專利名稱：含兩個(gè)表達(dá)載體的腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株及腺苷甲硫氨酸生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和微生物發(fā)酵工程。具體而言，本發(fā)明涉及含兩個(gè)表達(dá)載體的腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法以及利用此菌株發(fā)酵生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的關(guān)鍵技術(shù)。
背景技術(shù)：
腺苷甲硫氨酸(SAMe)是細(xì)胞內(nèi)主要的甲基供體，是生物體內(nèi)重要的中間代謝物，參與眾多生化反應(yīng)。腺苷甲硫氨酸在臨床上主要用于治療抑郁癥、肝病、冠心病和輕度關(guān)節(jié)炎。目前國(guó)內(nèi)對(duì)腺苷甲硫氨酸的需求完全依賴于進(jìn)口。
目前國(guó)內(nèi)研究工作的主要缺陷有1、單位體積發(fā)酵液中腺苷甲硫氨酸含量太低，且僅為小試發(fā)酵，未做放大實(shí)驗(yàn)；2、發(fā)酵成本過(guò)高，國(guó)內(nèi)研究者使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為分析純及進(jìn)口蛋白胨酵母粉，所需試劑價(jià)格昂貴，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。綜上，國(guó)內(nèi)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的研究?jī)H停留于實(shí)驗(yàn)階段，發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵成本都遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。這也是國(guó)內(nèi)一些廠家在已有生產(chǎn)批文的情況下仍然沒(méi)有腺苷甲硫氨酸產(chǎn)品上市的根本原因。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)基因工程手段，將控制或影響SAMe表達(dá)的兩個(gè)載體pPIC-SAM2和pGAPZ-SAM2轉(zhuǎn)入宿主菌巴斯德畢赤酵母菌株GS115構(gòu)建成重組的腺苷甲硫氨酸高表達(dá)菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2。兩個(gè)載體以整合于宿主菌基因組的方式改變宿主菌株細(xì)胞內(nèi)SAMe的代謝調(diào)控，大大強(qiáng)化了宿主菌的SAMe表達(dá)量。本發(fā)明中含兩個(gè)表達(dá)載體的工程菌株在丙三醇及甲醇的誘導(dǎo)下，成功克服了培養(yǎng)后期腺苷甲硫氨酸表達(dá)量下降等缺陷(含單一表達(dá)載體的工程菌株很難克服此缺陷)，五天發(fā)酵時(shí)間里可以持續(xù)累積SAMe；SAMe表達(dá)量?jī)杀队诤瑔我槐磉_(dá)載體的菌株。結(jié)合優(yōu)化的、新的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，大大提高了SAMe的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
腺苷甲硫氨酸雙表達(dá)載體的構(gòu)建和重組菌株的獲得方法按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所述方法，抽提S.Cerevisiae基因組DNA，同時(shí)根據(jù)Genbank中的Saccharomyces.Cerevisiae來(lái)源的S-alenosylmethionine sythetase(SAM2)基因，設(shè)計(jì)兩條專一引物，以Saccharomyces.Cerevisiae基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR目的產(chǎn)物回收與pGEM-T載體連接，構(gòu)建pGEM-T/SAM2載體，用BamHI和EcoRI雙酶切將SAM2切出，分別裝入pPIC3.5k和pGAPZ表達(dá)載體中，先將表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5-SAM2用SacI酶線性化，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞GS115菌，涂布于含G418抗生素的YPD平板，30℃培養(yǎng)3-6天，得到含G418抗性的菌株。經(jīng)過(guò)Dot-blot鑒定及HPLC測(cè)定SAM含量，篩選出含量最高的菌株SAM2工程菌。再將pGAPZ-SAM2用Avr II線性化，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入篩選出來(lái)的SAM2工程菌，涂布于含Zeocin抗生素的YPD平板，30℃培養(yǎng)2-5天，得到含pGAPZ-SAM2和pPIC3.5-SAM2的雙載體菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，經(jīng)過(guò)PCR鑒定得陽(yáng)性菌株，用高氯酸法提取SAM進(jìn)行HPLC定量分析。結(jié)果表明雙載體工程菌的SAMe產(chǎn)量達(dá)8.7g/L發(fā)酵液(搖瓶發(fā)酵)。
