專利名稱：牙鲆抗病相關(guān)mhc基因標記及其輔助育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類分子標記輔助育種技術(shù)，是一種能在魚類抗病品種培育中應(yīng)用的魚類抗病相關(guān)基因標記及其輔助育種方法。
背景技術(shù)：
病害是限制水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的瓶頸，由于缺乏優(yōu)良抗病品種，我國每年因病害給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成的直接經(jīng)濟損失高達上百億元人民幣。長期以來，由于忽視對魚類抗病機理和抗病功能基因的研究，缺少抗病相關(guān)的基因標記和分子標記，導致魚類抗病品種培育的研究進展緩慢，國內(nèi)外有關(guān)魚類抗病相關(guān)基因標記報道極少，也未見有關(guān)魚類抗病優(yōu)良品種培育的報道。
主要組織相容性復合體(MHC)基因編碼細胞表面糖蛋白，編碼的糖蛋白能與抗原多肽結(jié)合，通過與T細胞的相互作用，形成一個三元復合體，誘導和調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，激發(fā)機體特異性免疫反應(yīng)。一般來說，魚類的MHC I類分子結(jié)構(gòu)和哺乳動物相似，是由α鏈和β2-微球蛋白非共價連接形成的異二聚體。魚類的MHC II類分子是由α鏈和β鏈組成的異二聚體。自1990年Hashimoto et al.在硬骨魚-鯉魚中第一次報道了MHC基因至今，迄今已對大多數(shù)脊椎動物的MHC I、IIα、IIβ基因進行了克隆研究，如軟骨魚、硬骨魚、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類。研究表明MHC基因是目前已知的多態(tài)性最豐富的一個基因系統(tǒng)，存在大量的基因座位，每個基因座位又存在著大量的等位基因，這種多態(tài)性導致了每個個體都能結(jié)合和呈遞相當數(shù)量的與免疫反應(yīng)有直接功能相關(guān)性的多肽，其中多態(tài)性位點主要在外顯子2上。在脊椎動物的研究表明，MHC復合物在機體免疫反應(yīng)中起著重要的作用，而且特殊的MHC等位基因與機體抗病力有關(guān)，這在雞、鼠、羊和人等生物都有過相關(guān)報道。在魚類，目前已經(jīng)克隆了虹鱒(Grimholt et al.，2000)，真鯛(Chen et al.，2005)，溝鯰(Liu et al.，2004)和大菱鲆(Zhang and Chen，2005)等魚類的MHC基因，但有關(guān)MHC基因多態(tài)性與牙鲆等海水魚類抗病力的相互關(guān)系以及應(yīng)用抗病相關(guān)MHC基因標記進行抗病分子輔助育種的研究目前國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了篩選出牙鲆抗病相關(guān)的MHC基因標記，建立牙鲆分子標記輔助育種方法，為牙鲆抗病品種培育提供基因標記和技術(shù)方法。
本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下一、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記，包括1、MHC II B基因的克??；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選；二、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記輔助育種方法。
一、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記，包括1、牙鲆MHC II B基因的克?。?、抗病群體和敏感群體的制備；3、抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選1、牙鲆MHC II B基因的克隆包括cDNA克隆、基因組DNA序列的獲得、MHCIIB蛋白質(zhì)序列比對。
1).cDNA的擴增和克隆利用TRIzol試劑盒從魚類肝臟中提取總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈，并利用Smart RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)分別合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACEPCR反應(yīng)備用。根據(jù)不同物種MHC IIB的氨基酸序列的同源性設(shè)計簡并引物，得到一段MHC II B基因的cDNA片段。根據(jù)所得片段設(shè)計特異引物進行RACE PCR。獲得1182個堿基的MHCIIB全長cDNA序列，包括741個堿基的編碼區(qū)，33bp的5’不翻譯區(qū)和407bp的3’末端不翻譯區(qū)，并且具有一個脊椎動物典型的加尾信號AATAAA和27bp的PolyA尾巴。
