專利名稱：鹽芥的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中與抗脅迫相關(guān)的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及鹽芥中的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與其在培育耐鹽性提高植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
研究表明，擬南芥的一些近親具有極強(qiáng)的耐逆性，并且較適宜進(jìn)行遺傳操作。其中，鹽生植物—鹽芥與擬南芥極為相似，基因序列同源性可達(dá)70-90％，不僅具有遺傳學(xué)模式植物令人滿意的形態(tài)、生長特性及遺傳特點(diǎn)，還對海水的高鹽濃度具有較強(qiáng)的耐受能力。因此，鹽芥不但是一種可供研究植物自然耐鹽機(jī)制的優(yōu)異遺傳模式植物，更是一種分離優(yōu)異耐鹽相關(guān)基因的資源植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個鹽芥的耐鹽基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的耐鹽基因，名稱為ST120，來源于十字花科植物鹽芥(Thellungiella halophila)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由633個堿基組成，其編碼序列為自5’端第32-355位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明耐鹽基因所編碼的蛋白(ST120)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №2由107個氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增ST120中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
利用植物表達(dá)載體，將本發(fā)明的耐鹽基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，可獲得對高鹽耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其他的可參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆儲存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用ST120構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達(dá)啟動子等，它們可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明ST120的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥等單子葉植物，也可以是擬南芥、大豆、油菜等雙子葉植物、將本發(fā)明所提供的耐鹽基因ST120與擬南芥基因組基因進(jìn)行序列比對，結(jié)果該基因與擬南芥基因組中一個編碼Proline-rich蛋白的基因(GenBank登錄號At5g59170)具有較高的相似性(50％)，通過對轉(zhuǎn)化本基因后所得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行逆境脅迫試驗(yàn)，證明該基因轉(zhuǎn)入植物后可顯著提高轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性。本發(fā)明為人為控制植物中抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物(特別是水稻、小麥、油菜等農(nóng)作物)中發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為載體pCB2004的物理圖譜圖2A為轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥(WT)在含0mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后的生長情況圖2B為轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥(WT)在含150mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后的生長情況圖2C為在含不同濃度(0mM、150mM)NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥(WT)的存活率統(tǒng)計結(jié)果圖3為在土壤中生長兩周的ST120轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥經(jīng)不同濃度(0mM、200mM、250mM)NaCl脅迫處理8天后的生長情況圖4為在土壤中生長兩周的ST120轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥(WT)，經(jīng)不同濃度(200mM、250mM)NaCl脅迫處理8天與15天后的蓮苔直徑比較結(jié)果圖5為在土壤中生長兩周的ST120轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥(WT)，經(jīng)不同濃度(200mM、250mM)NaCl脅迫處理15天后產(chǎn)生的果莢數(shù)比較結(jié)果圖6為在土壤中生長兩周的ST120轉(zhuǎn)化體(120)和野生型擬南芥(WT)，經(jīng)不同濃度(200mM、250mM)NaCl脅迫處理15天后的死亡率比較結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、鹽芥耐鹽基因ST120的獲得一、鹽芥cDNA文庫的構(gòu)建提取鹽芥總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到鹽芥全基因組的cDNA，采用高通量構(gòu)建載體的方法(Gateway Technology)(汪宗桂，鄭文嶺，馬文麗；通路克隆系統(tǒng)DNA重組技術(shù)的新進(jìn)展。中國生物工程雜志(2003)，第23卷第7期)將鹽芥cDNA先重組克隆到pDONR207載體(Invitrogen公司)中，得到Entry cDNA文庫，然后再用重組克隆的方法將整個cDNA文庫穿梭至含有35S啟動子的植物過量表達(dá)雙元載體pCB2004(物理圖譜如圖1所示)中，得到鹽芥cDNA文庫。上述重組反應(yīng)完全按照Invitrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。
二、用鹽芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化野生型擬南芥將步驟一構(gòu)建的鹽芥cDNA文庫穿梭到雙元載體pCB2004中，再電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌C58，篩選陽性重組子，采用擬南芥花絮浸花轉(zhuǎn)化的方法(floral dip method)(StevenJ，Clough and Andrew F.BentFloral dipa simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournalVolume 16 Issue 6 Page 735-December 1998)將陽性重組子大規(guī)模轉(zhuǎn)化擬南芥。
