專利名稱：來源于鹽芥的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物中與抗脅迫相關的基因及其編碼蛋白與應用，特別是涉及鹽芥中的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與其在培育耐鹽性提高植物中的應用。
背景技術：
研究表明，擬南芥的一些近親具有極強的耐逆性，并且較適宜進行遺傳操作。其中，鹽生植物—鹽芥與擬南芥極為相似，基因序列同源性可達70-90％，不僅具有遺傳學模式植物令人滿意的形態(tài)、生長特性及遺傳特點，還對海水的高鹽濃度具有較強的耐受能力。因此，鹽芥不但是一種可供研究植物自然耐鹽機制的優(yōu)異遺傳模式植物，更是一種分離優(yōu)異耐鹽相關基因的資源植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個鹽芥的耐鹽基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的耐鹽基因，名稱為ST225，來源于十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由509個堿基組成，其編碼序列為自5’端第74-424位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質。
本發(fā)明耐鹽基因所編碼的蛋白(ST225)，也屬于本發(fā)明的保護范圍。它是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性作用的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №2由116個氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增ST225中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
利用植物表達載體，將本發(fā)明的耐鹽基因導入植物細胞或組織，可獲得對高鹽耐受力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。
所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其他的可參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆儲存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用ST225構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達啟動子等，它們可單獨使用或與其他的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。
為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
攜帶有本發(fā)明ST225的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物細胞或組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、小麥等單子葉植物，也可以是擬南芥、大豆、油菜等雙子葉植物、將本發(fā)明所提供的耐鹽基因ST225與擬南芥基因組基因進行序列比對，結果該基因與擬南芥基因組中編碼一個表達蛋白的基因(GenBank登錄號Atlg19530)有較高相似性(氨基酸水平上有75％的相似性)，通過對轉化本基因后所得到的轉基因擬南芥進行逆境脅迫試驗，證明該基因轉入植物后可顯著提高轉化植株的耐鹽性。本發(fā)明為人為控制植物中抗逆和耐逆相關基因的表達奠定了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物(特別是水稻、小麥、油菜等農(nóng)作物)中發(fā)揮重要作用。
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為載體pCB2004的物理圖譜圖2A為轉化體(225)和野生型擬南芥(WT)在含0mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后的生長情況圖2B為轉化體(225)和野生型擬南芥(WT)在含180mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后的生長情況圖2C為在含不同濃度(0mM、180mM)NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后轉化體(225)和野生型擬南芥(WT)的存活率統(tǒng)計結果圖3為生長在土壤中的ST225轉化體(225)和野生型擬南芥經(jīng)不同濃度(0mM、200mM、250mM)NaCl脅迫處理5天后的生長情況圖4為生長在土壤中的ST225轉化體(225)和野生型擬南芥(WT)，經(jīng)不同濃度(0mM、200mM、250mM)NaCl脅迫處理8天后的蓮苔直徑比較結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、鹽芥耐鹽基因ST225的獲得一、鹽芥cDNA文庫的構建提取鹽芥總RNA，反轉錄得到鹽芥全基因組的cDNA，采用高通量構建載體的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，鄭文嶺，馬文麗；通路克隆系統(tǒng)DNA重組技術的新進展。中國生物工程雜志(2003)，第23卷第7期)將鹽芥cDNA先重組克隆到pDONR207載體(Invitrogen公司)中，得到Entry cDNA文庫，然后再用重組克隆的方法將整個cDNA文庫穿梭至含有35S啟動子的植物過量表達雙元載體pCB2004(物理圖譜如圖1所示)中，得到鹽芥cDNA文庫。上述重組反應完全按照Invitrogen公司提供的實驗指南進行。