2).基因組DNA序列的獲得根據(jù)其它親緣關(guān)系相近魚類的已知MHC II B外顯子和內(nèi)含子的分界位點設(shè)計特異引物進行內(nèi)含子的擴增。結(jié)果表明牙鲆MHC II B基因組與其它脊椎動物的MHC II B基因組結(jié)構(gòu)類似，包含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，PCR擴增獲得了全部4個內(nèi)含子，其中內(nèi)含子1，2，3和4的長度分別為96/84bp，392bp，85bp和109bp，而5個外顯子的長度分別為85bp，279bp，274bp，114bp和430bp。測定了全部5個外顯子和4個內(nèi)含子的序列，因此獲得了牙鲆MHC基因全長序列。
3).MHCIIB蛋白質(zhì)序列比對通過DNAMAN推測得到741bp編碼區(qū)所編碼的246bp的蛋白質(zhì)序列，其分子量為27.78KD，等電點為6.69。經(jīng)MEGA2.0軟件分析此蛋白質(zhì)序列與已知的其它脊椎動物(大西洋鮭、鯉魚、麗魚、人、鼠、鯊魚、虹鱒、真鯛、鱸魚和斑馬魚)的MHC II B的蛋白質(zhì)序列，結(jié)果表明牙鲆MHCIIB蛋白質(zhì)序列與真鯛、鱸魚和麗魚的親緣關(guān)系最近，與大西洋鮭、鯉魚和虹鱒的關(guān)系次之，與鯊魚、鼠和人的親緣關(guān)系最遠。
2、抗病群體和敏感群體的制備采用自然選擇和人工感染途徑獲得抗病群體和不抗病群體。在發(fā)病旺季，從養(yǎng)殖場收集發(fā)病后存活的個體，同時用病原菌感染收集來的魚苗，根據(jù)對病原菌感染的抵抗能力大小獲得抗病群體和不抗病群體兩個基礎(chǔ)群體。
3、抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選總共對84個個體的411個陽性克隆進行了測序，結(jié)果表明，共有13種不同的核苷酸序列，分別編碼13種不同的氨基酸序列(Paol-allele*aPaol-allele*m)。411個陽性克隆質(zhì)粒中的280/268bp的外源序列，去除中間的內(nèi)含子序列，共編碼61個氨基酸，通過與人類MHC II B的氨基酸序列比對，確定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸區(qū)段對應(yīng)位點為22～82，其中抗原結(jié)合位點分別為第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位。在總的編碼區(qū)內(nèi)，多態(tài)性位點13個，其中多肽結(jié)合位點為6個，占多態(tài)位點的46.15％。在13種不同的氨基酸序列(Paol-allele*a-Paol-allele*m)中，Paol-allele*a-Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m是抗病群體和感病群體所共有的。即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同時出現(xiàn)于抗病群體和不抗病群體，基因型g和h只出現(xiàn)在抗病群體中，而基因型l只出現(xiàn)在感病群體中。不同等位基因在抗病群體和感病群體中的分布。因此，基因型g和h被認為是抗病相關(guān)的MHC基因標記，而基因型l則被認為可能是疾病敏感相關(guān)的MHC基因標記。
二、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記輔助育種方法將只在抗病群體中出現(xiàn)的MHCIIB基因型作為抗病相關(guān)MHC基因標記，將攜帶這些抗病基因標記的魚進行繁殖，培育后代，分離后代中的MHCIIB基因，研究MHCIIB基因的多態(tài)性，同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病MHCIIB基因標記的遺傳規(guī)律及其與魚體抗病力的關(guān)系，從中篩選出既含有抗病MHCIIB基因標記，抗病力又提高的魚苗，進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。
本發(fā)明與已有技術(shù)對比其特點是本發(fā)明采用功能基因組技術(shù)，以牙鲆為材料首次建立了我國養(yǎng)殖魚類抗病相關(guān)MHC基因標記，初步建立了牙鲆抗病MHC基因標記輔助育種技術(shù)，該技術(shù)具有針對性強、選育效率高、選育周期短等特點，為魚類抗病品種培育開辟了新的分子育種技術(shù)途徑，適宜在所有養(yǎng)殖魚類上推廣應(yīng)用，對養(yǎng)殖魚類抗病品種培育具有重要意義和應(yīng)用價值。


圖1牙鲆MHC II B全基因序列及其推導的氨基酸序列圖2牙鲆MHC II B 13種不同的基因型圖3牙鲆MHC II B 13種不同的基因型在抗病群體和感病群體中的分布頻率以及相應(yīng)的卡方檢驗；
具體實施例方式下面以牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選及其輔助育種技術(shù)的建立為例，對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進行詳細說明。
一、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選，包括1、牙鲆MHC II B基因的克?。?、牙鲆抗病群體和敏感群體的制備；3、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選1.牙鲆MHC II B基因的克隆包括cDNA克隆、基因組DNA序列的獲得、MHCIIB蛋白質(zhì)序列比對。
