專利名稱：一株用于生物脫硫的紅串紅球菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到一株新篩選的菌株紅串紅球菌。該紅串紅球菌能夠選擇性斷裂含碳物質(zhì)的C-S鍵，保持含碳物質(zhì)的生熱值基本不變。本發(fā)明的紅串紅球菌特別適用于含有有機(jī)硫化合物的物質(zhì)中脫硫，如用于脫除含硫的煤炭或原油及其餾分中的硫。
背景技術(shù)：
硫元素是石油中繼碳元素和氫元素之后的第三大元素，并且它無(wú)論在已加工或未加工的燃油中都是不受歡迎的組分。石油中的硫元素造成石油精煉過(guò)程中對(duì)設(shè)備的腐蝕，另外，含硫燃油燃燒產(chǎn)生的SO2會(huì)造成環(huán)境污染。環(huán)境部門對(duì)石油產(chǎn)品如汽油與柴油中硫含量的管制標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格。為了凈化空氣，成品汽油與柴油中允許的硫含量急劇下降。
無(wú)機(jī)的硫鐵礦硫和有機(jī)硫各占煤炭的3.5％(w/w)。硫鐵礦硫相對(duì)容易被脫除。微生物如真菌(HE De-wen，CHAI Li-yuan，SONG Wei-feng，″ExperimentalResearch on Factors Affecting Desulfurization Mechanism of Fungi，″EnvironmentalScience and Technology，27(1)5-6)等通過(guò)氧化或還原方式代謝無(wú)機(jī)硫和有機(jī)硫?yàn)樗苄粤蛩猁}。HE De-wen等人報(bào)道的真菌能夠利用無(wú)機(jī)的硫鐵礦硫化合物作為能源，并且在2天內(nèi)脫除煤炭中總硫量的43.75％，無(wú)機(jī)硫含硫的54.84％。玫瑰色紅球菌ITGS8能夠在96小時(shí)內(nèi)脫除Mengen褐煤中55.2％的硫酸鹽硫，20％的硫鐵礦硫，23.5％的有機(jī)硫，和30.2％的總硫含量(Bozdemir，T.O.，Durusoy，T.，Erincin，E.，and Yurum，Y.1996.Biodesulfurization of Turkish lignites.l.Optimization of the growth parameters of Rhodococcus rhodochrous，asulfur-removing bacterium.Fuel，75(3)1596-1600)。
Kodama等人曾在1973年報(bào)道一個(gè)在有氧條件下，通過(guò)“kodama”途徑裂解二苯并噻吩(DBT)導(dǎo)致DBT芳香環(huán)斷裂的轉(zhuǎn)化過(guò)程(Kodama K.，Umehara K.，Shimizu K.，Nakatanni S.，Minoda Y.，Yamada K.1973.Identification of microbialproducts from dibenzothiophene and its proposed oxidation pathway.Agr.Biol.Chem.3745-50)，但是在這個(gè)過(guò)程中DBT的硫元素并沒(méi)有被釋放出來(lái)，“kodama”途徑見(jiàn)圖1。Van Afferden M等人也在1990年報(bào)道了一個(gè)利用DBT作為單一碳源、硫源與能源的特異性路徑(Van Afferden M.，Schacht S.，Klein J.，Trüper H.G.1990.Desulfurization of dibenzothiophene by Brevibacterium sp.DO.Arch.Microbiol.153324-328)。這兩個(gè)路徑都導(dǎo)致了芳香環(huán)中C-C鍵的斷裂，造成燃油中燃燒熱值降低，因此這兩個(gè)代謝途徑都不是在BDS過(guò)程中希望利用的路徑。
Kilbane等人1989年在Rhodococcus rhodochrous IGTS8(US 5,002,888)和Bacillus sphaericus strain ATCC No.53969(US 5,104,801)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)選擇性斷裂C-S鍵的路徑，命名為“4S”路徑。Rhodococcus rhodochrous IGTS8能夠執(zhí)行一個(gè)針對(duì)雜環(huán)分子，如噻吩、硫化物、二硫化物、硫醇、亞砜和砜中的硫原子的選擇性逐步氧化過(guò)程，而碳骨架不被代謝(Kayser K.J.，Bielaga-Jones B.A.，Jackowski K.，Odusan O.，Kilbane J.J.1993.Utilization of organosulfur compoundsby axenic and mixed cultures of Rhodococcus rhodochrous IGTS8.J.Gen.Microbiol.1393123-3129)。特別是通過(guò)“4S”途徑Rhodococcus rhodochrous IGTS8能夠降解DBT產(chǎn)生2-羥基聯(lián)苯(2-HBP)和硫酸鹽(Gallagher J.R.，Olson E.S.，StanleyD.C.1993.Microbial desulfurization of dibenzothiophenea sulfur specific pathway.FEMS Microbiol.Lett.10731-36)，“4S”途徑見(jiàn)圖2。
