專利名稱：用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)pcr檢測的引物序列和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的擴(kuò)增與檢測。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不斷商品化，其安全性問題一直被世人關(guān)注，并不斷發(fā)生爭議。為了保障人類的身體健康，消除消費(fèi)者顧慮，有利于國際貿(mào)易和商品流通，以歐盟為代表的很多國家，在經(jīng)歷了短暫的爭議后，對(duì)此類特殊產(chǎn)品都制定出安全管理?xiàng)l例，以便嚴(yán)格管理。歐洲、日本等多國還制定了相應(yīng)的限量法規(guī)。我國農(nóng)業(yè)部也于今年出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理辦法。然而，要使消費(fèi)者了解或接受轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，各項(xiàng)法規(guī)能得以實(shí)施，除了給以相關(guān)信息及增加透明度外，關(guān)鍵問題是能夠有相應(yīng)的科學(xué)檢測方法來分析與鑒別傳統(tǒng)產(chǎn)品與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。尤其面對(duì)國內(nèi)外貿(mào)易中對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的限量要求，更應(yīng)有相應(yīng)的、準(zhǔn)確地定量方法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，尤其是轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行定性、定量檢測。在目前國內(nèi)外常用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法中，主要是以核酸為基礎(chǔ)的PCR檢測方法。PCR方法又分為定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR已廣泛應(yīng)用于基于核酸的各個(gè)研究和臨床診斷等領(lǐng)域，該方法使用兩段(約17～20多個(gè)核苷酸)寡核苷酸作為反應(yīng)的引物，這兩段寡核苷酸引物的序列應(yīng)不發(fā)生互補(bǔ)作用。但它們可和稱為模板的待測DNA兩條鏈上在一定的位點(diǎn)分別發(fā)生互補(bǔ)。反應(yīng)液包括含有鎂離子的反應(yīng)緩沖液、4種單核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通過溫度的變化，DNA變性及退火，而合成兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)之間的DNA片斷。這樣的反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，使第一個(gè)循環(huán)產(chǎn)生的DNA片斷得以擴(kuò)增。經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106。用該方法檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品整個(gè)過程繁雜，操作步驟多，而且需要PCR后處理，如瓊脂糖凝膠電脈和溴化乙錠染色，紫外光觀察結(jié)果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所使用的染色劑溴化乙錠對(duì)人體又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過程又給污染和假陽性提供了機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響對(duì)結(jié)果的正確判斷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種用于轉(zhuǎn)基因棉花實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測的引物也可以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測，操作簡單、省時(shí)省方、具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽性的特點(diǎn)。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物序列是5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’，該引物的最小序列是5’-cg agt ttc-3’；下游引物序列是5’-aac caa tgc cac ccc act ga-3’，該引物的最小序列是5’-tgc cac c-3’；用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物序列是5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’，該引物的最小序列是5’-cgattc aga-3’；下游引物序列是5’-atc gac ctg cag ccc aag ct-3’，該引物的最小序列是5’-ctg cag ccc-3’。
用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物序列是5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’，該引物的最小序列是5’-aga tcgggg-3’；下游引物序列是5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’，該引物的最小序列是5’-gct aaa tgg-3’。
用于檢測棉花(籽)內(nèi)源基因(acpl)的上游引物序列是5’-att gtg atggga ctt gag gaa ga-3’，該引物的最小序列是5’-atg gga ctt-3’；下游引物序列是5’-ctt gaa cag ttg tga tgg att gtg-3’，該引物的最小序列是5’-g ttg tgatg-3’。
按上述的引物序列制成的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)及其加工產(chǎn)品實(shí)時(shí)PCR檢測SYBRGreen熒光體系。
SYBRGreen染料能選擇性結(jié)合雙鏈DNA，并且由此而發(fā)出熒光，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增加的同時(shí)，熒光信號(hào)隨之也增強(qiáng)，因此，通過實(shí)時(shí)追蹤熒光信號(hào)的強(qiáng)度就能精確計(jì)算出由單鏈寡核甘酸引物擴(kuò)增的雙鏈產(chǎn)物的數(shù)量，對(duì)于靶基因鑒定或少量反應(yīng)時(shí)，SYBRGreen染料是一種理想的化學(xué)試劑。更重要的是SYBRGreen染料在PCR反應(yīng)中所要求的極端溫度下同樣十分穩(wěn)定，通過分析目的產(chǎn)物的熔解曲線，使用SYBRGreen染料可有效區(qū)別特異性產(chǎn)物、非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體，以彌補(bǔ)其特異性差的缺點(diǎn)。SYBRGreen熒光體系不儀簡單實(shí)用，而且其特異性隨著所采用PCR引物的精心設(shè)計(jì)和篩選而得以保證，完全可以和熒光探針PCR媲美，具有較高的實(shí)用價(jià)值。