1)、cDNA的擴增和克隆利用TRIzol試劑盒從牙鲆肝臟中提取總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈，并利用Smart RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)分別合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACEPCR反應(yīng)備用。根據(jù)不同物種MHC II B的氨基酸序列的同源性設(shè)計簡并引物dfMHCF(5’-GGTWTGTSGGWTACACTGA-3’)dfMHCR(5’-TCAGTGGYYGTSACATC AGA-3’)(W＝A/T；S＝G/C；Y＝C/T)，擴增得到牙鲆MHCII B基因的cDNA片段，其長度為295bp。根據(jù)所得片段設(shè)計基因特異引物GSP5’(5’-GTGACTTCCTG TCCGTCTCTTTGCCA-3’)和GSP3’(5’-GGAATCAAGAACGCTGAGAGGTGGAA-3’)，分別進行5’和3’RACE PCR，得到5’RACE約500bp的特異帶和3’RACE約950bp的特異帶。經(jīng)Dnaman分析去除重疊序列(260bp)和接頭序列后得到1182bp的全長cDNA序列，該MHC II B cDNA由741bp編碼區(qū)(其分子量為27.78KD，PH為6.69)，33bp的5’UTR區(qū)和407bp的3’UTR區(qū)組成，并且具有一個脊椎動物典型的加尾信號AATAAA和27bp的PolyA尾巴。
2)、基因組DNA序列的獲得根據(jù)其它親緣關(guān)系相近魚類的已知MHC II B外顯子和內(nèi)含子的分界位點設(shè)計特異引物進行了內(nèi)含子的擴增。與其它脊椎動物的MHC II B基因組結(jié)構(gòu)類似，牙鲆MHCIIB基因組包含有5個外顯子和4個內(nèi)含子。PCR擴增獲得了全部4個內(nèi)含子，其中內(nèi)含子1，2，3和4的長度分別為96/84bp，392bp，85bp和109bp，而5個外顯子的長度分別為85bp，279bp，274bp，114bp和430bp。測定了全部5個外顯子和4個內(nèi)含子的序列，因此獲得了牙鲆MHC基因全長序列(圖1)。
3)、MHCIIB基因序列比對通過DNAMAN推測得到了其中741bp編碼區(qū)所編碼的246bp的蛋白質(zhì)序列，其分子量為27.78KD，PH為6.69。經(jīng)MEGA 2.0分析此蛋白質(zhì)序列與已知的其它脊椎動物(大西洋鮭、鯉魚、麗魚、人、鼠、鯊魚、虹鱒、真鯛、鱸魚和斑馬魚)的MHC II B的蛋白質(zhì)序列相比，其同源性分別為57.6％，55.7％，66.4％，34.4％，34.0％，28.3％，55.3％，72.5％，72.1％和51.0％。此結(jié)果表明牙鲆的MHC II B序列與真鯛、鱸魚和麗魚的親緣關(guān)系較近，與大西洋鮭、鯉魚和虹鱒的關(guān)系次之，與鯊魚、鼠和人的親緣關(guān)系最遠。推測的牙鲆MHC II B氨基酸與魚類、鼠和人的MHC II B氨基酸序列比較結(jié)果，在24個與抗原多肽結(jié)合的相關(guān)氨基酸中，其中61位酪氨酸(Y)、63位酪氨酸(Y)、78位苯丙氨酸(F)、87位賴氨酸(K)、99位亮氨酸(L)、105位谷氨酸(E)、109位酪氨酸(Y)在魚類中基本保守，113位上的天冬氨酸(N)在魚類、鼠和人中都存在。
2.牙鲆抗病群體和敏感群體的制備采用自然選擇和人工感染途徑獲得抗病群體和不抗病群體。在牙鲆發(fā)病旺季，從養(yǎng)殖場收集發(fā)病后存活的個體，同時用鰻弧菌感染收集來的魚苗，根據(jù)對病原菌感染的抵抗能力大小獲得抗病群體和不抗病群體兩個基礎(chǔ)群體。
3.牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選總共對來自42個抗病個體和42個不抗病個體的411個MHC基因克隆進行了測序，結(jié)果表明，共有13種不同的核苷酸序列，分別編碼13種不同的氨基酸序列(Paol-allele*a Paol-allele*m)。在13種不同的核苷酸序列中，有5種不同的內(nèi)含子1序列，其中有12個核苷酸插入/缺失突變，2個核苷酸轉(zhuǎn)換和2個核苷酸顛換。84個個體中，有59個個體表現(xiàn)兩種或兩種以上不同序列，占總個體數(shù)的70.2％；59個個體中有5個個體表現(xiàn)出3個以上不同序列，占8.47％；5個個體中有1個個體表現(xiàn)5種不同序列，表明至少存在3個不同的MHCIIB位點。411個陽性克隆質(zhì)粒中的280/268bp的外源序列，去除中間的內(nèi)含子序列，共編碼61個氨基酸，通過與人類MHCIIB的氨基酸序列比對，確定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸區(qū)段對應(yīng)位點為22～82，其中抗原結(jié)合位點(PBR)分別為第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位。280/268bp的核苷酸序列中，32個核苷酸在外顯子1內(nèi)，編碼10個氨基酸，其中未發(fā)現(xiàn)有核苷酸變異；96/84bp的內(nèi)含子1序列；152bp的外顯子2序列，編碼51個氨基酸，有25個核苷酸變異位點，其中14個顛換，10個轉(zhuǎn)換，1個既有轉(zhuǎn)換又有顛換。在總的編碼區(qū)內(nèi)，多態(tài)性位點13個，其中多肽結(jié)合位點為6個，占多態(tài)位點的46.15％。