Kilbane等人公布了他們的工作之后各國(guó)科技工作者又先后篩選出一大批與IGTS8相似的能夠選擇性斷裂有機(jī)硫化合物中C-S的菌株，這些菌株如有Sphingomonas sp.Strain AD109(US 5,132,219)，Norcardia sp.CKYS2(US6,197,570)，Gordona sp.CYKS1(US 6,204,046)，Mycobacterium(CN 1379084A)，Pseudomonas delafildii R-8(CN 1386847A)等等。這些菌株都不屬于紅球菌，當(dāng)然屬于紅球菌的菌株也有報(bào)道，如中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所緱仲軒等人篩選出的紅平紅球菌LSSE-1(CN 1418948A)。紅平紅球菌LSSE-1能夠?qū)Ｒ恍詳嗔延袡C(jī)硫化合物中的C-S鍵，對(duì)礦質(zhì)燃料如石油，煤等脫硫不損失燃燒熱值，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。利用紅平紅球菌LSSE-1制備的生物催化劑能夠?qū)託渚撇裼瓦M(jìn)行深度脫硫，從263ppm降低到50ppm以下。LSSE-1在以DBT為單一硫源的基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)84h達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，菌體濃度為4.18OD(600nm處，下同)，168h達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌體濃度為5.87OD，生長(zhǎng)84h和168h的細(xì)胞的比脫硫活力分別為0.22和0.14mg(S)·g-1(DCW)·h-1(李珊，邢建民，緱仲軒等人，紅平紅球菌LSSE8-1的培養(yǎng)及其對(duì)二苯并噻吩中硫元素脫除的影響，過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2(3)257-261)。
雖然已經(jīng)分離出很多能夠用于燃油BDS過(guò)程的菌株，但是還有很多限制因素阻礙了石油BDS過(guò)程的商業(yè)化應(yīng)用。這些限制因素例如有用于脫硫的菌株生長(zhǎng)周期太長(zhǎng)，脫硫菌株的專一催化活性不夠高，脫硫過(guò)程中產(chǎn)生的硫酸鹽嚴(yán)重的抑制生物催化劑的活性，以及石油對(duì)脫硫菌株的毒性縮短了生物催化劑的壽命等等。
因此迫切需要一株具有增強(qiáng)的專一性催化活性，和增強(qiáng)的催化穩(wěn)定性的菌株用于生物脫硫過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服以往的脫硫菌株的缺點(diǎn)，提供一株從被石油污染的土壤中新篩選出的，生長(zhǎng)周期短、脫硫活性高、同時(shí)還能耐受高濃度硫酸根離子、具有良好的耐油性，以及催化活性穩(wěn)定的能專一性斷裂含有機(jī)硫的化合物中C-S鍵的菌株。以及該菌株在含硫的煤炭或原油及其餾分脫硫中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種用于生物脫硫的紅串紅球菌紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)FSD-2，2004年10月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC NO.1209。
本發(fā)明提供的紅串紅球菌革蘭氏染色為陽(yáng)性；細(xì)胞形態(tài)多樣性，多數(shù)為桿狀；菌落顏色為橘紅色。
本發(fā)明提供的紅串紅球菌的16SrRNA基因序列為TGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCCTATCGCATGGTGGGTGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCCTTTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGAACTGGAATTCCTGGGGTAACA本發(fā)明紅串紅球菌FSD-2作為生物催化劑對(duì)所有含硫化合物如原油、柴油、汽油、煤炭等進(jìn)行脫硫處理方法。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2無(wú)論是生長(zhǎng)細(xì)胞，休止細(xì)胞，細(xì)胞抽提液，以及細(xì)胞中與生物脫硫有關(guān)的酶的提取液都可以用于所有含硫化合物如原油、柴油、汽油、煤炭等的脫硫處理。