三、擬南芥耐鹽轉(zhuǎn)化體的篩選1、擬南芥轉(zhuǎn)化體庫的創(chuàng)建在土壤中大規(guī)模播種步驟二獲得的轉(zhuǎn)化有鹽芥cDNA文庫的擬南芥轉(zhuǎn)化體的種子，在種子發(fā)芽后約5天，表面噴灑濃度為0.2％的除草劑(glufosinate ammonium，商用名為Liberty，法國Aventis作物科學(xué)公司)進(jìn)行篩選，以野生型擬南芥為對照。約1周后可以觀察到轉(zhuǎn)化體植株和野生型植株具有明顯差別，野生型植株在0.2％除草劑glufosinate條件下不能存活，而轉(zhuǎn)化體植物不受影響，可以正常生長。以200株轉(zhuǎn)化體植株為一單位進(jìn)行收種。
2、高通量方法初篩耐鹽轉(zhuǎn)化體植株下述各實(shí)驗(yàn)中所用的種子均用如下方法進(jìn)行表面滅菌處理用50％消毒液(廣州藍(lán)月亮有限公司)在室溫下滅菌15分鐘，再用經(jīng)滅菌的純凈水沖洗4-5遍。
將經(jīng)消毒的步驟1收獲的種子在4℃下放置3天，以使種子發(fā)芽一致。然后將種子播種于MS基本培養(yǎng)基(含2％蔗糖，1.5％瓊脂粉，pH值5.8，高溫蒸汽滅菌15分鐘)上使其發(fā)芽，種子發(fā)芽生長條件為22℃，光照培養(yǎng)。發(fā)芽后，再將其播種于含有220mM NaCl和25mg/L除草劑glufosinate的MS基本培養(yǎng)基上高通量篩選耐鹽轉(zhuǎn)化體，每個15cm的培養(yǎng)皿播3000粒種子。待植株生長10天后，將存活下來的轉(zhuǎn)化體植株(既抗除草劑又耐鹽)移栽到土中，并單株收種。
3、耐鹽轉(zhuǎn)化體的復(fù)篩對每一可能的耐鹽轉(zhuǎn)化體，選取其大約25至30粒種子用上述步驟2的方法進(jìn)行表面滅菌后，播種于不同濃度的含鹽MS基本培養(yǎng)基上，鹽濃度在0-220mM NaCl之間。種子生長約一周后進(jìn)行觀察并記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)，觀察10天后，統(tǒng)計存活的植株數(shù)量，檢查存活植株數(shù)量和死亡植株數(shù)量之間比例，將存活植株移入含有25mg/L除草劑glufosinate的MS基本培養(yǎng)基上，1周后觀察小苗存活情況。如果小苗全部存活，表明上述耐鹽株系的耐鹽性狀和抗除草劑基因可能連鎖，符合篩選要求。最后，移栽以上耐鹽株系到土壤中，單株收種，將種子保存?zhèn)溆谩?br> 四、耐鹽基因ST120的獲得根據(jù)鹽芥cDNA在載體pCB2004中插入位點(diǎn)的上、下游序列設(shè)計引物擴(kuò)增cDNA序列，引物序列如下Omega(上游引物)5’-TTTTTACAACAATTACCAACAACAACAA-3’attB2(下游引物)5’-TACAAGAAAGCTGGGTTTTTTTTTTTT-3’提取步驟三篩選得到的耐鹽轉(zhuǎn)化體的基因組DNA，并以此為模板，在引物Omega和attB2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50uL PCR擴(kuò)增體系為0.25uL ExTaq聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)，2uL基因組DNA，10×PCR緩沖液5uL，dNTPs 100uM，上、下游引物各25uM，再用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至50uL。用PCR技術(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)入的鹽芥cDNA。PCR反應(yīng)條件為95℃ 1min，66℃ 1min，72℃ 2min，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以O(shè)mega作為測序引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明該基因具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由633個堿基組成，其編碼序列為自5’端第32-355位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。將該耐鹽基因命名為ST120，該基因所編碼的蛋白命名為ST120。
實(shí)施例2、轉(zhuǎn)ST120基因的擬南芥在培養(yǎng)基上的耐鹽實(shí)驗(yàn)用實(shí)施例1的方法構(gòu)建ST120的過量表達(dá)載體，將ST120克隆入含有35S啟動子的過量表達(dá)雙元載體pCB2004中，得到ST120的過量表達(dá)載體，命名為pCB2004/ST120。經(jīng)測序鑒定正確后，將pCB2004/ST120用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58，篩選陽性重組子，再用擬南芥花絮浸花轉(zhuǎn)化的方法(floral dip method)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株。然后對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐鹽實(shí)驗(yàn)，方法為將轉(zhuǎn)基因種子分別播種于含0mM、120mM、150mM、180mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，以野生型擬南芥為對照，在常規(guī)條件下培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)芽及生長情況。結(jié)果在不含NaCl的普通MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)12天后，轉(zhuǎn)化體(120)生長狀況與野生型(WT)基本一致(如圖2A所示，黑線上方為野生型(WT)，下方為轉(zhuǎn)化體(120))；在150mM NaCl脅迫條件下，萌發(fā)12天后，野生型生長明顯受到抑制，而轉(zhuǎn)化體的生長狀況顯著優(yōu)于野生型(如圖2B所示，黑線上方為野生型(WT)，下方為轉(zhuǎn)化體(120))，表明耐鹽性增強(qiáng)。在0mM、150mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)12天后轉(zhuǎn)化體(120)和野生型(WT)的存活率統(tǒng)計結(jié)果如圖2C所示(*表示差異及顯著，P＜0.05，n＝112)，在含150mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上生長12天的轉(zhuǎn)化體(120))的存活率高于野生型(WT)。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)ST120基因的擬南芥在土壤中的耐鹽實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例2中獲得的STT120轉(zhuǎn)基因植株(120)和野生型擬南芥(WT)的種子播種于MS基本培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，待子葉打開后，將兩種擬南芥植株移至土壤中繼續(xù)生長，生長兩周左右(約10片葉)，各分三組，分別澆灌含OmM NaCl(對照)、200mMNaCl、250mM NaCl的水溶液，觀察并記錄其生長情況。