專利名稱：分離和培養(yǎng)來自凍存臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用對細(xì)胞治療而言最為理想的臍帶血來分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)的方法。更具體地，其涉及利用凍存于-196℃的臍帶血來分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的可重復(fù)性(reproducible)方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞是指能夠分化為例如骨、軟骨、脂肪組織、神經(jīng)和肌肉等的原始細(xì)胞，已知骨髓中含有大量的間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)際上，當(dāng)前由骨髓中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，然后用于特定目的的研究或廣泛用于多種疾病的臨床試驗(yàn)。
盡管可自骨髓中容易地獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，但在獲得骨髓方面存在困難。此外，目前還難以解決與將干細(xì)胞植入其他個體時所出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)有關(guān)的問題。
而相對于骨髓而言，臍帶血比較容易獲得，同時，如果獲得了數(shù)量巨大的臍帶血單位，則有可能使用與患者的組織相容性基因相同或最為相似的臍帶血干細(xì)胞，并由此可能解決與免疫排斥有關(guān)的問題。不過，相對于骨髓而言，自臍帶血獲得間充質(zhì)干細(xì)胞比較困難，且因此在研究和臨床應(yīng)用方面均存在困難。
通常，一直主要采用以密度梯度離心方法自生產(chǎn)后24小時內(nèi)的臍帶血中分離并培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。不過，如果將密度梯度離心方法應(yīng)用于凍存臍帶血，則難以分離細(xì)胞，且易于造成細(xì)胞丟失，因此使得很難培養(yǎng)臍帶血中的那些極少量的間充質(zhì)干細(xì)胞。
作為分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的常規(guī)方法，可參照美國專利5,197,985和5,486,359，其公開了通過自人類骨髓分離間充質(zhì)干細(xì)胞并培養(yǎng)這些細(xì)胞以增殖間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。也就是說，美國專利5,197,985涉及用于誘導(dǎo)來自人類骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨形成細(xì)胞的方法，其包括通過將骨髓樣品加到含有刺激間充質(zhì)細(xì)胞生長但不刺激其分化的因子的培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)過程中僅容許間充質(zhì)干細(xì)胞選擇性粘附于一種基質(zhì)表面，由此提供來自人類骨髓的分離的、純化的、并培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞；將所述來自人類骨髓的分離的、純化的、并培養(yǎng)擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞加到多孔載體上；并將含有培養(yǎng)擴(kuò)增的來自人類骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞的多孔載體植入含有使得人類間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞所必需的因子的環(huán)境中。在該方法中，所述多孔載體包含羥磷灰石和磷酸三鈣(tricalcium phosphate)，且其中所述培養(yǎng)基包括添加了胎牛血清(FBS)的BGJb培養(yǎng)基或F-12Nutrient Mixture。此外，美國專利5,486,359公開了能夠分化為一種以上組織類型(例如骨、軟骨、肌肉或骨髓基質(zhì))的細(xì)胞的分離的人類間充質(zhì)干細(xì)胞，分離、純化和培養(yǎng)擴(kuò)增人類間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以及此類細(xì)胞的表征和用途，特別是其研究試劑、診斷和治療用途。在該專利中，間充質(zhì)干細(xì)胞來自骨髓，并培養(yǎng)于含有胎牛血清的BGJb培養(yǎng)基中。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此，本發(fā)明是針對培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞中的問題而做出的，本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的可重復(fù)性方法，其中可自凍存于-196℃的臍帶血獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，而不會在密度梯度離心過程中造成細(xì)胞丟失。
技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于自凍存的臍帶血中分離間充質(zhì)干細(xì)胞并培養(yǎng)這些細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟將凍存的臍帶血解凍并向其中加入αMEM(α-極限必需培養(yǎng)基)，隨后通過離心收集單核細(xì)胞；自獲得的單核細(xì)胞中分離CD133陽性細(xì)胞；并將分離的細(xì)胞在αMEM中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、IL-3(白細(xì)胞介素-3)和IL-6(白細(xì)胞介素-6)。