本發(fā)明紅串紅球菌FSD-2制備的休止細(xì)胞在4℃條件可以長(zhǎng)期保存并保持脫硫活性。
本發(fā)明提供的紅串紅球菌FSD-2主要應(yīng)用于含硫化合物如石油、煤炭等的脫硫，含硫化合物中的硫元素為有機(jī)硫或無(wú)機(jī)硫。本發(fā)明提供的紅串紅球菌可利用的硫源廣泛，如可以利用硫酸鹽、磺酸鹽、砜類、噻吩及其衍生物、苯并噻吩及其衍生物以及二苯并噻吩(DBT)及其衍生物作為單一硫源生長(zhǎng)，見(jiàn)圖4。本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2對(duì)含硫有機(jī)物如DBT及其衍生物中的C-S鍵進(jìn)行專一性降解，不破壞烴結(jié)構(gòu)中的C-C鍵，因此不損失燃料的燃燒值。本發(fā)明紅串紅球菌FSD-2的生長(zhǎng)周期短、脫硫活性高、同時(shí)還能耐受高濃度硫酸根離子、具有良好的耐油性。


圖1是DBT降解的“kodama”途徑。
圖2是R.erythropolis IGTS8降解DBT的“4S”途徑。
圖3是Rhodococcus erythropolis FSD-2在平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)。
圖4是FSD-2菌株以不同含硫化合物為單一硫源生長(zhǎng)時(shí)的菌體濃度，其中T、BT、TSA、MTP、MT、DMT、TXTO、DMDBT、MBT、DBT分別代表噻吩、苯并噻吩、鄰甲苯磺酸、2-甲基硫茚、2-甲基噻吩、2，5-二甲基噻吩、噻吩-9-酮、4，6-二甲基二苯并噻吩、3-甲基苯并噻吩和二苯并噻吩。
圖5是R.erythropolis FSD-2菌株與相關(guān)菌株基于16SrRNA的進(jìn)化樹(shù)。
圖6是柴油經(jīng)過(guò)紅串紅球菌FSD-2處理之前后含硫經(jīng)合物含量的變化關(guān)系。
圖7是FSD-2對(duì)DBT代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。
圖8是HBP濃度與OD關(guān)系曲線。
圖9是FSD-2降解DBT生成2-HBP與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系。
圖10是1～3號(hào)精制柴油深度生物脫硫前后的GC-SCD圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2是以山東孤島油田采取的被石油污染的土壤為菌源，DBT作為選擇壓力分離出的一株能夠?qū)Ｒ恍詳嗔袲BT中C-S鍵的菌株，其生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 紅串紅球菌FSD-2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”鑒定，該菌株屬于紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，命名為FSD-2。
圖3為該紅串紅球菌在FMAD瓊脂平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)。FMA培養(yǎng)基配方5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/l KH2PO4、0.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/l FeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/lNaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對(duì)氨基甲苯和0.5mg/l VB12；FMAD培養(yǎng)基即FMA培養(yǎng)基中加入適量DBT，如0.1～10mmol/l。
利用Vector NTI Suite 8軟件對(duì)紅串紅球菌FSD-2的16SrRNA基因分別與玫瑰色紅球菌IGTS8(US 5,104,801)以及紅平紅球菌LSSE8-1(CN 1418948A)的16SrRNA基因進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果FSD-2與IGTS8的同源性為98.7％，與LSSE8-1的同源性為97.2％，可見(jiàn)FSD-2菌株與IGTS8和LSSE8具有較高的同源性，同屬于紅球菌，但同時(shí)也具有明顯的差別，顯然并非相同菌株。