經(jīng)上述不同濃度鹽脅迫處理8天后的植株生長情況如圖3所示(隔線上方為野生型(WT)，下方為轉(zhuǎn)化體(120))，在正常生長條件下(0mM NaCl)，轉(zhuǎn)化體(120)生長狀況與野生型(WT)基本一致；在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)化體(120)明顯比野生型植株生長快。經(jīng)上述鹽脅迫處理8天和15天后測定轉(zhuǎn)化體(120)和野生型(WT)的蓮苔直徑，結(jié)果如圖4所示(*表示差異達(dá)顯著，P＜0.05，n＝28)，與轉(zhuǎn)化體(120)相比，野生型(WT)植株的生長明顯受到抑制。經(jīng)上述鹽脅迫處理15天后統(tǒng)計轉(zhuǎn)化體(120)和野生型(WT)植株產(chǎn)生的果莢數(shù)，結(jié)果如圖5所示(*表示差異達(dá)顯著，p＜0.05，n＝24)，表明鹽脅迫對果莢的產(chǎn)量也有較顯著的影響，野生型植株產(chǎn)生的果莢數(shù)明顯少于ST120轉(zhuǎn)化體(120)。經(jīng)上述鹽脅迫處理15天后統(tǒng)計轉(zhuǎn)化體(120)和野生型(WT)植株的死亡率，結(jié)果如圖6所示(*表示差異達(dá)顯著，p＜0.05，n＝55)，表明在鹽脅迫條件下，ST120轉(zhuǎn)化體(120)的死亡率明顯低于野生型擬南芥植株。
序列表<160>2<210>1<211>633<212>DNA<213>十字花科鹽芥(Thellungiella halophila)<400>1gggaaaacta agagggaata tacaaattaa gatgaaatct tccgtagtct cttccatgct 60tgtcgttctt cttcttcttc tcgtgtttcc acatggcgaa caaagggagc tccagaaact 120tagtggagta gagacttacc atcctggtca agtgacggtc caagcaaggg gcattccggg 180aatccatatt cctgaaccaa aacctaatat tcatattcct cctaattttc agtttcctcc 240tcgtcgtcca acattgccgc ctggtactaa gtgcccgaac gggaaaaaat acgtggcatt 300ctgtaagaag tataaaatcc catttgcatc ccctccaccc ccaaggtttc tttgaggcaa 360atatcgacca ccctggccat tgacctccct ttaagcttcg aatgcgtcta tatatatatg 420tgtgtgtcca cttttcttac gttgtactgg tttggcttct gtgcttcttt tcattaccga 480atatgcagat tgggtgtttg tcatacattg tgttattgtc aatttgggtt tgtttctatt 540ttctgccgcc agtttaataa ttatgtttaa taagcggccg ctaatatata taaaatattg 600ttatatcaaa taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 633<210>2<211>107<212>PRT<213>十字花科鹽芥(Thellungiella halophila)<400>2Met Lys Ser Ser Val Val Ser Ser Met Leu Val Val Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Val Phe Pro His Gly Glu Gln Arg Glu Leu Gln Lys Leu Ser Gly20 25 30
Val Glu Thr Tyr His Pro Gly Gln Val Thr Val Gln Ala Arg Gly Ile35 40 45Pro Gly Ile His Ile Pro Glu Pro Lys Pro Asn Ile His Ile Pro Pro50 55 60Asn Phe Gln Phe Pro Pro Arg Arg Pro Thr Leu Pro Pro Gly Thr Lys65 70 75 80Cys Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Val Ala Phe Cys Lys Lys Tyr Lys Ile85 90 95Pro Phe Ala Ser Pro Pro Pro Pro Arg Phe Leu100 10權(quán)利要求
1.鹽芥的一個耐鹽基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№1的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述耐鹽基因的編碼蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性作用的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于所述蛋白具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
5.含有權(quán)利要求1所述耐鹽基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述耐鹽基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求1所述耐鹽基因的宿主菌。
8.一種培育耐鹽植物的方法，是利用植物表達(dá)載體將權(quán)利要求1所述的耐鹽基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，獲得對高鹽耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述被轉(zhuǎn)化的植物宿主為水稻、小麥、大豆、油菜或擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽芥的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供鹽芥的一個耐鹽基因及其編碼蛋白與其在培育耐鹽性提高植物中的應(yīng)用。該基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。編碼具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性作用的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的耐鹽基因?qū)⒃谂嘤望}性增強(qiáng)的植物(特別是水稻、小麥等農(nóng)作物)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK1793364SQ200510115928
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者陳曦, 向成斌 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)