在13種不同的氨基酸序列(Paol-allele*a Paol-allele*m)中，Paol-allele*a Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m基因型是抗病群體和感病群體所共有。即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同時出現(xiàn)于抗病群體和不抗病群體，基因型g和h只出現(xiàn)在抗病群體中(其序列見圖2)，而基因型l只出現(xiàn)在感病群體中。不同等位基因在抗病群體和感病群體中的分布見圖3。經(jīng)Chi-square Test分析后，基因型d和l在感病群體中出現(xiàn)的頻率明顯高于在抗病群體中出現(xiàn)的頻率，而基因型g和h在抗病群體中出現(xiàn)的頻率明顯高于在感病群體中出現(xiàn)的頻率(表1)。因此，基因型g和h被認為是抗病相關(guān)的MHC基因標記，而基因型l則被認為可能是疾病敏感相關(guān)的MHC基因標記。
表1牙鲆MHC II B 13種基因型在抗病群體和感病群體中分布頻率的卡方檢驗

二、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記輔助育種方法將只在牙鲆抗病群體中出現(xiàn)的MHCIIB基因型g和h作為抗病相關(guān)基因標記，將攜帶這些抗病基因標記的魚進行繁殖，培育后代，分離后代個體中的MHCIIB基因，研究MHCIIB基因的多態(tài)性，同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病相關(guān)MHCIIB基因標記的遺傳規(guī)律及其與魚體抗病力的關(guān)系，從中篩選出既含有抗病相關(guān)MHCIIB基因標記，且抗病力又提高的魚苗，進行培育和繁殖后即可建立抗病優(yōu)良品種。
序列表<110>中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所<120>牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記及其輔助育種方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1864<212>DNA<213>牙鲆(Paralichthys olivaceus)<400>1acgcggggag tgttcgtcaa gtgaacagag gaacatggct tcattcatcc tcagcttctc 60cctcttcttc atcacggtct gcacagcagg taggatcaga acactgatca ctgatcaata120cactgatcaa tacactgatc aatacatgga tcattctctg actcgttttc ttgtctgctc180ttcagatgga tttctgcatt atacggtgac agactgtgag tttaactcct cgaagctgaa240cgacatcgag tacacacagt cttactatta caacaaactg gagatcgtca ggttcagcag300cagtgtgggg aagtacgttg gatacactga gtttggaatc aagaacgctg agaggtggaa360caatggtcca gaggtgatct ctagaagagg tgagaaggag agctactgct ttcacaacgt420tggaatcttc acagaatctg ctctgacgaa gtcaggtgag tgtgtgtgtg ttgtatgtgt480gtgagtgtgt gttgtatgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtttgga ttgtatgtgt540gagtgtgtgt tgtatgtgtt gtatgtgtgt gtgttgtgtg tgttcttcat gttccagatg600aaattcataa agaatctgat gagtcaaact tttatttatt gtctttgttt cctggaaata660gactcagctc ggtgtcacca cctgctggtc acacgctgta actacagccg ctgacactga720agcttctctt tgcttcttta tgaaataaaa taaaggatga aacaatcctc tgatgttttc780agttgatcaa tcgaaccaca gactaagatc cagttcacac ctgacgtgac caacatctgt840cttccagcca aaccctacgt caggcttaac tctgtggcgc ccccagctgg caaacatgcc900atgttggtct gcagcgtctt tgacttctac cccaaacgga tcaaagtgag ctggcaaaga960gacggacagg aagtcacctc tgatgtcact tccactgatg agctggcaga cggtgattgg 1020tactaccaga tccactccca cctggagtac atgcccaagt ctggagagaa gatttcctgt 1080gtggtggaac atgccagcct gagtaaacct ctgatcactg actggggtaa atacctgtct 1140