二、用鹽芥cDNA文庫轉化野生型擬南芥將步驟一構建的鹽芥cDNA文庫穿梭到雙元載體pCB2004中，再電轉化至農(nóng)桿菌C58，篩選陽性重組子，采用擬南芥花絮浸花轉化的方法(floral dip method)(StevenJ，Clough and Andrew F.BentFloral dipa simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournalVolume 16Issue 6Page 735-December 1998)將陽性重組子大規(guī)模轉化擬南芥。
三、擬南芥耐鹽轉化體的篩選1、擬南芥轉化體庫的創(chuàng)建在土壤中大規(guī)模播種步驟二獲得的轉化有鹽芥cDNA文庫的擬南芥轉化體的種子，在種子發(fā)芽后約5天，表面噴灑濃度為0.2％的除草劑(glufosinate ammonium，商用名為Liberty，法國Aventis作物科學公司)進行篩選，以野生型擬南芥為對照。約1周后可以觀察到轉化體植株和野生型植株具有明顯差別，野生型植株在0.2％除草劑glufosinate條件下不能存活，而轉化體植物不受影響，可以正常生長。以200株轉化體植株為一單位進行收種。
2、高通量方法初篩耐鹽轉化體植株下述各實驗中所用的種子均用如下方法進行表面滅菌處理用50％消毒液(廣州藍月亮有限公司)在室溫下滅菌15分鐘，再用經(jīng)滅菌的純凈水沖洗4-5遍。
將經(jīng)消毒的步驟1收獲的種子在4℃下放置3天，以使種子發(fā)芽一致。然后將種子播種于MS基本培養(yǎng)基(含2％蔗糖，1.5％瓊脂粉，pH值5.8，高溫蒸汽滅菌15分鐘)上使其發(fā)芽，種子發(fā)芽生長條件為22℃，光照培養(yǎng)。發(fā)芽后，再將其播種于含有220mM NaCl和25mg/L除草劑glufosinate的MS基本培養(yǎng)基上高通量篩選耐鹽轉化體，每個15cm的培養(yǎng)皿播3000粒種子。待植株生長10天后，將存活下來的轉化體植株(既抗除草劑又耐鹽)移栽到土中，并單株收種。
3、耐鹽轉化體的復篩對每一可能的耐鹽轉化體，選取其大約25至30粒種子用上述步驟2的方法進行表面滅菌后，播種于不同濃度的含鹽MS基本培養(yǎng)基上，鹽濃度在0-220mM NaCl之間。種子生長約一周后進行觀察并記錄相應數(shù)據(jù)，觀察10天后，統(tǒng)計存活的植株數(shù)量，檢查存活植株數(shù)量和死亡植株數(shù)量之間比例，將存活植株移入含有25mg/L除草劑glufosinate的MS基本培養(yǎng)基上，1周后觀察小苗存活情況。如果小苗全部存活，表明上述耐鹽株系的耐鹽性狀和抗除草劑基因可能連鎖，符合篩選要求。最后，移栽以上耐鹽株系到土壤中，單株收種，將種子保存?zhèn)溆谩?br> 四、耐鹽基因ST225的獲得根據(jù)鹽芥cDNA在載體pCB2004中插入位點的上、下游序列設計引物擴增cDNA序列，引物序列如下Omega(上游引物)5’-TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA-3’attB2(下游引物)5’-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3’提取步驟三篩選得到的耐鹽轉化體的基因組DNA，并以此為模板，在引物Omega和attB2的引導下進行PCR擴增，50uL PCR擴增體系為0.25uL ExTaq聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)，2uL基因組DNA，10×PCR緩沖液5uL，dNTPs 100uM，上、下游引物各25uM，再用雙蒸水將反應體系補充至50uL。用PCR技術擴增轉入的鹽芥cDNA。PCR反應條件為95℃ 1min，66℃ 1min，72℃ 2min，共40個循環(huán)。反應結束后，以Omega作為測序引物對PCR產(chǎn)物進行測序，測序結果表明該基因具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由509個堿基組成，其編碼序列為自5’端第74-424位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質。將該耐鹽基因命名為ST225，該基因所編碼的蛋白命名為ST225。
實施例2、轉ST225基因的擬南芥在培養(yǎng)基上的耐鹽實驗用實施例1的方法構建ST225的過量表達載體，將ST225克隆入含有35S啟動子的過量表達雙元載體pCB2004中，得到ST225的過量表達載體，命名為pCB2004/ST225。經(jīng)測序鑒定正確后，將pCB2004/ST225用電轉化法轉化農(nóng)桿菌C58，篩選陽性重組子，再用擬南芥花絮浸花轉化的方法(floral dip method)轉化野生型擬南芥植株。然后對轉基因植株進行耐鹽實驗，方法為將轉基因種子分別播種于含0mM、120mM、150mM、180mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，以野生型擬南芥為對照，在常規(guī)條件下培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)芽及生長情況。結果在不含NaCl的普通MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)12天后，轉化體(225)生長狀況與野生型(WT)基本一致(如圖2A所示，黑線上方為野生型(WT)，下方為轉化體(225))；在180mM NaCl脅迫條件下，萌發(fā)12天后，野生型生長明顯受到抑制，而轉化體的生長狀況顯著優(yōu)于野生型(如圖2B所示，黑線上方為野生型(WT)，下方為轉化體(225))，表明耐鹽性增強。在含0mM、180mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后轉化體(225)和野生型(WT)的存活率統(tǒng)計結果如圖2C所示(*表示差異及顯著，P＜0.05，n＝143)，在含180mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上生長12天的轉化體(225))的存活率高于野生型(WT)。