本發(fā)明提供了自凍存于-196℃的臍帶血單位中分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的可重復(fù)性方法。也就是說，其目的在于通過找出自細(xì)胞數(shù)相對較少的臍帶血中分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳條件，從而有助于使用臍帶血來治療難治性疾病。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，通過自凍存的臍帶血中獲得單核細(xì)胞，分離CD133陽性細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞培養(yǎng)于含有干細(xì)胞因子、GM-CSF、G-CSF、IL-3和IL-6的αMEM中，由此能夠保護(hù)原始間充質(zhì)干細(xì)胞，并提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，由此完成了本發(fā)明。自含有與單核細(xì)胞相混合的紅細(xì)胞的凍存的臍帶血中分離單核細(xì)胞十分困難。因此，必須選擇并培養(yǎng)被認(rèn)為含有干細(xì)胞的CD133陽性細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，細(xì)胞培養(yǎng)的成功率可高達(dá)大約90％。尚未報道可用常規(guī)方法自凍存的臍帶血或骨髓中培養(yǎng)干細(xì)胞。


根據(jù)下面的詳細(xì)描述并結(jié)合附圖，可更加清楚地了解本發(fā)明的上述的以及其他的目的、特征和其他優(yōu)點(diǎn)。
在附圖中，圖1至圖6所示的照片(X 100)分別是根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)來自凍存的臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞5、7、10、14、20和25天后的結(jié)果。
最佳實(shí)施方式現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例來更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的用于自凍存的臍帶血中分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。提供這些實(shí)施例的目的僅在于示例性地說明本發(fā)明，不能將其理解為是對本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞將凍存于-196℃的臍帶血單位在37℃水浴中解凍。為了自臍帶血分離單核細(xì)胞，將臍帶血以2倍體積的αMEM(α-極限必需培養(yǎng)基，JeilBiotech Services，Korea)進(jìn)行稀釋，并以300xg在室溫離心10min。收集分離的血膜層(buffy coat layer)，再以2倍體積的αMEM進(jìn)行稀釋，覆蓋在Ficoll-Hypaque上，并以300xg在室溫離心30min。
Ficoll-Hypaque是Ficoll(蔗糖聚合物)和Hypaque(sodium ditrizoate)的聚合物，其被廣泛用于自血液中分離單核細(xì)胞。Ficoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細(xì)胞重但比紅細(xì)胞輕，因此可以根據(jù)單核細(xì)胞與紅細(xì)胞之間的不同比重而將兩者分離。也就是說，如果將血液置于Ficoll-Hypaque上并離心，單核細(xì)胞會聚集在Ficoll-Hypaque上。
將通過密度梯度離心方法所獲得的單核細(xì)胞以沒有混合添加物的αMEM洗滌2次。
使用分離試劑盒(Miltenyi Bioteck，Germany)，按照如下方法自獲得的單核細(xì)胞中選擇CD133陽性細(xì)胞在單核細(xì)胞中加入100μl的封閉試劑以去除非特異性結(jié)合，然后與100μl的CD133/微珠混合。將混合物在4℃培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)物中加入10倍體積的PBS(D-磷酸緩沖鹽，JeilBiotech Services，Korea)，300xg離心10分鐘，然后棄掉PBS以獲得粘附于管子上的細(xì)胞。以500μl的PBS重懸細(xì)胞。以3ml的PBS洗滌分離試劑盒的柱子，然后將重懸的細(xì)胞加到柱上并在柱上保持15分鐘。將柱子以PBS漂洗4次，自試劑盒中取下，然后置于管子中，加入PBS，隨后以活塞進(jìn)行沖洗以選擇陽性細(xì)胞。
隨后，向含有抗生素(1000U/ml青霉素G，1000μg/ml硫酸鏈霉素，Gibco-BRL)、抗真菌劑(0.25μg/ml兩性霉素B)和2mM的谷氨酰胺(Sigma)的αMEM中加入20％胎牛血清(FBS，Jeil Biotech Services，Korea)、干細(xì)胞因子(50ng/ml)、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子10ng/ml)、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子10ng/ml)、IL-3(白細(xì)胞介素-310ng/ml)和IL-6(白細(xì)胞介素-610ng/ml)，并將細(xì)胞以1×106/cm2的濃度重懸。
培養(yǎng)5天后，自培養(yǎng)細(xì)胞組中去除懸浮的細(xì)胞。獲得粘附的細(xì)胞后，將其在含有20％胎牛血清和抗生素的αMEM中培養(yǎng)25天，每隔2天更換全部培養(yǎng)基，不進(jìn)行洗滌。
圖1至圖6所示的照片(X 100)分別是根據(jù)本發(fā)明的方法將來自凍存的臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)5、7、10、14、20和25天后所觀察到的結(jié)果。如圖所示，在培養(yǎng)分離自臍帶血的單核細(xì)胞時，培養(yǎng)后5天，觀察到粘附于瓶底并在瓶底生長的細(xì)胞，在第7天，細(xì)胞形成集落并生長成具有不同形狀的細(xì)胞。培養(yǎng)后10天，單核細(xì)胞分化為紡錘狀細(xì)胞，而在培養(yǎng)后25天，這些紡錘狀細(xì)胞通過細(xì)胞分裂和擴(kuò)增成為徹底的間充質(zhì)干細(xì)胞，由此完成了培養(yǎng)。