通過(guò)在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)網(wǎng)頁(yè)的Blast分析，對(duì)紅串紅球菌FSD-2菌株的16SrRNA基因在國(guó)際Genbank庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，得到101個(gè)菌株與本發(fā)明的菌株FSD-2具有相似性，其中絕大多數(shù)為紅球菌或其衍生菌株，同源性在97％～99％之間，圖5為R.erythropolis FSD-2菌株與相關(guān)菌株基于16SrRNA的進(jìn)化樹(shù)。FSD-2與相關(guān)菌株親緣關(guān)系很近，但是與每支菌卻不完全相同，說(shuō)明本發(fā)明菌株為首次被分離鑒定。
本發(fā)明的菌株紅串紅球菌FSD-2能夠在豐富培養(yǎng)基，如LB中迅速生長(zhǎng)，也可以在加有無(wú)機(jī)硫源如Na2SO4，或有機(jī)硫源如DBT的FMA中生長(zhǎng)。菌株FSD-2在pH4～9均能良好生長(zhǎng)，最佳pH6～8；生長(zhǎng)溫度28～42℃，最佳溫度30～32℃；屬于好氧菌。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2幾乎能夠降解所有的含硫化合物，如磺酸鹽、砜類、噻吩及其衍生物、苯并噻吩及其衍生物以及二苯并噻吩(DBT)及其衍生物，釋放其中的硫元素為無(wú)機(jī)硫化合物溶解于水相中。圖6是一種經(jīng)過(guò)加氫處理的柴油利用紅串紅球菌FSD-2處理前后含硫化合物含量的變化圖。
本發(fā)明提供的以紅串紅球菌FSD-2為生物催化劑的生物脫硫方法是(1)生長(zhǎng)細(xì)胞脫硫利用紅串紅球菌FSD-2接種于無(wú)硫礦質(zhì)培養(yǎng)基FMA中，并加入適量的需進(jìn)行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭作為單一硫源，紅串紅球菌FSD-2邊生長(zhǎng)邊對(duì)底物脫硫；(2)休止細(xì)胞脫硫利用FMAD培養(yǎng)基(FMA培養(yǎng)基中加入適量DBT)或豐富培養(yǎng)基如LB培養(yǎng)基培養(yǎng)紅串紅球菌FSD-2到對(duì)數(shù)期末期，收集細(xì)菌，然后利用0.85％的生理鹽水洗滌兩次，重新懸浮于pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，加入1％的葡萄糖，做成休止細(xì)胞，再往休止細(xì)胞中加入適量的需進(jìn)行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭培育一段時(shí)間，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)這些化合物的脫硫；(3)固定化細(xì)胞脫硫按照(2)中制備休止細(xì)胞的方法制備紅串紅球菌FSD-2菌株的菌體懸浮液，利用海藻酸鈉、聚丙烯酰氨凝膠、瓊脂糖、殼聚糖等制備成含有FSD-2菌株的珠子，以這些珠子作為生物催化劑可以對(duì)需進(jìn)行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭進(jìn)行脫硫；(4)細(xì)胞抽提液脫硫按照(2)中制備休止細(xì)胞的方法制備紅串紅球菌FSD-2菌株的菌體懸浮液，利用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片，得到的細(xì)胞抽提液中加入適量需進(jìn)行生物脫硫處理的含硫化合物如DBT，石油或煤炭進(jìn)培育合適的時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)生物脫硫。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2耐油性強(qiáng)。菌體濃度為11.37g(DCW)·l-1的休止細(xì)胞，按油水比(OWR)2∶5加入柴油，對(duì)柴油進(jìn)行生物脫硫處理，30℃培育12小時(shí)，平均比脫硫活性為0.7798mg(S)·g-1(DCW)·h-1，比OWR為1∶5時(shí)平均比脫硫活力的0.6491mg(S)·g-1(DCW)·h-1還高20.14％。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2催化活性穩(wěn)定。利用休止細(xì)胞對(duì)柴油脫硫，OWR為1∶5時(shí)，經(jīng)過(guò)處理柴油18小時(shí)后的細(xì)胞的脫硫活性與處理柴油3小時(shí)后的細(xì)胞的脫硫活性僅降低了0.0654mg(S)·g-1(DCW)·h-1。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2能夠耐受高濃度的硫酸鹽。