀的同時獲得“無飽和”在多個大田位置進(jìn)行農(nóng)學(xué)測量，比較轉(zhuǎn)基因和對照。結(jié)論為總體上轉(zhuǎn)基因植物的行為與Nex 710對照相似，并顯示類似的性狀(除了更為改善的飽和物水平以外)。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因?qū)χ参锝】禌]有持續(xù)的負(fù)影響。表23中提供了性狀和評分系統(tǒng)的概述。在多個大田位置使用多種標(biāo)準(zhǔn)。
表24-27以數(shù)字展示了一些代表性結(jié)果。在這些圖表中使用以下縮寫DTF＝至開花天數(shù) EOF＝至開花結(jié)束天數(shù)HT＝高度 SC＝不育數(shù)DTM＝至成熟天數(shù) LSV＝晚季活力LOD＝倒伏 SD WT＝種子重量表24顯示來自事件號218-11.30的株系的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)。表25顯示來自事件號36-11.19的株系的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)。表26顯示來自事件號69-11.19的株系的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)。以上證明可以實踐本發(fā)明，即獲得“無飽和”蕓苔，而不對其他重要的農(nóng)學(xué)性狀產(chǎn)生不利影響。
表23.
大田分級
表23.(續(xù))大田分級
表24.來自事件#218-11.30的最佳表現(xiàn)株系的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)概述
表25.來自事件36-11.19的最佳表現(xiàn)株系的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)概述
表26.來自事件69-11.19的最佳表現(xiàn)株系的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)概述
實施例19-劑量效應(yīng)；通過插入多個拷貝的δ-9去飽和酶基因進(jìn)一步降低飽和物該實施例進(jìn)一步顯示“疊加”多個拷貝的δ-9去飽和酶基因具有令人驚奇的劑量效ccc應(yīng)，所述劑量效應(yīng)可用于甚至進(jìn)一步降低油料種子植物(如蕓苔)的飽和物。除非另有說明，以下為使用FAME方法測量的溫室數(shù)據(jù)。
表27報道了來自天然Nex 710、簡單事件(218、36、69)的F310種子批量脂肪酸數(shù)據(jù)，以及從每個F3種子包回溯至基于InVader測定選擇的F2植物的數(shù)據(jù)。(表27的后兩列顯示了與Nex 710對照相比，各個植物的近似平均總飽和物和總飽和物的近似平均降低。)在該世代中未使用Southern數(shù)據(jù)。因此，基于飽和物表達(dá)和InVader測定，通過種植F3植物并使用Southern重新測試對選擇的可能的疊加和可能的親本同胞以及空白進(jìn)行再確認(rèn)。
例如，雖然未進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，來自41個“疊加”株系的樣品具有平均3.5％的總飽和物。21個“單個”株系具有平均3.84％的總飽和物。
表28包含再次種植以確認(rèn)拷貝數(shù)和接合性的可能的F3疊加、可能的親本同胞和空白的概述。名為TDN0400141、TDN0400142、TDN0400145、TDN0400155、TDN0400158和TDN0400160的株系可能為純合疊加。株系TDN0400189、TDN0400143、TDN0400197、TDN0400167和TDN0400184可能為疊加的親本同胞。株系TDN0400198、TDN0400199為疊加自交產(chǎn)生的空白。TDN0400202、TDN0400204和TDN0400208為簡單事件。該材料目前仍在大田中或最近收獲。因此尚未提供大田數(shù)據(jù)。
圖8和9是用來自F3植物的DNA進(jìn)行的兩個凝膠電泳。在這一步驟中遇到了與分離用于Southern分析的DNA相似的問題，所以凝膠中未顯示提交的所有9個植物。基于凝膠，株系TDN0400141、TDN0400142和可能的TDN0400158(僅有2個植物)為純合疊加。TDN0400145對事件36仍然分離，TDN0400155對事件69仍然分離。株系TDN0400160似乎具有奇怪的分離條帶，可能說明對3個簡單事件都分離。對TDN0400160進(jìn)行追蹤觀察。該雜交的8號植物具有2.6％的低飽和水平，與高接合性的三重疊加一致。額外的分子分析可以證明這一點。凝膠中沒有顯示所有可能為親本同胞的株系(表29中事件欄中突出顯示的株系TDN0400184、TDN0400189和TDN0400197，在下文討論)。基于單個植物脂肪酸數(shù)據(jù)，似乎來自TDN0400184(可能為單個事件218的近交)的9個植物具有與可能的疊加一樣低的飽和水平。即，數(shù)據(jù)的傾向為與“近交”(sibbed-out)事件(從兩個轉(zhuǎn)基因事件的雜交回收的單個轉(zhuǎn)基因事件)相比，疊加始終顯示飽和物的降低。
表29含有來自Nex 710、簡單事件和每個單個F4植物的10種子批量脂肪酸數(shù)據(jù)。再培養(yǎng)了每種可能疊加、空白、單純事件等的9個植物，采樣組織用于分子分析并保存至結(jié)實用于脂肪酸分析。
表27.
