專利名稱：高比活HuG－CSF酵母表達(dá)載體、高產(chǎn)菌株及HuG－CSF生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵工程。具體而言，本發(fā)明涉及高比活HuG-CSF酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、分泌表達(dá)HuG-CSF的酵母菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)、構(gòu)建結(jié)果及利用它來生產(chǎn)HuG-CSF的分離純化方法。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)生產(chǎn)和銷售的G-CSF產(chǎn)品都是大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)系統(tǒng)，不能對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工修飾(如糖基化等)，而且表達(dá)的蛋白多以包涵體形式存在，在生產(chǎn)過程中需要變性、復(fù)性，但復(fù)性率很低，因此活性低，只有6.0×107IU/mg蛋白，在臨床使用上亦有較大的副作用；并且分離純化過程十分復(fù)雜，生產(chǎn)成本很高。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)取代大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，目標(biāo)蛋白HuG-CSF不需要復(fù)性，其生物比活性可達(dá)8.0×108單位/毫克蛋白；純化過程非常簡單，兩次柱層析后即可從發(fā)酵液中提取獲得純度達(dá)98％以上的目標(biāo)蛋白HuG-CSF，大大簡化了生產(chǎn)工序，降低了生產(chǎn)成本。
HuG-CSF酵母重組菌株的構(gòu)建方法為將克隆修飾的HuG-CSF基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除Kex2位點Lys-Arg之后的Ste13位點Glu-Ala-Glu-Ala，構(gòu)建成HuG-CSF基因分泌型表達(dá)載體；利用Invitrogen公司的PichiaEasyComp Transformation Kit的方法，將HuG-CSF基因分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母(Pichia pastori5)的菌株GS115，構(gòu)建成分泌型表達(dá)HuG-CSF的酵母工程菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115；通過抗生素篩選、生物比活性測定和蛋白總量測定，獲得高表達(dá)的目標(biāo)酵母重組菌株。
上述的酵母重組菌株目標(biāo)蛋白HuG-CSF的表達(dá)量占分泌蛋白總量的80％以上，比活性為8.0×108單位/毫克蛋白；目標(biāo)蛋白HuG-CSF具有與天然HuG-CSF相同的免疫原性。
本工程菌株接受外源基因是以整合于基因組的形式，這與大腸桿菌、釀酒酵母的獨立染色體組外的質(zhì)粒表達(dá)體系有顯著差別，故本工程菌株較大腸桿菌、釀酒酵母穩(wěn)定，不易發(fā)生外源基因丟失現(xiàn)象，以本工程菌作為樣品模板，通過PCR、分子雜交等技術(shù)鑒定選擇出來的陽性菌株一定是真實可靠的，且其目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物HuG-CSF直接分泌在發(fā)酵液中，因此檢測其蛋白表達(dá)量及目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性非常簡易，這較大腸桿菌表達(dá)體系——表達(dá)產(chǎn)物需復(fù)性——優(yōu)越得多；另外，酵母是一種低等真核生物，其表達(dá)后加工模式類似高等真核生物，故用它表達(dá)的基因產(chǎn)物不僅與天然產(chǎn)物有相同的生物活性，而且毒副作用低，產(chǎn)品加工成本低，適用性更廣。
HuG-CSF的純化方法為利用獲得的高產(chǎn)物表達(dá)量、高產(chǎn)物活性的酵母重組菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115進(jìn)行發(fā)酵，離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH在4.0-5.0范圍內(nèi)，過CM Sepharose層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，加硫酸銨至終濃度為10％，過疏水層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，得到HuG-CSF。