利用休止細(xì)胞對(duì)柴油脫硫，OWR為1∶5，加入Na2SO4到終濃度為20mM時(shí)，30℃培育12小時(shí)，平均比脫硫活性為0.6231mg(S)·g-1(DCW)·h-1，比未加入Na2SO4的休止細(xì)胞處理柴油時(shí)比脫硫活力僅降低4％。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2的休止細(xì)胞在4℃條件保存1個(gè)月，比脫硫活力在0.7147～0.8595mg(S)·g-1(DCW)·h-1之間，變化不大，便于保藏。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2的生長(zhǎng)周期短，該菌株對(duì)數(shù)中后期培養(yǎng)物以10％接種量接入到FMAD培養(yǎng)基中，24小時(shí)即可到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期菌體濃度為11.8OD，即3.7g(DCW)·l-1，比生長(zhǎng)速率0.1542g(DCW)·l-1·h1。
本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2對(duì)含硫化合物降解后不斷裂碳骨架，因此對(duì)烴類結(jié)構(gòu)影響不大，不損失燃燒值，表2是利用MS-GC分析法測(cè)定的紅球菌FSD-2的休止細(xì)胞處理前后柴油中各種烴類含量百分比變化。
表2 紅球菌FSD-2的休止細(xì)胞處理前后柴油中各種烴類含量百分比變化
實(shí)施例1FSD-2菌株的篩選從山東孤島油田附近采取被石油污染的土壤樣品，經(jīng)過(guò)一個(gè)三步驟過(guò)程篩選分離純化對(duì)石油選擇性脫硫的微生物。第一步，加入0.5g被石油污染的土壤樣品到50ml含有終濃度為1mmol/l DBT的無(wú)硫基本培養(yǎng)基FBM中(FBM培養(yǎng)基含有10.0g/l葡萄糖，2.0g/l NH4Cl，6.3g/l KH2PO4，8.0g/l K2HPO4，0.2g/lMgCl2·6H2O，等等，含有1mmol/l DBT的FBM培養(yǎng)基為FBMD培養(yǎng)基)，30℃振蕩培養(yǎng)5天，以10％接種量轉(zhuǎn)接到FBMD培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)2天，反復(fù)轉(zhuǎn)接2-3次。第二步，經(jīng)過(guò)如此2-3次富集培養(yǎng)后，取1ml培養(yǎng)物，于3000rpm離心5min，取上清0.5ml做Gibb’s分析(DBT經(jīng)“4S”途徑降解后，生成的產(chǎn)物2-HBP與2，6-二氯醌-4-亞胺在堿性環(huán)境下反應(yīng)生成蘭色化合物)。第三步，把Gibb’s反應(yīng)成蘭色的培養(yǎng)物取出100μl，涂于FBMD瓊脂平板上，30℃靜置培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落按上述方式在FBMD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌株培養(yǎng)物做Gibb’s分析，有蘭色反應(yīng)的菌株培養(yǎng)物則表明該菌株有很大可能性能夠?qū)Ｒ贿x擇性斷裂DBT中的C-S鍵，并生成了2-HBP。
一共挑選了500株菌株，篩選得到1株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，對(duì)DBT具有專一性脫硫能力的紅串紅球菌FSD-2，并于2004年10月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC NO.1209。
實(shí)施例2FSD-2菌株代謝物分析挑取FMAD瓊脂斜面培養(yǎng)的FSD-2菌株，接種到50ml FMAD液體培養(yǎng)基中。FMAD液體培養(yǎng)基的成分5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/l KH2PO4、0.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度1.0mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/l FeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/lCuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對(duì)氨基甲苯和0.5mg/l VB12。30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24-48小時(shí)，取10ml培養(yǎng)物，加入2ml二氯甲烷萃取培養(yǎng)物中的代謝產(chǎn)物，萃取液采用PE Autosystem GC/Q-Mass910氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，見(jiàn)圖7。DBT經(jīng)過(guò)紅串紅球菌FSD-2降解后，最終被轉(zhuǎn)化為2-HBP，這與“4S”途徑的最終產(chǎn)物一致，說(shuō)明該菌株通過(guò)C-S鍵斷裂方式降解DBT。