實(shí)施例2培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原的表征為了確定上述分離和培養(yǎng)的紡錘狀間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原的特征，通過FACS對細(xì)胞表面抗原進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于表1。通過將發(fā)光的免疫抗原指示劑附著在細(xì)胞表面，將FACS(熒光激活的細(xì)胞分選；一種流式細(xì)胞儀)用于分析細(xì)胞的特征，或可根據(jù)所需的目的分離具有特定抗原指示劑的分離的細(xì)胞。
表1

表1證實(shí)，對于根據(jù)本發(fā)明所分離和培養(yǎng)的干細(xì)胞，CD34、CD45和CD14(造血干細(xì)胞的特征性指示劑)呈陰性反應(yīng)，SH2、SH3、CD29和CD44(間充質(zhì)干細(xì)胞的特征性指示劑)呈陽性反應(yīng)，而CD166呈弱陽性反應(yīng)。對這一事實(shí)的解釋為，其說明根據(jù)本發(fā)明所分離并培養(yǎng)的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
實(shí)施例3比較間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的成功率分別根據(jù)常規(guī)的方法和本發(fā)明的方法培養(yǎng)50單位的臍帶血，并比較兩者的細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。結(jié)果顯示于下面的表2。
具體而言，在常規(guī)方法中，臍帶血被用于干細(xì)胞培養(yǎng)，其中對所用的臍帶血的量以及自分娩至收集的時間均沒有設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。此外，常規(guī)方法的培養(yǎng)基中沒有添加細(xì)胞生長因子，除此之外，采用的細(xì)胞的分離過程與本發(fā)明的方法相似。
表2

從以上表2可以看出，通過對間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的成功率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，常規(guī)方法的成功率為0％，而本發(fā)明具有98％的高成功率。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可以自細(xì)胞數(shù)相對缺乏的臍帶血中有效地分離并培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，因此，可將原本無用而被廢棄的臍帶血作為細(xì)胞治療的一種重要的途徑，用于治療各種難治性疾病。
盡管已經(jīng)示例性地公開了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離如所附權(quán)利要求書所述的本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)的情況下，可以存在各種更改、添加和替換。
權(quán)利要求
1.用于自凍存的臍帶血中分離和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟將凍存的臍帶血解凍并向其中加入αMEM(α-極限必需培養(yǎng)基)，隨后離心收集單核細(xì)胞；自獲得的單核細(xì)胞中分離CD133陽性細(xì)胞；并將分離的細(xì)胞在αMEM中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，所述αMEM中含有干細(xì)胞因子、GM-CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、IL-3(白細(xì)胞介素-3)和IL-6(白細(xì)胞介素-6)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述臍帶血中與2倍體積的αMEM混合，覆蓋在Ficoll-Hypaque上，然后進(jìn)行離心以收集單核細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于培養(yǎng)單核細(xì)胞的αMEM還包括抗生素、抗真菌劑、谷氨酰胺和胎牛血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用凍存的臍帶血分離和培養(yǎng)最適合用于細(xì)胞治療的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。該方法包括將凍存的臍帶血的解凍并向其中加入αMEM(α－極限必需培養(yǎng)基)，隨后離心收集單核細(xì)胞；自獲得的單核細(xì)胞中分離CD133陽性細(xì)胞；并將分離的細(xì)胞在αMEM中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有干細(xì)胞因子、GM－CSF(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子)、G－CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、IL－3(白細(xì)胞介素－3)和IL－6(白細(xì)胞介素－6)。
文檔編號C12N1/00GK1878861SQ200480033036
公開日2006年12月13日 申請日期2004年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月11日
發(fā)明者韓薰, 金成煥 申請人:韓薰