表27.
表27.
表27.
表27(續(xù)).
表27(續(xù)).
表27(續(xù)).
表27(續(xù)).
表28.
表28.
表29.
表29.
表29.
表29.
表29.
表29.
表29(續(xù)).
表29(續(xù)).
表29(續(xù)).
表29(續(xù)).
表29(續(xù)).
表29(續(xù)).
序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司<120>在種子中具有“不飽和”或降低飽和水平的脂肪酸的某些植物以及來自種子的油<130>DAS-119XC1 PCT<150>US 60/617,532<151>2004-10-08<160>5<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1365<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>植物優(yōu)化的Δ-9去飽和酶基因的可讀框的核酸序列<400>1atgtctgctc caaccgctga catcagggct agggctccag aggctaagaa ggttcacatc60gctgataccg ctatcaacag gcacaattgg tacaagcacg tgaactggct caacgtcttc120ctcatcatcg gaatcccact ctacggatgc atccaagctt tctgggttcc acttcaactc180aagaccgcta tctgggctgt gatctactac ttcttcaccg gacttggaat caccgctgga240taccacaggc tttgggctca ctgctcttac tctgctactc ttccacttag gatctggctt300gctgctgttg gaggaggagc tgttgaggga tctatcagat ggtgggctag ggatcacagg360gctcatcata ggtacaccga taccgacaag gacccatact ctgttaggaa gggacttctc420tactctcacc ttggatggat ggtgatgaag cagaacccaa agaggatcgg aaggaccgac480atctctgatc tcaacgagga cccagttgtt gtttggcaac acaggaacta cctcaaggtt540gtgttcacca tgggacttgc tgttccaatg cttgttgctg gacttggatg gggagattgg600
cttggaggat tcgtgtacgc tggaatcctt aggatcttct tcgttcaaca agctaccttc660tgcgtgaact ctcttgctca ctggcttgga gatcaaccat tcgatgatag gaactctcct720agggatcacg tgatcaccgc tcttgttacc cttggagagg gataccacaa cttccaccac780gagttcccat ctgactacag gaacgctatc gagtggcacc agtacgatcc taccaagtgg840tctatctggg cttggaagca acttggattg gcttacgatc tcaagaagtt cagggctaac900gagatcgaga agggaagggt tcaacaactt cagaagaagc ttgataggaa gagggctact960cttgattggg gaaccccact tgatcaactt ccagtgatgg aatgggatga ctacgttgag1020caagctaaga acggaagggg acttgttgct atcgctggag ttgttcacga tgttaccgac1080ttcatcaagg atcacccagg aggaaaggct atgatctctt ctggaatcgg aaaggatgct1140accgctatgt tcaacggagg agtgtactac cactctaacg cagctcacaa ccttcttagc1200accatgaggg tgggagtgat caggggagga tgcgaggttg agatctggaa gagggctcag1260aaggagaacg ttgagtacgt tagggatgga tctggacaaa gggtgatcag ggctggagag1320caaccaacca agatcccaga gccaatccca accgctgatg ctgct1365<210>2<211>1381<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SEQ ID NO1的ORF，之前為Kozak序列和BamHI克隆位點，加上ORF末端的翻譯終止子<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(10)<223>Kozak序列和BamHI克隆位點<220>
<221>misc_feature<222>(1379)..(1381)<223>翻譯終止子<400>2ggatccaaca atgtctgctc caaccgctga catcagggct agggctccag aggctaagaa60ggttcacatc gctgataccg ctatcaacag gcacaattgg tacaagcacg tgaactggct120caacgtcttc ctcatcatcg gaatcccact ctacggatgc atccaagctt tctgggttcc180acttcaactc aagaccgcta tctgggctgt gatctactac ttcttcaccg gacttggaat240caccgctgga taccacaggc tttgggctca ctgctcttac tctgctactc ttccacttag300gatctggctt gctgctgttg gaggaggagc tgttgaggga tctatcagat ggtgggctag360ggatcacagg gctcatcata ggtacaccga taccgacaag gacccatact ctgttaggaa420gggacttctc tactctcacc ttggatggat ggtgatgaag cagaacccaa agaggatcgg480aaggaccgac atctctgatc tcaacgagga cccagttgtt gtttggcaac