實(shí)施例3FSD-2菌株生長(zhǎng)細(xì)胞降解DBT挑取FMAD瓊脂斜面培養(yǎng)的FSD-2菌株，接種到50ml FMAD液體培養(yǎng)基中。FMAD液體培養(yǎng)基的成分5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/l KH2PO4、00.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度0.5mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/l FeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對(duì)氨基甲苯和0.5mg/l VB12。30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，定期取樣做Gibb’s分析。Gibb’s分析方法如下培養(yǎng)物于5000轉(zhuǎn)/分離心，取上清0.5ml，加入3.5ml pH10的0.05M硼砂-0.2N NaOH緩沖液調(diào)pH8.0以上，加入10μl 1％的2，6-二氯醌-4-亞胺(Gibb’s試劑)，30℃反應(yīng)20分鐘，利用可見(jiàn)分光光度計(jì)于590nm測(cè)定吸光度。吸光度值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)即可得到培養(yǎng)物中HBP的濃度。本發(fā)明的紅串紅球菌FSD-2培養(yǎng)60h后，F(xiàn)MAD培養(yǎng)基中的0.5mmol/l DBT全部降解，見(jiàn)圖9。
實(shí)施例4FSD-2菌株休止細(xì)胞對(duì)精制柴油深度脫硫挑取FMAD瓊脂斜面培養(yǎng)的FSD-2菌株，接種到50ml FMAD液體培養(yǎng)基中。FMAD液體培養(yǎng)基的成分5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/l KH2PO4、00.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度0.2mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/l FeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對(duì)氨基甲苯和0.5mg/l VB12。30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24-48小時(shí)，按10％接種量轉(zhuǎn)接同樣的FMAD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中后期，離心收集菌體，菌體用0.85％生理鹽水洗滌兩次，在用pH7.0的磷酸緩沖液重新懸浮到菌體濃度為12g(DCW)·l-1的懸浮液，加入1％(w/v)的葡萄糖作為能源，即制備成可用于柴油生物脫硫的休止細(xì)胞。按OWR為1∶5加入精制柴油，30℃，150轉(zhuǎn)/分培育12小時(shí)，回收柴油，采用庫(kù)侖儀分析柴油中的總硫含量，見(jiàn)表3。
表3 FSD-2休止細(xì)胞對(duì)精制柴油深度脫硫前后總硫含量

分別對(duì)1號(hào)，2號(hào)與3號(hào)精制柴油進(jìn)行了GC-SCD分析，三個(gè)精制柴油樣品深度脫硫前后的含硫化合物分布見(jiàn)圖10。
實(shí)施例5FSD-2菌株休止細(xì)胞對(duì)加氫汽油深度脫硫挑取FMAD瓊脂斜面培養(yǎng)的FSD-2菌株，接種到50ml FMAD液體培養(yǎng)基中。FMAD液體培養(yǎng)基的成分5g/l葡萄糖、2g/l NH4Cl、14.04g/l Na2HPO4、2.24g/l KH2PO4、00.2g/l MgCl2·6H2O，微量元素溶液母液和維生素溶液母液的加入量各為1.0ml/l，DBT終濃度0.2mmol/l，pH值7.0～7.2。微量元素母液含有0.5g/l FeCl2·4H2O、0.5g/l ZnCl2、0.5g/l MnCl2·4H2O、0.1g/l NaMoO4·2H2O、0.05g/l CuCl2、0.05g/l NaWO4·2H2O和120mmol/l HCl。維生素母液含有400mg/l泛酸鈣、200mg/l肌醇、400mg/l煙酸、400mg/l鹽酸吡哆醇、200mg/l對(duì)氨基甲苯和0.5mg/l VB12。