按上述引物序列制成的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)及其加工產(chǎn)品實(shí)時(shí)PCR檢測的試劑盒。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因樣花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，通過檢測作物本身所具有的內(nèi)源參照基因(EndogenousReference Gene)，如棉花(籽)acpl內(nèi)源基因，一方面可以測定檢查模板DNA的質(zhì)量，另一方面可以測定樣品中轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的總DNA模板量；通過檢測轉(zhuǎn)基因作物中轉(zhuǎn)入的外源基因，如MON531品系外源結(jié)構(gòu)基因、MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因和MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因，一方面可以測定是否有轉(zhuǎn)基因成分存在，另一方面可以測定樣品中轉(zhuǎn)基因作物的DNA模板量，通過建立轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)參照樣品的內(nèi)源參照基因與外源基因Ct值之差(ΔCt)與轉(zhuǎn)基因成分百分含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出樣品及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測的引物也可以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行定性檢測，具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)時(shí)PCR技術(shù)采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性。該技術(shù)巧妙地運(yùn)用了PCR技術(shù)的DNA高效擴(kuò)增的缺點(diǎn)，更重要的是SYBRGreen染料在PCR反應(yīng)中所要求的極端溫度下同樣十分穩(wěn)定，通過分析目的產(chǎn)物的熔解曲線，使用SYBRGreen染料可有效區(qū)別特異性產(chǎn)物、非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體，以彌補(bǔ)其特異性差，檢測技術(shù)快速和敏感，本發(fā)明使得檢測方法具有操作簡單、省時(shí)省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢測原理示意圖。
圖2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢測溶解曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不限于實(shí)施例。
實(shí)施例1用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系的SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，按常規(guī)引物制備合成方法制造，檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系外源結(jié)構(gòu)基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因MON531品系的外源結(jié)構(gòu)基因。
引物5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’、5’-aac caa tgc cac ccc act ga-3’。
試劑盒應(yīng)用該引物序列采用常規(guī)制法制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系的外源結(jié)構(gòu)基因的試劑盒。
實(shí)施例2用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON1445品系的SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因。
引物5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’、5’-atc gac ctg cag ccc aagct-3’。
試劑盒應(yīng)用該引物序列制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因的試劑盒。
實(shí)施例3用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON15985品系的SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因(轉(zhuǎn)基因成分)。
檢測基因MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因。
引物5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’、5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’。
試劑盒應(yīng)用該引物序列制成的用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因的試劑盒。
實(shí)施例4用于棉花(籽)SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)內(nèi)源基因。
檢測基因acpl基因。
引物5’-att gtg atg gga ctt gag gaa ga-3’、5’-ctt gaa cag ttg tga tgg attgtg-3’。
試劑盒應(yīng)用該引物序列制成的用于檢測棉花(籽)內(nèi)源acpl基因的試劑盒。
檢測主要儀器實(shí)時(shí)PCR儀、超凈工作臺(tái)、消毒滅菌鍋、制冰機(jī)、核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機(jī)，臺(tái)式小型離心機(jī)，Mini個(gè)人離心機(jī)、低溫冰箱，冷藏冷凍冰箱、純水器、雙蒸水器、旋渦震蕩器、微量進(jìn)樣器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
檢測主要試劑10×PCR緩沖液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、SYBRGreen、引物(按引物序列制成試劑盒)等。
SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR檢驗(yàn)所用引物序列如實(shí)施例1～4所述。
SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系
SYBRGreen實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)參數(shù)為
上機(jī)運(yùn)行按預(yù)先設(shè)定的樣品擺放順序?qū)CR反應(yīng)管依次擺放，上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免物質(zhì)泄漏污染儀器，開始運(yùn)行進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。
結(jié)果分析與計(jì)算定性分析
基線的設(shè)置實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)結(jié)束并分析后，應(yīng)設(shè)置無效基線范圍。無論采用任何熒光通道基線范圍選擇在3-20個(gè)循環(huán)；閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值＝40為準(zhǔn)。
結(jié)果判斷待測樣品外源基因檢測Ct值≥40，內(nèi)參照基因檢測Ct值23-30者，表明未檢出×××基因；待測樣品外源基因檢測Ct值28-34，內(nèi)參照基因檢測Ct值23-30者。表明檢出×××基因。
定量分析用EXCEL或其它方法計(jì)算數(shù)據(jù)，可以創(chuàng)建以DNA濃度(x)對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)Ct值(Y)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于樣品DNA的濃度，可以根據(jù)回歸方程logX＝Y(jié)-b/m計(jì)算(b為交叉點(diǎn)值，m為斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-內(nèi)源基因Ct值。將ΔCt值代入方程，即可得出樣品中某一外源基因的相對(duì)含量。
如圖2所示，外源基因出現(xiàn)PCR擴(kuò)增，表明該樣品檢測出了外源轉(zhuǎn)基因成分，即為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。未出現(xiàn)外源基因PCR擴(kuò)增，表明該樣品未檢測出外源轉(zhuǎn)基因成分。
權(quán)利要求
1.用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物的最大序列是5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’，最小序列是5’-cg agt ttc-3’；下游引物的最大序列是5’-aac caa tgc cac ccc act ga-3’，最小序列是5’-tgc cac c-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物序列是5’-tcc cat tcg agt ttc tca cgt-3’，下游引物序列是5’-aaccaa tgc cac ccc act ga-3’。
3.用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物的最大序列是5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’，最小序列是5’-cga ttc aga-3’；下游引物的最大序列是5’-atc gac ctg cag ccc aag ct-3’，最小序列是5’-ctgcag ccc-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物序列是5’-gga gta aga cga ttc aga tca aac ac-3’，下游引物序列是5’-atc gac ctg cag ccc aag ct-3’。
5.用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物的最大序列是5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’，最小序列是5’-aga tcg ggg-3’；下游引物的最大序列是5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’，最小序列是5’-gctaaa tgg-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因的上游引物序列是5’-gtt act aga tcg ggg ata tcc-3’，下游引物序列是5’-aag gtt gct aaa tgg atg gga-3’。
7.用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測棉花(籽)內(nèi)源基因(acp1)的上游引物的最大序列是5’-att gtg atg ggactt gag gaa ga-3’，最小序列是5’-atg gga ctt-3’；下游引物的最大序列是5’-ctt gaa cag ttg tga tgg att gtg-3’，最小序列是5’-g ttg tga tg-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列，其特征是用于檢測棉花(籽)內(nèi)源基因(acp1)的上游引物序列是5’-att gtg atg gga ctt gag gaa ga-3’，下游引物序列是5’-ctt gaa cag ttg tgatgg att gtg-3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列制成的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)及其加工產(chǎn)品實(shí)時(shí)PCR檢測SYBRGreen熒光體系。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列制成的用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)及其加工產(chǎn)品實(shí)時(shí)PCR檢測的試劑盒。
全文摘要
用于轉(zhuǎn)基因棉花(籽)實(shí)時(shí)PCR檢測的引物序列和試劑盒，給出檢測轉(zhuǎn)基因棉花(籽)MON531品系外源結(jié)構(gòu)基因、MON1445品系外源結(jié)構(gòu)基因、MON15985品系外源結(jié)構(gòu)基因和acp1內(nèi)源基因的引物序列，最大、最小及優(yōu)選序列，按引物序列制成的試劑盒，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測和定性檢測，具有靈敏度高、避免交叉污染造成假陽性的優(yōu)點(diǎn)。SYBR
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1706969SQ20051004640
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日
發(fā)明者曹際娟, 劉善斌, 邱馳 申請(qǐng)人:曹際娟, 劉善斌, 邱馳