acaggaacta540cctcaaggtt gtgttcacca tgggacttgc tgttccaatg cttgttgctg gacttggatg600gggagattgg cttggaggat tcgtgtacgc tggaatcctt aggatcttct tcgttcaaca660agctaccttc tgcgtgaact ctcttgctca ctggcttgga gatcaaccat tcgatgatag720gaactctcct agggatcacg tgatcaccgc tcttgttacc cttggagagg gataccacaa780cttccaccac gagttcccat ctgactacag gaacgctatc gagtggcacc agtacgatcc840taccaagtgg tctatctggg cttggaagca acttggattg gcttacgatc tcaagaagtt900cagggctaac gagatcgaga agggaagggt tcaacaactt cagaagaagc ttgataggaa960gagggctact cttgattggg gaaccccact tgatcaactt ccagtgatgg aatgggatga1020ctacgttgag caagctaaga acggaagggg acttgttgct atcgctggag ttgttcacga1080tgttaccgac ttcatcaagg atcacccagg aggaaaggct atgatctctt ctggaatcgg1140aaaggatgct accgctatgt tcaacggagg agtgtactac cactctaacg cagctcacaa1200
ccttcttagc accatgaggg tgggagtgat caggggagga tgcgaggttg agatctggaa1260gagggctcag aaggagaacg ttgagtacgt tagggatgga tctggacaaa gggtgatcag1320ggctggagag caaccaacca agatcccaga gccaatccca accgctgatg ctgcttgatg1380a1381<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Δ-9正向B引物<400>3tgagttcatc tcgagttcat g 21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Δ-9反向B引物<400>4gatccaacaa tgtctgctcc20<210>5<211>455<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>植物優(yōu)化的Δ-9去飽和酶基因的可讀框的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)<400>5
Met Ser Ala Pro Thr Ala Asp Ile Arg Ala Arg Ala Pro Glu Ala Lys1 5 10 15Lys Val His Ile Ala Asp Thr Ala Ile Asn Arg His Asn Trp Tyr Lys20 25 30His Val Asn Trp Leu Asn Val Phe Leu Ile Ile Gly Ile Pro Leu Tyr35 40 45Gly Cys Ile Gln Ala Phe Trp Val Pro Leu Gln Leu Lys Thr Ala Ile50 55 60Trp Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Phe Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly65 70 75 80Tyr His Arg Leu Trp Ala His Cys Ser Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Leu85 90 95Arg Ile Trp Leu Ala Ala Val Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile100 105 110Arg Trp Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His His Arg Tyr Thr Asp Thr115 120 125Asp Lys Asp Pro Tyr Ser Val Arg Lys Gly Leu Leu Tyr Ser His Leu130 135 140Gly Trp Met Val Met Lys Gln Asn Pro Lys Arg Ile Gly Arg Thr Asp145 150 155 160Ile Ser Asp Leu Asn Glu Asp Pro Val Val Val Trp Gln His Arg Asn165 170 175
Tyr Leu Lys Val Val Phe Thr Met Gly Leu Ala Val Pro Met Leu Val180 185 190Ala Gly Leu Gly Trp Gly Asp Trp Leu Gly Gly Phe Val Tyr Ala Gly195 200 205Ile Leu Arg Ile Phe Phe Val Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser210 215 220Leu Ala His Trp Leu Gly Asp Gln Pro Phe Asp Asp Arg Asn Ser Pro225 230 235 240Arg Asp His Val Ile Thr Ala Leu Val Thr Leu Gly Glu Gly Tyr His245 250 255Asn Phe His His Glu Phe Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Glu Trp260 265 270His Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Trp Ser Ile Trp Ala Trp Lys Gln Leu275 280 285Gly Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Arg Ala Asn Glu Ile Glu Lys290 295 300Gly Arg Val Gln Gln Leu Gln Lys Lys Leu Asp Arg Lys Arg Ala Thr305 310 315 320Leu Asp Trp Gly Thr Pro Leu Asp Gln Leu Pro Val Met Glu Trp Asp325 330 335Asp Tyr Val Glu Gln Ala Lys Asn Gly Arg Gly Leu Val Ala Ile Ala340 345 350