實施例3、轉ST225基因的擬南芥在土壤中的耐鹽實驗將實施例2中獲得的ST225轉基因植株(225)和野生型擬南芥(WT)的種子播種于MS基本培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，待子葉打開后，將兩種擬南芥植株移至土壤中繼續(xù)生長，生長兩周左右(約10片葉)，各分三組，分別澆灌含0mM NaCl(對照)、200mMNaCl、250mM NaCl的水溶液，觀察并記錄其生長情況。經(jīng)上述不同濃度鹽脅迫處理5天后的植株生長情況如圖3所示(隔線上方為野生型(WT)，下方為轉化體(225))，在正常生長條件下(0mM NaCl)，轉化體(225)生長狀況與野生型(WT)基本一致；在鹽脅迫條件下，轉化體(225)明顯比野生型植株生長快。經(jīng)上述鹽脅迫處理8天后測定轉化體(225)和野生型(WT)的蓮苔直徑，結果如圖4所示(*表示差異達顯著，P＜0.05，n＝26)，與轉化體(225)相比，野生型(WT)植株的生長明顯受到抑制，其植株小于轉化體(225)。
序列表<160>2<210>1<211>509<212>DNA<213>十字花科鹽芥(Thellungiella halophila)<400>1ggggaccgac atccaagtct tctacatact tatcagaaaa aaattaatta gacaattgca 60acgactaaga gcaatgggtt ctctaatgtc aggatgggac tctccaccag cggatcctaa 225ttcagtgaaa aggtgcaagt cactaacaag agaagacatc gacgctttct ggaaagaaaa 180gaagaaaaat gaagaagaac atgttcaagc catttccaag ttggtagttc aggaggttgc 240ggaaagtcaa gcgcaagagg agaagataga agacgatcct tatgaaaacc aaagcaagaa 300aagtggatgg tggcaaagaa gcacctgggc gttcttgaat gagccgaggg aagaagaggg 360tcggccgaac aagtacgtgt cgcagttcaa agtggctcac atcgccaaaa gcgtgggcca 420gtaatgatac tattatgtaa tcactggcta atcacatgca tgtctacctg tgtgtgtgtg 480tgaattgtga ttagtcgtcc tttctggtg 509<210>2<211>116<212>PRT<213>十字花科鹽芥(Thellungiella halophila)<400>2Met Gly Ser Leu Met Ser Gly Trp Asp Ser Pro Pro Ala Asp Pro Asn1 5 10 15Ser Val Lys Arg Cys Lys Ser Leu Thr Arg Glu Asp Ile Asp Ala Phe20 25 30Trp Lys Glu Lys Lys Lys Asn Glu Glu Glu His Val Gln Ala Ile Ser35 40 45Lys Leu Val Val Gln Glu Val Ala Glu Ser Gln Ala Gln Glu Glu Lys
50 55 60Ile Glu Asp Asp Pro Tyr Glu Asn Gln Ser Lys Lys Ser Gly Trp Trp65 70 75 80Gln Arg Ser Thr Trp Ala Phe Leu Asn Glu Pro Arg Glu Glu Glu Gly85 90 95Arg Pro Asn Lys Tyr Val Ser Gln Phe Lys Val Ala His Ile Ala Lys100 105 110Ser Val Gly Gln11權利要求
1.鹽芥的一個耐鹽基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的耐鹽基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№1的DNA序列。
3.權利要求1所述耐鹽基因的編碼蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性作用的蛋白質。
4.根據(jù)權利要求3所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
5.含有權利要求1所述耐鹽基因的表達載體。
6.含有權利要求1所述耐鹽基因的轉基因細胞系。
7.含有權利要求1所述耐鹽基因的宿主菌。
8.一種培育耐鹽植物的方法，是利用植物表達載體將權利要求1所述的耐鹽基因導入植物細胞或組織，獲得對高鹽耐受力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述被轉化的植物宿主為水稻、小麥、大豆、油菜或擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于鹽芥的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與應用。其目的是提供鹽芥的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與其在培育耐鹽性提高植物中的應用。該基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID №2的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。編碼具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性作用的蛋白質。本發(fā)明的耐鹽基因將在培育耐鹽性增強的植物(特別是水稻、小麥等農(nóng)作物)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK1793365SQ200510115929
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權日2005年11月11日
發(fā)明者陳曦, 向成斌 申請人:中國科學技術大學