利用菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2發(fā)酵生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的工藝方法將菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2發(fā)酵培養(yǎng)五天(培養(yǎng)基為1.5％KH2PO4、2％MgSO4·7H2O、4％K2SO4、0.3％CaSO4、3％丙三醇、2％蛋氨酸和0.3％PTM1)，發(fā)酵過(guò)程中控制pH在5.0-6.0范圍內(nèi)，溫度30℃，DO值大于30％，先后流加丙三醇、甲醇及PTM1。五天后停止發(fā)酵，將菌體破細(xì)胞得SAMe抽提液，用層析柱純化抽提液，得SAMe純品。用HPLC測(cè)定含量，在1000L發(fā)酵罐中SAMe最終累積量為14-16g/L發(fā)酵液，處于國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。
本發(fā)明的效果及意義本發(fā)明從根本上克服了國(guó)內(nèi)腺苷甲硫氨酸研究中存在的產(chǎn)量低、發(fā)酵成本過(guò)高的缺陷。本發(fā)明中1000L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達(dá)14-16g/L發(fā)酵液，所用培養(yǎng)基均為工業(yè)試劑，價(jià)格低廉，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)要求；轉(zhuǎn)向市場(chǎng)后，將徹底改變國(guó)內(nèi)腺苷甲硫氨酸需求完全依賴進(jìn)口的局面。

附圖1為pPIC-SAM2表達(dá)載體構(gòu)建圖譜。
pPIC3.5k載體結(jié)構(gòu)為乙醇氧化酶1啟動(dòng)子區(qū)域第1-937bp載體多克隆位點(diǎn)第938-968bp
乙醇氧化酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域981-1314bp組氨酸脫氫酶基因區(qū)域4242-1708bp卡那霉素抗性基因區(qū)域5458-4656bp乙醇氧化酶1基因片段第5850-6607bp來(lái)源于pBR322載體的基因片段7689-7016bp氨芐西林抗性基因8694-7834bp附圖2為pGAPZ-SAM2表達(dá)載體構(gòu)建圖譜。
pGAPZ-A載體結(jié)構(gòu)為磷酸丙三醇酸脫氫酶基因啟動(dòng)子區(qū)域第1-483bp載體多克隆位點(diǎn)第484-563bpmyc抗原決定簇包第564-593bp多聚組氨酸包第609-626bp乙醇氧化酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第630-970bp轉(zhuǎn)錄延伸因子1啟動(dòng)子區(qū)域第971-1381bp合成原核啟動(dòng)子第1382-1449bp鏈霉菌zeocin抗性基因閱讀框第1450-1824bp細(xì)胞色素合成酶1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域第1825-2142bp大腸桿菌復(fù)制子1(來(lái)源于pUC載體)第2153-2826bp具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例介紹本發(fā)明的技術(shù)細(xì)節(jié)和具體應(yīng)用。
實(shí)施例一 SAMe雙表達(dá)載體的構(gòu)建及畢赤酵母工程菌株的獲得(一)材料1.1菌株和質(zhì)粒畢赤酵母(P.pastoris)宿主菌GS115(his4)、E.coliTop10F′酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ-A、pPIC3.5K均為Invitrogen公司產(chǎn)品?？寺≠|(zhì)粒載體pGEM-T為Promega公司產(chǎn)品。E.coli菌株DH5α為華美公司產(chǎn)品。
1.2酶與試劑實(shí)驗(yàn)所用的限制性內(nèi)切酶(除Avr II為Biolabs公司產(chǎn)品外)、T4-DNA連接酶、Wizard DNA clean-up kit均購(gòu)自Promega公司；RNeasy Mini Kit、cDNA synthesisKit for RT-PCR(AMV)，DIG DNA Labeling and Detection Kit、尼龍膜等購(gòu)自Boehringer Mannheim公司，使用方法參照廠家使用說(shuō)明書(shū)。Pichia EasyCompTransformation kit為Invitrogen公司產(chǎn)品；PCR Marker(1543、994、695、515、377、237bp)為華美生物工程公司產(chǎn)品，常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.3主要儀器DNA合成儀為Backman Instruments Inc.OLIGO 1000M DNA Synthesizer，ABI377測(cè)序儀、2400型PCR儀是PE公司產(chǎn)品，水浴鍋、電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀等是LKB公司產(chǎn)品，臺(tái)式低溫離心機(jī)是Eppendof公司產(chǎn)品。
(二)方法SAM2克隆、載體構(gòu)建及序列分析2.1.1 RT-PCR擴(kuò)增SAM2基因利用RT-PCR技術(shù)，從Saccharomyces Cerevisiae基因組中制備SAM2基因片斷，并插入克隆載體pGEM-T Vector，進(jìn)行基因序列的分析。