本發(fā)明的效果及意義本發(fā)明利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)HuG-CSF，是由酵母工程菌直接將G-CSF分泌到發(fā)酵液中，分泌的HuG-CSF蛋白占總分泌蛋白的80％以上，表達(dá)量達(dá)到30-40mg蛋白/L發(fā)酵液水平。在分離純化過程中只需要將離心后的上清液直接過離子交換柱和疏水柱即可達(dá)到98％以上的純度，比活性可達(dá)到8.0×108IU/mg蛋白。大大簡化了生產(chǎn)工序，降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用將有良好的經(jīng)濟(jì)效益。附圖
為HuG-CSF表達(dá)載體構(gòu)建圖pGAPZα-A載體結(jié)構(gòu)為磷酸甘油酸脫氫酶基因啟動子區(qū)域第1-483bp
α-交配因子分泌信號肽序列第493-759bp載體多克隆位點第760-828bpmyc抗原決定簇包第827-856bp多聚組氨酸包第872-889bp乙醇氧化酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第893-1233bp轉(zhuǎn)錄延伸因子1啟動子區(qū)域第1234-1644bp合成原核啟動子第1645-1712bp鏈霉菌zeocin抗性基因閱讀框第1713-2087bp細(xì)胞色素合成酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第2088-2405bp大腸桿菌復(fù)制子1(來源于pUC載體)第2416-3089bp具體實施方式下面結(jié)合實施例詳細(xì)介紹本發(fā)明在HuG-CSF重組酵母工程菌株的構(gòu)建和HuG-CSF純化工藝中的具體應(yīng)用。
實施例1 HuG-CSF酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的獲得(一)材料1.HuG-CSF基因2.pGAPZα-A、P.pastoris Strain GS115(his4)均購自Invitrogen公司。
(二)方法由于HuG-CSF基因的481-486位具有一個Xho I位點ctcgag，所以通過引物介導(dǎo)的PCR方法利用同義突變?yōu)閏tcgaa；編碼HuG-CSF基因的全長序列525bp(不含起始密碼子atg，但含終止密碼子tag)，其5’和3’端分別通過XhoI(ctcgag)、NotI(gcggccgc)克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pGAPZa-A的多克隆位點。
1.基因PCR擴(kuò)增(1)引物設(shè)計在5’端引物中刪除Kex2位點Lys-Arg之后的Ste13位點Glu-Ala-Glu-Ala和起始密碼子ATG。
P1-5’GCCTCGAGAAAAGAACTCCACTGGGTCCAGCACGCTCTCTXhoI Lys-Arg(Kex2位點)GCCGCAGTCTTTCCTGC 3’P2-5’TGGCGGCCGCCTACGGCTGGGCCAGGTGACGCAGANotIACGCGGTAAGACACTTC3’(2)熱循環(huán)94℃，5’；94℃，30’’→58℃，30’’→72℃，30’’；72℃，7’；擴(kuò)增30個循環(huán)。
2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收與克隆(1)HuG-CSF基因經(jīng)擴(kuò)增電泳后獲得約525bp的DNA帶；(2)用德國寶靈曼公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物高純度試劑盒回收目標(biāo)片段并進(jìn)行T-Vector克隆。
3.基因序列分析采用美國PE公司生產(chǎn)的ABI 377A DNA自動測序儀進(jìn)行DNA序列分析。
4.酵母分泌型表達(dá)載體構(gòu)建采用基因克隆技術(shù)將HuG-CSF基因通過XhoI/NotI插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游的Xho I/Not I位點，構(gòu)建成含α-factor信號肽的分泌型酵母表達(dá)載體。pGAPZα-A/G-CSF表達(dá)載體分子大小為3.672kb。其中pGAPZα-A為3.147kb，HuG-CSF為525bp(包含終止密碼子3bp)；HuG-CSF插入于載體pGAPZα-A第747bp與第810bp(NotI I位點)之間。具體情況見附圖一。
5.表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌GS115利用Invitrogen公司生產(chǎn)的Pichia EasyComp Transformation Kit(Cat.No.K1730-01)經(jīng)稍作改進(jìn)的方法進(jìn)行。按照《分子克隆實驗指南》的方法，具體操作如下