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85 90 95Val Gly Ile Phe Thr Glu Ser Ala Leu Thr Lys Ser Ala Lys Pro Tyr100 105 110Val Arg Leu Asn Ser Val Ala Pro Pro Ala Gly Lys His Ala Met Leu115 120 125Val Cys Ser Val Phe Asp Phe Tyr Pro Lys Arg Ile Lys Val Ser Trp130 135 140Gln Arg Asp Gly Gln Glu Val Thr Ser Asp Val Thr Ser Thr Asp Glu145 150 155 160Leu Ala Asp Gly Asp Trp Tyr Tyr Gln Ile His Ser His Leu Glu Tyr165 170 175Met Pro Lys Ser Gly Glu Lys Ile Ser Cys Val Val Glu His Ala Ser180 185 190Leu Ser Lys Pro Leu Ile Thr Asp Trp Asp Pro Ser Met Pro Glu Ser195 200 205Glu Arg Asn Lys Ile Ala Ile Gly Thr Ser Gly Leu Ile Leu Gly Leu210 215 220Thr Leu Ser Leu Ala Gly Phe Ile Tyr Tyr Lys Arg Lys Ala Gln Gly225 230 235 240Arg Asp Pro Gly Ser His24權(quán)利要求
1.一種牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記，其特征在在于它的技術(shù)內(nèi)容包括如下三個方面1)、牙鲆MHC II B基因的克??；2)、抗病群體和敏感群體的制備；3)、抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選；1)、牙鲆MHC II B基因的克隆利用TRIzol試劑盒從魚類肝臟中提取總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈，并利用Smart RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)分別合成5’-和3’-RACE-Ready-cDNA，RACE PCR反應(yīng)備用；根據(jù)不同物種MHC II B的氨基酸序列的同源性設(shè)計簡并引物，得到一段MHC II B基因的cDNA片段；根據(jù)所得片段設(shè)計特異引物進行RACEPCR；獲得1182個堿基的MHCIIB全長cDNA序列，包括741個堿基的編碼區(qū)，33bp的5’不翻譯區(qū)和407bp的3’末端不翻譯區(qū)，并且具有一個脊椎動物典型的加尾信號AATAAA和27bp的PolyA尾巴；根據(jù)其它親緣關(guān)系相近魚類的已知MHC II B外顯子和內(nèi)含子的分界位點設(shè)計特異引物進行內(nèi)含子擴增；結(jié)果表明牙鲆MHC II B基因組與其它脊椎動物的MHC II B基因組結(jié)構(gòu)類似，包含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，其中5個外顯子的長度分別為85bp，279bp，274bp，114bp和430bp，而內(nèi)含子1，2，3和4的長度分別為96/84bp，392bp，85bp和109bp；測定了全部5個外顯子和4個內(nèi)含子的序列，獲得了牙鲆MHCIIB全基因序列；牙鲆MHCIIB基因及其推導的氨基酸序列1 ACGCGGGGAGTGTTCGTCAAGTGAACAGAGGAAC35 ATGGCTTCATTCATCCTCAGCTTCTCCCTCTTCTTCATCACGGTCTGCACAGcaggtaggatcagaacactgatcactgatcaatacact1M A S F I L S F S L F F I T V C T125 gatcaatacactgatcaatacatggatcattctctgactcgttttcttgtctgctcttCAGATGGATTTCTGCATTATACGGTGACAGAC18A D G F L H Y T V T D215 TGTGAGTTTAACTCCTCGAAGCTGAACGACATCGAGTACACACAGTCTTACTATTACAACAAACTGGAGATCGTCAGGTTCAGCAGCAGT29 C E F N S S K L N D I E Y T Q S Y Y Y N K L E I V R F S S S305 GTGGGGAAGTACGTTGGATACACTGAGTTTGGAATCAAGAACGCTGAGAGGTGGAACAATGGTCCAGAGGTGATCTCTAGAAGAGGTGAG59 