2.1.2 Saccharomyces Cerevisiae總RNA的獲取收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的S.Cerevisiae細(xì)胞，離心，按RNeasy Mini Kit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取的總RNA取2ul進(jìn)行甲醛凝膠電泳，可見(jiàn)清晰的一條帶，證明所提取的RNA無(wú)降解。
2.1.3 cDNA第一鏈的合成具體操作參見(jiàn)寶靈曼反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)總體積為20uL，RNA為7.5ug，oligo dT 1uL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2uL，25mmol/LMgCl24uL，2.5mmol/LdNTPS 2uL，RNasin 20單位，反轉(zhuǎn)錄酶40單位，42℃水浴2hrs，取出置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.1.4 SAM2基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成1)引物的設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank發(fā)表的Saccharomyces Cerevisiae來(lái)源的S-alenosylmethionine sythetase，SAM2基因序列(登陸號(hào)為M23368)，及酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ-A、pPIC3.5K，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。引物序列如下PP1 5′-GAGGATCCACCATGGCCAAGAGCAAAACT23′(下劃線為BamH I酶切位點(diǎn))PP2 3′-GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA25′(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn))PG1 5′-TATTCTAGAACCATGGCCAAGAGCAAAACT23′(下劃線為XbaI酶切位點(diǎn))PG2 3′-GCGGCCGCCTCGAGAGCCTAGCATAAAGAAA25′(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))2)引物的合成與純化引物的合成與純化由大連寶生物工程公司完成。
2.2 SAM2基因擴(kuò)增取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2ul，加入兩對(duì)正、反引物各20umol/L，2.5mmol/L dNTPs4uL，10×PCR反應(yīng)緩沖液5uL，Taq DNA聚合酶2U，加ddH2O至50uL；熱循環(huán)條件為94℃變性5min.后；94℃，30sec.；43℃，30sec.；72℃，1.0min.；循環(huán)35次后，72℃ 10min。循環(huán)結(jié)束后取5uL做1.5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果，可見(jiàn)有約1200bp的特異擴(kuò)增帶，與預(yù)期的SAM2cDNA大小一致。
2.3 SAM2克隆載體的構(gòu)建2.3.1用Wizard DNA clean-up kit回收PCR產(chǎn)物，具體操作見(jiàn)Wizard的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
2.3.2載體兩種PCR產(chǎn)物按1∶3比例進(jìn)行pGEM T-Vector克隆，其反應(yīng)體系為2×buffer 5ulpGEM-T Vector(50ng/ul) 1ulPCR產(chǎn)物 3ulT4-DNA Ligase(3U/ul)1ulTotal volume10ul4℃冰箱放置18hrs。
2.3.3 DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備 用CaCl2法制備，具體操作參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》2.3.4 重組體轉(zhuǎn)化 以改良法進(jìn)行，具體操作為新配制2∶1的0.1mol/LCaCl2/2×SSC混合液，分別加入兩種10uL連接反應(yīng)液，混勻后，冰上放置1.5min.，立即加入100uL的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置時(shí)間不少于5min.，42℃熱擊2min.，冰浴1min.后，分別涂布LB Amp.100ug/mL平板，37℃培養(yǎng)16hrs。
2.4重組子鑒定與DNA序列測(cè)定2.4.1分別挑取白色單菌落，用LB附加Amp.100ug/mL液體培養(yǎng)基，在37℃搖床上，以300r/min.的轉(zhuǎn)速，振蕩培養(yǎng)12-16hrs后，用堿法小量提取質(zhì)粒，提出的質(zhì)粒分別用BamH I/EcoR I和XhoI/XbaI對(duì)重組體作酶切分析，若能切出約1200bp DNA片段，則為陽(yáng)性克隆。
2.4.2各取一個(gè)陽(yáng)性重組體作中量搖菌和質(zhì)粒提取，用PEG法純化質(zhì)粒，具體操作見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》；用標(biāo)樣法估測(cè)質(zhì)粒濃度，并校正至200ng/uL用作DNA序列測(cè)定。