30℃，150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24-48小時(shí)，按10％接種量轉(zhuǎn)接同樣的FMAD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中后期，離心收集菌體，菌體用0.85％生理鹽水洗滌兩次，在用pH7.0的磷酸緩沖液重新懸浮到菌體濃度為4g(DCW)·l-1的懸浮液，加入1％(w/v)的葡萄糖作為能源，即制備成可用于生物脫硫的休止細(xì)胞。按OWR為1∶5加入加氫汽油，30℃，150轉(zhuǎn)/分培育12小時(shí)，回收汽油，采用庫(kù)侖儀分析汽油中的總硫含硫?？偭蚝繛?35μg·ml-1的加氫汽油，經(jīng)16h脫硫后，總硫含量降為218μg·ml-1，比脫硫活力為0.6879mg(S)·g-1(DCW)·h-1。
權(quán)利要求
1.一株用于生物脫硫的紅串紅球菌，紅串紅球菌Rhodococcus erythropolisFSD-2，2004年10月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)為CGMCC NO.1209。
2.按照權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌，其特征在于該菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性；細(xì)胞形態(tài)多樣性，多數(shù)為桿狀；菌落顏色為橘紅色。
3.按照權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌，其特征在于該紅串紅球菌的16SrRNA基因序列為TGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCCTATCGCATGGTGGGTGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCCTTTGTGAAAACCAGCAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGAACTGGAATTCCTGGGGTAACA。
4.按照權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌，其特征在于所述的該紅串紅球菌對(duì)含硫有機(jī)物中的C-S鍵進(jìn)行專一性降解，不破壞有機(jī)物中的C-C鍵。
5.按照權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌，其特征在于所述的該紅串紅球菌在pH4～9均能良好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度28～42℃，屬于好氧菌。
6.權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌在原油、柴油、汽油、煤炭進(jìn)行脫硫處理中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌生長(zhǎng)細(xì)胞在含硫化合物脫硫中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌休止細(xì)胞在含硫化合物脫硫中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌固定化細(xì)胞在含硫化合物脫硫中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的紅串紅球菌細(xì)胞抽提液在含硫化合物脫硫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株用于生物脫硫的紅串紅球菌及應(yīng)用。該菌株為紅串紅球菌Rhodococcus erythropolis FSD－2，于2004年10月11日保藏于CGMCC，保藏號(hào)為CGMCC NO.1209。本發(fā)明的紅串紅球菌FSD－2是以山東孤島油田采取的被石油污染的土壤為菌源，DBT作為選擇壓力篩選分離得到，生長(zhǎng)周期短、脫硫活性高、能耐受硫酸根離子、具有良好的耐油性，催化活性穩(wěn)定，能專一性斷裂含有機(jī)硫的化合物中C－S鍵。本發(fā)明還涉及一個(gè)利用紅串紅球菌FSD－2或其細(xì)胞抽提液作為生物催化劑對(duì)含有有機(jī)硫化合物的礦質(zhì)燃料進(jìn)行生物脫硫的方法。
文檔編號(hào)C12S1/02GK1854290SQ200510046350
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者張全, 唐似茵, 佟明友, 黎元生, 高會(huì)杰 申請(qǐng)人:中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院