(1)挑取畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115單菌落，在30℃，300轉(zhuǎn)/分鐘條件下以YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5；取0.1-0.5毫升菌液至50毫升同樣培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600＝6-8，在5000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心5分鐘，去上清液，用10毫升溶液I重懸，制成感受態(tài)細(xì)胞；(2)取100微升感受態(tài)，加入5-10微升線性化的HuG-CSF重組表達(dá)載體，再加400毫升溶液II，混勻后28℃培養(yǎng)1小時，加1毫升YPD，30℃培養(yǎng)1小時；(3)將培養(yǎng)物在5000轉(zhuǎn)/分鐘、4℃條件下離心15分鐘，去上清，用200毫升溶液III重懸，涂布YPD+Zeocin100毫克/升平板，28-30℃培養(yǎng)24-36小時，產(chǎn)生單菌落。
6.高表達(dá)酵母工程菌株的獲得用Zeocin抗生素篩選獲得陽性菌株后，提取工程菌基因組DNA，進(jìn)一步以引物P1/P2作PCR分析和以德國寶靈曼公司生產(chǎn)的DiG Labelling and Detection Kit標(biāo)記HuG-CSF基因之525bp DNA片段為探針，進(jìn)行Southern blotting鑒定，篩選出陽性菌株，再進(jìn)行生物比活性測定和總蛋白測定，結(jié)果表明HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115為高表達(dá)G-CSF的工程菌株。
實施例2 HuG-CSF的純化方法構(gòu)建HuG-CSF分泌表達(dá)的酵母菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115后，-80℃保存菌種。發(fā)酵前，接種平板，使菌種活化，在YPD+Zeocin100毫克/升培養(yǎng)基中，接種單菌落發(fā)酵36小時，離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0范圍內(nèi)，過CM Sepharose層析柱，收集0.4摩爾/升氯化鈉洗脫峰，加硫酸銨至終濃度為10％，過PhenylSepharose層析柱，收集2％硫酸銨洗脫峰，洗脫液經(jīng)透析后得到純度大于98％的HuG-CSF原液。
權(quán)利要求
1.一種HuG-CSF酵母表達(dá)載體HuG-CSF/pGAPZα-A，其特征在于將克隆修飾的HuG-CSF基因插入pGAPZα-A之GAP啟動子/α-factor信號肽下游位點，刪除載體上Kex2位點Lys-Arg之后的Ste13位點Glu-Ala-Glu-Ala，構(gòu)建成HuG-CSF分泌型表達(dá)載體HuG-CSF/pGAPZα-A。
2.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于宿主被分泌型表達(dá)載體HuG-CSF/pGAPZα-A轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述的宿主為巴斯德畢赤酵母菌株GS115，構(gòu)建成的分泌型HuG-CSF重組酵母菌株為HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115。
4.一種HuG-CSF的純化方法，其特征在于直接從分泌型HuG-CSF酵母菌株HuG-CSF/pGAPZα-A/GS115的發(fā)酵液中分離純化HuG-CSF離心收集發(fā)酵上清液，以醋酸調(diào)節(jié)pH在4.0-5.0范圍內(nèi)，過CM Sepharose層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，加硫酸銨至終濃度為10％，過疏水層析柱，收集目標(biāo)洗脫峰，得到HuG-CSF。
全文摘要
本發(fā)明涉及HuG－CSF分泌表達(dá)的酵母菌株HuG－CSF/pGAPZ α－A/GS115構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)、構(gòu)建結(jié)果及利用此菌株生產(chǎn)HuG－CSF的純化方法。本發(fā)明采用酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)取代大腸桿菌包涵體表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)酵液上清中的HuG－CSF蛋白含量占總分泌蛋白的80％以上，目標(biāo)蛋白HuG－CSF不需要復(fù)性，其生物比活性可達(dá)到8.0×10
文檔編號C12R1/84GK1824781SQ200510129889
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者梁國棟, 陳海寧, 鄧剛, 蒲廣西, 郝新保, 白玉杰 申請人:海南國棟藥物研究所有限公司