2.4.3DNA序列測(cè)定和分析 測(cè)序引物為SP6/T7，測(cè)序具體操作程序按PE公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將測(cè)序正確的質(zhì)粒分別命名為pGEM-SAM2(pPIC)和pGEM-SAM2(pGAPZ)。
(三)表達(dá)載體構(gòu)建和酵母轉(zhuǎn)化3.1.1表達(dá)載體構(gòu)建 用BamH I/EcoR I分別酶切pGEM-SAM2(pPIC)和pPIC3.5K，回收目標(biāo)片段后按常規(guī)方法構(gòu)建表達(dá)載體，即將基因插入AOX1啟動(dòng)子下游的BamH I/EcoR I位點(diǎn)，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC-SAM2，見(jiàn)附圖1。同時(shí)用Xho I/Xba I分別酶切pGEM-SAM2(pGAPZ)和pGAPZ-A，回收目標(biāo)片段后按常規(guī)方法構(gòu)建表達(dá)載體，即將基因插入GAP啟動(dòng)子下游的Xho I/Xba I位點(diǎn)，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGAPZ-SAM2，見(jiàn)附圖2。兩種載體分別轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F’。E.coliTOP10F’感受態(tài)細(xì)胞的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法見(jiàn)Pichia產(chǎn)品使用指南。
3.1.2用XhoI/XbaI酶切分析E.coli TOP10F’/pGAPZ-SAM2重組體的質(zhì)粒，對(duì)重組體篩選、鑒定，能切下1200bp片段則為陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆載體命名為pGAPZ-SAM2；用BamH I/EcoR I酶切分析E.coli TOP10F’/pPIC-SAM2重組體的質(zhì)粒，對(duì)重組體篩選、鑒定，能切下1200bp片段則為陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆載體命名為pPIC-SAM2。從酶切分析的結(jié)果可見(jiàn)所篩選鑒定的2個(gè)表達(dá)載體均為陽(yáng)性克隆。
3.1.3將篩選到的陽(yáng)性工程菌株(單菌落)E.coli TOP10F′/pGAPZ-SAM2和E.coli TOP10F’/pPIC-SAM2，用低鹽LB附加zeocin25ug/mL搖活(37℃)，將菌液制成含15％丙三醇的混和液，-70℃冰柜保存；同時(shí)在低鹽LB附加zeocin25ug/mL平板上劃線，37℃培養(yǎng)出現(xiàn)單菌落后，貯存于4℃冰箱，作為擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種板。
3.2雙載體工程菌株構(gòu)建及鑒定分析3.2.1 GS115/pPIC-SAM2工程菌株構(gòu)建 以Bgl II酶切pPIC-SAM2載體呈線性化并用Pichia EasyComp Transformation Kit轉(zhuǎn)化酵母P.pastoris GS115，具體操作為(1)Bgl II酶切陽(yáng)性載體反應(yīng)體系為10×buffer25ulBgl II(5U/ul) 1ul載體 3ugddH2O定容至 50ul37℃水浴10hrs以上，用2×無(wú)水乙醇沉淀，離心去上清，最終溶于5ul。
(2)轉(zhuǎn)化 酵母轉(zhuǎn)化操作見(jiàn)Pichia EasyComp Transformation Kit產(chǎn)品使用指南。
3.2.2工程菌株鑒定分析(1)平板篩選 將轉(zhuǎn)化液涂布于YPD+G418 1.0mg/ml平板，30℃培養(yǎng)2-3天，平板上長(zhǎng)出單菌落。
(2)PCR鑒定分析 用牙簽挑取1/4-1/2菌落投入5mLYPD+Zeocin100mg/L液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)24hrs以上，至OD600＝1.8-2.0，以Pichia產(chǎn)品使用指南的方法提取酵母工程菌株基因組DNA，用作PCR的模板，PCR鑒定具體操作見(jiàn)2.2。
(3)點(diǎn)雜交鑒定分析 按DIG DNA Labeling and Detection Kit產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。結(jié)果表明有90％以上的被鑒定重組菌株為陽(yáng)性菌株。確定為陽(yáng)性菌株后可用于進(jìn)一步的搖瓶發(fā)酵，用高氯酸法提取SAM進(jìn)行HPLC定量分析。結(jié)果表明，GS115/pPIC-SAM2工程菌的SAM產(chǎn)量可達(dá)5.1g/L發(fā)酵液(搖瓶發(fā)酵)。
3.2.3 GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2雙載體工程菌株構(gòu)建以Avr II酶切pGAPZ-SAM2載體呈線性化并用Pichia EasyCompTransformation Kit轉(zhuǎn)化GS115/pPIC-SAM2工程菌，操作見(jiàn)Pichia EasyCompTransformation Kit產(chǎn)品使用指南。
3.2.4雙載體工程菌株鑒定分析(1)平板篩選 將轉(zhuǎn)化液涂布于YPD+Zeocin 0.1g/L+G418 1.0g/L平板，30℃培養(yǎng)2-3天，平板上長(zhǎng)出單菌落。