Gly Val Val His Asp Val Thr Asp Phe Ile Lys Asp His Pro Gly Gly355 360 365Lys Ala Met Ile Ser Ser Gly Ile Gly Lys Asp Ala Thr Ala Met Phe370 375 380Asn Gly Gly Val Tyr Tyr His Ser Asn Ala Ala His Asn Leu Leu Ser385 390 395 400Thr Met Arg Val Gly Val Ile Arg Gly Gly Cys Glu Val Glu Ile Trp405 410 415Lys Arg Ala Gln Lys Glu Asn Val Glu Tyr Val Arg Asp Gly Ser Gly420 425 430Gln Arg Val Ile Arg Ala Gly Glu Gln Pro Thr Lys Ile Pro Glu Pro435 440 445Ile Pro Thr Ala Asp Ala Ala450 45權(quán)利要求
1.蕓苔植物，所述蕓苔植物產(chǎn)生具有包含少于3.5％總飽和物和少于80％油酸的油級分的種子。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述油級分包含70％至78％的油酸。
3.權(quán)利要求1的植物，其中所述油級分包含不高于3％的亞麻酸。
4.權(quán)利要求1的植物，其中所述油級分包含70％至78％的油酸和不高于3.5％的亞麻酸。
5.由權(quán)利要求1的蕓苔植物產(chǎn)生的種子。
6.蕓苔油，其包含少于3.5％的總飽和物和少于80％的油酸。
7.油炸食品組合物，其包含馬鈴薯材料和根據(jù)權(quán)利要求6的蕓苔油。
8.權(quán)利要求1的蕓苔植物，其中所述油級分具有不高于2.7％的總飽和物。
9.權(quán)利要求5的蕓苔種子，所述種子具有包含不高于2.7％的總飽和物的油級分。
10.權(quán)利要求6的蕓苔油，所述蕓苔油具有包含不高于2.7％的總飽和物的油級分。
11.產(chǎn)生油炸食品組合物的方法，其中所述方法包括在根據(jù)權(quán)利要求6的蕓苔油中油炸馬鈴薯材料。
12.蕓苔植物，所述蕓苔植物包含至少一個穩(wěn)定整合進(jìn)所述植物基因組的多核苷酸，所述多核苷酸編碼Δ-9去飽和酶蛋白，其中編碼SEQ IDNO5的蛋白質(zhì)的核酸分子的完全互補(bǔ)序列在洗滌后與所述多核苷酸保持雜交，其中所述洗滌條件為室溫下用2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗滌15分鐘。
13.權(quán)利要求12的植物，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO1。
14.權(quán)利要求12的植物，其中所述洗滌條件為室溫下用0.1×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘。
15.權(quán)利要求12的植物，其中所述洗滌條件為55℃下用0.1×SSC和0.1％SDS洗滌30分鐘。
16.權(quán)利要求12的植物，其中所述基因組包含兩個所述多核苷酸。
17.權(quán)利要求12的植物，其中所述基因組包含三個所述多核苷酸。
18.權(quán)利要求12的植物，其中所述多核苷酸與種子特異性啟動子有效連接。
19.由權(quán)利要求5的種子產(chǎn)生的植物。
20.與相應(yīng)野生型蕓苔植物種子的野生型油級分相比，降低轉(zhuǎn)基因蕓苔植物的至少一個種子油級分的飽和脂肪的方法，其中所述方法包括產(chǎn)生表達(dá)編碼Δ-9去飽和酶蛋白的多核苷酸的蕓苔植物，其中編碼所述蛋白的核苷酸分子與SEQ ID NO1的分子雜交。
21.權(quán)利要求20的方法，其中油級分包含少于80％的油酸。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)引起與所述相應(yīng)的野生型蕓苔植物相比，所述轉(zhuǎn)基因蕓苔植物的所述種子的油級分中軟脂酸(16∶0)的降低、山萮酸(22∶0)的降低和棕櫚油酸(16∶1)的提高。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述飽和脂肪降低至少60％。
24.包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸。
25.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物高度至少為100cm，平均種子重量大于3mg。
全文摘要
本發(fā)明提供了“無飽和”蕓苔油。本發(fā)明還提供了可用于產(chǎn)生這些油的種子。產(chǎn)生這些種子的植物也包括在本發(fā)明之內(nèi)。所有這些都通過在蕓苔中使用Δ－9去飽和酶基因而令人驚奇地實現(xiàn)。該計數(shù)可用于本文公開的其他植物。本發(fā)明的油具有迄今為止尚未獲得的特別有利的特征和脂肪酸譜。本發(fā)明還提供植物優(yōu)化的Δ－9去飽和酶基因。本發(fā)明還提供植物優(yōu)化的Δ－9去飽和酶基因。在一些優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選植物包含至少兩個拷貝的本發(fā)明Δ－9去飽和酶基因。令人驚奇地，這些植物產(chǎn)生的種子不顯示基因沉默效應(yīng)，而是令人驚奇地具有進(jìn)一步降低的總飽和物水平。
文檔編號A23L1/01GK101065013SQ200580040443
公開日2007年10月31日 申請日期2005年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月8日
發(fā)明者M·湯普森, S·萊迪 申請人:美國陶氏益農(nóng)公司