V G K Y V G Y T E F G I K N A E R W N N G P E V I S R R G E395 AAGGAGAGCTACTGCTTTCACAACGTTGGAATCTTCACAGAATCTGCTCTGACGAAGTCAGgtgagtgtgtgtgtgttgtatgtgtgtga89 K E S Y C F H N V G I F T E S A L T K S485 gtgtgtgttgtatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttggattgtatgtgtgagtgtgtgttgtatgtgttgtatgtgtgtgtgt575 tgtgtgtgttcttcatgttccagatgaaattcataaagaatctgatgagtcaaacttttatttattgtctttgtttcctggaaatagact665 cagctcggtgtcaccacctgctggtcacacgctgtaactacagccgctgacactgaagcttctctttgcttctttatgaaataaaataaa755 ggatgaaacaatcctctgatgttttcagttgatcaatcgaaccacagactaagatccagttcacacctgacgtgaccaacatctgtcttc845 cagCCAAACCCTACGTCAGGCTTAACTCTGTGGCGCCCCCAGCTGGCAaaCATGCCATGTTGGTCTGCAGCGTCTTTGACTTCTACCCCA109A K P Y V R L N S V A P P A G K H A M L V C S V F D F Y P935 AACGGATCAAAGTGAGCTGGCAAAGAGACGGACAGGAAGTCACCTCTGATGTCACTTCCACTGATGAGCTGGCAGACGGTGATTGGTACT138 K R I K V S W Q R D G Q E V T S D V T S T D E L A D G D W Y1025ACCAGATCCACTCCCACCTGGAGTACATGCCCAAGTCTGGAGAGAAGATTTCCTGTGTGGTGGAACATGCCAGCCTGAGTAAACCTCTGA168 Y Q I H S H L E Y M P K S G E K I S C V V E H A S L S K P L1115TCACTGACTGGGAgtaaatacctgtctgtcacttgtctgtctgccccctcgtctgtgtgctcacctgctcagctgtctttctccctttct198 I T D W D1205gtgctcagTCCATCCATGCCTGAGTCAGAAAGAAACAAGATCGCTATTGGGACCTCAGGACTGATCCTGGGTCTGACCTTATCTCTGGCT203 P S M P E S E R N K I A I G T S G L I L G L T L S L A1295GGATTCATCTACTACAAGAGGAAGGCCCAAGgtcagagccagaaacccatttcacaccagtttatacagaccaaatccagtttagaccag230 G F I Y Y K R K A Q1385ttttaatggtgtgtatttgttttgacccttgtctcttctctttaaaccagGACGGGATCCTGGTTCCCACTAACTGAGTCTTGTCCTGGA240 G R D P G S H *1475CCTGGACTTGGTCCTGGATCTATTTCTGTTTTCCTGATGGAAGTAAAATTAGCTGCTGCTTCAACCTGCTTTCTGTTTTCAGTCCAGCAG1565ACTCAGCGCTGCCACCTGCTGGACTTGCTGAACACCAAATTCTCTGATGGTCTGTGCTGGTCTGAACCTGATCTAGAACCAGTCCTGTTC1655TCACTGTGGATCCAGACTCTGGTACATCAGCTGGATCACAAACACCTGATTTGTTGCTTCACGGTGTGAAATCTATATTTTTTTTCTCAT1745CCTCCTGTTGTTAAACAGTTTTAAATCCTCTTTGATTCAGATCTCAGGTGTCTATACTTTTACTGTTTTCTAATCAAAATAAACTTTGAA1835CCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。2)、抗病群體和敏感群體的制備采用自然選擇和人工感染途徑獲得抗病群體和不抗病群體；在發(fā)病旺季，從養(yǎng)殖場收集發(fā)病后存活的個體，同時用病原菌感染收集來的魚苗，根據(jù)對病原菌感染的抵抗能力大小獲得抗病群體和不抗病群體兩個基礎(chǔ)群體；3)、牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記的篩選對42個抗病個體和42個感病個體的411個MHCIIB克隆進行了測序，發(fā)現(xiàn)了13種不同的核苷酸序列，分別編碼13種不同的氨基酸序列，命名為13種不同的基因型(Paol-allele*a