(2)PCR鑒定分析 用牙簽挑取1/4-1/2菌落投入5mL YPD+Zeocin100mg/L液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)24hrs以上，至OD600＝1.8-2.0，以Pichia產(chǎn)品使用指南的方法提取酵母工程菌株基因組DNA，用作PCR的模板，并以pGAPZ的專有引物進(jìn)行PCR鑒定分析。結(jié)果表明有80％以上的被鑒定重組菌株為陽(yáng)性菌株。確定為陽(yáng)性菌株后作進(jìn)一步的搖瓶發(fā)酵，用高氯酸法提取SAM進(jìn)行HPLC定量分析。結(jié)果表明GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2雙載體工程菌的腺苷甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)8.7g/L發(fā)酵液(搖瓶發(fā)酵)。
實(shí)施例二 利用重組菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2發(fā)酵生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸將GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2工程菌按7.5％的接種量接入培養(yǎng)基中(1000L發(fā)酵罐)，培養(yǎng)基配方為1.5％KH2PO4、2％MgSO4·7H2O、4％K2SO4、0.3％CaSO4、3％丙三醇和2％蛋氨酸。接種后補(bǔ)加PTM1至終濃度為0.3％，用氨水(28％)調(diào)節(jié)pH至5.5，溫度控制在30℃，DO大于30％，培養(yǎng)16-24hrs時(shí)工程菌完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，DO值和pH值均快速上升，此時(shí)開(kāi)始流加50％丙三醇，當(dāng)濕菌體量大于300g/L發(fā)酵液時(shí)停止流加丙三醇，開(kāi)始流加甲醇，同時(shí)流加60％山梨醇，并調(diào)節(jié)pH至5.8，培養(yǎng)120hrs時(shí)停止發(fā)酵，將菌體破細(xì)胞得SAMe抽提液，用層析柱純化抽提液，得SAMe純品。用HPLC測(cè)定含量，在1000L發(fā)酵罐中SAMe最終累積量為14.6g/L發(fā)酵液。
權(quán)利要求
1.一種腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株，其特征在于宿主菌中含兩個(gè)腺苷甲硫氨酸表達(dá)載體pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株，其特征在于所述的宿主菌為巴斯德畢赤酵母菌株GS115，構(gòu)建成的重組菌為腺苷甲硫氨酸高表達(dá)菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2。
3.一種腺苷甲硫氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于培養(yǎng)腺苷甲硫氨酸高表達(dá)菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，收集目標(biāo)產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腺苷甲硫氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)工藝為發(fā)酵培養(yǎng)重組菌株GS115/pPIC-SAM2、pGAPZ-SAM2，培養(yǎng)基成分為1.5％KH2PO4、2％MgSO4·7H2O、4％K2SO4、0.3％CaSO4、3％丙三醇、2％蛋氨酸和0.3％PTM1；發(fā)酵過(guò)程中控制pH在5.0-6.0范圍內(nèi)，溫度30℃，DO值大于30％，并先后流加丙三醇和甲醇作為誘導(dǎo)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含兩個(gè)表達(dá)載體的腺苷甲硫氨酸高產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法及利用此菌株發(fā)酵生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明把影響腺苷甲硫氨酸表達(dá)的兩個(gè)載體轉(zhuǎn)入同一宿主菌得到重組菌株GS115/pPIC－SAM2、pGAPZ－SAM2。此菌株在丙三醇及甲醇的誘導(dǎo)下，成功克服了培養(yǎng)后期腺苷甲硫氨酸累積量下降等缺陷，其產(chǎn)量是含單一表達(dá)載體菌株的兩倍。結(jié)合新的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，1000L發(fā)酵罐中腺苷甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)14－16g/L發(fā)酵液，遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)研究水平。發(fā)酵所用培養(yǎng)基均為工業(yè)試劑，成本低廉。各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
文檔編號(hào)C12P13/12GK1824768SQ200510129888
公開(kāi)日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者梁國(guó)棟, 蒲廣西, 鄧剛, 郝新保, 白玉杰 申請(qǐng)人:海南國(guó)棟藥物研究所有限公司