Paol-allele*m)；411個陽性克隆質(zhì)粒中的280/268bp的外源序列，去除中間的內(nèi)含子序列，共編碼61個氨基酸，通過與人類MHCIIB的氨基酸序列比對，確定本研究所得的MHCIIB基因的氨基酸區(qū)段對應(yīng)位點為22～82，其中抗原結(jié)合位點分別為第35、37、39、56、58、60、65、66和第75位；在總的編碼區(qū)內(nèi)，多態(tài)性位點13個，其中多肽結(jié)合位點為6個，占多態(tài)位點的46.15％；在13種不同的氨基酸序列(Paol-allele*a-Paol-allele*m)中，Paol-allele*a-Paol-allele*f和Paol-allele*j，Paol-allele*k，Paol-allele*i，Paol-allele*m是抗病群體和感病群體所共有的；即基因型a，b，c，d，e，f，i，j，k和m同時出現(xiàn)于抗病群體和不抗病群體，基因型g和h只出現(xiàn)在抗病群體中，而基因型l只出現(xiàn)在感病群體中；不同等位基因在抗病群體和感病群體中的分布。因此，基因型g和h被認為是抗病相關(guān)的MHC基因標記，而基因型l則被認為可能是疾病敏感相關(guān)的MHC基因標記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記，其特征在于所述的MHCIIB 13種不同的基因型，其氨基酸序列為182838485868Paol-allele*aSLFFITVCTADGFRYYMVADCEFNSSKLNDIEFTLSFYYNKLEFIRFSSSVGKYVGYTEFGPaol-allele*b..............H...T.............Y.Q.Y......Y.................Paol-allele*c..............H...T.................Y......Y.........F.......Paol-allele*d..............H.T.T.............Y.E.Y.....KIV........F.......Paol-allele*e .............LH.V.T.............Y.E.Y......I.........F.......Paol-allele*f ..............H.V.NN............Y...Y......I.........F.......Paol-allele*g .............LH.T.NS..............Q.Y......IV................Paol-allele*h ..............H.T.GS............Y.E.Y.....KIV........F.......Paol-allele*i .............LH.V.DS............YIY.H......Y.........F.......Paol-allele*j ..............F.V.T.............YIY.H......Y.................Paol-allele*k ..............H.T.DS............YIY.H......YV................Paol-allele*l .............LH.A.NS............Y.Q.Y......IV................PBR * * ** * ****Polymorphic pp p ppppp p pppp。
3.一種MHC基因標記輔助育種方法，其特征在于它的方法是將只在抗病群體中出現(xiàn)的MHCIIB基因型作為抗病相關(guān)MHC基因標記，將攜帶這些抗病基因標記的魚進行繁殖，培育后代，分離后代中的MHCIIB基因，研究MHCIIB基因的多態(tài)性，同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病MHCIIB基因標記的遺傳規(guī)律及其與魚體抗病力的關(guān)系，從中篩選出既含有抗病MHCIIB基因標記，抗病力又提高的魚苗，進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。
全文摘要
一種牙鲆抗病相關(guān)MHC基因標記及其輔助育種方法，它的方法是MHCIIB基因的克隆，抗病和感病群體的制備，抗病相關(guān)MHCIIB基因標記的篩選，基因標記輔助育種技術(shù)的建立。本發(fā)明克隆了牙鲆MHCIIB全基因，并從牙鲆抗病和感病群體中鑒定出13種不同的MHCIIB基因型，其中10個基因型(a，b，c，d，e，f，i，j，k，m)在抗病和感病群體中都存在，2個基因型(g和h)只在抗病群體中存在；另有1個基因型(1)只在感病群體中存在。將基因型g和h作為抗病相關(guān)MHC基因標記，建立了抗病相關(guān)基因標記輔助育種方法。本發(fā)明首次克隆了牙鲆MHCIIB全基因并篩選到抗病相關(guān)的MHC基因標記，建立了抗病基因標記輔助育種方法。本發(fā)明方法具有針對性強、選育效率高的特點，適用于各種魚類抗病相關(guān)標記的篩選和抗病品種選育。
文檔編號C12N15/65GK1810972SQ20051004555
公開日2006年8月2日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日
發(fā)明者陳松林, 張玉喜, 劉云國, 沙珍霞, 田永勝, 鄧寒 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所